QUANTA Lite TM ANA ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM ANA ELISA 708750 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM ANA αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντι-πυρηνικών αντισωμάτων (ANA) σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αυτών των αντισωμάτων μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλα ορολογικά τεστ και κλινικά ευρήματα με σκοπό τη διάγνωση ρευματικών ασθενειών όπως του συστηματικού ερυθηματώδoυς λύκου (SLE), σύνδρομο Sjögren s, σκληρόδερμα και άλλων σχετικών μολύνσεων του συνδετικού ιστού. Η διαδικασία συλλογικά ανιχνεύει σε ένα πηγαδάκι ολικό ΑΝΑ έναντι χρωματίνης DNA διπλής έλικας (dsdna) και ιστόνη (histone) Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, κεντρομερίδιο και PCNA καθώς και αντισώματα κυτταροπλασματικού αντιγόνου ως τα Jo-1, μιτοχόνδρια (Μ-2) και ριβοσώματα(ribosomal-p) πρωτεϊνης. Ορός θετικός για απροσδιόριστα αντιγόνα με τη μέθοδο Εμμεσου Ανοσοφθορισμού (IFA) σε κύτταρα HEp-2 μπορεί να ελεγχθεί. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Η παρουσία είναι ξεχωριστό χαρακτηριστικό συστηματικών αυτοάνοσων ασθενειών. 1-4 Τυπικά τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA) ανιχνεύονται με τη μέθοδο Εμμεσου Ανοσοφθορισμού (IFA) σε κύτταρα νεφρού ποντικού (mouse kidney) ή σε κύτταρα HEp-2 σαν υπόστρωμα. 3 Επιπλέον έλεγχοι σε ΑΝΑ θετικούς ορούς με μεθόδους ELISA, ανοσοαποτύπωση Western, ή ανοσοκατακρήμνιση μπορούν να χρησιμιποιηθούν για τον προσδιορισμό ειδικών αντισωμάτων στον ορό. 1-4 Προσφάτως ένα μίγμα διαγνωστικώς σημαντικών αντιγόνων μαζί με κύτταρα HEp-2 έχουν χρησιμοποιηθεί για ανίχνευση ΑΝΑ. 5-9 Τα πλεονεκτήματα της ανοσοενζυματικής μεθόδου ELISA έναντι του Εμμεσου Ανοσοφθορισμού IFA περιλαμβάνουν εύκολη εκτέλεση, ημιποσοτικά αποτελέσματα και αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Τα μειονεκτήματα της ανάλυσης ELISA σε σύγκριση με την ανάλυση IFA συμπεριλαμβάνουν απουσία ευαισθησίας σε άγνωστα πυρηνικά και κυτοπλασμικά αντιγόνα, και απουσία μοτίβου ANA, το οποίο έχει αναφερθεί για IFA. Όμως η διαγνωστική ωφέλεια των ΑΝΑ άγνωστης ειδικότητας δεν είναι ενφανής καθότι πολλοί υγειείς άνθρωποι είναι θετικοί κατά ΑΝΑ αλλά αρνητικοί σε διαγνωστικώς σημαντικά αυτοαντισώματα. 10-12 Επιπλέον αφότου η ειδική αντίδραση εντοπισθεί τα ΑΝΑ δεν είναι πλέον σημαντικά για τη διάγνωση. Έτσι η μέθοδος ΑΝΑ ELISA έχει χρησιμότητα στο κλινικό εργαστήριο. Αρχη Μεθοδου Υψηλώς κεκκαθαρμένα ανεξάρτητα αντιγόνα από πυρήνες και πυρινίσκους HEp-2 είναι συνδεδεμένα σε πηγαδάκια μικροπλάκας. Τα αντιγόνα συμπεριλαμβανομένων της χρωματίνης (dsdna & Histones) Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, κεντρομεριδίου (centromere), PCNA, Jo-1, μιτοχόνδρια (Μ2), και ριβοσώματα-p πρωτεϊνη. Η αντίδραση αντι-χρωματίνης έχει προσφάτως αποδειχθεί ότι είναι ευαίσθητη και πρόσφατος δείκτης για SLE. 13 Έτοιμοι μάρτυρες (control) και αραιωμένος ορός ασθενούς προσθέτονται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο αντιπυρηνικό αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο του δείγματος ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων (conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετριέται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται. Η επεξεργασία μπορεί να κριθεί με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια μαρτύρων (control). Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με πυρηνικά και κυτταροπλασματικού αντιγόνα (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα στο πυρηνικά και κυτταροπλασματικού αντιγόνα) 3. ANA ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο σto πυρηνικά και κυτταροπλασματικού αντιγόνου, προαραιωμένο, 1.2ml 4. ANA ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο σto πυρηνικά και κυτταροπλασματικού αντιγόνου, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml 1

Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 14 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. 2

Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 ANA ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος ANA Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος ANA High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Αραιώστε 1:41 κάθε δείγμα ασθενή προσθέτοντας 10μLδείγματος σε 400μL ANA (sample diluent) διάλυμα αραίωσης. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. Τα Σημ: αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται μέσα σε 8 ώρες από την παρασκευή τους. Δείγματα αραιωμένα 1:41 σε ΑΝΑ αραιωτικό (Sample Diluent) μπορούν να τοποθετηθούν απευθείας στα πηγαδάκια με υπόστρωμα HEp-2 για επιβεβαίωση του θετικού και προσδιορισμό ΑΝΑ. Τα θετικά δείγματα μπορούν να τιτλοποιηθούν ως προς το τελικό σημείο χρησιμοποιώντας PBS σαν αραιωτικό. Αρχική αραίωση δείγματος εκτός της 1:41 στο αραιωτικό δεν έχει επαληθευθεί. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HS HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 3

5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.15. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.15. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυ NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του ANA ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του ANA ELISA Low. Η τιμή του ANA ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X ANA oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. ANA ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί μετά να ταξινομηθεί σαν αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον πίνακα παρακάτω. Mονάδες Αρνητικό <20 Ενδιάμεσο θετικό 20-60 Ισχυρώς θετικό >60 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει την παρουσία αντισωμάτων ANA και ενισχύει την πιθανότητα ρευματικών νόσων όπως συστηματικός ερυθυματώδης λύκος, σύνδρομο Sjörgen, σκληροδερμία, ή/και μικτή νόσος του συνδετικού ιστού. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι κανένα από τα εξεταζόμενα αντισώματα δεν είναι παρόν ή ότι βρίσκονται κάτω από τα επίπεδα της αρνητικής οριακής τιμής για την ανάλυση. 4

