Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1

Μάρτιος 2015 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 24 Έκδοση 1 Ποσοτική in vitro διάγνωση Για χρήση με το σύστημα Rotor-Gene Q, ABI PRISM, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR και τα όργανα LightCycler και SmartCycler 672123 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, Γερμανία R3 1072512EL Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample & Assay Technologies Η QIAGEN ηγείται στο χώρο πρωτοποριακών τεχνολογιών δειγμάτων και προσδιορισμών, παρέχοντας τη δυνατότητα απομόνωσης και ανίχνευσης των περιεχομένων οποιουδήποτε βιολογικού δείγματος. Τα προηγμένα, υψηλής ποιότητας προϊόντα και οι υπηρεσίες μας αποτελούν εγγύηση επιτυχίας - από το δείγμα έως το αποτέλεσμα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα: στον καθαρισμό DNA, RNA και πρωτεϊνών στους προσδιορισμούς νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών στην έρευνα microrna και RNAi στην αυτοματοποίηση τεχνολογιών δειγμάτων και προσδιορισμών Αποστολή μας είναι η διασφάλιση των δικών σας επιτυχιών και επιτευγμάτων. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφθείτε μας στη διεύθυνση www.qiagen.com.

Περιεχόμενα Προβλεπόμενη χρήση 4 Περίληψη και ερμηνεία 4 Αρχές της διαδικασίας 6 Υλικά που παρέχονται 9 Περιεχόμενα του κιτ 9 Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται 10 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 11 Γενικές προφυλάξεις 11 Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων 12 Διαδικασία 14 Προετοιμασία RNA δείγματος 14 Πρωτόκολλο: Συνιστώμενη τυποποιημένη ανάστροφη μεταγραφή κατά EAC14 Πρωτόκολλο: qpcr σε όργανα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ή Rotor-Gene Q 5plex HRM με στροφέα 72 σωληναρίων 17 Πρωτόκολλο: qpcr στο ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS, στο σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, και στο όργανο LightCycler 480 21 Πρωτόκολλο: qpcr σε όργανα LightCycler 1.2 και 2.0 26 Πρωτόκολλο: qpcr στο όργανο SmartCycler 30 Ερμηνεία των αποτελεσμάτων 34 Αρχή της ανάλυσης δεδομένων 34 Αποτελέσματα 35 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 38 Ποιοτικός έλεγχος 41 Περιορισμοί 41 Χαρακτηριστικά απόδοσης 42 Μη κλινικές μελέτες 42 Κλινικές μελέτες 44 Βιβλιογραφία 48 Σύμβολα 49 Πληροφορίες επικοινωνίας 49 Πληροφορίες παραγγελίας 50 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 3

Προβλεπόμενη χρήση Το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 προορίζεται για την ποσοτικοποίηση των μεταγραφημάτων σύντηξης bcr1 τύπου PML-RARA σε δείγματα μυελού των οστών ή περιφερικού αίματος σε μια υποομάδα ασθενών με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ, AML) που διαγνώσθηκαν με κυτταρομορφολογία M3 και μετάθεση t(15;17)(q22;q21), με σημείο διακοπής στο ιντρόνιο 6 του PML. Τα λαμβανόμενα αποτελέσματα προορίζονται για να χρησιμοποιούνται ως ένα βοήθημα για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία, καθώς και για την παρακολούθηση της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (MRD) για την παρακολούθηση της υποτροπής της νόσου. Περίληψη και ερμηνεία Τα μεταγραφήματα του γονιδίου σύντηξης (FG) PML-RARA, τα οποία είναι το μοριακό αποτέλεσμα της μετάθεσης t(15;17)(q22;q21), συσχετίζονται με την πλειονότητα των περιπτώσεων οξείας προκοκκιοκυτταρικής λευχαιμίας (APL) (>90%), ένα διακριτό υποσύνολο της ΟΜΛ με κυτταρομορφολογία M3 που αποτελεί το 10 15% όλων των περιπτώσεων ΟΜΛ. Η ισορροπημένη αμοιβαία μετάθεση t(15;17) οδηγεί στη σύντηξη του γονιδίου προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (PML) με τον υποδοχέα ρετινοϊκού οξέος άλφα (RARA) παράγοντας την πρωτεΐνη σύντηξης PML-RARA. Η χιμαιρική πρωτεΐνη PML- RARA είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας. Η έκφρασή της συσχετίζεται με μειωμένη μυελοειδή διαφοροποίηση, λόγω αυξημένης συγγένειας για το σύμπλοκο πυρηνικής πρωτεΐνης καταστολέα (NcoR), αλλοίωσης της δομής της χρωματίνης από την ιστόνη αποακετυλασών (HDAC), και αναστολής της μεταγραφής. Η θεραπεία με all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) είναι ιδιαιτέρως αποτελεσματική στην APL και δρα ως διαφοροποιητικός παράγοντας προάγοντας την απελευθέρωση του συμπλόκου NCoR/HDAC, αποκαθιστώντας έτσι τη φυσιολογική μεταγραφή. Τα σημεία διακοπής του RARA πάντα συμβαίνουν στο ιντρόνιο 2. Ανάλογα με τη θέση των σημείων διακοπής εντός της θέσης PML, μπορεί να σχηματιστούν το ιντρόνιο 6, εξόνιο 6 και ιντρόνιο 3, οι αντίστοιχοι υποτύποι μεταγραφήματος PML-RARA που αναφέρονται ως μακρύ (L ή bcr1), παραλλαγή (V ή bcr2), και βραχύ (S ή bcr3) (Εικόνα 1). Αυτοί οι υποτύποι μεταγραφήματος αντιπροσωπεύουν το 55%, 5% και 40% των περιπτώσεων, αντίστοιχα. 4 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Τύπος Σχετική συχνότητα Εμπρόσθι ος ε κκι νητ ής Ανάστ ροφος Εικόνα 1. Σχηματικό διάγραμμα του μεταγραφήματος PML-RARA FG που καλύπτεται από τους εκκινητές και σύνολο ανιχνευτών EAC qpcr. Για τον τύπο bcr1 (L): ENF903 ENP942 ENR962. Για τον τύπο bcr2 (V): ENF906 ENP942 ENR962. Για τον τύπο bcr3 (S): ENF905 ENP942 ENR962. Ο αριθμός κάτω από τους εκκινητές και τον ανιχνευτή αναφέρεται στη θέση του νουκλεοτιδίου στο μεταγράφημα του φυσιολογικού γονιδίου. Η σχετική συχνότητα αναφέρεται στην αναλογία κάθε τύπου μεταγραφημάτων FG μεταξύ των παραλλαγών PML-RARA. Η συνδυασμένη θεραπεία με χημειοθεραπεία με βάση ανθρακυκλίνη και ATRA είναι ιδιαιτέρως επιτυχής στην APL, παρέχοντας μακροχρόνιες υφέσεις και πιθανή θεραπεία στο 70% των νεοδιαγνωσθέντων ασθενών. Ωστόσο, υποτροπή και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης εξακολουθούν να παρατηρούνται στο 15 25% των ασθενών. Η ανίχνευση του μοναδικού γονιδίου σύντηξης PML-RARA μέσω συμβατικής ποιοτικής αντίστροφης μεταγραφήςαλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για ταχεία διάγνωση και πρόβλεψη της ανταπόκρισης στις θεραπείες. Εντούτοις, αυτή η τεχνική παρουσιάζει μειονεκτήματα και η ευαισθησία της είναι σχετικά χαμηλή. Η ποσοτικοποίηση του αριθμού αντιγράφων PML-RARA μέσω ποσοτικής PCR (qpcr) πραγματικού χρόνου παρουσιάζει διάφορα πλεονεκτήματα. Είναι μια ιδιαιτέρως ευαίσθητη και αναπαραγώγιμη τεχνική η οποία επιτρέπει επίσης την αξιολόγηση της κινητικής. Η ανάλυση της προγνωστικής αξίας ενός καλά τεκμηριωμένου τυποποιημένου πρωτοκόλλου qpcr (Πρόγραμμα EAC) στους ασθενείς με APL κατά τη διάρκεια διαφορετικών φάσεων θεραπείας έχει δείξει ότι αυτή η προσέγγιση είναι μια ισχυρή εναλλακτική λύση για την αξιολόγηση της MRD, και ότι η διαστρωμάτωση του κινδύνου υποτροπής μπορεί να Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 5

καθοριστεί με βάση τον κανονικοποιημένο αριθμό αντιγράφων PML-RARA. Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης μετά τη σταθεροποίηση, ένας θετικός προσδιορισμός qpcr αποτελεί ισχυρό προγνωστική δείκτη επακόλουθης αιματολογικής υποτροπής. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας συντήρησης, και πέρα από το τέλος της θεραπείας, μια θετική εξέταση qpcr σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο υποτροπής και μικρότερη επιβίωση. Η διαστρωμάτωση του κινδύνου υποτροπής με βάση την ποσοτικοποίηση του κανονικοποιημένου αριθμού αντιγράφων (NCN) PML-RARA διαχωρίζει τους ασθενείς σε 3 ομάδες: εκείνους με υψηλό κίνδυνο υποτροπής, εκείνους με ενδιάμεσο κίνδυνο και εκείνους με χαμηλό κίνδυνο υποτροπής (1). Η παρακολούθηση PML-RARA μέσω ευαίσθητης ανίχνευσης του μεταγραφήματος θεωρείται ως αναπόσπαστο μέρος της συνολικής θεραπευτικής στρατηγικής στην APL (βλ. παραπομπές 2 και 3 για λεπτομέρειες), σύμφωνα με την οποία ο τύπος και η ένταση της θεραπείας διαμορφώνονται σε ασθενείς με διαφορετικούς κινδύνους υποτροπής κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Η τυποποίηση και επικύρωση της μεθόδου ποσοτικοποίησης της MRD τεκμηριώθηκαν σε ένα πολυκεντρικό πρόγραμμα που διενεργήθηκε από το EAC και δημοσιεύθηκε το 2003 (4, 5). Το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 βασίζεται σε αυτήν την τεχνική. Αρχές της διαδικασίας Η τεχνική qpcr επιτρέπει την ακριβή ποσοτικοποίηση των προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της διεργασίας ενίσχυσης PCR. Επιπλέον, τα δεδομένα PCR μπορούν να ληφθούν γρήγορα, χωρίς μετεπεξεργασία PCR, μέσω ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο των σημάτων φθορισμού κατά τη διάρκεια ή/και μετά την κυκλοποίηση PCR, μειώνοντας έτσι δραστικά τον κίνδυνο επιμόλυνσης του προϊόντος PCR. Επί του παρόντος, υπάρχουν διαθέσιμοι 3 κύριοι τύποι τεχνικών qpcr: Ανάλυση qpcr που χρησιμοποιεί χρωστική SYBR Green I, ανάλυση qpcr που χρησιμοποιεί ιχνηθέτες υδρόλυσης, και ανάλυση qpcr που χρησιμοποιεί ιχνηθέτες υβριδισμού. Αυτός ο προσδιορισμός εκμεταλλεύεται την αρχή της ολιγονουκλεοτιδικής υδρόλυσης διπλής χρωστικής qpcr. Κατά τη διάρκεια της PCR, εμπρόσθιοι ή ανάστροφοι εκκινητές υβριδίζουν σε μια ειδική αλληλουχία. Ένα ολιγονουκλεοτίδιο διπλής χρώσης περιέχεται στο ίδιο μείγμα. Αυτός ο ιχνηθέτης, ο οποίος αποτελείται από ένα ολιγονουκλεοτίδιο σημασμένο με μια φθορίζουσα χρωστική (reporter) στο 5' άκρο του και μια καθοδική χρωστική απόσβεσης φθορισμού (quencher) στο 3' άκρο του, υβριδίζει σε μια αλληλουχία-στόχο εντός του προϊόντος PCR. Η ανάλυση qpcr με τους ιχνηθέτες υδρόλυσης εκμεταλλεύεται τη δραστηριότητα 5'à3' εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης από Thermus aquaticus (Taq). Όταν ο ιχνηθέτης είναι άθικτος, η εγγύτητα της φθορίζουσας χρωστικής με τη χρωστική απόσβεσης φθορισμού οδηγεί σε καταστολή του φθορισμού της φθορίζουσας χρωστικής κυρίως μέσω μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. 6 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Κατά τη διάρκεια της PCR, εάν ο στόχος ενδιαφέροντος είναι παρών, ο ιχνηθέτης ανασυνδέεται ειδικά μεταξύ των θέσεων εμπρόσθιων και ανάστροφων εκκινητών. Η δραστηριότητα 5'à3' εξωνουκλεάσης της DNA πολυμεράσης διασπά τον ιχνηθέτη μεταξύ της φθορίζουσας χρωστικής και της χρωστικής απόσβεσης φθορισμού μόνο εάν ο ιχνηθέτης υβριδίζει στο στόχο. Τα θραύσματα του ανιχνευτή στη συνέχεια μετατοπίζονται από το στόχο, και ο πολυμερισμός του κλώνου συνεχίζεται. Το 3' άκρο του ανιχνευτή μπλοκάρεται για να αποτραπεί η επέκταση του ανιχνευτή κατά τη διάρκεια της PCR (Εικόνα 2). Αυτή η διεργασία λαμβάνει χώρα σε κάθε κύκλο και δεν παρεμβαίνει στην εκθετική συσσώρευση του προϊόντος. Η αύξηση του σήματος φθορισμού ανιχνεύεται μόνο εάν η αλληλουχία-στόχος είναι συμπληρωματική στον ιχνηθέτη και ως εκ τούτου ενισχύεται κατά τη διάρκεια της PCR. Λόγω αυτών των απαιτήσεων, δεν ανιχνεύεται μη ειδική ενίσχυση. Συνεπώς, η αύξηση του φθορισμού είναι ευθέως ανάλογη με την ενίσχυση του στόχου κατά τη διάρκεια της PCR. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 7

