ΜΕΛΕΤΗ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΜΙΚΡΟΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΕΛΑΙΟΛΑΔΟ ΧΩΡΙΣ ΣΥΝ-ΕΠΙΦΑΝΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΗ ΟΥΣΙΑ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΗ- ΙΟΝΙΚΩΝ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΟΠΟΙΗΤΩΝ Β, Πολυχνιάτου, Κ,Τζιά Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών Ηρώων Πολυτεχνείου 5, Πολυτεχνειούπολη, Ζωγράφου, Αθήνα, 15780 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα w/o (νερό-σε-έλαιο) μικρογαλακτώματα παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον στη βιομηχανία τροφίμων, βρίσκοντας χρήση σε πολλές εφαρμογές. Περιέχουν σταγονίδια πολύ μικρής διαμέτρου (d <100 nm) και παρουσιάζουν αριθμό δυνητικών πλεονεκτημάτων έναντι των συμβατικών γαλακτωμάτων για τον εγκλεισμό και τη διανομή υδρόφιλων ουσιών (βιοενεργών συστατικά) σε τρόφιμα και ποτά. Χαρακτηρίζονται από υψηλή οπτική καθαρότητα, φυσική/θερμοδυναμική σταθερότητα και αυξημένη βιοδιαθεσιμότητα. Μπορούν να βελτιώσουν τη διαλυτότητα μη αναμίξιμων, κατά τα άλλα, υγρών, ενώ προσδίδουν μεγάλη επιφάνεια αλληλεπίδρασης ανάμεσα στο νερό και τη λιπαρή φάση. Τα συστήματα αυτά περιέχουν νανοδομές διαφορετικής πολικότητας μέσα στο μονοφασικό διάλυμα που μπορούν να θεωρηθούν ως νανοφάσεις. Ακόμη έχουν την τάση να επαναγαλακτωματοποιούνται αυθόρμητα σε περίπτωση διαχωρισμού. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η δυνατότητα σχηματισμού και οι φυσικοχημικές ιδιότητες μικρογαλακτωμάτων με βάση το ελαιόλαδο, χρησιμοποιώντας μη-ιονικούς γαλακτωματοποιητές (Tween 20, 40, 60, 80, Span 20, 80), χωρίς την προσθήκη συνεπιφανειοδραστικής ουσίας, Τα σταθερά μικρογαλακτώματα παρουσιάζονται σε τριμερή διαγράμματα φάσης (έλαιο-νερό-γαλακτωματοποιητής), προκειμένου να προσδιοριστεί η γαλακτωματοποιητική ικανότητα καθενός γαλακτωματοποιητή. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν μικρογαλακτώματα στις επιτρεπόμενες αναλογίες όπως καθορίστηκαν από τα διαγράμματα φάσης και επεξεργάστηκαν τα δεδομένα που προέκυψαν από τον προσδιορισμό των ιδιοτήτων τους. Η επίδραση της συγκέντρωσης των γαλακτωματοποιητών στα συστήματα μικρογαλακτωμάτων αξιολογήθηκε με βάση τη διάμετρο των σταγονιδίων, το ζ-δυναμικό, τη σταθερότητα και τη θολότητα του γαλακτώματος. Από τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης προέκυψε ότι είναι δυνατόν να παρασκευαστούν σταθερά w/o μικρογαλακτώματα με βάση το ελαιόλαδο χωρίς την προσθήκη συνεπιφανειοδραστικής ουσίας και επιπλέον προσδιορίστηκε ο πιο αποτελεσματικός τύπος γαλακτωματοποιητή καθώς και η βέλτιστη αναλογία στην οποία πρέπει αυτός να προστεθεί στο σύστημα.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα γαλακτώματα είναι μίγματα δύο ή περισσότερων μη αναμίξιμων υγρών διεσπαρμένων το ένα μέσα στο άλλο, σε μικρά σφαιρικά σταγονίδια με μία διαχωριστική μεμβράνηδιεπιφάνεια αποτελούμενη από κάποιες απαραίτητες επιφανειοδραστικές ουσίες/ γαλακτωματοποιητές και είναι συνήθως θερμοδυναμικά ασταθή. Ωστόσο, τα γαλακτώματα που περιέχουν πολύ μικρής διαμέτρου σταγονίδια (10 nm< d <100 nm), γνωστά και ως μικρογαλακτώματα, είναι εξαιρετικά σταθερά και πλησιάζουν θερμοδυναμική σταθερότητα [1]. Το