Ο3εΔyj1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΣ-ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΟ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΠΙΜΥΩΝ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟ=ΥΓΕΝΑΣΗΣ-2 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Νικολcίίδου Μάρθα Χημικός ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2009
~ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική σχολή του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα N. 5343/32, άρθρο 202, παράγραφος 2 (νομική κατοχύρωση του Ιατρικού Τμήματος)»
Ημερομηνία αίτησης της κ. Νικολάΐδου Μάρθας: 9-12-2005 Ημερομηνία ορισμού Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής: 489x/4-2-2003 Μέλη Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής: Επιβλέπων Μαρσέλος Μάριος-Αθανάσιος, Καθηγητής Φαρμακολόγίας Μέλη Τσούκαλη Ελένη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τοξικολογίας Ιατρικής Σχολής ΑΠΟ Παππάς Περικλής, Λέκτορας Φαρμακολογίας Ημερομηνία ορισμού θέματος: 18-4-2003 «Διερεύνηση της επίδρασης αντιφλεγμονωδών φαρμάκων στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα επίμυων» ΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΠΤΑΜΕΑΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΙΙΙΤΡΟΙΙΗΣ : 664x/23-6-2009 1. Ευαγγέλου Άγγελος, Καθηγητής Φυσιολογίας Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Ιωαωίνων 2. Μαρσέλος Μάριος-Αθανάσιος, Καθηγητής Φαρμακολογίας Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Ιωαωίνων 3. Τσούκαλη Ελένη Καθηγήτρια Τοξικολογίας Ιατρικής Σχολής ΑΠΟ 4. Παπαδοπούλου Χρυσάνθη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Ιωαωίνων 5. Αντωνίου Αικατερίνη Επίκουρη Καθηγήτρια Φαρμακολογίας Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Ιωαωίνων 6. Κούκλης Παναγιώτης Επίκουρος Καθηγητής Βιολογίας Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Ιωαωίνων 7. Παππάς Περικλής, Επίκουρος Καθηγητής Φαρμακολογίας Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Ιωαωίνων Έ γκριση Διδακτορικής Διατριβής με βαθμό «ΑΡΙΣΤΑ» στις 10-7-2009 ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Γονδέβενος Ιωάωης Καθηγητής Παθολογίας-Καρδιολογίας HAP
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΦΑΡΜΑΚΑ 1.1 Η φλεγμονή 8 1.1.1 0 μηχανισμός της φλεγμονής 8 1.1.2 Τα είδη της φλεγμονής 12 1.1.3 Κλινική συμπτωματολογία της φλεγμονής 13 1.1.4 Φλεγμονή και παθήσεις 14 1.2 Φλεγμονή και Κεντρικό Νευρικό Σύστημα 14 1.3 Αντιφλεγμονώδη Φάρμακα 16 2. ΟΙ ΚΥΚΛΟΞΥΓΕΝΑΣΕΣ ΚΑΙ ΟΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΚΥΚΛΟΞΥΓΕΝΑΣΗΣ-2 2.1 Οι κυκλοξυγενάσες 19 2.1.1 Τα προστανοειδή 23 2.2 Ο εντοπισμός της κυκλοοξυγενάσης-2 στο Κ.Ν.Σ 26 2.2.1 Η ρύθμιση της κυκλοξυγενάσης-2 στον εγκέφαλο 28 2.3 Ο ρόλος της κυκλοοξυγενάσης-2 σε διαταραχές του Κ.Ν.Σ 31 2.3.1 Παθήσεις των εγκεφαλικών αγγείων και κυκλοξυγενάση-2 32 2.3.2 Νόσος Alzheimer και κυκλοξυγενάση-2 34 2.3.3 Άλλες νευρολογικές παθήσεις και κυκλοξυγενάση-2 35 2.4 Οι εκλεκτικοί αναστολείς της κυκλοξυγενάσης-2 36 2.4.1 Ιστορική Αναδρομή 36 2.4.2 Η ανάπτυξη των εκλεκτικών αναστολέων της κυκλοξυγενάσης-2 37 2.4.3 Σχέση δομής και ενζυμικής δραστικότητας της κυκλοξυγενάσης-2 38 2.4.4 Σχέση μεταξύ αμινοξικού προφίλ της κυκλοξυγενάσης-2 και μηχανισμού αναστολής 39 2.4.5 Μηχανισμός δέσμευσης των εκλεκτικών αναστολέων της κυκλοξυγενάσης2 41 2.5 Η Φαρμακοκινητική των εκλεκτικών αναστολέων της κυκλοξυγενάσης-2 42 2.5.1 Η Σελεκοξίβη..43 2.5.2 Η Ροφεκοξίβη 43 2.5.3 Η Παρεκοξίβη και η Βαλντεκοξίβη 44