Ανασύνδεση Εκκινητές και ανασύνδεση ιχνηθέτη Πολυμερισμός Μετατόπιση κλώνου Δι άσπαση Οδηγεί στην απελευθέρωση της χρωστικής απόσβεσης φθορισμού και στην εκπομπή σήματος φθορισμού της Ολοκλήρωση πολυμερισμού Ολοκλήρωση προϊόντος PCR και συσσώρευση σήματος φθορισμού σε κάθε κύκλο Φθορίζουσα χρωστική Χρωστική απόσβεσης φθορισμού Ειδικός ιχνηθέτης Προϊόν PCR Εμπρόσθιοι και ανάστροφοι εκκινητές Taq πολυμεράση Εικόνα 2. Γενική αρχή της αντίδρασης. Το ολικό RNA μεταγράφεται αντίστροφα και το παραγόμενο cdna ενισχύεται μέσω της PCR χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος ειδικών εκκινητών και έναν ειδικό εσωτερικό ιχνηθέτη διπλής χρώσης (FAM TAMRA ).Το ολικό RNA μεταγράφεται αντίστροφα και το παραγόμενο cdna ενισχύεται μέσω της PCR χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος ειδικών εκκινητών και έναν ειδικό εσωτερικό ιχνηθέτη διπλής χρώσης (FAM TAMRA ). Ο ιχνηθέτης συνδέεται στο αμπλικόνιο κατά τη διάρκεια κάθε βήματος ανασύνδεσης της PCR. Όταν η Taq επεκτείνεται από τον εκκινητή που είναι συνδεδεμένος στο αμπλικόνιο, μετατοπίζει το 5' άκρο του ανιχνευτή, το οποίο στη συνέχεια αποικοδομείται από τη δραστηριότητα της 5'à3' εξωνουκλεάσης της Taq DNA πολυμεράσης. Η διάσπαση συνεχίζεται μέχρι την τήξη του αμπλικονίου από τον υπολειπόμενο ιχνηθέτη. Αυτή η διεργασία απελευθερώνει το φθορισμοφόρο και τη χρωστική απόσβεσης φθορισμού, διαχωρίζοντάς τα στο χώρο και οδηγώντας σε μια αύξηση του φθορισμού από το FAM και μια μείωση του φθορισμού από το TAMRA. 8 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Υλικά που παρέχονται Περιεχόμενα του κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Kit (24) Αρ. καταλόγου 672123 Αριθμός αντιδράσεων 24 ABL Control Gene Standard Dilution (Πρότυπο αραιωμένο διάλυμα γονιδίου-μάρτυρα ABL) (10 3 αντίγραφα/5 µl) ABL Control Gene Standard Dilution (Πρότυπο αραιωμένο διάλυμα γονιδίου-μάρτυρα ABL) (10 4 αντίγραφα/5 µl) ABL Control Gene Standard Dilution (Πρότυπο αραιωμένο διάλυμα γονιδίου-μάρτυρα ABL) (10 5 αντίγραφα/5 µl) PML-RARA bcr1 Fusion Gene Standard Dilution (τυπική αραίωση γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1) (10 1 αντίγραφα/5 µl) PML-RARA bcr1 Fusion Gene Standard Dilution (τυπική αραίωση γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1) (10 2 αντίγραφα/5 µl) PML-RARA bcr1 Fusion Gene Standard Dilution (τυπική αραίωση γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1) (10 3 αντίγραφα/5 µl) PML-RARA bcr1 Fusion Gene Standard Dilution (τυπική αραίωση γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1) (10 5 αντίγραφα/5 µl) PML-RARA bcr1 Fusion Gene Standard Dilution (τυπική αραίωση γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1) (10 6 αντίγραφα/5 µl) Primers and Probe Mix ABL (Εκκινητές και μείγμα ιχνηθετών ABL)* C1-ABL 50 µl C2-ABL 50 µl C3-ABL 50 µl F1-PML- RARA bcr1 F2-PML- RARA bcr1 F3-PML- RARA bcr1 F4-PML- RARA bcr1 F5-PML- RARA bcr1 PPC-ABL 25x 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 90 µl Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 9

Primers and Probe Mix PML-RARA bcr1 Fusion Gene (εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1) ipsogen PML-RARA bcr1 Kit Handbook (Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1) (αγγλικά) PPF-PML- RARA bcr1 25x 110 µl 1 * Μείγμα ειδικών ανάστροφων και εμπρόσθιων εκκινητών για το γονίδιο-μάρτυρα ABL συν ειδικός ιχνηθέτης FAM TAMRA. Μείγμα ειδικών ανάστροφων και εμπρόσθιων εκκινητών για το γονίδιο σύντηξης PML- RARA bcr1 συν ειδικός ανιχνευτής FAM TAMRA. Σημείωση: Φυγοκεντρίστε σύντομα τα πρότυπα αραιωμένα διαλύματα και τους εκκινητές και τα μείγματα ιχνηθετών πριν τη χρήση. Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS), τα οποία και είναι διαθέσιμα από τον προμηθευτή του προϊόντος. Αντιδραστήρια Νερό κατηγορίας εφαρμογών PCR χωρίς νουκλεάση Αντιδραστήρια για ανάστροφη μεταγραφή: Το επικυρωμένο αντιδραστήριο είναι ανάστροφη μεταγραφάση Superscript II (ή Superscript), περιλαμβάνει 5x ρυθμιστικό διάλυμα πρώτου κλώνου, 100 mm DTT (Life Technologies, αριθμός καταλόγου 18064-022) Αναστολέας RNασών: Το επικυρωμένο αντιδραστήριο είναι RNaseOUT (Life Technologies, αρ. καταλόγου 10777-019) Σετ dntp, κατηγορίας εφαρμογών PCR Τυχαίο εξαμερές MgCl 2 Ρυθμιστικό διάλυμα και Taq DNA πολυμεράση: Τα επικυρωμένα αντιδραστήρια είναι TaqMan Universal PCR Master Mix (κύριο μείγμα PCR 2x) (Life Technologies, αρ. καταλόγου 4304437) και LightCycler TaqMan Master (κύριο μείγμα PCR 5x) (Roche, αρ. καταλόγου 04535286001) Αναλώσιμα Ανθεκτικά στα αερολύματα αποστειρωμένα ρύγχη πιπέτας PCR χωρίς νουκλεάση με υδρόφοβα φίλτρα 10 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Σωληνάρια PCR χωρίς RNάση και DNάση 0,5 ml ή 0,2 ml Πάγος Εξοπλισμός Πιπέτα μικρολίτρων* αποκλειστική για PCR (1 10 µl, 10 100 µl, 100 1000 µl) Φυγόκεντρος πάγκου* με στροφέα για σωληνάρια αντίδρασης 0,2 ml/0,5 ml (με μέγιστη ταχύτητα 13.000 / 14.000 rpm) Όργανο PCR πραγματικού χρόνου:* Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ή άλλα όργανα Rotor-Gene Q, LightCycler 1.2, 2.0 ή 480, ABI PRISM 7000, 7700 ή 7900HT SDS, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, ή SmartCycler, και σχετικό ειδικό υλικό Θερμικός κυκλοποιητής* ή λουτρό νερού* (βήμα ανάστροφης μεταγραφάσης) * Βεβαιωθείτε πως τα όργανα έχουν ελεγχθεί και βαθμονομηθεί σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Συμπληρωματικά αντιδραστήρια Κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls (αρ. καταλόγου 672091), που αποτελείται από κυτταρικές σειρές με αρνητική, υψηλή και χαμηλή θετική έκφραση του γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1 για την ποσοτική επικύρωση της εκχύλισης RNA και της ανάστροφης μεταγραφής Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για διαγνωστική χρήση in vitro Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες παρακαλείστε να ανατρέξετε στα σχετικά δελτία δεδομένων ασφάλειας (SDS). Αυτά τα δελτία είναι διαθέσιμα online σε εύχρηστη μορφή PDF στη διεύθυνση www.qiagen.com/safety όπου και μπορείτε να βρείτε, να προβάλλετε και να εκτυπώσετε τα δελτία SDS για κάθε κιτ και συστατικό των κιτ της QIAGEN. Απορρίψτε τα απόβλητα δειγμάτων και προσδιορισμών σύμφωνα με τις εκάστοτε τοπικές διατάξεις ασφαλείας. Γενικές προφυλάξεις Η χρήση δοκιμασιών qpcr απαιτεί καλές εργαστηριακές πρακτικές, συμπεριλαμβανομένης της συντήρησης του εξοπλισμού, οι οποίες είναι αποκλειστικές για τη μοριακή βιολογία και συμμορφώνονται με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα σχετικά πρότυπα. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 11

