ΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΕ ΕΤΕΡΟΓΕΝΗ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ

ΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΕ ΕΤΕΡΟΓΕΝΗ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΕΝΖΥΜΩΝ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ ΕΠΕΝΕΡΓΟΥΝΤΩΝ ΣΕ ΑΔΙΑΛΥΤΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ το υπόστρωμα σε στερεά (αδιάλυτη) μορφή κλασσική περίπτωση: η υδρόλυση αδιάλυτων πολυμερών π.χ. κυτταρίνη το ένζυμο πρέπει να μεταφερθεί από το διάλυμα προς το στερεό προκειμένου να λάβει χώρα η αντίδραση

Δύο περιπτώσεις: v v ( ) s ( ) s Το ένζυμο δρα μόνο στο υπόστρωμα που βρίσκεται σε διάλυση Το ένζυμο δρα μόνο σε υπόστρωμα που βρίσκεται σε αδιάλυτη μορφή

P E E P E + Αν Α μία κενή θέση στο στερεό υπόστρωμα A E P Αν θεωρήσουμε τον συνολικό αριθμό θέσεων a 0 σταθερό τότε έχουμε ότι: a 0 a (ea)

Έχουμε: K a e a (ea) τα οποία δίνουν: Ακόμη: Αρα: v και e 0 e (ea) k 2 ( ea) (ea) a 0 a (ea) k K a 0 e K a e e e 0 a 2 0 a e 0 e 0

Περιορισμός από διάχυση N e k e (e e * ) e e * NERNST όπου k e ο συντελεστής μεταφοράς μάζας o k e είναι συνάρτηση των φυσικών ιδιοτήτων και των υδροδυναμικών συνθηκών. o συντελεστής αυτός αυξάνεται με την ανάδευση. ο ρυθμός Ν e δίνεται σε μονάδες μάζας ενζύμου ανά μονάδα χρόνου ανά μονάδα επιφανείας.

N e k e (e e * ) Θεωρώντας ψευδομόνιμη κατάσταση: N e de dt 0 μια και το ένζυμο, ως καταλύτης, δεν καταναλώνεται. Επομένως έχουμε ότι: e e * Άρα η προηγούμενη ανάλυση ισχύει, και δεν χρειάζεται να θεωρήσουμε περιορισμό του ρυθμού αντίδρασης από την μεταφορά

ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΕΝΖΥΜΑ Ακινητοποιημένο ονομάζουμε ένα ένζυμο του οποίου η ελεύθερη κίνηση στον χώρο είτε έχει αποτραπεί εντελώς είτε έχει περιοριστεί Το αποτέλεσμα της ακινητοποίησης είναι μία μορφή αδιάλυτη σε υδατικά διαλύματα.

Η ακινητοποίηση των ενζύμων γίνεται για τέσσερις βασικούς λόγους: Διευκολύνει την ανακύκλωση του ενζύμου χωρίς την ανάγκη διαχωρισμού από το διάλυμα της αντίδρασης. Χρησιμεύει στον βιοχημικό σαν πρότυπο για ένζυμα που στην φυσική τους μορφή βρίσκονται προσκολλημένα σε μεμβράνες. Σε ορισμένες περιπτώσεις η ευστάθεια και η ενεργότητα του ενζύμου επαυξάνονται με την ακινητοποίηση. Με την ακινητοποίηση του ενζύμου διευκολύνεται και ο διαχωρισμός του προϊόντος.

Ένα σύστημα ακινητοποιημένου ενζύμου ορίζεται από: το ένζυμο το υλικό υποστήριξης τον τρόπο που αυτά συνδέονται μεταξύ τους.

Επιθυμητές ιδιότητες υλικού υποστήριξης μεγάλη ειδική επιφάνεια διαπερατότητα στο υπόστρωμα υδρόφιλο χαρακτήρα αδιαλυτότητα χημική, μηχανική και θερμική ευστάθεια κατάλληλο σχήμα και μέγεθος σωματιδίων αντίσταση σε μικροβιακές επιθέσεις δυνατότητα αναγέννησης.