3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA. Οι τιμές ANA που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία ανοσοποιητικών περιπλοκών ή άλλων ανοσοσφαιρινών πρόσθετων στο δείγμα των ασθενών μπορεί να προκαλέσει ανεπτυγμένο ανακριβή σύνδεση και να παράγει ψευδώς θετικά σε αυτήν την δοκιμασία. 2. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με νόσο Συνδετικού ιστού θετικοί σε αντιπυρηνικά αντισώματα. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της επεξεργασίας πρέπει να είναι σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ευρήματα και ορολογικούς ελέγχους. 4. Η ειδικότητα του αντιντιδρώντος ορού δεν μπορεί να προσδιορισθεί με αυτή τη διαδικασία. Επιπλέον διαδικασίες για τον προσδιορισμό ειδικών αντισωμάτων απαιτούνται. 5. Τα ΑΝΑ ELISA High Υψηλός πρότυπους ορούς καί ΑΝΑ ELISA Low Χαμηλός πρότυπους ορούς περιλαμβάνουν θετικό κατά RNP. To αντιγόνο αυτό είναι πολύ ευαίσθητο για τη διάσπαση. Έτσι οι μάρτυρες είναι ευαίθητος δείκτης της ακεραιότητας του αντιγόνου. Άλλοι μάρτυρες μπορούν να προστεθούν για τον έλεγχο της στάθμης άλλων αντιγόνων. 6. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Τιμές Το διαχωριστικό όριο μεταξύ θετικού και αρνητικού αποτελέσματος είναι οι 20 μονάδες (units). Δείγματα 246 εθελοντών εξετάσθηκαν. 65% αυτών ήταν γυναίκες με ηλικία 18 75 και μέσο όρο 38 ετών. 23 (9.4%) ήταν θετικά αποδίδοντας ειδικότητα 90.6%. Όμως 6 από τά ELISA θετικά δείγματα ήταν επίσης θετικά με Έμμεσο Ανοσοφθορισμό IFA σε κύτταρα HEp-2, συμπεριλαμβανομένων δύο θετικών δειγμάτων 40 και 50 μονάδων. Λαμβάνοντας 6 ΑΝΑ θετικά δείγματα από υγιείς εθελοντές μόνο 6.9% ήταν βιολογικά ψευδώς θετικά. Τα υπόλοιπα θετικά από τους υγιείς εθελοντές ήταν όλα 35 μονάδες ή μικρότερα. Περίπου 60% από τους υγιείς εθελοντές ήταν κάτω των 10 μονάδων. Συσχέτιση Ευαισθησίας και Ειδικότητας Σύγκριση μεταξύ άλλης εμπορικης μεθόδου ΑΝΑ ELISA Κλινικώς προσδιοριζόμενα δείγματα ελέγχθησαν και με τις την INOVA ANA ELISA και με την άλλη εμπορική ANA ELISA. Τά αποτελέσματα του υγιούς πλυθησμού και αυτών με SLE, σύνδρομο Sjorgen s και σκληρόδερμα είναι τα κατωτέρω. Επι πλέον οροίέχοντες αντισώματα κατά SS-A, SS-B, Sm,RNP, Scl-70 Χρωματίνης, ριβοςώματα P και Μ2 ελέγχθησαν με ANA ELISA. Ελέγχθησαν επίσης τα θετικά δείγματα με IFA ή Ανοσοαποτύπωση (Western blot) κατά Κεντρομεριδίου, P-80 coilin, nucleoli και PCNA. Και οι δύο δοκιμασίες έδωσαν όμοια αποτελέσματα. Όπως φαίνεται από τον πίνακα η σχέση ευαισθησίας είναι 89% και η σχέση ειδικότητας 89%. Σύγκριση υγιών ατόμων με τις δύο δοκιμασίες. Φυσιολογικό n=134 Αρνητικό Θετικό ANA ELISA Αναφοράς Αρνητικό 106 6** Θετικό 13* 9*** * Δείγματα με τιμές από 1 έως 1.6 (Units) μονάδες αναφοράς αντίστοιχες με 20 έως 33 (Units) μονάδες INOVA. 4 από τα δείγματα ήταν ΑΝΑ θετικά με IFA σε κύτταρα HEp-2. ** Δείγματα με τιμές20 έως 25 (Units) μονάδες INOVA. 2 από τα δείγματα ήταν ΑΝΑ θετικά με IFA. *** 3 από αυτά τα δείγματα ήταν ΑΝΑ θετικά με IFA. Σύγκριση ασθενών με Συστηματική Ρευματική Νόσο (SRD) στις δοκιμασίες INOVA και ANA ELISA Αναφοράς. SRD n=100 Αρνητικό Θετικό ANA ELISA Αναφοράς Αρνητικό 4* 1 Θετικό 6 89 * Ένα από τα δείγματα ήταν αρνητικό με IFA σε κύτταρα HEp-2. Σύγκριση δειγμάτων με αντίδραση στη δοκιμασία INOVA και ANA ELISA Αναφοράς. Αντίδραση n=74 Αρνητικό Θετικό ANA ELISA Αναφοράς Αρνητικό 2* 7*** Θετικό 1** 64 * Ήταν 1 κατά PCNA, 1 κατά Scl-70, αμφότερα θετικά κατά ΑΝΑ ΙFA σε κύτταρα HEp-2. ** Δείγματα θετικά σε πυρινίσκο με ΙFA. *** Σε αυτά περιλαμβάνονται 1 κατά Scl-70, 1 κατά RNP, 1 κατά M2 και 4 κατά Jo-1, όλα χαμηλά έως ενδιάμεσα στη δοκιμασία. Τά κατά Scl-70 και κατά RNP ήταν θετικά σε κύτταρα HEp-2. Τά άλλα ήταν ANA αρνητικά αλλά ασθενώς θετικά στο κυτταροπλασματικό με ΙFA ως αναμένετο. 5