Αυτό το κιτ προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται σε αυτό το κιτ έχουν επικυρωθεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή των χρόνων και θερμοκρασιών επώασης ενδέχεται να οδηγήσει σε εσφαλμένα ή ασύμβατα δεδομένα. Τα αντιδραστήρια PPC και PPF μπορεί να αλλοιωθούν εάν εκτεθούν στο φως. Όλα τα αντιδραστήρια είναι μορφοποιημένα ειδικά για χρήση με αυτήν τη δοκιμασία. Για βέλτιστη απόδοση της δοκιμασίας, δεν επιτρέπεται να γίνουν υποκαταστάσεις. Ο προσδιορισμός των επιπέδων μεταγραφημάτων με χρήση qpcr απαιτεί τόσο την ανάστροφη μεταγραφή του mrna όσο και την ενίσχυση του παραγόμενου cdna μέσω PCR. Συνεπώς, ολόκληρη η διαδικασία του προσδιορισμού πρέπει να εκτελείται υπό συνθήκες χωρίς RNάση/DNάση. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή ώστε να αποφευχθεί: Επιμόλυνση RNάσης/DNάσης, η οποία θα μπορούσε να προκαλέσει αποικοδόμηση της μήτρας mrna και του παραγόμενου cdna Επιμόλυνση από μεταφορά mrna ή PCR με αποτέλεσμα ψευδές θετικό σήμα Συνεπώς, συνιστούμε τα ακόλουθα. Χρησιμοποιείτε εργαστηριακό εξοπλισμό (π.χ. πιπέτες, ρύγχη πιπέτας, φιαλίδια αντίδρασης) χωρίς νουκλεάση και φοράτε γάντια όταν εκτελείτε τον προσδιορισμό. Χρησιμοποιείτε νέα ανθεκτικά στα αερολύματα ρύγχη πιπετών για όλα τα βήματα διανομής με πιπέτα προκειμένου να αποφύγετε τη διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Παρασκευάζετε το κύριο προ-μείγμα PCR με αποκλειστικά για το σκοπό αυτό υλικά (πιπέτες, ρύγχη κτλ.) σε αποκλειστικό χώρο όπου δεν έχουν εισαχθεί μήτρες DNA (cdna, DNA, πλασμίδιο). Προσθέτετε τη μήτρα σε ξεχωριστή ζώνη (κατά προτίμηση σε ξεχωριστό δωμάτιο) με ειδικά υλικά (πιπέτες, ρύγχη κτλ.). Χειρίζεστε τα πρότυπα αραιωμένα διαλύματα (C1 3 και F1 5) σε ξεχωριστό δωμάτιο. Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων Τα κιτ αποστέλλονται σε ξηρό πάγο και πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 30 C έως 15 C κατά την παραλαβή. Ελαχιστοποιήστε την έκθεση των εκκινητών και μειγμάτων ιχνηθετών στο φως (σωληνάρια PPC και PPF). Αναμείξτε απαλά και φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια πριν το άνοιγμα. Φυλάσσετε όλα τα συστατικά του κιτ στους αρχικούς περιέκτες. 12 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Αυτές οι συνθήκες φύλαξης ισχύουν τόσο για τα ανοιγμένα όσο και τα μη ανοιγμένα συστατικά. Συστατικά που φυλάσσονται σε συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που αναφέρονται στις ετικέτες ενδέχεται να μην έχουν σωστή απόδοση και να επηρεάσουν αρνητικά τα αποτελέσματα του προσδιορισμού. Οι ημερομηνίες λήξης για κάθε αντιδραστήριο υποδεικνύονται στις ετικέτες των επιμέρους συστατικών. Σε σωστές συνθήκες φύλαξης, το προϊόν θα διατηρήσει την απόδοσή του μέχρι την ημερομηνία λήξης που είναι τυπωμένη στην ετικέτα. Δεν υπάρχουν εμφανή σημάδια που να υποδεικνύουν τυχόν αστάθεια αυτού του προϊόντος. Εντούτοις, θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να εκτελούνται ταυτόχρονα με άγνωστα δείγματα. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 13

Διαδικασία Προετοιμασία RNA δείγματος Η προετοιμασία RNA από δείγματα ασθενούς (αίμα ή μυελός των οστών) πρέπει να έχει διενεργηθεί με χρήση επικυρωμένης διαδικασίας. Η ποιότητα του προσδιορισμού εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ποιότητα του RNA εισόδου. Συνεπώς συνιστούμε την επικύρωση του κεκαθαρμένου RNA μέσω ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης* ή χρησιμοποιώντας το βιοαναλυτή Agilent Bioanalyzer πριν από την ανάλυση. Πρωτόκολλο: Συνιστώμενη τυποποιημένη ανάστροφη μεταγραφή κατά EAC Απαραίτητες ενέργειες πριν από την έναρξη Προετοιμάστε dntp, 10 mm έκαστο. Φυλάξτε στους 20 C σε κλάσματα. Προετοιμάστε τυχαίο εξαμερές, 100 μm. Φυλάξτε στους 20 C σε κλάσματα. Προετοιμάστε MgCl 2, 50 mm. Φυλάξτε στους 20 C σε κλάσματα. Διαδικασία 1. Αποψύξτε όλα τα απαραίτητα συστατικά και τοποθετήστε τα σε πάγο. 2. Επωάστε 1 µg RNA (1 4 µl) για 10 λεπτά στους 70 C και ψύξτε αμέσως σε πάγο για 5 λεπτά. 3. Φυγοκεντρίστε σύντομα (περίπου 10 δευτερόλεπτα, 10.000 rpm) για να συλλέξετε το υγρό στο κάτω μέρος του σωληναρίου. Στη συνέχεια διατηρήστε σε πάγο. 4. Προετοιμάστε το ακόλουθο μείγμα RT σύμφωνα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία (Πίνακας 1). * Όταν εργάζεστε με χημικά θα πρέπει πάντοτε να φοράτε προστατευτική ποδιά εργαστηρίου, γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. 14 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πίνακας 1. Προετοιμασία του μείγματος RT Συστατικό Ρυθμιστικό διάλυμα πρώτου κλώνου (παρέχεται με την ανάστροφη μεταγραφάση Superscript II), 5x Όγκος ανά δείγμα (µl) Τελική συγκέντρωση 4,0 1x MgCl 2 (50 mm) 2,0 5 mm dntp (10 mm έκαστο, να προετοιμάζεται προηγουμένως και να φυλάσσεται στους 20 C σε κλάσματα) DTT (100 mm, παρέχεται με την ανάστροφη μεταγραφάση Superscript II) 2,0 1 mm 2,0 10 mm Αναστολέας RNασών (40 U/µl) 0,5 1 U/µl Τυχαίο εξαμερές (100 µm) 5,0 25 µm Ανάστροφη μεταγραφάση Superscript II ή Superscript (200 U/µl) Θερμασμένο δείγμα RNA (για προσθήκη στο βήμα 5) Νερό κατηγορίας εφαρμογών PCR χωρίς νουκλεάση (για προσθήκη στο βήμα 5) 0,5 5 U/µl 1,0 4,0 50 ng/µl 0,0 3,0 Τελικός όγκος 20,0 5. Διανείμετε με πιπέτα 16 μl του μείγματος RT σε κάθε σωληνάριο PCR. Στη συνέχεια προσθέστε 1 4 µl (1 µg) RNA (από το βήμα 3), και προσαρμόστε τον όγκο σε 20 µl με νερό κατηγορίας εφαρμογών PCR χωρίς νουκλεάση (βλ. Πίνακα 2). Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 15

Πίνακας 2. Προετοιμασία της αντίδρασης ανάστροφης μεταγραφής Συστατικό Όγκος (µl) Μείγμα RT 16 Θερμασμένο RNA δείγματος (1 µg) 1 4 Νερό κατηγορίας εφαρμογών PCR χωρίς νουκλεάση 0 3 Τελικός όγκος 20 6. Αναμείξτε καλά και φυγοκεντρίστε σύντομα (περίπου 10 δευτερόλεπτα, 10.000 rpm) για να συλλέξετε το υγρό στο κάτω μέρος του σωληναρίου. 7. Επωάστε στους 20 C για 10 λεπτά. 8. Επωάστε στους 42 C σε θερμικό κυκλοποιητή για 45 λεπτά, κατόπιν αμέσως στους 99 C για 3 λεπτά. 9. Ψύξτε σε πάγο (για να διακόψετε την αντίδραση) για 5 λεπτά. 10. Φυγοκεντρίστε σύντομα (περίπου 10 δευτερόλεπτα, 10.000 rpm) για να συλλέξετε το υγρό στο κάτω μέρος του σωληναρίου. Στη συνέχεια διατηρήστε σε πάγο. 11. Αραιώστε το τελικό cdna με 30 µl νερό κατηγορίας εφαρμογών PCR χωρίς νουκλεάση έτσι ώστε ο τελικός όγκος να είναι 50 µl. 12. Διενεργήστε PCR σύμφωνα με τα ακόλουθα πρωτόκολλα, σύμφωνα με το όργανο qpcr που διαθέτετε. 16 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πρωτόκολλο: qpcr σε όργανα Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM ή Rotor-Gene Q 5plex HRM με στροφέα 72 σωληναρίων Κατά τη χρήση αυτού του οργάνου, συνιστούμε την εκτέλεση όλων των μετρήσεων εις διπλούν, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Αριθμός αντιδράσεων για όργανα Rotor-Gene Q με στροφέα 72 σωληναρίων Δείγματα Αντιδράσεις Με τους εκκινητές και το μείγμα ιχνηθετών ABL (PPC-ABL) n δείγματα cdna Πρότυπο ABL Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 2 x 3 αντιδράσεις (3 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις διπλούν) 2 αντιδράσεις Με τους εκκινητές και το μείγμα ανιχνευτών PML-RARA bcr1 (PPF-PML- RARA bcr1) n δείγματα cdna Πρότυπο PML-RARA Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 2 x 5 αντιδράσεις (5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις διπλούν) 2 αντιδράσεις Επεξεργασία δειγμάτων σε όργανα Rotor-Gene Q με στροφέα 72 σωληναρίων Συνιστούμε την εξέταση τουλάχιστον 8 δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα για τη βελτιστοποίηση της χρήσης των προτύπων και των εκκινητών και μειγμάτων ιχνηθετών. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 17

Εικόνα 3. Προτεινόμενη προετοιμασία στροφέα για κάθε πείραμα με το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1. F1 5: πρότυπα PML-RARA bcr1, C1 3: πρότυπα ABL, S: δείγμα cdna, H 2 O: μάρτυρας νερού. Σημείωση: Φροντίστε έτσι ώστε να τοποθετείτε πάντοτε ένα δείγμα προς εξέταση στη θέση 1 του στροφέα. Διαφορετικά, κατά τη διάρκεια του βήματος βαθμονόμησης, το όργανο δεν θα εκτελέσει βαθμονόμηση, και θα ληφθούν εσφαλμένα δεδομένα φθορισμού. Γεμίστε όλες τις άλλες θέσεις με κενά σωληνάρια. qpcr σε όργανα Rotor-Gene Q με στροφέα 72 σωληναρίων Σημείωση: Εκτελέστε όλα τα βήματα σε πάγο. Διαδικασία 13. Αποψύξτε όλα τα απαραίτητα συστατικά και τοποθετήστε τα σε πάγο. 14. Προετοιμάστε το ακόλουθο μείγμα qpcr σύμφωνα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία. 18 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Όλες οι συγκεντρώσεις αφορούν τον τελικό όγκο της αντίδρασης. Ο Πίνακας 4 περιγράφει το σχήμα διανομής με πιπέτα για την προετοιμασία ενός μείγματος αντιδραστηρίων, υπολογισμένο για την επίτευξη τελικού όγκου αντίδρασης 25 µl. Μπορεί να προετοιμαστεί ένα προ-μείγμα, σύμφωνα με τον αριθμό των αντιδράσεων, χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών (είτε PPC-ABL είτε PPF-PML- RARA bcr1). Συμπεριλαμβάνονται επιπλέον όγκοι για αντιστάθμιση σφάλματος διανομής με πιπέτα. Πίνακας 4. Προετοιμασία του μείγματος qpcr Συστατικό Κύριο μείγμα TaqMan Universal PCR, 2x Εκκινητές και μείγμα ιχνηθετών, 25x Νερό κατηγορίας εφαρμογώ ν PCR χωρίς νουκλεάση Δείγμα (για προσθήκη στο βήμα 4) Συνολικός όγκος 1 αντίδρασ η (µl) ABL: 24 + 1 αντιδράσει ς (µl) PML-RARA bcr1: 28 + 1 αντιδράσεις (µl) Τελική συγκέντρω ση 12,5 312,5 362,5 1x 1 25 29 1x 6,5 162,5 188,5 5 5 έκαστο 5 έκαστο 25 25 έκαστο 25 έκαστο 15. Χορηγήστε 20 µl από το προ-μείγμα qpcr ανά σωληνάριο. 16. Προσθέστε 5 µl προϊόντος RT (cdna, 100 ng RNA ισοδύναμο) που ελήφθη στην ανάστροφη μεταγραφή (βλ. «Πρωτόκολλο: Συνιστώμενη τυποποιημένη ανάστροφη μεταγραφή κατά EAC», σελίδα 14) στο αντίστοιχο σωληνάριο (συνολικός όγκος 25 µl). Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 19