Μέθοδοι ακινητοποίησης

Παγίδευση σε μήτρα η πιο συνηθισμένη μέθοδος ακινητοποίησης βασίζεται στον σχηματισμό πηκτώματος (gel) υδατικού διαλύματος που περιέχει το ένζυμο Τα πιο συνηθισμένα υλικά είναι: η πολυακρυλαμίδη, η κυτταρίνη άλλα τεχνητά ή φυσικά πολυμερή.

Τα συνηθισμένα προβλήματα αυτής της παγίδευσης σε μήτρα είναι: (α) συνεχής διαρροή του ενζύμου δια μέσου των πόρων του πηκτώματος λόγω της παρατηρούμενης κατανομής του μεγέθους των πόρων. (β) μειωμένη πρόσβαση του υποστρώματος προς το ένζυμο. (γ) απώλεια της ενεργότητας του ενζύμου λόγω των ελεύθερων ριζών που παράγονται κατά τον πολυμερισμό.

Παγίδευση σε μικροκάψουλες Οι μικροκάψουλες αποτελούνται από λεπτές ημιπερατές συνήθως νάυλον μεμβράνες. Το πρόβλημα αυτής της μεθόδου είναι ότι συνήθως οι μικροκάψουλες είναι πολύ ευαίσθητες και δεν αντέχουν σε ενζυμικούς αντιδραστήρες.

Προσρόφηση σε υλικά με φορτισμένες ή όχι επιφάνειες Συνήθη υλικά υποστήριξης είναι: η αλουμίνα ο αμπερλίτης ο μπεντονίτης κλπ. Το κυριότερο πρόβλημα αυτής της μεθόδου είναι η παρατηρούμενη μετουσίωση.

Χημειορρόφηση O σχηματισμός ισχυρών ομοιοπολικών δεσμών είτε με επιφάνεια είτε μεταξύ των μορίων του ενζύμου μέσω ενός συνδετικού παράγοντα. Η σύνδεση μπορεί να επιτευχθεί με τρεις διαφορετικούς τρόπους: (α) σύνδεση μέσω γλουταραλδεΰδης, μία διαδικασία που δημιουργεί ένα αδιάλυτο συσσώρευμα, π.χ. παπαΐνη. (β) προσρόφηση του ενζύμου σε κολλοειδή σωμάτια σίλικας (γ) ενσωμάτωση του ενζύμου σε πορώδες υλικό, ακολουθούμενη από σύνδεση των ενζύμων στο εσωτερικό των πόρων.

Οι δεσμοί δημιουργούνται: με τις δραστικές ομάδες στις πλευρικές αλύσσους των αμινοξέων με τις τερματικές καρβοξυλομάδες ή αμινομάδες των πολυπεπτιδικών αλύσσων. Τυπικά σχηματίζονται 10-15 δεσμοί ανά ένζυμο (όταν το ένζυμο αποτελείται από ένα πολυπεπτίδιο).

Μέθοδοι ακινητοποίησης

Ενδεχόμενα προβλήματα Απώλεια ενεργότητας Περιορισμός από διάχυση Στερεοχημικά προβλήματα

Απώλεια της ενεργότητας λόγω της ακινητοποίησης αλλαγή στην στερεομετρία του ενζύμου σε μορφή που να μην επιτρέπει την πρόσβαση του υποστρώματος στο σημείο δράσης του ενζύμου. μπλοκάρισμα της ενεργού θέσης του ενζύμου με το να παίρνει ενεργό μέρος στην ακινητοποίηση. Μπορεί να προληφθεί με κάποιο αντιστρεπτό παρεμποδιστή για την παροδική προφύλαξη του ενεργού σημείου κατά την διάρκεια της ακινητοποίησης. τροποποίηση της στερεομετρίας του ενζύμου με τέτοιο τρόπο που να χάνει την ικανότητα καταλυτικής δράσης. οι συνθήκες επεξεργασίας κατά την ακινητοποίηση μπορεί να μετουσιώσουν το ένζυμο καθιστώντας το άχρηστο για κατάλυση.