μικρό μέγεθος των σταγονιδίων ενισχύει τη σταθερότητα του γαλακτώματος καθώς οι κινήσεις Brown των σταγονιδίων μπορούν να υπερκεράσουν την τάση αποσταθεροποίησης του γαλακτώματος λόγω της διαφοράς ειδικού βάρους των δύο φάσεων. Επομένως ακόμη και μετά από παρατεταμένη αποθήκευση δεν παρατηρείται αποκορύφωση ή ιζηματοποίηση στο γαλάκτωμα [1]. Το μικρό μέγεθος των σταγονιδίων εμποδίζει επίσης την κροκίδωση των σταγονιδίων καθώς και τη συσσωμάτωσή τους. Η μακροπρόθεσμη φυσική σταθερότητα των μικρογαλακτωμάτων τα καθιστά μοναδικά, παρέχοντας έναν αριθμό δυνητικών πλεονεκτημάτων σε σχέση με τα συμβατικά γαλακτώματα [2]. Τα μικρογαλακτώματα είναι ακόμη διαυγείς και ισότροπες διασπορές. Λειτουργούν ως μικρο-αντιδραστήρες για τη σύνθεση αρωματικών ουσιών στα τρόφιμα, ως μέσα για τη διαλυτοποίηση αδιάλυτων (σε νερό ή έλαιο αντίστοιχα) βιοδραστικών ουσιών και ως συστήματα χορήγησης μη διαλυτών ουσιών (χρωστικές, αρωματικές ύλες, θρεπτικά συστατικά κ.α.) με ελεγχόμενη απελευθέρωση [3,4]. Το ελαιόλαδο επιλέχθηκε ως κύριο συστατικό των μικρογαλακτωμάτων, λόγω της υψηλής θρεπτικής του αξίας και της μεγάλης σταθερότητάς του στην οξείδωση. Είναι ανώτερο σε σύγκριση με άλλα φυτικά έλαια, καθώς χρησιμοποιείται σε φυσική μορφή και έχει μοναδικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Το ελαιόλαδο περιέχει φυσικά αντιοξειδωτικά συστατικά και σε συνδυασμό με τη σύνθεση των λιπαρών οξέων του έχει θετική επίδραση στην υγεία και ως εκ τούτου θεωρείται λειτουργικό τρόφιμο [5]. Παρότι έχουν πραγματοποιηθεί πολλές έρευνες σχετικά με μικρογαλακτώματα, ελάχιστες μόνο αναφορές έχουν παρουσιαστεί σε συστήματα τροφίμων, λόγω του περιορισμένου αριθμού των επιφανειοδραστικών ουσιών που είναι κατάλληλες για τρόφιμα. Πολλές επιφανειοδραστικές ουσίες είναι μη επιτρεπόμενες σε τρόφιμα, ενώ άλλες μπορούν να προστεθούν μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Επομένως είναι σαφές ότι η επιλογή της κατάλληλης επιφανειοδραστικής ουσίας είναι μείζονος σημασίας, ενώ παράλληλα πρέπει να γίνει προσπάθεια, ώστε να γίνει χρήση της μικρότερης δυνατής συγκέντρωσης της ουσίας [6]. Η καταλληλότητα μίας επιφανειοδραστικής ουσίας εξαρτάται από έναν αριθμό παραγόντων, όπως: η υδροφιλική-λιποφιλική ισορροπία (HLB) της επιφανειοδραστικής ουσίας, το είδος του γαλακτώματος (w/o ή o/w), η φύση του ελαίου, οι διεπιφανειακές δυνάμεις ανάμεσα στις δύο φάσεις, η θερμοκρασία, και η αλληλεπίδραση μεταξύ του γαλακτωματοποιητή και των συστατικών του συστήματος [7]. Επιπλέον για το σχηματισμό των μικρογαλακτωμάτων μπορεί επίσης να απαιτείται η παρουσία μίας συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Αλκοόλες μεσαίου μήκους αλυσίδας και σε μικρότερο βαθμό, αμίνες και οξέα έχουν χρησιμοποιηθεί ως συν-επιφανειοδραστικές ουσίες, λόγω της ικανότητάς τους να μειώνουν την επιφανειακή τάση της διπλοστιβάδας και το ιξώδες του γαλακτώματος. Ωστόσο, δεν είναι όλες οι συν-επιφανειοδραστικές ουσίες εγκεκριμένες για ανθρώπινη κατανάλωση, καθώς ορισμένες εξ αυτών ενδέχεται να προκαλέσουν τοξικότητα και ερεθισμό [8]. Επιπλέον, είναι δυνατόν να οδηγήσουν σε αποσταθεροποίηση μικρογαλακτώματος κατά την αραίωση, λόγω μετάπτωσης της συνεπιφανειοδραστικής ουσίας από τη διεπιφάνεια στη συνεχή φάση [9].