17. Αναμείξτε απαλά, με επαναλαμβανόμενη αναρρόφηση/εξώθηση με πιπέτα. 18. Τοποθετήστε τα σωληνάρια στο θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. 19. Προγραμματίστε το όργανο Rotor-Gene Q με το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 5. Πίνακας 5. Προφίλ θερμοκρασίας Λειτουργία ανάλυσης Ποσοτικοποίηση Διατήρηση Θερμοκρασία: 50 C Χρόνος: 2 λεπτά Διατήρηση 2 Θερμοκρασία: 95 C Κυκλοποίηση Χρόνος: 10 λεπτά 50 φορές 95 C για 15 δευτερόλεπτα 60 C για 1 λεπτό με λήψη φθορισμού FAM στο κανάλι Green: Μονό 20. Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 5. 21. Για όργανα Rotor-Gene Q, επιλέξτε «SLOPE CORRECT» (διόρθωση κλίσης) για την ανάλυση. Συνιστούμε τη ρύθμιση του κατωφλίου στο 0,03. 20 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πρωτόκολλο: qpcr στο ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS, στο σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, και στο όργανο LightCycler 480 Κατά τη χρήση εξοπλισμού qpcr πλακιδίων 96 φρεατίων, συνιστούμε την εκτέλεση όλων των μετρήσεων εις διπλούν, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6. Αριθμός αντιδράσεων με χρήση εξοπλισμού qpcr πλακιδίων 96 φρεατίων Δείγματα Αντιδράσεις Με τους εκκινητές και το μείγμα ιχνηθετών ABL (PPC-ABL) n δείγματα cdna Πρότυπο ABL Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 2 x 3 αντιδράσεις (3 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις διπλούν) 2 αντιδράσεις Με τους εκκινητές και το μείγμα ανιχνευτών PML-RARA bcr1 (PPF- PML-RARA bcr1) n δείγματα cdna Πρότυπο PML-RARA bcr1 Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 2 x 5 αντιδράσεις (5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις διπλούν) 2 αντιδράσεις Επεξεργασία δείγματος στο ABI PRISM 7000, 7700 και 7900 SDS, στο σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, και στα όργανα LightCycler 480 Συνιστούμε την εξέταση τουλάχιστον 8 δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα για τη βελτιστοποίηση της χρήσης των προτύπων και των εκκινητών και μειγμάτων ιχνηθετών. Η διάταξη πλακιδίων στην Εικόνα 4 δείχνει ένα παράδειγμα τέτοιου πειράματος. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 21

Εικόνα 4. Προτεινόμενη προετοιμασία πλακιδίων για ένα πείραμα. S: δείγμα cdna, F1 5: πρότυπα PML-RARA bcr1, C1 3: πρότυπα ABL, H 2 O: μάρτυρας νερού. qpcr στο ABI PRISM 7000, 7700 και 7900 SDS, στο σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, και στα όργανα LightCycler 480 Σημείωση: Εκτελέστε όλα τα βήματα σε πάγο. Διαδικασία 22. Αποψύξτε όλα τα απαραίτητα συστατικά και τοποθετήστε τα σε πάγο. 23. Προετοιμάστε το ακόλουθο μείγμα qpcr σύμφωνα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία. Όλες οι συγκεντρώσεις αφορούν τον τελικό όγκο της αντίδρασης. Ο Πίνακας 7 περιγράφει το σχήμα διανομής με πιπέτα για την προετοιμασία ενός μείγματος αντιδραστηρίων, υπολογισμένο για την επίτευξη τελικού όγκου αντίδρασης 25 µl. Μπορεί να προετοιμαστεί ένα προ-μείγμα, σύμφωνα με τον αριθμό των αντιδράσεων, χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών (είτε PPC-ABL είτε PPF-PML- RARA bcr1). Συμπεριλαμβάνονται επιπλέον όγκοι για αντιστάθμιση σφάλματος διανομής με πιπέτα. 22 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πίνακας 7. Προετοιμασία του μείγματος qpcr Συστατικό Κύριο μείγμα TaqMan Universal PCR, 2x Εκκινητές και μείγμα ιχνηθετών, 25x Νερό κατηγορίας εφαρμογώ ν PCR χωρίς νουκλεάση Δείγμα (για προσθήκη στο βήμα 4) Συνολικός όγκος 1 αντίδρασ η (µl) ABL: 24 + +1 αντιδράσει ς (µl) PML-RARA bcr1: 28 + +1 αντιδράσει ς (µl) Τελική συγκέντρωσ η 12,5 312,5 362,5 1x 1 25 29 1x 6,5 162,5 188,5 5 5 έκαστο 5 έκαστο 25 25 έκαστο 25 έκαστο 24. Χορηγήστε 20 µl από το προ-μείγμα qpcr ανά φρεάτιο. 25. Προσθέστε 5 µl προϊόντος RT (cdna, 100 ng RNA ισοδύναμο) που ελήφθη στην ανάστροφη μεταγραφή (βλ. «Πρωτόκολλο: Συνιστώμενη τυποποιημένη ανάστροφη μεταγραφή κατά EAC», σελίδα 14) στο αντίστοιχο φρεάτιο (συνολικός όγκος 25 µl). 26. Αναμείξτε απαλά, με επαναλαμβανόμενη αναρρόφηση/εξώθηση με πιπέτα. 27. Κλείστε το πλακίδιο και φυγοκεντρήστε σύντομα (300 x g, περίπου 10 δευτερόλεπτα). 28. Τοποθετήστε το πλακίδιο στο θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Προγραμματίστε τον θερμικό κυκλοποιητή με το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 8 για το ABI PRISM 7000, 7700 και Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 23

7900HT SDS και το σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, ή στον Πίνακα 9 για το όργανο LightCycler 480. Πίνακας 8. Προφίλ θερμοκρασίας για το σύστημα ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS και Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Λειτουργία ανάλυσης Διατήρηση Θερμοκρασία: 50 C Πρότυπη καμπύλη Απόλυτη ποσοτικοποίηση Χρόνος: 2 λεπτά Διατήρηση 2 Θερμοκρασία: 95 C Κυκλοποίηση Χρόνος: 10 λεπτά 50 φορές 95 C για 15 δευτερόλεπτα 60 C για 1 λεπτό με λήψη φθορισμού FAM, χρωστική απόσβεσης φθορισμού: TAMRA Πίνακας 9. Προφίλ θερμοκρασίας για το όργανο LightCycler 480 Λειτουργία ανάλυσης Μορφές ανίχνευσης Διατήρηση Θερμοκρασία: 50 C Απόλυτη ποσοτικοποίηση («Abs Quant») Επιλέξτε «SIMPLE PROBE» (απλός ιχνηθέτης) στο παράθυρο DETECTION FORMAT (μορφές ανίχνευσης) Χρόνος: 2 λεπτά Διατήρηση 2 Θερμοκρασία: 95 C Κυκλοποίηση Χρόνος: 10 λεπτά 50 φορές 95 C για 15 δευτερόλεπτα 60 C για 1 λεπτό με λήψη φθορισμού FAM που αντιστοιχεί σε (483 533 nm) για LC έκδοση 01 και (465 510 nm) για LC έκδοση 02 29. Για το ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS και το σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR, ακολουθήστε το βήμα 8α. Για το LightCycler 480, ακολουθήστε το βήμα 8β. 24 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

8α. ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS και σύστημα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR: Συνιστούμε ένα κατώφλι ρυθμισμένο στο 0,1 όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο EAC στο βήμα ανάλυσης και γραμμή βάσης ρυθμισμένη μεταξύ των κύκλων 3 και 15. Ξεκινήστε το πρόγραμμα κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 8. 8β. LightCycler 480: Συνιστούμε μια λειτουργία ανάλυσης Fit point (σημεία προσαρμογής) με υπόβαθρο 2,0 και κατώφλι στα 2,0. Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 9. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 25

Πρωτόκολλο: qpcr σε όργανα LightCycler 1.2 και 2.0 Κατά τη χρήση τριχοειδών οργάνων, συνιστούμε τη μέτρηση των δειγμάτων εις διπλούν και των μαρτύρων μόνο εις απλούν, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Αριθμός αντιδράσεων για τα όργανα LightCycler 1.2 και 2.0 Δείγματα Αντιδράσεις Με τους εκκινητές και το μείγμα ιχνηθετών ABL (PPC-ABL) n δείγματα cdna Πρότυπο ABL Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 1 x 3 αντιδράσεις (3 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις απλούν) 1 αντίδραση Με τους εκκινητές και το μείγμα ανιχνευτών PML-RARA bcr1 (PPF- PML-RARA bcr1) n δείγματα cdna Πρότυπο PML-RARA bcr1 Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 1 x 5 αντιδράσεις (5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις απλούν) 1 αντίδραση Επεξεργασία δείγματος στα όργανα LightCycler 1.2 και 2.0 Συνιστούμε την εξέταση τουλάχιστον 5 δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα για τη βελτιστοποίηση της χρήσης των προτύπων και των εκκινητών και μειγμάτων ιχνηθετών. Η διάταξη τριχοειδών στην Εικόνα 5 δείχνει ένα παράδειγμα πειράματος. 26 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Εικόνα 5. Προτεινόμενη προετοιμασία στροφέα για κάθε πείραμα με το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1. F1 5: πρότυπα PML-RARA bcr1, C1 3: πρότυπα ABL, S: άγνωστο δείγμα DNA προς ανάλυση, H 2 O: μάρτυρας νερού. qpcr σε όργανα LightCycler 1.2 και 2.0 Σημείωση: Λόγω ιδιαίτερων τεχνολογικών απαιτήσεων, τα πειράματα στο LightCycler πρέπει να πραγματοποιούνται χρησιμοποιώντας ειδικά αντιδραστήρια. Συνιστούμε τη χρήση του LightCycler TaqMan Master και την τήρηση των οδηγιών του κατασκευαστή για την προετοιμασία του κύριου μείγματος 5x. Σημείωση: Εκτελέστε όλα τα βήματα σε πάγο. Διαδικασία 30. Αποψύξτε όλα τα απαραίτητα συστατικά και τοποθετήστε τα σε πάγο. 31. Προετοιμάστε το ακόλουθο μείγμα qpcr σύμφωνα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία. Όλες οι συγκεντρώσεις αφορούν τον τελικό όγκο της αντίδρασης. Ο Πίνακας 11 περιγράφει το σχήμα διανομής με πιπέτα για την προετοιμασία ενός μείγματος αντιδραστηρίων, υπολογισμένο για την επίτευξη τελικού όγκου αντίδρασης 20 µl. Μπορεί να προετοιμαστεί ένα προ-μείγμα, σύμφωνα με τον αριθμό των αντιδράσεων, χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών (είτε PPC-ABL είτε PPF-PML- RARA bcr1). Συμπεριλαμβάνονται επιπλέον όγκοι για αντιστάθμιση σφάλματος διανομής με πιπέτα. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 27