Σύγκριση μεταξύ καί ΙΝΟVA ΙFA σε κύτταρα HEp-2. Όλα τα φυσιολογικά και κλινικώς προσδιορισθέντα δείγματα που ελεγχθησαν με ελέγχθησαν καί με ΙΝΟVA ΙFA σε κύτταρα HEp-2. Για αμερόληπτα αποτελέσματα ο τεχνικός που διάβασε τον Εμμεσο Ανοσοφθορισμό ΙFA δεν γνώριζε τα δείγματα. Όπως φαίνεται στον πίνακα η δοκιμασία ΙΝΟVA ANA ELISA αποδίδει σημαντικά λιγότερα ΑΝΑ θετικά για υγιεί πλυθησμό απ ότι ο Εμμεσος Ανοσοφθορισμός ΙFA. Επιπλέον όπως φαίνεται στον δεύτερο πίνακα η δοκιμασία είναι πλησιέστερα στην ευαισθησία στη τεχνική HEp-2 στον προσδιορισμό ΑΝΑ για ασθενείς με SLE, σύνδρομο Sjögren s,και σκληρόδερμα. Σύγκριση υγιών εθελοντών μεταξύ καί ΙΝΟVA ΙFA σε κύτταρα HEp-2. Φυσιολογικά n=134 Αρνητικό Θετικό ΙFA σε κύτταρα HEp-2 Αρνητικό 91 10* Θετικό 28 5 * Δείγματα με τιμή < 35 μονάδων (units) Σύγκριση ασθενών με SRD μεταξύ καί ΙΝΟVA ΙFA σε κύτταρα HEp-2. SRD n=100 Αρνητικό Θετικό ΙFA σε κύτταρα HEp-2 Αρνητικό 1 3** Θετικό 9* 87 * Υπάρχουν 3 δείγματα, το καθένα από ΣΕΛ, σύνδρομο Sjögren και σκληροδερμία, σε μια ποικιλία μοτίβων ANA IFA, κυρίως χαμηλής έντασης ANA. ** Δείγματα από ασθενείς με SLE ένα των οποίων ήταν ισχυρώς θετικό σε κυτταροπλασματικό φθορισμό και ήταν θετικό σε ριβοσώματα-p με ELISA. Σύγκριση ρυθμιστικού διαλύματος για ανίχνευση ANA με σε κύτταρα HEp-2 Έχει προβλεφθεί ότι εργαστήρια θα χρησιμοποιήσουν ΙΝΟVA ELISA για ομαδικό έλεγχο αρνητικών δειγμάτων και κατόπιν επιβεβαίωση των θετικών με συμβατικές δοκιμασίες ΙFA. Για ευκολία το διάλυμα αραίωσης (ANA sample diluent) είναι συμβατό με τις παραδοσιακές δοκιμασίες ΙFA. Ένα υποσύνολο των ελεχθέντων δειγμάτων κατά ΑΝΑ με τεχνική Εμμεσου Ανοσοφθορισμού (IFA) σε NOVA Lite TM HEp-2 ελέγχθησαν κατά ΑΝΑ με IFA σε κύτταρα HEp-2 με τη χρήση διάλυματος αραίωσης (ANA sample diluent) για την αραίωση των δειγμάτων αντί του αραιωτικού PBS της δοκιμασίας NOVA Lite TM. Τα αποτελέσματα με τη χρήση δύο διαφορετικών αραιωτικών ήταν τα ίδια για SLE, σύνδρομο Sjögren s και σκληρόδερμα. Μόνο 5 από τα 97 δείγματα δεν συμφωνούσαν. Το ΑΝΑ αραιωτικό δειγμάτων μειώνει τη μη ειδική ένωση, και αποδίδει 3τριπλάσια θετικά σε προηγουμένως αρνητικά δείγματα λόγω της μείωσης της κυτταροπλασματικής χρώσης η οποία επιτρέπει την εμφάνιση της μορφής ΑΝΑ. Αποδίδει επίσης διπλάσια αρνητικά σε προηγούμενα ασθενώς θετικά δείγματα διότι μειώνεται η χρώση του πυρήνος. Όπως αναμένετο υπήρχε μαγαλύτερη ασυμφωνία αποτελεσμάτων του φυσιολογικού καθότι ασθενώς ή αρνητικά με τεχνική Εμμεσου Ανοσοφθορισμού (IFA) είναι δυσκολότερο να προσδιορισθούν απ ότι τα ισχυρώς θετικά. Χρησιμοποιώντας αραιωτικό PBS 33% υγειών εθελοντών ήταν θετικοί ενώ με τη χρήση διάλυματος αραίωσης ANA ELISA diluent 26% ήταν θετικοί. Πρόσφατη βιβλιογραφία αναφέρει ένα 30% θετικών κατά ΑΝΑ σε υγειεί πλυθησμό και αραίωση 1:40. 11 Ο τίτλος 4 θετικών δειγμάτων προσδιορίσθηκε με διαδοχικές αραιώσεις του διάλυματος αραίωσης (ANA sample diluent) 1:41 με αραιωτικό PBS. Οι τίτλοι τελικού σημείου ήταν με μία διαδοχική αραίωση του δείγματος το οποίο ήταν αρχικά αραιωμένο με ΝΟVA Lite TM PBS. Αρχικές αραιώσεις δειγμάτων άλλες εκτός της 1:41 σε ANA sample diluent δεν έχουν προσδιορισθεί. Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση INOVA ANA ELISA Θετικό Ομάδα Ασθενών Συνολικός Αριθμός # % Υγιείς εθελοντές 246 23 9% Κλινικώς ανευρεθέντες ασθενείς SLE 46 43 93% Σύνδρομο Sjögren s 27 24 89% Σκληρόδερμα 27 23 85% Αντιγονικά προσδιορισμένο* 74 71 96% *Μεταξύ 4 και 9 δειγμάτων γνωστών σαν θετικά κατά SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, Χρωματίνη, Ριβοσώματα-P και Μιτοχόνδρια Μ2 εξετασθέντων. Εξετάσθησαν επίσης δείγματα θετικά, με Έμμεσο Ανοσοφθορισμό IFA ή Ανοσοαποτύπωση Western Blot,κατά Κεντρομεριδίου, P-80 coilin, nucleoli και PCNA. Βάσει των ανωτέρω η κλινική ευαισθησία του ANA ELISA κατά SLE είναι 93% και η ειδικότητα είναι 91%. Το ποσοστό των ΑΝΑ θετικών δειγμάτων με SLE συμφωνεί με το παρόν εγχειρίδιο. 1-4 Πρέπει να σημειωθει ότι κάποιοι από τους ορούς των ασθενών έχουν ελεγχθει για κορτικοειδεί. Οι ασθενείς με σύνδρομο Sjögren s και σκληρόδερμα ήταν θετικοί κατά ΑΝΑ με Έμμεσο Ανοσοφθορισμό IFA. έχει ενδιαφέρον ότι τά βιολογικώς ELISA ψευδώς θετικά δείγματα σε υγιεί πλυθησμό ήταν συμαντικά μικρότερος απ ότι με Έμμεσο Ανοσοφθορισμό IFA σε κύτταρα HEp-2 για τά οποία γενικώς αναφέρεται σαν 20% - 30% (κατωτέρω πίνακας). 11,12 6

Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Στη διαδικασία: 5 δείγματα ορού και ελέγχθηκαν με ΑΝΑ ELISA από 12 φορές σε μία πλάκα με τά εξής αποτελέσματα. Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέσος όρος 31U 51U 54U 144U 172U SD 1.3 3.4 6.0 9.6 6.5 CV 4% 7% 11% 7% 4% Μεταξύ της διαδικασίας 4 θετικά δείγματα και 1 υψηλώς αρνητικό δοκιμάστηκαν μία φορά ημερησίως για 6 ημέρες με τα εξής αποτελέσματα. Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα 5 Μέσος όρος 16U 27U 31U 47U 160U SD 1.6 2.4 2.2 5.1 22.6 CV 10% 9% 7% 11% 14% Βιβλιογραφία 1. Von Muhlen CA and Tan EM: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24:323-358 (1995). 2. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 44:93-151 (1989). 3. Van Venrooj WJ and Maini RN, editors: Manual of Biological Markers of Disease, section B: Autoantigens. Kluwer Academic Publishing, Boston (1994). 4. Tan EM, et al: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25:1271-1277 (1982). 5. Jaskowski TD, et al: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 105:468-473 (1996). 6. Woodruff E and O Neil L: Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arth Rheum 40:1612-1618 (1997). 7. Carey JL: Enzyme immunoassays for antinuclear antibodies. Clin Lab Med 17:355-365 (1997). 8. Homburger HA, et al: Detection of antinuclear antibodies: comparative evaluation of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence methods. Arch Pathol Lab Med 122:993-999 (1998). 9. Gniewek RA, et al: Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol 4:185-188 (1997). 10. Vlachoyiannopoulos PG, et al: Clinical features and evolution of antinuclear antibody positive individuals in a rheumatology outpatient clinic. J Rheumatol 25:886-891 (1998). 11. Tan EM, et al: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 40:1601-1611 (1997). 12. Lipscomb MF, et al: Comparison of substrates for the detection of antinuclear antibodies in normals and in patients with connective tissue and other diseases. Diagn Immunol 2:181-187 (1984). 13. Amoura Z, et al: The key role of nucleosomes in lupus. Arthritis Rheum 42:833-843 (1999). 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628750GRC October 2009 Revision 6 7