Για τους παραπάνω λόγους, μελετήθηκε η γαλακτωματοποιητική ικανότητα διαφόρων μηιονικών γαλακτωματοποιητών κατάλληλων για τρόφιμα που, όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία, είναι ικανοί να σχηματίσουν μικρογαλάκτωμα χωρίς την προσθήκη συνεπιφανειοδραστικής ουσίας [10]. Ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη σχηματισμού και της σταθερότητας w/o μικρογαλακτωμάτων με βάση εξευγενισμένο ελαιόλαδο, με μη-ιονικούς γαλακτωματοποιητές χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας, καθώς και η αξιολόγηση των ιδιοτήτων τους. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Για τα μικρογαλακτώματα χρησιμοποιήθηκε εξευγενισμένο ελαιόλαδο, χορηγία της Μινέρβα Α,Ε, Χρησιμοποιήθηκαν οι χημικοί γαλακτωματοποιητές: μονολαυρική πολυοξυαιθυλενοσορβιτάνη (Tween 20) (HLB=16,7), μονοπαλμιτική πολυοξυ-αιθυλενο-σορβιτάνη (Tween 40) (HLB=15,6), μονοστεατική πολυοξυ-αιθυλενο-σορβιτάνη (Tween 60) (HLB=14,9), μονοελαϊκή πολυοξυ-αιθυλενο-σορβιτάνη (Tween 80) (HLB=15), μονολαυρική σορβιτάνη (Span 20) (HLB=8,6) και μονοελαϊκή σορβιτάνη (Span 80) (HLB=4,3) της Across Organics (New Jersey, USA). ΜΕΘΟΔΟΙ Κατασκευή διαγραμμάτων φάσης των μικρογαλακτωμάτων Για την κατασκευή των διαγραμμάτων φάσης ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Σε ορισμένη ποσότητα ελαιόλαδου, το οποίο διατηρείται στους 40 o C (με τη βοήθεια υδατόλουτρου), προστίθεται κατάλληλη ποσότητα γαλακτωματοποιητή (χημικού γαλακτωματοποιητή ή ενδογενούς συστατικού του ελαιόλαδου), ώστε η τελική ποσότητα του μίγματος να είναι 50 g, και γίνεται ανάμιξη του μίγματος με ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας (CAT Unidrive 1000 homogenizer) στις 12,000 rpm για 10 min. Δοκιμάστηκαν αναλογίες γαλακτωματοποιητή-ελαίου από 0-10% κ.β. του τελικού μίγματος με βήμα μεταβολής 2% κ.β., Στη συνέχεια προστίθεται απιονισμένο νερό, ίδιας θερμοκρασίας, στάγδην, με ρυθμό (50 μl/30 s) μέχρις ότου το γαλάκτωμα να μην προκύπτει διαυγές, όπως επιβεβαιώνεται μέσω μέτρησης της θολότητάς του. Παρασκευή μικρογαλακτωμάτων Τα μικρογαλακτώματα παρασκευάστηκαν στις αναλογίες (έλαιο:γαλακτωματοποιητής:νερό) που ήταν εφικτό να σχηματιστούν, όπως προέκυψε από τα διαγράμματα φάσης και με την ίδια διαδικασία όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το ελαιόλαδο αναμιγνύεται με την επιθυμητή ποσότητα γαλακτωματοποιητή (αναλογίες: 0, 2, 4, 6, 8, 10% κ,β, γαλακτωματωποιητή/τελικό μίγμα) στους 40 o C για 10 min και ακολούθως προστίθεται νερό 40 o C σε αναλογία 2% κ.β. στο τελικό μίγμα στάγδην (50 μl/30 s) υπό συνεχή ανάδευση στις 12,000 rpm. Προσδιορισμός σταθερότητας γαλακτώματος με βάση το ελαιόλαδο Η σταθερότητα των γαλακτωμάτων με βάση το ελαιόλαδο προσδιορίστηκε βάσει του διαχωρισμού φάσης λόγω διαφοράς ειδικού βάρους, 20 ml του παρασκευαζόμενου γαλακτώματος μεταφέρονται σε γυάλινους βαθμονομημένους σωλήνες των 20 ml και
