ΕΓΚΛΩΒΙΣΜΟΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΣΕ ΠΟΛΥΜΕΡΗ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ

Transcript

1 ΕΓΚΛΩΒΙΣΜΟΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΣΕ ΠΟΛΥΜΕΡΗ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ Α. Γαϊτανάρου, Μ. Ρουσσάκη, Α. Δέτση Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Αθήνα Σ. Βουγιούκα, Κ. Παπασπυρίδης Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εργαστήριο Τεχνολογίας Πολυμερών, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σημαντικό μέρος της έρευνας που διεξάγεται σήμερα σχετικά με τη βελτίωση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων βιοδραστικών μορίων, έχει ως στόχο την ανάπτυξη νέων μεθόδων μεταφοράς φαρμάκων (Drug Delivery), συμπεριλαμβανομένων των τεχνικών εγκλωβισμού μορίων σε νανοσωματίδια. Σκοπός της εργασίας αυτής, είναι ο εγκλωβισμός βιοδραστικών μορίων, συγκεκριμένα κινολινυλο-χαλκονών και ωρονών, σε νανοσωματίδια πολυμερών, με σκοπό αφενός την αύξηση της διαλυτότητάς τους in vivo και αφετέρου τη μείωση της κυτταροτοξικότητάς τους. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι χαλκόνες (1,3-διφαινυλο-2-προπεν-1-όνες) είναι φυσικά προϊόντα, πρόδρομες ενώσεις για τη βιοσύνθεση των φλαβονοειδών. Απαντώνται ευρύτατα σε συνήθη λαχανικά και φρούτα και εμφανίζουν, μεταξύ άλλων, αξιόλογη αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αντιπαρασιτική, αντικαρκινική και αντιβακτηριακή δράση [1]. Οι κινολινόνες είναι ετεροκυκλικές αζωτούχες ενώσεις των οποίων το σύστημα συμπυκνωμένων δακτυλίων απαντά σε μεγάλο αριθμό αλκαλοειδών. Ανήκουν στην κατηγορία των προνομιούχων ενώσεων καθώς επιδέχονται σημαντικές δομικές τροποποιήσεις και επιτρέπουν τη μελέτη της σχέσης δομής-βιολογικής δραστικότητας. Παρουσιάζουν μεγάλο εύρος βιολογικών ιδιοτήτων, όπως αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη, αντιβιοτική και αντιπαρασιτική [2]. Η σύνθεση υβριδικών μορίων που συνδυάζουν το α,βακόρεστο καρβονυλικό σύστημα της χαλκόνης με το ετεροκυκλικό σύστημα της κινολινόνης στον ίδιο δομικό σκελετό, οδηγεί σε νέα παράγωγα με σημαντική αντιπαρασιτική δράση [3]. Οι ωρόνες (Ζ-2-βενζυλιδενοβενζοφυραν-3-(2Η)-όνες) αποτελούν μια κατηγορία φλαβονοειδών οι οποίες απαντώνται σπανιώτερα στη φύση. Οι κύριες φυσικές πηγές τους είναι είναι ανθοφόρα φυτά, φτέρες, βρύα και καφέ θαλάσσια φύκια. Αντιπροσωπευτικές φυσικές ωρόνες είναι η ωρεοσιδίνη, η σουλφουρετίνη και η μαριτιμετίνη. Η δράση αυτής της κατηγορίας ενώσεων δεν έχει μελετηθεί εκτενώς, πρόσφατες μελέτες όμως αποδεικνύουν ότι διαθέτουν σημαντική αντιοξειδωτική, αντιπαρασιτική, αντικαρκινική και αντιβακτηριακή δράση [1, 4]. Στην παρούσα εργασία, θα μελετηθεί η δυνατότητα εγκλεισμού σε νανοσωματίδια δύο ενώσεων που παρασκευάστηκαν στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας και έχουν μελετηθεί για τη βιολογική τους δράση. Για τη μελέτη, επιλέχθηκαν η κινολινυλο-χαλκόνη (1) (Σχήμα