2.5.4 Η Λουμιρακοξίβη 45 2.5.5 Η Ετορικοξίβη 46 2.6 Η εκλεκτικότητα των αναστολέων της κυκοξυγενάσης-2 47 2.7 Η Ετορικοξίβη 48 2.7.1 Φαρμακοτεχνική μορφή 49 2.7.2 Ενδείξεις 49 2.7.3 Μηχανισμός δράσης 49 2.7.4 Δοσολογία και οδός χορήγησης 49 2.7.5 Φαρμακοκινητική 50 2.7.6 Αντενδείξεις 51 2.7.7 Προφυλάξεις 52 2.7.8 Ανεπιθύμητες ενέργειες 52 2.7.9 Αλληλεπιδράσεις 53 3. ΝΕΥΡΟΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ 3.1 Η Σεροτονίνη 54 3.1.1 Οι υποδοχείς 5-ΗΤΙΑ 62 3.1.2 Οι υποδοχείς 5-ΗΤ2Α 63 3.2 Η Ντοπαμίνη 64 3.3 Η Νοραδρεναλίνη 69 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 71 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 72 1. Πειραματόζωα 72 2. Χημικά αντιδραστήρια 74 3. Χορήγηση ουσιών 74 4. Πειραματικά πρωτόκολλα 5. Αιμοληψία, εκτομή και επεξεργασία περιοχών εγκεφάλου 74 78 6. Προσδιορισμός της Θερμοκρασίας σώματος 80 7. Προσδιορισμός των επιπέδων των κυτταροκινών στο αίμα 80 8. Πειραματική μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς 81 9. Προσδιορισμός των νευρομεταβιβαστών με Υγρή Χρωματογραφία 10. Στατιστική επεξεργασία 81 85 2
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 86 1. Πείραμα 1 86 1.1 Παράμετροι συμπεριφοράς 86 1.2 Νευροχημικές παράμετροι 89 2. Πείραμα 2 104 2.1 Παράμετροι συμπεριφοράς 104 2.2 Νευροχημικοί παράμετροι 107 3. Πείραμα 3 122 3.1 Παράμετροι συμπεριφοράς.122 3.2 Νευροχημικοί παράμετροι 126 4. Πείραμα 4 144 4.1 Παράμετροι συμπεριφοράς 144 4.2 Νευροχημικοί παράμετροι 147 4.3 Θερμοκρασία σώματος των επίμυων 161 4.4 Επίπεδα ΙΕ-6 στο αίμα επίμυων 162 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 164 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 177 ΠΕΡΙΛΗΨΕΙΣ 179 Περίληψη στα Ελληνικά 179 Περίληψη στα Αγγλικά 181 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 183 ΠΙΝΑΚΕΣ 196 ΕΙΚΟΝΕΣ 197 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 206 3
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση των εκλεκτικών αναστολέων της κυκλοξυγενάσης-2 (ΟΟΧ-2) στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (Κ.Ν.Σ.) των επίμυων. Σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η πιθανή επίδραση της ετορικοξίβης, ενός εκλεκτικού ΟΟΧ-2 αναστολέα, σε συμπεριφορικές και νευροχημικές λειτουργίες και εάν αυτή μεταβάλλεται από τη χορήγηση των αγωνιστών και ανταγωνιστών της σεροτονίνης. "Ενας ακόμη στόχος της συγκεκριμένης μελέτης ήταν να διερευνηθεί η πιθανή επίδραση της ετορικοξίβης σε συμπεριφορικές και νευροχημικές λειτουργίες μετά από την εγκατάσταση φλεγμονής. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκαν μια σειρά πειραμάτων στα οποία χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί επίμυες ηλικίας περίπου τριών μηνών. Τα πειραματόζωα έλαβαν όλες τις ουσίες και τα φάρμακα με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση. Η αυθόρμητη συμπεριφορά καταγράφηκε με το σύστημα αυτόματης καταγραφής συμπεριφοράς ανοιχτού πεδίου (Open-Field test) στο οποίο παρακολουθείται η οριζόντια και κάθετη κινητικότητα του πειραματόζωου. 0 προσδιορισμός των επιπέδων των νευρομεταβιβαστών έγινε με τη χρήση της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης (ΗPLC). Επιπλέον, στο πειραματικό πρωτόκολλο χορήγησης λιποπολυσακχαρίτη (LPS), καταγράφηκε η Θερμοκρασία του σώματος των επίμυων και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ιντερλευκίνης-6 (ΙΕ-6) στο αίμα των πειραματόζωων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ετορικοξίβη μία ώρα μετά τη χορήγησή της μείωσε την κινητική δραστηριότητα των επίμυων και τη ντοπαμινεργική λειτουργία ενώ, αύξησε τα επίπεδα της νοραδρεναλίνης (ΝΑ) και τη σεροτονινεργική λειτουργία σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου των επίμυων. Όμως, οι περισσότερες από τις επιδράσεις της ετορικοξίβης καταργήθηκαν μετά