αποθηκεύονται για 4 εβδομάδες στους 25 C. Η αποκορύφωση των λιπαρών και η δημιουργία ιζήματος προσδιορίζεται από την αναλογία του όγκου της κορυφής και του ιζήματος επί του συνολικού όγκου του γαλακτώματος. Ο Δείκτης σταθερότητας γαλακτώματος (ESI) υπολογίζεται από το ύψος της κορυφής (HC) και το ύψος του ιζήματος (HS) και δίνεται ως ποσοστό του αρχικού ύψους γαλακτώματος (ΗΕ): ESI (%) = 100 [HE-(HS + HC)] / HE Προσδιορισμός μεγέθους σταγονιδίων, διασποράς και ζ-δυναμικού γαλακτώματος Το μέγεθος των σταγονιδίων, η κατανομή του μεγέθους τους καθώς και το ζ-δυναμικό των σταγονιδίων των μικρογαλακτωμάτων με βάση το ελαιόλαδο προσδιορίστηκε με Δυναμική Σκέδασης Φωτός - Dynamic Light Scattering DLS (Zetasizer nano-zs 2000, Malvern Instruments Ltd, UK). Οι μετρήσεις έγιναν στους 25 o C, Οι τιμές του ζ-δυναμικού υπολογίστηκαν από την εξίσωση Helmholtz-Smoluckowski και τα δεδομένα διορθώθηκαν μέσω του ιξώδους, του δείκτη διάθλασης και της διηλεκτρικής σταθεράς του δείγματος. Προσδιορισμός θολότητας Η θολότητα των μικρογαλακτωμάτων με βάση το ελαιόλαδο προσδιορίστηκε με θολοσίμετρο (HACH 2100N) στους 25 o C ως μέτρο της αναλογίας και του μεγέθους των σταγονιδίων της διεσπαρμένης φάσης. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων Τα δεδομένα των μετρήσεων προέκυψαν ως μέσος όρος τριών επαναλήψεων, ενώ η επεξεργασία τους έγινε με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), με χρήση του κριτηρίου διαφοράς Duncan's test με το λογισμικό STATISTICA v. 7.0 (Statsoft Inc., Tulsa, USA). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα συστήματα μικρογαλακτωμάτων μπορούν να σχηματιστούν με κατάλληλες αναλογίες ελαίου, νερού και γαλακτωματοποιητή [11]. Προκειμένου να σχεδιαστούν w/ο μικρογαλακτώματα με βάση το ελαιόλαδο δοκιμάστηκαν διάφοροι συνδυασμοί ελαίουνερού-επιφανειοδραστικού, ώστε να βρεθεί ο καλύτερος τύπος του γαλακτωματοποιητή αλλά και η βέλτιστη αναλογία αυτού. Κατασκευή Διαγραμμάτων Φάσης με χημικούς γαλακτωματοποιητές Τα μερικά (partial) τριαδικά διαγράμματα φάσης των μικρογαλακτωμάτων με βάση το ελαιόλαδο και τους χημικούς γαλακτωματοποιητές στους 40 o C παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Ο σχηματισμός μικρογαλακτωμάτων προσδιορίστηκε με οπτική παρατήρηση. Η περιοχή κάτω από τη γραμμή τάσης στο διάγραμμα φάσης περιγράφει το πεδίο των αναλογιών των τριών συστατικών που με ανάμιξή τους μπορούν να αποδώσουν μικρογαλάκτωμα. Αύξηση της συγκέντρωσης των γαλακτωματοποιητών είχε ως αποτέλεσμα τη διαλυτοποίηση μεγαλύτερης ποσότητας νερού στο σύστημα με μορφή μικρογαλακτώματος. Σε ένα σύστημα μικρογαλακτώματος, η συγκέντρωση του γαλακτωματοποιητή πρέπει γενικώς να είναι υψηλή, ώστε να παρέχεται ο αριθμός των επιφανειοδραστικών μορίων που απαιτούνται για τη σταθεροποίηση των μικροσταγονίδιων που παράγονται κατά την ομογενοποίηση του μικρογαλακτώματος [12]. Στα περισσότερα από τα συστήματα που μελετήθηκαν, συγκέντρωση του γαλακτωματοποιητή μεγαλύτερη από 30% w/w είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία παχύρευστου μίγματος.