2 1), η οποία εμφανίζει ισχυρή δράση έναντι των παρασίτων Trypanosoma brucei και Leishmania infantum αλλά είναι κυτταροτοξική και εμφανίζει πολύ περιορισμένη διαλυτότητα στους κοινούς οργανικούς διαλύτες ενώ είναι αδιάλυτη στο νερό, και η ωρεοσιδίνη (2) (Σχήμα 1), μια φυσική ωρόνη με ισχυρή αντιοξειδωτική και αντικαρκινική δράση. Σχήμα 1. Βιοδραστικά μόρια κινολινυλο-χαλκόνης και ωρεοσιδίνης Ο εγκλεισμός ουσιών σε μικρο-νανοσωματίδια πραγματοποιείται για διάφορους λόγους, όπως την προστασία ευαίσθητων ενεργών ουσιών από περιβαλλοντικούς παράγοντες, τη μείωση της πτητικότητάς τους, τη βελτίωση φυσικών ή χημικών ιδιοτήτων τους, τη διαχείριση τοξικών ουσιών και την ελεγχόμενη αποδέσμευση δραστικών ουσιών στο περιβάλλον [5, 6]. Οι τεχνικές εγκλωβισμού ουσιών σε νανοσωματίδια πολυμερούς μπορούν να καταταχθούν σε δυο κύριες κατηγορίες: α) παρασκευή νανοσωματιδίων με in situ πολυμερισμό και β) παρασκευή από προσχηματισμένα πολυμερή. Στην πρώτη περίπτωση, χρησιμοποιούνται κατάλληλα μονομερή είτε διεσπαρμένα στη συνεχή φάση ενός γαλακτώματος, είτε διαλυμένα σε κάποιο μη-διαλύτη του πολυμερούς, προκειμένου να είναι δυνατό να διαχωριστούν στο τέλος τα πολυμερικά νανοσωματίδια, από τα μονομερή που δεν αντέδρασαν. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιούν διαλύματα προσχηματισμένων πολυμερών, όπως στην περίπτωση της τεχνικής που εφαρμόστηκε για τη συγκεκριμένη εργασία, δηλαδή της γαλακτωματοποίησης με ταυτόχρονη εξάτμιση του οργανικού διαλύτη. Κατά την τεχνική αυτή, μια οργανική φάση, που αποτελείται από το διάλυμα του πολυμερούς και της ενεργούς ουσίας, αναμιγνύεται με μια υδατική φάση η οποία περιέχει σε κατάλληλη ποσότητα μια επιφανειοδραστική ουσία, όπως η πολυ-(βινυλική αλκοόλη) (PVA). Σχηματίζεται με αυτό τον τρόπο ένα γαλάκτωμα από το οποίο αφήνεται να εξατμιστεί ο οργανικός διαλύτης και τα σχηματιζόμενα νανοσωματίδια συλλέγονται με φυγοκέντρηση και επαναδιαλύονται σε απεσταγμένο νερό. Τα χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων που σχηματίζονται εξαρτώνται από διάφορους παράγοντες, όπως ο τύπος και η συγκέντρωση του πολυμερούς, το είδος της επιφανειοδραστικής ουσίας και η συγκέντρωσή της στο υδατικό διάλυμα, το μέσο μοριακό βάρος του πολυμερούς που χρησιμοποιείται, η αναλογία υδατικής οργανικής φάσης του γαλακτώματος, ο ρυθμός ανάδευσης κι η θερμοκρασία κατά το σχηματισμό του γαλακτώματος, καθώς και ο τύπος του οργανικού διαλύτη. Ανάλογα με τις επιθυμητές ιδιότητες για κάθε εφαρμογή, επιλέγονται και οι κατάλληλες συνθήκες [7]. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ α. Σύνθεση των βιοδραστικών ενώσεων α1. Σύνθεση της κινολινυλο-χαλκόνης (1).