το πέρας τριών ωρών από τη χορήγησή της. Το αποτέλεσμα της δράσης της ετορικοξίβης στην κινητική δραστηριότητα και τη νευροχημική διαβίβαση διερευνήθηκε περαιτέρω σε επίπεδο αγωνιστών και ανταγωνιστών των υποδοχέων της σεροτονίνης (5-ΗΤ). "Ετσι, παρ' όλο που ο 5-ΗΤΙΑ αγωνιστής δεν επηρέασε τη δράση της ετορικοξίβης στην κινητική δραστηριότητα των επίμυων εντούτοις, ανέστειλε πλήρως τη δράση ετορικοξίβης στη ντοπαμινεργική και σεροτονινεργική λειτουργία καθώς και στα επίπεδα της ΝΑ στις - υπό εξέταση περιοχές του εγκεφάλου επίμυων. Αντίθετα, ο 5-ΗΤΙΑ ανταγωνιστής, ανέστειλε τη δράση της ετορικοξίβης μόνο στην κάθετη κινητικότητα ενώ, ανέστειλε μερικώς τη δράση της ετορικοξίβης στις συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου επίμυων. 179
Όσον αφορά τους 5-ΗΤ2Α υποδοχείς, φαίνεται ότι o αγωνιστής των 5-ΗΤ2Α υποδοχέων ανέστειλε τη δράση της ετορικοξίβης στην κινητική δραστηριότητα των επίμυων και στη ντοπαμινεργική λειτουργία του προμετωπιαίου φλοιού καθώς και στη σεροτονινεργική λειτουργία όλων των περιοχών του εγκεφάλου που μελετήθηκαν. Αντίθετα, ο 5-ΗΤ2A ανταγωνιστής, δεν άσκησε καμία επίδραση στις μεταβολές που προκαλεί η ετορικοξίβη στην κινητική δραστηριότητα των επίμυων ενώ ανέστειλε μερικώς τις νευροχημικές μεταβολές που παρατηρήθηκαν λόγω χορήγησης ετορικοξίβης. Η χορήγηση LPS προκάλεσε μειωμένη κινητική δραστηριότητα των επίμυων η οποία όμως αναιρέθηκε μερικώς από την ετορικοξίβη. Επιπλέον, το LPS προκάλεσε νευροχημικές μεταβολές που χαρακτηρίζονται από ιστική διαφοροποίηση. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι, οι όποιες νευροχημικές δράσεις προκάλεσε το LPS, αναιρέθηκαν από τον εκλεκτικό αναστολέα της ΟΟΧ-2, ετορικοξίβη. Τέλος, η χορήγηση του LPS προκάλεσε την ανάπτυξη μιας περιφερικής φλεγμονής, η οποία εκδηλώθηκε με αύξηση της Θερμοκρασίας του σώματος και των επιπέδων των ιντερλευκινών στο αίμα όπως για παράδειγμα της ΙΕ-6. Το αποτέλεσμα της φλεγμονής στη Θερμοκρασία του σώματος αναιρέθηκε από τον εκλεκτικό ΟΟΧ-2 αναστολέα όχι όμως και αυτό της ΙΕ-6. Συνοψίζοντας, ο εκλεκτικός αναστολέας της ΟΟΧ-2, ετορικοξίβη, προκάλεσε μεταβολές σε παράγοντες της συμπεριφοράς καθώς και σε νευροχημικές λειτουργίες που εντοπίζονται κυρίως στην σεροτονινεργική νευροδιαβίβαση. Η περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού που χαρακτηρίζει την προαναφερόμενη δράση της ετορικοξίβης έδειξε την εμπλοκή των 5-ΗΤΙΑ και 5-ΗΤ2Α υποδοχέων με κυρίαρχο ρόλο των 5-ΗΤ2Ά αγωνιστών. Τέλος η μελέτη της δράσης της ετορικοξίβης σε εγκατεστημένη φλεγμονή απέδειξε ότι ο ΟΟΧ-2 αναστολέας μπορεί να αναιρέσει τις μεταβολές που προκαλεί η περιφερική φλεγμονή στη ντοπαμινεγική και σεροτονινεργική λειτουργία καθώς και την υποκινητικότητα και την αυξημένη Θερμοκρασία του σώματος των επίμυων εκτός της αυξημένης παραγωγής ιντερλευκινών. Δεδομένης της εμπλοκής των 5-ΗΤ2A υποδοχέων στη φλεγμονή και στη δράση της ετορικοξίβης μία σημαντική αλληλεπίδραση προσταγλανδινών και σεροτονίνης αναδεικνύεται με επακόλουθη δράση σε συγκεκριμένους υποδοχείς και το αντίστοιχο που χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. 180
INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF ANTIINFAMMATORY DRUGS ON RAT CENTRAL NERVOUS SYSTEM - INHIBITORS OF CYCLOOΧΥGENASE-2 Martha Nikolaidou SYMMARY In the present study the effects of cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors on the rat Central Nervous System were examined. The aim of the study was to investigate further possible effects of etoricoxib a selective COX-2 inhibitor on behavioral and neurochemical functions and if the action of etoricoxib can be altered by the administration of serotonin's agonists and antagonist. Another goal of this particular study was to investigate a possible effect of etoricoxib on behavioral and neurochemical functionss after inuced inflammation. For this reason, a number of experiments were held in which three-month yearsold male Wistar rats were used. All substances and drugs were intraperitoneal injected to experinmental subjects. The spontaneous behavior was recorded with an automated open-field behavioral recorder system (Open-Field test) in which horizontal and vertical mobility is monitored. For the determination of neurotransmitters a High-Pressure Liquid Chromatogrphy (HPLC) was used. Moreover, at the experimental protocol of lipopolysacharide (LPS) administration, the body temperature was recorded and the levels of interleukin-6 (ΙL-6) in blood were determined in rats.. The results showed that etoricoxib one hour after its administration reduced rat mobility and dopaminergic function while increased noradrenaline (NA) levels and serotonergic function in specific rat brain regions. However, after the completion of three hours from its administration, most of the effects of etoricoxib were suppressed. The effect of etoricoxib on mobile activity and neurochemical transmission was investigated further using serotonin (5-HT) agonists and antagonists. Even though, 5HT,A agonist did not influence etoricoxib action on rat mobile activity, nevertheless, completely abolished the action of etoricoxib on dopaminergic and serotonergic function as well as on the NA levels in the rat brain regions included in the study. On the other hand, 5-ΗΡΙΑ antagonist abolished the action of etoricoxib only on the vertical mobile activity while abolished the action of etoricoxib on NA levels and on serotonergic function in specific rat brain regions. 181
With regard to 5-HT2A receptos it appears that 5-HT2A agonist abolished the effects of etoricoxib on rat mobility and on dopaminergic function at the prefrontal cortex as well as on the serotonergic function in all rat brain regions being studied. On the contrary, the 5-HT2A antagonist had no effect on etoricoxib-induced changes on rat mobility while inhibited partially the etoricoxib action on neurochemical changes after etoricoxib administration. LPS administration induced a decrease on mobile activity in rats but it was partially reversed by etoricoxib. Moreover, LPS caused neurochemical changes showing tissue differentiation. It is noteworthy that neurochemical effects of LPS were reversed by the selective COX-2 inhibitor, etoricoxib. Finally, the adminisration of LPS induced infiamation which was obvious by the elevated body temperature and IL-6 levels in the blood. The effect of inflammation on body temperature was reversed by the selective COX-2 inhibitor but not that of IL-6. In conclusion, the selective COX-2 inhibitor, etoricoxib induced changes on behavioral factors as well as on neurochemical functions focused on the serotonergic transmission. Further investigation of the mechanism that relies on this action of etoricoxib showed implication of 5-ΗΤΙΑ and 5-HT2A receptors with an important role of 5-HT2A. Finally, etoricoxib can reverse the LPS-induced changes on dopaminergic and serotonergic fuction as well as the reduced mobility and increased body temperature except from elevated production of IL-6. The involvement of 5-HT2A receptors in inflammation and in the effects of etoricoxib's action, revealed a crucial interaction between prostaglandins and serotonin, supporting a subsequent action on these receptors and the opposite, that needs to be examined further. 182