Πίνακας 11. Προετοιμασία του μείγματος qpcr Συστατικό Φρέσκο προετοιμασμέν ο κύριο μείγμα LightCycler TaqMan, 5x Εκκινητές και μείγμα ιχνηθετών, 25x Νερό κατηγορίας εφαρμογών PCR χωρίς νουκλεάση Δείγμα (για προσθήκη στο βήμα 4) 1 αντίδρασ η (µl) ABL: 14 + 1 αντιδράσει ς (µl) PML- RARA bcr1: 16 + 1 αντιδράσει ς (µl) Τελική συγκέντρωσ η 4,0 60 68,0 1x 0,8 12 13,6 1x 10,2 153 173,4 5,0 5 έκαστο 5,0 έκαστο Συνολικός όγκος 20,0 20 έκαστο 20,0 έκαστο 32. Χορηγήστε 15 µl από το προ-μείγμα qpcr ανά τριχοειδές. 33. Προσθέστε 5 µl προϊόντος RT (cdna, 100 ng RNA ισοδύναμο) που ελήφθη στην ανάστροφη μεταγραφή (βλ. «Πρωτόκολλο: Συνιστώμενη τυποποιημένη ανάστροφη μεταγραφή κατά EAC», σελίδα 14) στο αντίστοιχο σωληνάριο (συνολικός όγκος 20 µl). 34. Αναμείξτε απαλά, με επαναλαμβανόμενη αναρρόφηση/εξώθηση με πιπέτα. 35. Τοποθετήστε τα τριχοειδή στους προσαρμογείς που παρέχονται με τη συσκευή, φυγοκεντρήστε σύντομα (700 x g, περίπου 10 δευτερόλεπτα). 36. Φορτώστε τα τριχοειδή στο θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. 37. Προγραμματίστε τα όργανα LightCycler 1.2 ή 2.0 με το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 12. 28 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πίνακας 12. Προφίλ θερμοκρασίας Λειτουργία ανάλυσης Ποσοτικοποίηση Διατήρηση Θερμοκρασία: 95 C Κυκλοποίηση Χρόνος: 10 λεπτά Ράμπα: 20 50 φορές 95 C για 10 δευτερόλεπτα, ράμπα: 20 60 για 1 λεπτό, ράμπα: 20, με λήψη φθορισμού FAM: Μονό Διατήρηση 2 45 C για 1 λεπτό, ράμπα: 20 38. Για το LightCycler 1.2, ακολουθήστε το βήμα 9α. Για το LightCycler 2.0, ακολουθήστε το βήμα 9β. 9α. LightCycler 1.2: Συνιστάται η λειτουργία F1/F2 και «2 nd derivative analysis» (ανάλυση 2ης παραγώγου). Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 12. 9β. LightCycler 2.0: Συνιστούμε τη χρήση αυτοματοποιημένης (F max) ανάλυσης στο LightCycler 2.0 έκδοση λογισμικού 4.0 για τη λήψη αναπαραγώγιμων αποτελεσμάτων. Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 12. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 29

Πρωτόκολλο: qpcr στο όργανο SmartCycler Κατά τη χρήση αυτού του οργάνου, συνιστούμε τη μέτρηση των δειγμάτων εις διπλούν και των μαρτύρων μόνο εις απλούν, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 13. Πίνακας 13. Αριθμός αντιδράσεων για το όργανο SmartCycler Δείγματα Αντιδράσεις Με τους εκκινητές και το μείγμα ιχνηθετών ABL (PPC-ABL) n δείγματα cdna Πρότυπο ABL Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 1 x 3 αντιδράσεις (3 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις απλούν) 1 αντίδραση Με τους εκκινητές και το μείγμα ανιχνευτών PML-RARA bcr1 (PPF- PML-RARA bcr1) n δείγματα cdna Πρότυπο PML-RARA bcr1 Μάρτυρας νερού n x 2 αντιδράσεις 1 x 5 αντιδράσεις (5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα, έκαστο εξεταζόμενο εις απλούν) 1 αντίδραση Επεξεργασία δείγματος στο όργανο SmartCycler Συνιστούμε την εξέταση τουλάχιστον 5 δειγμάτων cdna στο ίδιο πείραμα για τη βελτιστοποίηση της χρήσης των προτύπων και των εκκινητών και μειγμάτων ιχνηθετών. Η διάταξη δύο μπλοκ στην Εικόνα 6 δείχνει ένα παράδειγμα. Όλοι οι προσδιορισμοί στο πρώτο μπλοκ πραγματοποιούνται με το PPC-ABL Όλοι οι προσδιορισμοί σε αυτό το δεύτερο μπλοκ πραγματοποιούνται με το PPF-PML-RARA bcr1 Εικόνα 6. Προτεινόμενη προετοιμασία πλακιδίων για ένα πείραμα. S: δείγμα cdna, F1 5: πρότυπα PML-RARA bcr1, C1 3: πρότυπα ABL, H 2 O: μάρτυρας νερού. 30 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

qpcr στο όργανο SmartCycler Σημείωση: Εκτελέστε όλα τα βήματα σε πάγο. Διαδικασία 39. Αποψύξτε όλα τα απαραίτητα συστατικά και τοποθετήστε τα σε πάγο. 40. Προετοιμάστε το ακόλουθο μείγμα qpcr σύμφωνα με τον αριθμό των δειγμάτων υπό επεξεργασία. Όλες οι συγκεντρώσεις αφορούν τον τελικό όγκο της αντίδρασης. Ο Πίνακας 14 περιγράφει το σχήμα διανομής με πιπέτα για την προετοιμασία ενός μείγματος αντιδραστηρίων, υπολογισμένο για την επίτευξη τελικού όγκου αντίδρασης 25 µl. Μπορεί να προετοιμαστεί ένα προ-μείγμα, σύμφωνα με τον αριθμό των αντιδράσεων, χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών (είτε PPC-ABL είτε PPF-PML- RARA bcr1). Συμπεριλαμβάνονται επιπλέον όγκοι για αντιστάθμιση σφάλματος διανομής με πιπέτα. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 31

Πίνακας 14. Προετοιμασία του μείγματος qpcr Συστατικό Κύριο μείγμα TaqMan Universal PCR, 2x Εκκινητές και μείγμα ιχνηθετών, 25x Νερό κατηγορίας εφαρμογώ ν PCR χωρίς νουκλεάση Δείγμα (για προσθήκη στο βήμα 4) Συνολικός όγκος 1 αντίδρασ η (µl) ABL: 14 + 1 αντιδράσει ς (µl) PML-RARA bcr1: 16 + 1 αντιδράσεις (µl) Τελική συγκέντρω ση 12,5 187,5 212,5 1x 1 15 17 1x 6,5 97,5 110,5 5 5 έκαστο 5 έκαστο 25 25 έκαστο 25 έκαστο 41. Χορηγήστε 20 µl από το προ-μείγμα qpcr ανά φρεάτιο. 42. Προσθέστε 5 µl προϊόντος RT (cdna, 100 ng RNA ισοδύναμο) που ελήφθη στην ανάστροφη μεταγραφή (βλ. «Πρωτόκολλο: Συνιστώμενη τυποποιημένη ανάστροφη μεταγραφή κατά EAC», σελίδα 14) στο αντίστοιχο σωληνάριο (συνολικός όγκος 25 µl). 43. Αναμείξτε απαλά, με επαναλαμβανόμενη αναρρόφηση/εξώθηση με πιπέτα. 44. Φορτώστε τα δείγματα στο θερμικό κυκλοποιητή σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. 45. Προγραμματίστε το όργανο SmartCycler με το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 15. 32 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πίνακας 15. Προφίλ θερμοκρασίας Διατήρηση Θερμοκρασία: 50 C Χρόνος: 2 λεπτά Διατήρηση 2 Θερμοκρασία: 95 C Χρόνος: 10 λεπτά Κυκλοποίηση 50 φορές 95 C για 15 δευτερόλεπτα 60 C για 1 λεπτό με λήψη: Μονό 46. Συνιστούμε ένα κατώφλι ρυθμισμένο στο 30. Ξεκινήστε το πρόγραμμα θερμικής κυκλοποίησης, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 15. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 33

Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Αρχή της ανάλυσης δεδομένων Χρησιμοποιώντας τεχνολογία TaqMan, ο αριθμός των κύκλων PCR που απαιτούνται για την ανίχνευση ενός σήματος πάνω από το κατώφλι ονομάζεται κύκλος κατωφλίου (C T ) και είναι ευθέως ανάλογος με την ποσότητα του στόχου που είναι παρών κατά την έναρξη της αντίδρασης. Χρησιμοποιώντας πρότυπα με γνωστό αριθμό μορίων, είναι δυνατή η δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης και ο καθορισμός της ακριβούς ποσότητας του στόχου που είναι παρών στο εξεταζόμενο δείγμα. Οι πρότυπες καμπύλες ipsogen βασίζονται σε πλασμίδια. Χρησιμοποιούμε 3 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα πλασμιδίου για το γονίδιο-μάρτυρα ABL (CG), και 5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα για το γονίδιο σύντηξης (PML-RARA bcr1), προκειμένου να διασφαλίσουμε ακριβείς πρότυπες καμπύλες. Οι εικόνες 7 και 8 δείχνουν ένα παράδειγμα των καμπυλών ενίσχυσης TaqMan που λαμβάνονται με το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1. Εικόνα 7. Ανίχνευση προτύπων ABL (C1, C2, C3). 10 3, 10 4 και 10 5 αντίγραφα/5 µl. 34 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Εικόνα 8. Ανίχνευση προτύπων PML-RARA bcr1 (F1 F5). 10 1, 10 2, 10 3, 10 5 και 10 6 αντίγραφα/5 µl. Αποτελέσματα Πρότυπη καμπύλη και κριτήρια ποιότητας Ανεπεξέργαστα δεδομένα μπορούν να επικολληθούν σε ένα αρχείο Excel για ανάλυση. Για κάθε γονίδιο (ABL και PML-RARA), ανεπεξέργαστες τιμές C T που λαμβάνονται από πρότυπα αραιωμένα διαλύματα πλασμιδίου σχεδιάζονται σύμφωνα με τον αριθμό αντιγράφου log (3, 4 και 5 για C1, C2 και C3, και 1, 2, 3, 5 και 6 για F1, F2, F3, F4 και F5). Η Εικόνα 9 δείχνει ένα παράδειγμα της θεωρητικής καμπύλης που υπολογίζεται σε 5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 35