a, b, c, d, e, f, Σχήμα 1. Μερικά τριαδικά διαγράμματα φάσης μικρογαλακτωμάτων με ελαιόλαδο - νερό και χημικούς γαλακτωματοποιητές στους 40 C. Η συγκέντρωση του γαλακτωματοποιητή αυξάνεται από τα αριστερά προς τα δεξιά και η συγκέντρωση του νερού από κάτω προς τα πάνω (a. Tween 20, b. Tween 40, c. Tween 60, d. Tween 80, e. Span 20, f. Span 80 αντιστοίχως) Όπως προκύπτει από τα διαγράμματα φάσης, οι περισσότεροι γαλακτωματοποιητές πολυοξυαιθυλενικής σορβιτάνης (Tweens) παρουσίασαν μέτρια γαλακτωματοποιητική ικανότητα στο μελετούμενο σύστημα. Ο γαλακτωματοποιητής Span 20 αποδείχθηκε ότι έχει την πιο αποτελεσματική γαλακτωματοποιητική ικανότητα - προσθήκη 27,5% w/w αυτού πέτυχε 8,39% w/w διασπορά νερού. Αυτό είναι θεωρητικά αναμενόμενο, δεδομένου ότι το Span 20 έχει τιμή HLB 8,6 ενώ για συστήματα μικρογαλακτωμάτων w/o με ελαιόλαδο απαιτούνται χαμηλές τιμές HLB [13]. Ακολουθούμενος από το Span 20, ο γαλακτωματοποιητής Tween 40 είχε τις καλύτερες ιδιότητες γαλακτωματοποίησης - μέγιστο διεσπαρμένο νερό 5,5% w/w με προσθήκη 17,5% w/w Tween 40 στο τελικό μίγμα. Εκτός από την περιοχή μικρογαλακτώματος, στα διαγράμματα φάσης παρατηρήθηκαν μεγάλες κρυσταλλικές (LC) περιοχές οι οποίες χαρακτηρίζονται από αστάθεια και θολότητα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι από τη μελέτη προέκυψε ότι η διαλυτοποίηση νερού σε ένα σύστημα τριών συστατικών του ελαιόλαδου είναι εφικτή, χωρίς προσθήκη συνεπιφανειοδραστικής ουσίας. Με βάση τα διαγράμματα φάσης προσδιορίστηκε το εύρος παρασκευής μικρογαλακτώματος. Οι χημικοί γαλακτωματοποιητές, Tween 20, 40, 60, 80 και Span 20, 80 δοκιμάστηκαν για την ικανότητά τους να σχηματίσουν w/o συστήματα μικρογαλακτωμάτων με ελαιόλαδο σε σταθερές επιλεγμένες αναλογίες βάρους και ερευνήθηκαν ο τύπος και οι ιδιότητες των γαλακτωμάτων. Προσδιορισμός Σταθερότητας Γαλακτωμάτων Τα εμπορικά γαλακτώματα είναι σημαντικό να διαθέτουν μεγάλο χρόνο ζωής και σταθερά ποιοτικά χαρακτηριστικά. Για αυτό εξετάστηκε η σταθερότητα των συστημάτων και η επίδραση του χρόνου στο Δείκτη Σταθερότητας Γαλακτώματος (ESI). Η σταθερότητα όλων των w/o μικρογαλακτωμάτων (Πίνακας 1) μειώθηκε σημαντικά (P<0,05) κατά τη διάρκεια της 2-μηνης περιόδου αποθήκευσης. Οπτική παρατήρηση έδειξε ότι τα μικρογαλακτώματα δεν παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές στην εμφάνισή τους κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Ο γαλακτωματοποιητής Span 20 αποδείχθηκε πιο αποτελεσματικός από τους άλλους γαλακτωματοποιητές στη φυσική σταθερότητα των γαλακτωμάτων, όπου λόγω της χαμηλής τιμής HLB αυτού οδήγησε σε υψηλότερη σταθερότητα. Η σταθεροποιητική επίδραση του Span 20 μπορεί να εξηγηθεί από την υψηλή αρνητική τιμή του ζ-δυναμικού αυτού [14]. Γενικά οι Tween 20, Tween 40 και Span 20 βρέθηκαν σημαντικώς (P<0,05) πιο αποτελεσματικοί στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων (Πίνακας 1), ενώ οι