Ο γενικός κανόνας Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα του ενζύμου που ακινητοποιείται και όσο μακροσκελέστερη είναι η διαδικασία ακινητοποίησης, τόσο δυσμενέστερη είναι και η διατήρηση της ενεργότητας.

Περιορισμός λόγω εξωτερικής διάχυσης s 0 s NERNST

Θεωρώντας ψευδομόνιμη κατάσταση (ρυθμός μεταφοράς στην επιφάνεια = ρυθμός κατανάλωσης) για το υπόστρωμα και κινητική Michaelis-Menten στην επιφάνεια του υλικού υποστήριξης, έχουμε: k s (s 0 s) v max s K m s Ή ορίζοντας αδιάστατες μεταβλητές: x s s 0, Da v max k s s 0, k K m s 0 1 x Da x k +x

1 x Da x k +x Η αδιάστατη μεταβλητή x παίρνει τιμές ανάμεσα στο 0 και στο 1 η αδιάστατη παράμετρος Da ονομάζεται αριθμός Damkοehler και ισούται με τον λόγο του μέγιστου ρυθμού αντίδρασης προς τον μέγιστο ρυθμό μεταφοράς μάζας Για μεγάλες τιμές του Da (Da>>1), ο ρυθμός μεταφοράς μάζας καθορίζει και τον συνολικά παρατηρούμενο ρυθμό (περιοχή περιορισμού από την διάχυση) για μικρές τιμές του Da (Da<<1) ο ρυθμός αντίδρασης καθορίζει τον συνολικό ρυθμό (περιοχή περιορισμού από την αντίδραση)

Λύση x 4k 1+ 2 1 2 Da +k 1 Μια και το x πρέπει να είναι θετικό, η αποδεκτή λύση είναι: με το + αν β>0 με το - αν β<0

Παράγοντας αποτελεσματικότητας τo x και επομένως το η τείνει στο 1 καθώς το Da τείνει στο 0 x k x 1 k 1 x(k +1) k +x για Da>>1 (περιοχή περιορισμού από την διάχυση) έχουμε ότι: 1+k Da, v k s s 0 Η αντίδραση γίνεται ουσιαστικά αντίδραση α τάξης ως προς s 0 και ανεξάρτητη από τις κινητικές σταθερές v max και K m, καθώς και άλλες επιδράσεις όπως του ph κλπ. 1

Περιορισμός λόγω εσωτερικής διάχυσης υπάρχει κυρίως για τα παγιδευμένα ένζυμα σε μήτρα χρειάζεται και μεταφορά του υποστρώματος στο εσωτερικό του σωματιδίου, κάτι που μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τον παρατηρούμενο ρυθμό κατανάλωσης του υποστρώματος.

Aς αγνοήσουμε κατ αρχή την εξωτερική διάχυση Ας θεωρήσουμε επίσης ότι το σωματίδιο που περιέχει το ακινητοποιημένο ένζυμο είναι σφαιρικό. Ο ρυθμός διάχυσης δια μέσου του σωματιδίου σε ακτίνα r θα εξαρτάται από την τοπική βαθμίδα της συγκέντρωσης του υποστρώματος ds/dr: r N r D es ds dr 4 r2 D es η διαπερατότητα που εξαρτάται από: 1. το πορώδες του σωματιδίου, 2. την πολυπλοκότητα του δικτύου πόρων 3. τη συσχέτιση ανάμεσα στα μεγέθη των πόρων και του υποστρώματος. υπάρχουν εμπειρικές σχέσεις για τον προσδιορισμό της, αλλά συνήθως προσδιορίζεται πειραματικά.