Εικόνα 9. Θεωρητική καμπύλη υπολογιζόμενη σε 5 πρότυπα αραιωμένα διαλύματα. Μια καμπύλη γραμμικής παλινδρόμησης (y = ax + b) υπολογίζεται για κάθε γονίδιο (ABL και PML-RARA), όπου a είναι η κλίση της γραμμής και b είναι η τομή y, η οποία είναι η συντεταγμένη y του σημείου όπου η γραμμή τέμνει τον άξονα y. Η εξίσωσή της και ο συντελεστής προσδιορισμού (R²) αναγράφονται στο γράφημα. Καθώς τα πρότυπα είναι δεκαπλάσιες αραιώσεις, η θεωρητική κλίση της καμπύλης είναι 3,3. Μια κλίση μεταξύ 3,0 και 3,9 είναι αποδεκτή εφόσον R² είναι >0,95 (6). Ωστόσο, μια τιμή για R² >0,98 είναι επιθυμητή για ακριβή αποτελέσματα (7). Κανονικοποιημένος αριθμός αντιγράφων (NCN) Η εξίσωση πρότυπης καμπύλης ABL πρέπει να χρησιμοποιηθεί για τη μετατροπή ανεπεξέργαστων τιμών C T (που λαμβάνονται με PPC-ABL) για τα άγνωστα δείγματα σε αριθμούς αντιγράφων ABL (ABL CN ). Η εξίσωση πρότυπης καμπύλης PML-RARA πρέπει να χρησιμοποιηθεί για τη μετατροπή ανεπεξέργαστων τιμών C T (που λαμβάνονται με PPF-PML-RARA) για τα άγνωστα δείγματα σε αριθμούς αντιγράφων PML-RARA (PML- RARA CN ). Η αναλογία αυτών των τιμών CN δίνει τον κανονικοποιημένο αριθμό αντιγράφων (NCN): NCN = PML-RARA CN ABL CN Τιμή MRD Η τιμή ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (MRD) είναι η αναλογία μεταξύ της CG-κανονικοποιημένης έκφρασης του FG κατά την παρακολούθηση (FG CN /CG CN ) FUP και των διαγνωστικών δειγμάτων (FG CN /CG CN ) DX. Τιμή MRD (MRDv) = (FG CN /CG CN ) FUP 36 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

(FG CN /CG CN ) DX Ευαισθησία Η ευαισθησία (SENSv) υπολογίζεται σύμφωνα με τη σχετική έκφραση του FG κατά τη διάγνωση (FG CN /CG CN ) DX και την έκφραση του CG (CG CN,FUP ) στο δείγμα παρακολούθησης. Ευαισθησία (SENSv) = CG CN,DX CG CN,FUP x FG CN,DX Έλεγχος ποιότητας στις τιμές ABL Κακή ποιότητα του RNA ή προβλήματα κατά τη διάρκεια των βημάτων qpcr οδηγούν σε χαμηλό ABL CN. Συνιστούμε την απόρριψη των αποτελεσμάτων από δείγματα που δίνουν ABL CN <1318 (τιμή χαμηλότερη από το 95% CI από δείγματα ασθενών στη μελέτη EAC, παραπομπή 5). Αναπαραγωγιμότητα μεταξύ θυγατρικών κλώνων Η διακύμανση στις τιμές C T μεταξύ των θυγατρικών κλώνων πρέπει να είναι <2, που αντιστοιχεί σε μια 4-πλάσια μεταβολή στις τιμές αριθμού αντιγράφων. Η διακύμανση στις τιμές C T μεταξύ των θυγατρικών κλώνων είναι γενικά <1,5 εάν η μέση τιμή C T των θυγατρικών κλώνων είναι <36 (6). Σημείωση: Κάθε χρήστης πρέπει να μετρά τη δική του επαναληψιμότητα στο εκάστοτε εργαστήριο. Μάρτυρες νερού Οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να δίνουν μηδενικό CN. Ένας θετικός μάρτυρας νερού προκύπτει από διασταυρούμενη μόλυνση. Βλ. «Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων», παρακάτω, για να βρείτε μια λύση. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 37

Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αυτός ο οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων μπορεί να σας βοηθήσει στην επίλυση οποιωνδήποτε προβλημάτων που ενδεχομένως προκύψουν. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στη σελίδα Frequently Asked Questions (συχνές ερωτήσεις) του Κέντρου Τεχνικής Υποστήριξης της εταιρείας μας: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. Οι επιστήμονες των Τεχνικών Υπηρεσιών της QIAGEN είναι πάντοτε πρόθυμοι/-ες να απαντήσουν σε οποιεσδήποτε απορίες σας σχετικά με τις πληροφορίες και το πρωτόκολλο αυτού του εγχειριδίου ή τεχνολογίες δειγμάτων και προσδιορισμών (για πληροφορίες επικοινωνίας, βλ. «Πληροφορίες επικοινωνίας», σελίδα 49). Σχόλια και προτάσεις Αρνητικό αποτέλεσμα για το γονίδιο-μάρτυρα (ABL) και το PML-RARA bcr1 σε όλα τα δείγματα το πρότυπο είναι εντάξει α) Κακή ποιότητα RNA Πάντοτε να ελέγχετε την ποιότητα του RNA και τη συγκέντρωση προτού ξεκινήσετε. β) Αποτυχία βήματος ανάστροφης μεταγραφής Εκτελέστε ένα θετικό μάρτυρα RNA κυτταρικής σειράς (κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls, αρ. καταλόγου 672091) παράλληλα. Πάντοτε να ελέγχετε την ποιότητα του RNA και τη συγκέντρωση προτού ξεκινήσετε. Εκτελέστε ένα θετικό μάρτυρα RNA κυτταρικής σειράς (κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls, αρ. καταλόγου 672091) παράλληλα. Αρνητικό αποτέλεσμα για το γονίδιο-μάρτυρα (ABL) στα δείγματα το πρότυπο είναι εντάξει α) Κακή ποιότητα RNA Πάντοτε να ελέγχετε την ποιότητα του RNA και τη συγκέντρωση προτού ξεκινήσετε. β) Αποτυχία βήματος ανάστροφης μεταγραφής Αρνητικό σήμα προτύπου a) Σφάλμα διανομής με πιπέτα Εκτελέστε ένα θετικό μάρτυρα RNA κυτταρικής σειράς (κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls, αρ. καταλόγου 672091) παράλληλα. Πάντοτε να ελέγχετε την ποιότητα του RNA και τη συγκέντρωση προτού ξεκινήσετε. Εκτελέστε ένα θετικό μάρτυρα RNA κυτταρικής σειράς (κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls, αρ. καταλόγου 672091) παράλληλα. Ελέγξτε το σχήμα διανομής με πιπέτα και την προετοιμασία της αντίδρασης. Επαναλάβετε την εκτέλεση PCR. 38 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

b) Ακατάλληλη φύλαξη των συστατικών του κιτ Οι αρνητικοί μάρτυρες είναι θετικοί Διασταυρούμενη μόλυνση Σχόλια και προτάσεις Φυλάσσετε το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 στους 15 έως 30 C και διατηρείτε τους εκκινητές και τα μείγματα ανιχνευτών (PPC και PPF) προστατευμένα από το φως. Βλ. «Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων», σελίδα 12. Αποφεύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη. Φυλάσσετε τα αντιδραστήρια σε κλάσματα. Αντικαταστήστε όλα τα κρίσιμα αντιδραστήρια. Επαναλάβετε το πείραμα με νέα κλάσματα όλων των αντιδραστηρίων. Πάντοτε να χειρίζεστε τα δείγματα, τα συστατικά του κιτ και τα αναλώσιμα σύμφωνα με τις κοινώς αποδεκτές πρακτικές προκειμένου να αποφύγετε επιμόλυνση από μεταφορά. Απουσία σήματος, ακόμα και στους πρότυπους μάρτυρες a) Σφάλμα διανομής με πιπέτα ή παράλειψη αντιδραστηρίων b) Ανασταλτικές επιδράσεις του υλικού του δείγματος, προκαλούμενες από ανεπαρκή καθαρισμό c) LightCycler: Επιλέχθηκε λανθασμένο κανάλι ανίχνευσης d) LightCycler: Δεν προγραμματίστηκε λήψη δεδομένων Ελέγξτε το σχήμα διανομής με πιπέτα και την προετοιμασία της αντίδρασης. Επαναλάβετε την εκτέλεση PCR. Επαναλάβετε την προετοιμασία RNA. Ορίστε τη ρύθμιση καναλιού σε F1/F2 ή 530 nm/640 nm. Ελέγξτε τα προγράμματα κύκλων. Επιλέξτε τη λειτουργία λήψης «SINGLE» (μονό) στο τέλος κάθε τμήματος ανασύνδεσης του προγράμματος PCR. Απουσία σήματος ή χαμηλό σήμα στα δείγματα αλλά οι πρότυποι μάρτυρες είναι εντάξει Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 39

α) Κακή ποιότητα RNA ή χαμηλή συγκέντρωση β) Αποτυχία βήματος ανάστροφης μεταγραφής Σχόλια και προτάσεις Η ένταση του φθορισμού είναι πολύ χαμηλή a) Ακατάλληλη φύλαξη των συστατικών του κιτ b) Πολύ χαμηλή αρχική ποσότητα RNA-στόχου LightCycler: Η ένταση φθορισμού ποικίλλει a) Σφάλμα διανομής με πιπέτα b) Ανεπαρκής φυγοκέντριση των τριχοειδών Πάντοτε να ελέγχετε την ποιότητα του RNA και τη συγκέντρωση προτού ξεκινήσετε. Εκτελέστε ένα θετικό μάρτυρα RNA κυτταρικής σειράς (κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls, αρ. καταλόγου 672091) παράλληλα. Πάντοτε να ελέγχετε την ποιότητα του RNA και τη συγκέντρωση προτού ξεκινήσετε. Εκτελέστε ένα θετικό μάρτυρα RNA κυτταρικής σειράς (κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls, αρ. καταλόγου 672091) παράλληλα. Φυλάσσετε το κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 στους 15 έως 30 C και διατηρείτε τους εκκινητές και τα μείγματα ανιχνευτών (PPC και PPF) προστατευμένα από το φως. Βλ. «Φύλαξη και χειρισμός αντιδραστηρίων», σελίδα 12. Αποφεύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη. Φυλάσσετε τα αντιδραστήρια σε κλάσματα. Αυξήστε την ποσότητα του RNA δείγματος. Σημείωση: Ανάλογα με την επιλεγμένη μέθοδο προετοιμασίας RNA, ενδέχεται να υπάρξουν ανασταλτικές επιδράσεις. Η διακύμανση που προκαλείται από το επονομαζόμενο «σφάλμα διανομής με πιπέτα» μπορεί να μειωθεί αναλύοντας τα δεδομένα στη λειτουργία F1/F2 ή 530 nm/640 nm. Το προετοιμασμένο μείγμα PCR μπορεί ακόμα να βρίσκεται στο επάνω δοχείο του τριχοειδούς, ή φυσαλίδα αέρα εγκλωβισμένη στο άκρο του τριχοειδούς. Πάντοτε να φυγοκεντρίζετε τα τριχοειδή φορτωμένα με το μείγμα της αντίδρασης, όπως περιγράφεται στο ειδικό εγχειρίδιο χρήσης της συσκευής. 40 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

c) Η εξωτερική επιφάνεια του άκρου του τριχοειδούς είναι βρώμικη Σχόλια και προτάσεις LightCycler: Σφάλμα της πρότυπης καμπύλης Σφάλμα διανομής με πιπέτα Πάντοτε να φοράτε γάντια όταν χειρίζεστε τα τριχοειδή. Η διακύμανση που προκαλείται από το επονομαζόμενο «σφάλμα διανομής με πιπέτα» μπορεί να μειωθεί αναλύοντας τα δεδομένα στη λειτουργία F1/F2 ή 530 nm/640 nm. Ποιοτικός έλεγχος Ποιοτικός έλεγχος ολόκληρου του κιτ διενεργήθηκε σε ένα όργανο LightCycler 480. Αυτό το κιτ παράγεται σύμφωνα με το πρότυπο ISO 13485:2003. Πιστοποιητικά ανάλυσης είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος στο www.qiagen.com/support/. Περιορισμοί Οι χρήστες πρέπει να έχουν εκπαιδευτεί και εξοικειωθεί με την τεχνολογία πριν από τη χρήση αυτής της συσκευής. Αυτό το κιτ πρέπει να χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται στο παρόν εγχειρίδιο, σε συνδυασμό με ένα επικυρωμένο όργανο που αναφέρεται στην ενότητα «Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται», σελίδα 10. Κάθε παραγόμενο διαγνωστικό αποτέλεσμα θα πρέπει να ερμηνεύεται στο πλαίσιο των υπόλοιπων κλινικών ή εργαστηριακών ευρημάτων. Η επαλήθευση της απόδοσης του συστήματος για οποιεσδήποτε διαδικασίες που εφαρμόζονται στο εκάστοτε εργαστήριο και δεν καλύπτονται από τις μελέτες αξιολόγησης απόδοσης της QIAGEN αποτελούν ευθύνη του χρήστη. Δώστε προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στο κουτί και στις ετικέτες όλων των συστατικών. Μη χρησιμοποιείτε τα συστατικά μετά την ημερομηνία λήξης τους. Σημείωση: Το κιτ έχει σχεδιαστεί σύμφωνα με τις μελέτες «Europe Against Cancer» (Η Ευρώπη κατά του καρκίνου, EAC) (4, 5). Πρέπει να χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται στο παρόν εγχειρίδιο, σε συνδυασμό με επικυρωμένα αντιδραστήρια και όργανα. Οποιαδήποτε μη προβλεπόμενη χρήση αυτού του προϊόντος ή/και τροποποίηση των συστατικών θα επισύρει ακύρωση της ευθύνης της QIAGEN. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 41