3 Η σύνθεση του παραγώγου 1 πραγματοποιήθηκε μέσω μικτής αλδολικής συμπύκνωσης μεταξύ της 3-ακετυλο-4-υδροξυ-2(1Η)-κινολινόνης (3) και της 3,5-δι-tert-βουτυλ-4- υδροξυβενζαλδεΰδης (4), παρουσία πιπεριδίνης σε διαλύτη αιθανόλη. (Σχήμα 2). Το τελικό προϊόν παραλήφθηκε σε μορφή κίτρινου στερεού, μετά από οξίνιση του μίγματος της αντίδρασης με υδατικό διάλυμα HCl 10%. Σχήμα 2. Σύνθεση της κινολινυλο-χαλκόνης 1 α2. Σύνθεση της ωρεοσιδίνης (2). Η σύνθεση της ωρεοσιδίνης (2) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε πρόσφατα στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας [1] (Σχήμα 3). Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η προστασία των φαινολικών υδροξυλίων της 2,4,6-τρι-υδροξυ-ακετο-φαινόνης (5) και της 3,4- δι-υδροξυ-βενζαλδεΰδης (6) με κατάλληλη προστατευτική ομάδα (μεθοξυμεθυλενο-ομάδα, ΜΟΜ), οι οποίες στη συνέχεια αντέδρασαν σε βασικό περιβάλλον προς το σχηματισμό της αντίστοιχης χαλκόνης (7). Η χαλκόνη κυκλοποιήθηκε οξειδωτικά, χρησιμοποιώντας οξικό υδράργυρο σε διαλύτη πυριδίνη, οπότε μετά από κατάλληλη επεξεργασία παρελήφθη η ωρόνη (8). Απομάκρυνση των προστατευτικών ΜΟΜ-ομάδων με ήπια θέρμανση σε μίγμα μεθανόλης-υδατικού διαλύματος HCl 10% οδήγησε στην παραλαβή της ωρεοσιδίνης (2). Σχήμα 3. Σύνθεση της ωρεοσιδίνης (2)

4 Η ταυτοποίηση της δομής των ενώσεων που παρασκευάστηκαν πραγματοποιήθηκε με Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR). β.1. Παρασκευή Πολυμερικών Σωματιδίων Μεταξύ των διαφόρων μεθοδολογιών που έχουν αναπτυχθεί για την παρασκευή νανοσωματιδίων από πολυγαλακτικό οξύ (PLA), επιλέχθηκε η μέθοδος γαλακτωματοποίησης - εξάτμισης του οργανικού διαλύτη, λόγω του ότι οι ενώσεις που εγκλωβίστηκαν είναι υδρόφοβες. Χρησιμοποιήθηκαν προσχηματισμένα πολυμερή, των οποίων το μέσου αριθμού μοριακό βάρος προσδιορίστηκε στα g/mol, μετά από μετρήσεις ιξωδομετρίας. Σύμφωνα με τη μέθοδο, παρασκευάστηκε διάλυμα του πολυμερούς σε ακετόνη σε συγκέντρωση 10 mg/ml. Παράλληλα, παρασκευάστηκε υδατικό διάλυμα πολυ-(βινυλικής αλκοόλης) (PVA) περιεκτικότητας 1% w/v με ανάδευση για μια ώρα στους 45 C. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν 30 ml από το υδατικό διάλυμα της PVA σε ποτήρι ζέσεως και υπό ανάδευση σε μαγνητικό αναδευτήρα πραγματοποιήθηκε η έγχυση 2 ml του διαλύματος του πολυμερούς με τη χρήση σύριγγας. Κατά την ανάμιξη της οργανικής με την υδατική φάση, παρατηρήθηκε ο σχηματισμός γαλακτώματος. Η ανάδευση συνεχίστηκε για 10 min στο μαγνητικό αναδευτήρα και ακολούθησε τοποθέτηση του γαλακτώματος σε αναδευτήρα (shaker), στα 90 rpm για 5 ώρες, με στόχο την αργή εξάτμιση του οργανικού διαλύτη και το σχηματισμό των σωματιδίων PLA. Η απομόνωση των σωματιδίων από το υδατικό διάλυμα πραγματοποιείται με φυγοκέντρηση. Η πρώτη φυγοκέντρηση εφαρμόζεται για 5 min, στους 15 C και σε rpm, για την καταβύθιση των μεγαλύτερων σωματιδίων. Το υπερκείμενο ανακτάται και φυγοκεντρείται για 20 min, στους 10 C και σε rpm. Το υπερκείμενο αυτής της φυγοκέντρησης (S1) απομακρύνεται και τα νανοσωματίδια που έχουν σχηματιστεί είναι ευδιάκριτα ως συσσωμάτωμα. Ξεπλένονται με απιονισμένο νερό, για απομάκρυνση της PVA που είχε κατακαθίσει παρασυρόμενη από τα σωματίδια του PLA και αφού επαναδιαλυθούν τα σωματίδια στο νερό, τοποθετούνται