γαλακτωματοποιητές Tween 60 και Span 80 αποδείχτηκαν μη αποτελεσματικοί. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τα μικρογαλακτώματα με χαμηλή αναλογία γαλακτωματοποιητή είχαν τάση να κορυφώνονται, ενώ τα μικρογαλακτώματα με υψηλή αναλογία γαλακτωματοποιητή έτειναν να δημιουργούν ίζημα. Αυτό συμβαίνει, επειδή οι γαλακτωματοποιητές με χαμηλές τιμές HLB είναι περισσότερο λιπόφιλοι, ενώ οι εκείνοι με υψηλές τιμές HLB είναι περισσότερο υδρόφιλοι. Ιδανικές αναλογίες γαλακτωματοποιητή αποδείχθηκαν από 6-8% w/w στο τελικό μίγμα. Πίνακας 1. Σταθερότητα μικρογαλακωμάτων με χρήση χημικών γαλακτωματοποιητών Γαλακτωματοποιητής ESI % ανά βδομάδα αποθήκευσης Αναλογία (oil-surf-wat) 1 2 3 4 5 6 7 8 Τυφλό 98:0:2 99 98,5 98 98 98 98 98 98 88:10:2 100 100 99,5 99 97,5 96,5 95,5 94 Tween 20 Tween 40 Tween 60 Tween 80 Span 20 Span 80 90:8:2 100 100 100 99,5 98 97,5 97 96 92:6:2 100 100 100 100 99 99 98 98 94:4:2 100 100 100 100 99 99 98 98 96:2:2 100 99,5 99,5 100 99 99 98,5 98,5 88:10:2 100 100 99,5 97 97,5 97 96 95 90:8:2 100 100 100 97,5 97,5 97,5 98 96,5 92:6:2 100 100 100 97,5 97,5 97,5 98 97 94:4:2 100 100 100 99 98 98 98,5 98 96:2:2 99,5 99,5 100 99 99 99 98,5 98 88:10:2 100 99 98,5 97,5 97 95 93 93 90:8:2 100 100 100 98 97 96 94,5 94,5 92:6:2 100 100 100 99 97,5 96,5 95 94,5 94:4:2 99 100 100 99 98 97 96 95 96:2:2 99 100 99,5 99 98,5 98 96 97 88:10:2 100 99 99,5 98 98 96,5 95,5 95,5 90:8:2 100 100 100 98,5 98,5 97,5 95,5 95,5 92:6:2 100 100 100 99 99,5 98 97,5 96,5 94:4:2 100 99,5 100 99 99,5 98,5 97 96,5 96:2:2 100 99 100 99 98,5 98,5 97,5 97,5 88:10:2 100 99,5 99 98,5 98,5 97,5 96 96 90:8:2 100 100 100 99,5 99 98 97 97 92:6:2 100 100 100 100 100 99,5 98 98 94:4:2 100 100 100 100 100 100 99 99 96:2:2 100 99 99 100 100 100 100 99 88:10:2 100 99,5 99 98 97,5 96 95 95 90:8:2 100 100 100 98,5 98 97,5 96 95 92:6:2 100 100 100 100 98,5 98,5 97,5 96 94:4:2 100 100 100 99,5 99 98,5 97,5 96 96:2:2 100 99 100 99 98,5 98,5 98 96
Προσδιορισμός Μεγέθους Σταγονιδίων και Διασποράς Προκειμένου να αξιολογηθεί το μέγεθος, ο δείκτης διασποράς και το ζ-δυναμικό των διεσπαρμένων σταγονιδίων διεξήχθησαν μετρήσεις Δυναμικής Σκέδασης του Φωτός (DLS) στα μικρογαλακτώματα. Σχήμα 2. Επίδραση του είδους και της αναλογίας του γαλακτωματοποιητή στη Μέση Διάμετρο των σταγονιδίων (nm) των μικρογαλακτωμάτων Η κατανομή μεγέθους σωματιδίων θεωρείται ως το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό για την αξιολόγηση της σταθερότητας των γαλακτωμάτων [15]. Έχουν πραγματοποιηθεί έρευνες σχετικά με το πώς επιδρούν τα συστατικά του συστήματος στο μέγεθος των σταγονιδίων. Το Σχήμα 2 δείχνει το μέσο μέγεθος των σωματιδίων των μικρογαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν σε σχέση με την περιεκτικότητα του γαλακτωματοποιητή (% w/w) στο μίγμα. Τόσο το είδος του γαλακτωματοποιητή όσο και η αναλογία του είχαν σημαντική επίδραση στη μέση διάμετρο των σταγονιδίων (P<0,05). Το μέγεθος των σταγονιδίων έτεινε να μειώνεται αυξανομένης της αναλογίας του γαλακτωματοποιητή. Κατώτερες μέσες τιμές διαμέτρου έδειξαν τα γαλακτώματα που παρασκευάστηκαν με Tween 40, Tween 20 και Span 20. Το μικρότερο μέγεθος των σταγονιδίων επιτεύχθηκε με Tween 40, 6% w/w και ήταν 45 nm. Σχήμα 3. Επίδραση είδους και αναλογίας γαλακτωματοποιητή στο δείκτη πολυδιασποράς ΡDI των μικρογαλακτωμάτων