Χαρακτηριστικά απόδοσης Μη κλινικές μελέτες Υλικά και μέθοδοι Η αξιολόγηση της απόδοσης διενεργήθηκε σε ένα ABI PRISM 7700 SDS, σε συνδυασμό με αντιδραστήρια που παρατίθενται στην ενότητα «Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται», σελίδα 10. Μελέτες ισοδυναμίας επικύρωσαν τη χρήση του στα ακόλουθα όργανα: ABI PRISM 7000 και 7900HT SDS, LightCycler 1.2 και 480, Rotor-Gene 3000, και SmartCycler. Μη κλινικές μελέτες διενεργήθηκαν για τον καθορισμό της αναλυτικής απόδοσης του κιτ ipsogen PML-RARA bcr1. Αυτές οι μη κλινικές εργαστηριακές μελέτες διενεργήθηκαν σε ολικό RNA από την NB4 κυτταρική σειρά αραιωμένο σε μια σταθερή τελική ποσότητα ολικού RNA MV4-11 κυτταρικής σειράς. Για τον καθορισμό της επαναληψιμότητας του προσδιορισμού, 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις του NB4 ολικού RNA (5 ng, 500 pg, 50 pg, 5 pg και 0,5 pg) αραιωμένες σε MV4-11 ολικό RNA, σε σταθερό τελικό συνολικό όγκο 200 ng, αναλύθηκαν σε 5 θυγατρικούς κλώνους ανά εκτέλεση και σε 4 διαφορετικές εκτελέσεις. Τα δείγματα με 5 pg και 0,5 pg NB4 RNA σε MV4-11 RNA ήταν πολύ χαμηλά για να δώσουν αποτελέσματα (Εικόνα 10). Εικόνα 10. Διαγράμματα ενίσχυσης αραιώσεων 2,5 x 10 2 (5 ng), 2,5 x 10 3 (0,5 ng) και 2,5 x 10 4 (0,05 ng) NB4 ολικού RNA σε MV4-11 αρνητικό ολικό RNA. Αναλυτικά δεδομένα Οι Πίνακες 16 19 δείχνουν τις αναλύσεις μεταξύ προσδιορισμών με το μέσο κύκλο κατωφλίου (C T ), τυπική απόκλιση (ΤΑ), αριθμό δειγμάτων (n), συντελεστή διακύμανσης (ΣΔ), μέσο αριθμό αντιγράφων (CN), και μέσο κανονικοποιημένο αριθμό αντιγράφων (NCN). 42 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πίνακας 16. Ανάλυση μεταξύ και εντός προσδιορισμών κυτταρικές σειρές PML-RARA και ABL Κυτταρική σειρά PML- RARA Αραίωση Ανάλυση μεταξύ προσδιορισμών Μέσος C T ΤΑ n ΣΔ (%) Ανάλυση εντός προσδιορισμών Ελάχ. ΣΔ Μέγ. ΣΔ 5 ng 29,86 0,29 20 0,98 0,32 1,42 0,5 ng 33,70 0,48 20 1,42 0,56 2,16 0,05 ng 37,03 0,37 18 1,01 1,07 2,03 ABL 24,06 0,22 100 0,92 0,15 2,31 Πίνακας 17. Ανάλυση μεταξύ προσδιορισμών πλασμίδια Γονίδιο PML- RARA ABL Πλασμίδιο Μέσος C T ΤΑ n ΣΔ (%) F1 (10 1 αντίγραφα) 35,95 0,29 8 0,79 F2 (10 2 αντίγραφα) 32,25 0,59 8 1,84 F3 (10 3 αντίγραφα) 28,71 0,55 8 1,90 F4 (10 5 αντίγραφα) 22,14 0,49 7 2,23 F5 (10 6 αντίγραφα) 18,64 0,72 8 3,84 C1 (10 3 αντίγραφα) 28,85 0,76 7 2,62 C2 (10 4 αντίγραφα) 25,25 0,71 8 2,82 C3 (10 5 αντίγραφα) 21,74 0,81 8 3,74 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 43

Πίνακας 18. Ανάλυση μεταξύ προσδιορισμών κυτταρικές σειρές PML- RARA bcr1 και ABL (μέσος CN) Κυτταρική σειρά PML- RARA bcr1 Αραίωση 2,5 x 10 2 (5 ng/200 µg) 2,5 x 10-3 (0,5 ng/200 ng) 2,5 x 10 4 (0,05 ng/200 ng) Μέσος CN ΤΑ n ΣΔ (%) 583,95 149,19 20 25,55 44,98 12,25 20 27,23 4,91 1,55 19 31,52 ABL 35.171,47 22.448,3 99 63,83 Πίνακας 19. Ανάλυση μεταξύ προσδιορισμών κυτταρική σειρά PML- RARA bcr1 (μέσος NCN) Κυτταρική σειρά PML-RARA bcr1 Αραίωση 2,5 x 10 2 (5 ng/200 ng) 2,5 x 10 3 (0,5 ng/200 ng) 2,5 x 10 4 (0,05 ng/200 ng) Μέσος NCN* ΤΑ n ΣΔ (%) 271,4 150,00 20 55,56 15,35 8,12 20 52,87 1,66 0,91 18 55,14 * Για αυτά τα αποτελέσματα μελέτης μόνο, ο NCN δίνεται ως PML-RARA bcr1 CN ABL CN x 10.000. Κλινικές μελέτες Η αξιολόγηση της απόδοσης διενεργήθηκε σε ένα ABI PRISM 7700 SDS, σε συνδυασμό με αντιδραστήρια που παρατίθενται στην ενότητα «Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται», σελίδα 10. Μελέτες ισοδυναμίας επικύρωσαν τη χρήση του στα ακόλουθα όργανα: ABI PRISM 7000 και 7900HT SDS, LightCycler 1.2 και 480, Rotor-Gene 3000, και SmartCycler. Μια ομάδα 26 εργαστηρίων, σε 10 Ευρωπαϊκές χώρες, οργανωμένα σε μια συντονισμένη δράση του EAC, χρησιμοποίησαν πλασμίδια παρεχόμενα από την ipsogen για να καθορίσουν ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο για την ανάλυση qpcr των κύριων σχετιζόμενων με τη λευχαιμία γονιδίων σύντηξης στο κλινικό περιβάλλον. Το μεταγράφημα PML-RARA bcr1 ήταν ένα από τα γονίδια σύντηξης (FG) που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Παρουσιάζουμε εδώ 44 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

μια σύνοψη αυτής της μελέτης επικύρωσης. Τα πλήρη αποτελέσματα έχουν δημοσιεύθηκαν το 2003 (1, 2). Επαναληψιμότητα μεταξύ εργαστηρίων για τα πρότυπα πλασμιδίων CG και FG Ένα σύνολο 11 εργαστηρίων πραγματοποίησαν ένα πείραμα επαναληψιμότητας μεταξύ εργαστηρίων για την αξιολόγηση της διακύμανσης στη μέτρηση των πρότυπων αραιωμένων διαλυμάτων πλασμιδίων CG και FG. Τα αραιωμένα διαλύματα εκτελέστηκαν εις διπλούν σε κάθε εγκατάσταση. Ο Πίνακας 20 αναφέρει τη μέση τιμή, την τυπική απόκλιση και τον ΣΔ (%) για κάθε αραιωμένο διάλυμα. Πίνακας 20. Επαναληψιμότητα μεταξύ εργαστηρίων για τα πρότυπα πλασμιδίων CG και FG Γονίδιο Γονίδιο-μάρτυρας ABL Γονίδιο σύντηξης PML- RARA bcr1 Αραίωση Μέσος όρος C T ΤΑ ΣΔ (%) C1 29,26 0,69 2,31 C2 25,79 0,65 2,53 C3 22,40 0,61 2,70 F1 35,84 0,79 2,21 F2 32,47 0,49 1,50 F3 28,91 0,34 1,17 F4 21,82 0,30 1,40 F5 18,47 0,29 1,55 Τιμές έκφρασης του μεταγραφήματος PML-RARA bcr1 FG Οι Πίνακες 21 και 22 δείχνουν τις τιμές έκφρασης μεταγραφήματος PML-RARA bcr1 FG και ABL CG, για την NB4 κυτταρική σειρά, σε ασθενείς με APL κατά τη διάγνωση, και για αρνητικούς ασθενείς-μάρτυρες. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 45

Πίνακας 21. Τιμές έκφρασης του μεταγραφήματος PML-RARA bcr1 FG και ABL CG Τιμές C T PML-RARA bcr1 Τιμές C T (95% εύρος) ABL NB4 κυτταρική σειρά 24,7 23,7 Δείγματα ασθενών με APL Μυελός των οστών (n = 14) 25,6 (23,1 27,5) 24,4 (21,7 28,5) Περιφερικό αίμα (n = 9) 25,7 (23,7 29,4) 24,6 (22,0 27,4) Αρνητικά δείγματα ασθενών Μυελός των οστών (n = 26) 25,35 (24,68 26,02) Περιφερικό αίμα (n = 74) 25,15 (24,83 25,48) Οι τιμές ABL CT δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των φυσιολογικών και των λευχαιμικών δειγμάτων, ούτε μεταξύ των τύπων δειγμάτων (περιφερικό αίμα ή μυελός των οστών) ή των λευχαιμικών δειγμάτων από ασθενείς που διαγνώσθηκαν με APL. 46 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Πίνακας 22. Τιμές έκφρασης του μεταγραφήματος PML-RARA bcr1 FG και ABL CG Τιμές CN και NCN Δείγματα ασθενών Μυελός των οστών (n = 14) Περιφερικό αίμα (n = 9) Τιμές CN (95% εύρος) PML-RARA bcr1 5.129 (1.480 25.704) 3.891 (475 14.454) Αρνητικά δείγματα ασθενών Μυελός των οστών (n = 26) Περιφερικό αίμα (n = 74) ABL 1.538,7 (133,2 46.781,28) 1400,76 (50,27 11.274) 19.201 (12.922 25.480) 21.136 (17.834 24.437) Τιμές NCN (95% εύρος) CN bcr1/ CN ABL 0,30 (0,09 1,82) 0,36 (0,11 0,78) Ποσοστά ψευδών θετικών και ψευδών αρνητικών Τα ποσοστά των ψευδών θετικών και ψευδών αρνητικών υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους μάρτυρες. Θετικοί μάρτυρες: NB4 κύτταρα, μια κυτταρική σειρά γνωστή για τη θετικότητά της για PML-RARA bcr1 FG. Δείγματα ασθενών ήδη αξιολογημένα για θετικότητα σε PML-RARA bcr1 Αρνητικοί μάρτυρες: Αρνητικά δείγματα RNA, μάρτυρες μη ενίσχυσης (NAC) από E. coli RNA αντί για ανθρώπινο RNA για τον έλεγχο για επιμόλυνση PCR, και μάρτυρες χωρίς μήτρα (NTC), οι οποίοι περιείχαν νερό αντί για ανθρώπινο RNA Ενίσχυση στα δείγματα RNA του FG διενεργήθηκε εις τριπλούν, και εις διπλούν για CG. Ένα ψευδές αρνητικό δείγμα ορίστηκε ως ένα θετικό δείγμα RNA με λιγότερο από 50% θετικών φρεατίων (0/2, 0/3 ή 1/3). Ένα ψευδές θετικό δείγμα ορίστηκε ως ένα αρνητικό δείγμα με τουλάχιστον 50% θετικών φρεατίων (1/2, 2/3 ή 3/3). Ο Πίνακας 23 δείχνει τον αριθμό και το ποσοστό των ψευδών αρνητικών και ψευδών θετικών δειγμάτων. Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 47