για τρίτη φορά στη φυγόκεντρο στις ίδιες συνθήκες με την προηγούμενη φορά, δηλαδή για 20 min, στους 10 C και σε rpm. Τέλος, το υπερκείμενο (S2) αποθηκεύεται σε κλειστή κωνική φιάλη και τα σωματίδια διαλύονται με περίπου 5 ml απιονισμένο νερό. Το διάλυμα των σωματιδίων αποθηκεύεται σε φιαλίδιο και ακολουθεί ο χαρακτηρισμός του. β.2. Εγκλωβισμός Ενώσεων σε Πολυμερικά Σωματίδια Η διαδικασία είναι παρόμοια με αυτήν που περιγράφηκε παραπάνω. Παρασκευάστηκε διάλυμα της εκάστοτε ένωσης σε οργανικό διαλύτη, διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) για τη χαλκόνη και μεθανόλη για την ωρεοσιδίνη, σε συγκέντρωση 10 mg/ml. Ακολουθεί η ανάμιξη 300 μl του διαλύματος αυτού με 1,5 ml του διαλύματος του πολυμερούς σε ακετόνη και η έγχυση αυτού του οργανικού διαλύματος σε 15 ml υδατικού διαλύματος PVA 1% w/v. Στη συνέχεια η διαδικασία συνεχίζεται όπως αναφέρθηκε παραπάνω, με τη διαφορά ότι το υπερκείμενο της δεύτερης φυγοκέντρησης (S1) δεν απορρίπτεται, αλλά φυλάσσεται και αυτό σε κλειστή κωνική φιάλη. γ. Χαρακτηρισμός Νανοσωματιδίων Ο χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων αναφορικά με το μέγεθος, το ζ-δυναμικό και τον δείκτη πολυδιασποράς τους, πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθόδου δυναμικής σκέδασης φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS).

5 Η ικανότητα εγκλωβισμού των μορίων στα νανοσωματίδια (encapsulation efficiency), προσδιορίστηκε εμμέσως, με τη χρήση φασματοσκοπίας απορρόφησης υπεριώδους-ορατού (UV-Vis). Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των μη εγκλωβισμένων ενώσεων στα διαλύματα S1 και S2, δηλαδή στα υπερκείμενα των φυγοκεντρήσεων, μέσω σύγκρισης με καμπύλη αναφοράς. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού των νανοσωματιδίων φαίνονται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά νανοσωματιδίων PLA, μετρήσεις DLS PLA PLA_ΧΑΛΚΟΝΗ PLA_ΩΡΟΝΗ T ( C) Διάμετρος (nm) 240,9 260,3 298,8 264,1 232,2 PdI 0,109 0,100 0,267 0,128 0,123 Z-δυναμικό (mv) -2,00 ± 0,01-1,42 ± 0,70-2,32 ± 0,34-6,64 ± 0,26-6,56 ± 0,92 Συγκρίνοντας μεταξύ τους τις τιμές που προκύπτουν για σχηματισμό γαλακτώματος σε θερμοκρασία δωματίου (25 C), παρατηρείται ότι όταν τα νανοσωματίδια περιέχουν κάποια από τις δυο ενώσεις, το μέγεθός τους αυξάνεται ελαφρώς, ενώ δεν υπάρχει σημαντική διαφορά ανάλογα με το εάν το μόριο που εγκλωβίζεται είναι η χαλκόνη ή η ωρεοσιδίνη. Επιπλέον, οι δείκτες πολυδιασποράς (Pdl) είναι σχετικά ικανοποιητικοί, εφόσον βρίσκονται κοντά στην περιοχή του 0.1, τιμή για την οποία το δείγμα θεωρείται ομοιογενές. Επίσης, το ζ- δυναμικό των σωματιδίων κυμαίνεται μεταξύ -1,42 mv και -6,64 mv δε φαίνεται επομένως να διαφοροποιείται σημαντικά μετά τον εγκλωβισμό των ενώσεων. Η αύξηση της θερμοκρασίας γαλακτωματοποίησης στους 35 ο C φαίνεται ότι επηρεάζει τα χαρακτηριστικά των σωματιδίων: όσον αφορά στον εγκλωβισμό της ωρεοσιδίνης, όταν αυξάνεται η θερμοκρασία γαλακτωματοποίησης το μέγεθος των σωματιδίων μειώνεται. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στο χαμηλότερο ιξώδες του διαλύματος του πολυμερούς, το οποίο συνήθως αναμένεται να οδηγεί σε μικρότερου μεγέθους νανοσωματίδια [6]. Η σταθερότητα των νανοσωματιδίων όμως δε φαίνεται να επηρεάζεται στην περίπτωση αυτή, δηλαδή από - 6,64 mv αναπτύσσεται δυναμικό -6,56 mv. Οι παρατηρήσεις αυτές δεν ισχύουν στην περίπτωση εγκλωβισμού της χαλκόνης. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση αυτή το μέγεθος και το δυναμικό φαίνεται να αυξάνονται με την αύξηση της θερμοκρασίας, η μεταβολή όμως δεν είναι σημαντική. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Οι τεχνικές εγκλωβισμού μορίων σε νανοσωματίδια πολυμερούς αποτελούν σημαντικό μέρος της έρευνας με στόχο την ανάπτυξη εξελιγμένων μεθόδων μεταφοράς φαρμακευτικών ουσιών και τη βελτίωση φυσικοχημικών ιδιοτήτων βιοδραστικών μορίων. Στη συγκεκριμένη εργασία, πραγματοποιήθηκε αρχικά επιτυχώς η παρασκευή νανοσωματιδίων από πολυγαλακτικό οξύ (PLA), μέσω της μεθόδου γαλακτωματοποίησης - εξάτμισης του οργανικού διαλύτη που επιλέχθηκε. Επετεύχθη επίσης ο εγκλωβισμός των δύο συνθετικών βιοδραστικών μορίων, στα πολυμερικά σωματίδια του πολυγαλακτικού οξέος. Τα πολυμερικά σωματίδια με τα εγκλωβισμένα μόρια εμφανίζουν αρνητικό ζ-δυναμικό, ικανοποιητικό μέσο μέγεθος (~200 nm), καθώς και μικρή τιμή δείκτη πολυδιασποράς (~0.1).

6 Σκοπός της εργασίας, ήταν να μελετηθούν επιπλέον ορισμένοι παράγοντες οι οποίοι πιθανόν να ελέγχουν την ικανότητα εγκλωβισμού βιοδραστικών μορίων. Το μέσο μέγεθος των τελικών νανοσωματιδίων, αποτελεί τον σημαντικότερο παράγοντα στο σχεδιασμό και στην παρασκευή ανάλογων μορίων σε επίπεδο νανοκλίμακας, στα πλαίσια της βιο-κατανομής και της κινητικής βιοδραστικών μορίων in vivo. Πραγματοποιήθηκαν επομένως αρχικά, προσπάθειες εγκλωβισμού των μορίων υπό διαφορετική θερμοκρασία σχηματισμού του πολυμερικού γαλακτώματος, με ποικίλα αποτελέσματα. Τα ποσοστά εγκλωβισμού των δύο αυτών βιοδραστικών ενώσεων στα πολυμερικά νανοσωματίδια του πολυγαλακτικού οξέος, η αξιολόγηση της βιοδραστικότητας και τοξικότητας τους, καθώς και η μελέτη επιπλέον παραγόντων της διαδικασίας σχηματισμού νανοσωματιδίων, είναι υπό εξέταση. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστούμε την Αναπλ. Καθ. Ε. Παυλάτου για τις μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) και τον Λέκτορα Ε. Τόπακα για τη διάθεση της φυγοκέντρου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Detsi A., Majdalani Μ., Kontogiorgis C.A., Hadjipavlou-Litina D., Kefalas P., Bioorg. Med. Chem. 17: (2009). [2] Detsi A., Bouloumbasi D., Prousis K.C.,Koufaki M., Athanasellis G.,Melagraki G., Afantitis A., Igglessi-Markopoulou O., Kontogiorgis C., Hadjipavlou-Litina D.J., J. Med. Chem. 50: (2007). [3] K. Prousis, M. Roussaki, B. Hall, S. Wilkinson, S. Costa Lima, A. Cordeiro da Silva, A. Detsi, 12 th Drug Design & Development Seminar (DDDS) of the DGP Joint meeting with COST Action CM0801 and SFB 544, March 2011, Heidelberg, Germany. [4] Roussaki Μ., Costa Lima S., Kypreou A.-M., Kefalas P., Cordeiro da Silva A., Detsi A. Int. J. Med. Chem. Volume 2012, Article ID , doi: /2012/ [5] Finch A. C., «Polymers for microcapsule walls» Chemistry and Industry 18 (1985) [6] Ντίνη Ε. Δ., «Συστήματα Εγκλεισμού και Απόδοσης Βιοενεργών Ουσιών σε Μικρο- και Νανο- Κλίμακα», Διδακτορική Διατριβή, Τμήμα Χημικών Μηχανικών ΑΠΘ, Θεσσαλονίκη, 2004 [7] Gref, R., Domb, A., Quellec, P., Blunk, T., Muller, R.H., Verbavatz, J.M., Langer, R. Adv. Drug Deliv. Rev., 16: (1995).