Ο δείκτης πολυδιασποράς PDI υποδεικνύει ουσιαστικά τον τρόπο με τον οποίο τα σταγονίδια διασπείρονται στη συνεχή φάση. Χαμηλό PDI σημαίνει μονοδιεσπαρμένα γαλακτώματα με υψηλή σταθερότητα, ενώ υψηλό PDI πολυδιεσπαρμένα γαλακτώματα με χαμηλή σταθερότητα αντίστοιχα. Το Σχήμα 3 δείχνει την πολυδιασπορά των γαλακτωμάτων που μελετήθηκαν. Τόσο το είδος του γαλακτωματοποιητή όσο και η αναλογία επηρέασαν σημαντικά το PDI (P<0,05). Οι περισσότεροι γαλακτωματοποιητές από τους εξετασθέντες έδειξαν χαμηλή πολυδιασπορά (Tween 20, 40, 80, Span 20) (Σχήμα 3). Τα καλύτερα αποτελέσματα έδωσαν οι γαλακτωματοποιητές Tween 40 και Tween 80. Ο γαλακτωματοποιητής Tween 60 έδειξε υψηλό δείκτη πολυδιασποράς, πιθανώς επειδή δεν διαλυτοποιείται επαρκώς στη θερμοκρασία ομογενοποίησης (40 o C). Προσδιορισμός ζ-δυναμικού Για την περαιτέρω μελέτη των μικρογαλακτωμάτων προσδιορίστηκε το ζ-δυναμικό τους. Για μικρογαλακτώματα με μη-ιονικά επιφανειοδραστικά συστατικά το ζ-δυναμικό (Σχήμα 4) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσει το φορτίο του συστήματος. Στην παρούσα μελέτη η επίδραση των διαφόρων γαλακτωματοποιητών προσδιορίστηκε καθώς και η αναλογία τους στην οποία προστέθηκαν στο σύστημα. Τόσο το είδος όσο και η αναλογία του γαλακτωματοποιητή επηρέασαν σημαντικά το ζ-δυναμικό των γαλακτωμάτων (P<0,05). Το ζ-δυναμικό προσδιορίζεται από την ηλεκτροφορητική κινητικότητα των διεσπαρμένων σταγονιδίων. Το ζ-δυναμικό αποτελεί μέτρο της σταθερότητας του γαλακτώματος. Υψηλές απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού αντιστοιχούν σε σταθερές διασπορές, ενώ χαμηλές τιμές ζ- δυναμικού είναι ενδεικτικές της αστάθειας της διασποράς και μπορεί να οδηγήσουν σε συσσωμάτωση [16]. Όλοι οι γαλακτωματοποιητές που εξετάστηκαν ενήργησαν κατά παρόμοιο τρόπο και μπορούν να ομαδοποιηθούν στατιστικά με εξαίρεση το Tween 60. Μεγαλύτερες αρνητικές τιμές ζ-δυναμικού έδειξαν οι γαλακτωματοποιητές Span 20 και Tween 20. Ο γαλακτωματοποιητής Tween 60 είχε τις μικρότερες τιμές ζ- δυναμικού, γεγονός που σημαίνει χαμηλή σταθερότητα. Πράγματι, η μελέτη του ESI% επιβεβαίωσε ότι τα μικρογαλακτώματα με Tween 60 είχαν χαμηλή σταθερότητα. Σχήμα 4. Επίδραση είδους και αναλογίας γαλακτωματοποιητή στο ζ-δυναμικό (mv) των μικρογαλακτωμάτων Προσδιορισμός Θολότητας Η σταθερότητα των μικρογαλακτωμάτων διερευνήθηκε επίσης με τη βοήθεια των μετρήσεων θολότητας. Τα διαυγή και ομοιογενή γαλακτώματα υποδηλώνεται ότι είναι παράλληλα μονοδιεσπαρμένα μικρογαλακτώματα [17]. Στην παρούσα μελέτη, οι τιμές θολότητας
κυμάνθηκαν από 26 έως 751 NTU (Σχήμα 5). Τόσο το είδος, καθώς και η αναλογία του γαλακτωματοποιητή επηρέασαν (Ρ<0,05) σημαντικά τη θολότητα των γαλακτωμάτων. Η θολότητα του μικρογαλακτώματος έτεινε να μειώνεται με αύξηση της συγκέντρωσης του γαλακτωματοποιητή. Οι χαμηλότερες τιμές θολότητας προέκυψαν από τους Tween 20, 40 και Span 20 (Πίνακες 2, 3), Είναι αξιοσημείωτο ότι η αρχική θολότητα του τυφλού γαλακτώματος χωρίς την προσθήκη επιφανειοδραστικού συστατικού ήταν 2547 ΝΤU, γεγονός που οφείλεται στο μεγάλο βαθμό πολυδιασποράς των σταγονιδίων του νερού στη συνεχή φάση του ελαιόλαδου. Σχήμα 5. Επίδραση είδους και αναλογίας γαλακτωματοποιητή στη θολότητα (NTU) των μικρογαλακτωμάτων ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Από τα αποτελέσματα της μελέτη προέκυψε ότι είναι εφικτή η παρασκευή σταθερών μικρογαλακτωμάτων με ελαιόλαδο χωρίς την προσθήκη συν-επιφανειοδραστικής ουσίας. Από τους γαλακτωματοποιητές που μελετήθηκαν, οι Span 20, Tween 40 και Tween 20 βρέθηκαν ότι έχουν τις καλύτερες ιδιότητες γαλακτωματοποιητικής ικανότητας. Σε