Πίνακας 23. Ψευδή αρνητικά και ψευδή θετικά δείγματα Ψευδής αρνητικότητα Ψευδής θετικότητα 10 3 10 4 FG Αρνητικός μάρτυρας NAC/NTC 0% (0/29) 0% (0/28) 11% (5/45) 5% (5/120) Βιβλιογραφία Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη, ενημερωμένη online βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιεύσεων στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν προϊόντα της QIAGEN. Με τις εύχρηστες δυνατότητες αναζήτησης μπορείτε να βρείτε τα άρθρα που αναζητάτε είτε με απλή αναζήτηση λέξης-κλειδιού ή ορίζοντας την εφαρμογή, τον ερευνητικό τομέα, τον τίτλο κτλ. Για ένα πλήρη κατάλογο της βιβλιογραφίας, επισκεφθείτε την online βιβλιογραφική βάση δεδομένων της QIAGEN (Reference Database) στη διεύθυνση www.qiagen.com/refdb/search.asp ή επικοινωνήστε με τις Τεχνικές Υπηρεσίες της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. Παρατιθέμενη βιβλιογραφία 1. Santamarie, C. et al. (2007) Using quantification of the PML-RARalpha transcript to stratify the risk of relapse in patients with acute promyelocytic leukemia. Haematologica 92, 315. 2. Kern, W. et al. (2004) Monitoring of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Atlas Genet. Cytogenet. Oncol. Haematol. 112, 4. 3. Lo-Coco, F. and Ammantuna, E. (2006) The biology of acute promyelocytic leukemia and its impact on diagnosis and treatment. Hematology ASH Educ. Program 514, 156. 4. Beillard, E. et al. (2003) Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using real-time quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program. Leukemia 17, 2474. 5. Gabert, J. et al. (2003) Standardization and quality control studies of 'realtime' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia a Europe Against Cancer program. Leukemia 17, 2318. 6. van der Velden, V.H. et al. (2003) Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects. Leukemia 17, 1013. 48 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

7. Branford, S. et al. (2006) Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukemia. Leukemia 20, 1925. Σύμβολα Τα ακόλουθα σύμβολα μπορεί να εμφανίζονται στη συσκευασία και στην επισήμανση: <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <Ν> αντιδράσεις Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολoγικό προϊόν Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Διεθνής Κωδικός Μονάδων Εμπορίας Περιορισμός θερμοκρασίας Κατασκευαστής Συμβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης Πληροφορίες επικοινωνίας Για θέματα τεχνικής υποστήριξης και περαιτέρω πληροφορίες, επισκεφθείτε το Κέντρο Τεχνικής Υποστήριξης στη διεύθυνση www.qiagen.com/support, καλέστε 00800-22-44-6000 ή επικοινωνήστε με κάποιο από τα Τμήματα Τεχνικής Εξυπηρέτησης της QIAGEN ή με τους τοπικούς αντιπροσώπους (βλ. οπισθόφυλλο ή επισκεφθείτε τη διεύθυνση www.qiagen.com). Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 49

Πληροφορίες παραγγελίας Προϊόν Περιεχόμενα Αρ. καταλ. ipsogen PML-RARA bcr1 Kit (24) Για 24 αντιδράσεις: Πρότυπα γονιδίουμάρτυρα ABL, πρότυπα γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1, εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών ABL, εκκινητές και μείγμα ανιχνευτών γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1 Rotor-Gene Q MDx για επικυρωμένη για IVD ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου σε κλινικές εφαρμογές Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Melt υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, μπορντώ) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα, εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και την εργασία, δεν περιλαμβάνει εγκατάσταση και κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Melt υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, μπορντώ) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα, εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και την εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση Κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 Controls για ποσοτική επικύρωση της εκχύλισης RNA και της ανάστροφης μεταγραφής του γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1 ipsogen PML-RARA bcr1 Controls Kit Κυτταρικές σειρές με αρνητική, υψηλή και χαμηλή θετική έκφραση του γονιδίου σύντηξης PML-RARA bcr1 672123 9002032 9002033 672091 Για τις τρέχουσες πληροφορίες άδειας και αποποιήσεις σχετικά με συγκεκριμένα προϊόντα, ανατρέξτε στο σχετικό εγχειρίδιο ή οδηγίες χρήσης του κιτ QIAGEN. Τα εγχειρίδια και οι οδηγίες χρήσης των κιτ QIAGEN είναι διαθέσιμα στη διεύθυνση www.qiagen.com. Μπορείτε επίσης να τα ζητήσετε από τις Τεχνικές Υπηρεσίες της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. 50 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 51

Αυτή η σελίδα έχει παραμείνει σκοπίμως κενή 52 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Αυτή η σελίδα έχει παραμείνει σκοπίμως κενή Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015 53

Αυτή η σελίδα έχει παραμείνει σκοπίμως κενή 54 Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 03/2015

Αυτό το προϊόν προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. Τα προϊόντα ipsogen δεν επιτρέπεται να μεταπωληθούν, να τροποποιηθούν για μεταπώληση ή να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή εμπορικών προϊόντων χωρίς την έγγραφη έγκριση της QIAGEN. Οι πληροφορίες στο παρόν έγγραφο μπορεί να αλλάξουν χωρίς προειδοποίηση. Η QIAGEN δεν αναλαμβάνει καμία ευθύνη για τυχόν σφάλματα που μπορεί να περιέχονται σε αυτό το έγγραφο. Αυτό το έγγραφο θεωρείται ότι είναι πλήρες και ακριβές κατά το χρόνο της δημοσίευσης. Σε καμία περίπτωση η QIAGEN δεν ευθύνεται για τυχαίες, ειδικές, πολλαπλές ή επακόλουθες ζημίες σε σχέση με, ή που προκύπτουν από τη χρήση αυτού του εγγράφου. Τα προϊόντα ipsogen είναι εγγυημένα ότι πληρούν τις δηλωμένες προδιαγραφές τους. Η αποκλειστική υποχρέωση της QIAGEN και η αποκλειστική αποκατάσταση του πελάτη περιορίζονται στην αντικατάσταση των προϊόντων δωρεάν σε περίπτωση που η απόδοση των προϊόντων αυτών δεν είναι η προβλεπόμενη. Trademarks: QIAGEN, ipsogen, Rotor-Gene (Όμιλος QIAGEN) ABI PRISM, Applied Biosystems, FAM, RNaseOUT, SuperScript, SYBR, TAMRA (Life Technologies Corporation) Agilent, Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) Excel (Microsoft Corporation) LightCycler, TaqMan (Όμιλος Roche) SmartCycler (Cepheid). Άδεια περιορισμένης χρήσης Η χρήση αυτού του προϊόντος ισοδυναμεί με την αποδοχή από πλευράς οποιουδήποτε αγοραστή ή χρήστη του κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 των εξής όρων: 1. Η χρήση του κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 επιτρέπεται μόνο σύμφωνα με το Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 και μόνο μαζί με τα συστατικά που περιέχει το κιτ. Η QIAGEN δεν παρέχει άδεια χρήσης υπό οποιαδήποτε πνευματική ιδιοκτησία της για τη χρήση ή ενσωμάτωση των παρεχόμενων συστατικών αυτού του κιτ σε οποιαδήποτε συστατικά που δεν περιλαμβάνονται σε αυτό το κιτ, εκτός και αν περιγράφεται διαφορετικά στο Εγχειρίδιο κιτ ipsogen PML-RARA bcr1 και πρόσθετα πρωτόκολλα στη διεύθυνση www.qiagen.com. 2. Με την εξαίρεση των ρητά αναφερόμενων αδειών, η QIAGEN δεν παρέχει καμία εγγύηση πως αυτό το κιτ και/ή η χρήση/-εις του δεν παραβιάζουν τα δικαιώματα τρίτων. 3. Αυτό το κιτ και τα συστατικά του φέρουν άδεια χρήσης για μία μόνο χρήση και δεν επιτρέπεται η επανάχρηση, η εκ νέου επεξεργασία ή η μεταπώλησή του. 4. Η QIAGEN αποποιείται ειδικά οποιεσδήποτε άλλες άδειες, ρητές ή έμμεσες εκτός από αυτές που αναφέρονται ρητά. 5. Ο αγοραστής ή ο χρήστης του κιτ συμφωνεί να μην προβεί και να μην επιτρέψει σε κανέναν άλλο να προβεί σε οποιεσδήποτε ενέργειες που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ή να διευκολύνουν οποιεσδήποτε πράξεις που απαγορεύονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα. Η QIAGEN διατηρεί το δικαίωμα να επιβάλλει τις απαγορεύσεις της παρούσας Άδειας περιορισμένης χρήσης σε οποιοδήποτε δικαστήριο και θα αποζημιωθεί για όλες τις δαπάνες ανάκρισης και δικαστηρίου, συμπεριλαμβανομένων των δαπανών υπεράσπισης στο πλαίσιο οποιασδήποτε ενέργειας για την επιβολή αυτής της Άδειας περιορισμένης χρήσης ή οποιουδήποτε των πνευματικών δικαιωμάτων της σχετικά με το κιτ και/ή τα συστατικά του. Για τους ενημερωμένους όρους της άδειας, βλ. www.qiagen.com. HB-1358-003 2013 2015 QIAGEN, με την επιφύλαξη κάθε δικαιώματος.

www.qiagen.com Australia techservice-au@qiagen.com Austria techservice-at@qiagen.com Belgium techservice-bnl@qiagen.com Brazil suportetecnico.brasil@qiagen.com Canada techservice-ca@qiagen.com China techservice-cn@qiagen.com Denmark techservice-nordic@qiagen.com Finland techservice-nordic@qiagen.com France techservice-fr@qiagen.com Germany techservice-de@qiagen.com Hong Kong techservice-hk@qiagen.com India techservice-india@qiagen.com Ireland techservice-uk@qiagen.com Italy techservice-it@qiagen.com Japan techservice-jp@qiagen.com Korea (South) techservice-kr@qiagen.com Luxembourg techservice-bnl@qiagen.com Mexico techservice-mx@qiagen.com The Netherlands techservice-bnl@qiagen.com Norway techservice-nordic@qiagen.com Singapore techservice-sg@qiagen.com Sweden techservice-nordic@qiagen.com Switzerland techservice-ch@qiagen.com UK techservice-uk@qiagen.com USA techservice-us@qiagen.com 1072512 151019183 Sample & Assay Technologies