Το ισοζύγιο υποστρώματος σε μόνιμη κατάσταση για ένα σφαιρικό φλοιό πάχους dr είναι: ds D es dr 4 r2 r ds D es dr 4 r2 r dr v4 r 2 dr Διαιρώντας με 4πdr και παίρνοντας το όριο καθώς το dr τείνει στο 0: d 2 s D es dr 2 ds v(s) 2 r dr R ds dr r 0 0, s(r) s 0

Έχοντας το s(r), o ρυθμός κατανάλωσης του υποστρώματος μπορεί να βρεθεί από την σχέση: Αδιάστατες μεταβλητές και παράμετροι: x v 0 A p V p D es ds dr r R s r R vmax K,,, s0 R 3 KmDes s η αδιάστατη παράμετρος φ ονομάζεται μέτρο Thiele το μέγεθος του δείχνει την ποσοτική σχέση ανάμεσα στους ρυθμούς αντίδρασης και εσωτερικής διάχυσης. m 0

d 2 x + 2 dx 9 2 x d 2 d 1+ x dx d 0 0, x(1) 1

Παράγοντας αποτελεσματικότητας Ορίζοντας τον παράγοντα αποτελεσματικότητας ως τον λόγο του παρατηρούμενου ρυθμού προς τον ρυθμό που θα παρατηρούσαμε ελλείψει εσωτερικής διάχυσης, έχουμε την ακόλουθη έκφραση: dx d 1 3 2 1+ f (, ) ο παράγοντας αποτελεσματικότητας εξαρτάται μόνο από τις δύο αδιάστατες παραμέτρους β και φ

Παράγοντας αποτελεσματικότητας 1 0 η εξάρτηση από την παράμετρο β είναι μικρή έχουμε περιορισμό της αποτελεσματικότητας για μεγάλες τιμές του συντελεστή φ (περιοχή περιορισμού από την εσωτερική διάχυση)

Εξωτερική και εσωτερική διάχυση Το μόνο που αλλάζει στην προηγούμενη ανάλυση είναι ότι η δεύτερη συνοριακή συνθήκη πρέπει να αντικατασταθεί από την συνθήκη: D es ds dr r R A p V p k s (s s s 0 ) Όπου s s η συγκέντρωση του υποστρώματος στην εξωτερική επιφάνεια του σωματιδίου Μία σημαντική αδιάστατη ποσότητα σ' αυτή την περίπτωση είναι ο αριθμός Biot: Bi k s R D es

Στερεοχημικά φαινόμενα αν έχουμε υποστρώματα μεγάλου μοριακού βάρους ενδέχεται η ακινητοποίηση του ενζύμου να καταστήσει αδύνατη την πρόσβαση του υποστρώματος προς το ένζυμο. π.χ. το ένζυμο Χημοτρυψίνη που δρα στην Καζεϊνη ως υπόστρωμα παρουσιάζει μείωση της ενεργότητας λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης στο 7% αν ακινητοποιηθεί σε DEAE-κυτταρίνη.

Επίδραση της ακινητοποίησης στην εξάρτηση της ενεργότητας από το ph αν έχουμε αρνητικά φορτισμένο υλικό υποστήριξης, η συγκέντρωση Η + στην επιφάνεια θα είναι μεγαλύτερη απ' ό,τι στο διάλυμα. Αυτό συνεπάγεται ότι το βέλτιστο ph του διαλύματος θα μετατοπιστεί προς αλκαλικότερες τιμές. Ανάλογη συμπεριφορά παρατηρείται όταν το υπόστρωμα έχει κάποιο καθαρό φορτίο. Goldstein: ph ph ph 0,43 ZF kt όπου Ζ το σθένος του υποστρώματος, Ψ το ηλεκτροστατικό δυναμικό, Τ η θερμοκρασία, F η σταθερά Faraday και k η σταθερά Boltzman αερίων

Επίδραση της ακινητοποίησης στην εξάρτηση της ενεργότητας από τη θερμοκρασία Η βέλτιστη θερμοκρασία συνήθως αυξάνεται με την ακινητοποίηση αν και έχουν αναφερθεί περιπτώσεις που μειώνεται ή και που δεν επηρεάζεται.