γενικές γραμμές, η χρήση του Span 20 βρέθηκε πιο αποτελεσματική στη φυσική σταθερότητα από ότι τη χρήση των άλλων γαλακτωματοποιητών (ESI%). Κατώτερη Μέση τιμή Διαμέτρου σταγονιδίων είχαν τα γαλακτώματα που παρασκευάστηκαν με Tween 40, Tween 80 και Span 20. Ανώτερες απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού έδωσαν οι γαλακτωματοποιητές Span 20 και Tween 20. Χαμηλότερες τιμές θολότητας έδωσαν το Tween 20 και Span 20. Ο γαλακτωματοποιητής Tween 60 δεν εμφάνισε καλά αποτελέσματα - τα μικρογαλακτώματα με Tween 60 είχαν μεγάλη θολότητα, χαμηλή σταθερότητα και υψηλό δείκτη πολυδιασποράς. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Lawrence M.J., Rees G.D., Microemulsion-based media as novel drug delivery systems, Adv Drug Deliv Rev 45:89 121, (2000). [2] Velikov K.P., Pelan E., Colloidal delivery systems for micronutrients and nutraceuticals, Soft Matter 4:1964 1980, (2008).
[3] Tadros T.F., Emulsion science and Technology: A general Introduction, Emulsion Science and Technology,, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co, KGaA, Weinheim, (2009), pp, 1 56. [4] McClements D.J., Rao J., Food-grade nanoemulsions: formulation, fabrication, properties, performance, biological fate, and potential toxicity, Crit Rev Food Sci Nutr 51:285 330, (2011). [5] Ambrosone L., Cinelli G., Mosca M., Ceglie A., Susceptibility of Water-Emulsified Extra Virgin Olive Oils to Oxidation, JAOCS 83: 165-170, (2006). [6] Bera A., Ojha K., Kumar T., Manda A., Water solubilization capacity, interfacial compositions and thermodynamic parameters of anionic and cationic microemulsions, Colloids Surf A 404:70 77, (2012). [7] Naouli N., Rosano H.L, Nonionic Microemulsion: Mechanism of Formation and Percolation, J Dispersion Sci Technol 30:370 378, (2009). [8] Cho Y.H., Kim S., Bae E.K., Mok C.K., Park J., Formulation of a Cosurfactant-Free O- W Microemulsion Using Nonionic Surfactant Mixtures, J Food Sci 73:115-121, (2008). [9] Fanun M., Microemulsions formation on water/nonionic surfactant/peppermint oil mixtures, J, Dispersion Sci, Technol, 30:399-405, (2009). [10] McClements D.J., Critical Review of Techniques and Methodologies for Characterization of Emulsion Stability, Crit Rev Food Sci Nutr 47:611 649, (2007). [11] Kralova I., Sjoblom J., Surfactants used in food industry: A review, J Dispersion Sci Technol 30: 1363 1383, (2009). [12] Bayrak Y, Iscan M, Studies on the phase behavior of the system non-ionic surfactant/alcohol/alkane/h2o, Colloids Surf A, 268:99-103, (2005). [13] Patel M.R., Patel R.B., Parikhl J.R., Bhatt K., Kundawala A.J., Microemulsions: As Novel Drug Delivery Vehicle, Pharmaceutical Reviews 5:6 (2007). [14] Whitehurst R.J. (2004) Emulsifiers in Food Technology, Blackwell Publishing, UK, [15] McClements D.J., Colloidal basis of emulsion color, Curr Opin Colloid Interface Sci 7:451 455 (2002). [16] Aken van G.A., Vingerhoeds M.H., Wijk R.A. Textural perception of liquid emulsions: Role of oil content, oil viscosity and emulsion viscosity, Food Hydrocolloid 25:789 796, (2011). [17] Garti N., Spernath A., Aserin A., Lutz R., Nano-sized self-assemblies of nonionic surfactants as solubilization reservoirs and microreactors for food systems, Soft Matter 1: 206-218 (2005).