Θεωρία των τεχνικών PCR και DGGE Γ. Κανινή Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τομέας Βοτανικής Πανεπιστήμιο Αθηνών
ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΡΟΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Καθαρισμός Αντίδραση PCR με universal primers Καθαρισμός προϊόντος PCR για DGGE + - DGGE + Spike DNA - Καθαρισμός, αραιώσεις
Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Έμμεσες μέθοδοι - απομόνωση βακτηριακών κυττάρων Ανάκτηση κυττάρων π.χ. με υπερήχους Αραίωση Φυγοκέντρηση - απομόνωση ολικού DNA Λυσοζύμη, απορρυπαντικά μειωμένη απόδοση χρονοβόρα βακτήρια προσροφημένα σε σωματίδια του εδάφους
Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Άμεσες μέθοδοι - απομόνωση DNA απευθείας από το δείγμα Απορρυπαντικά (SDS) Θερμοκρασία (70 ο C) Σπάσιμο κυττάρων με γυάλινα σφαιρίδια (glass beads) ή Λυσοζύμη Κύκλοι ψύξης (-70 ο C) - θέρμανσης (65 ο C) (thermal shock cycles) υψηλή συγκέντρωση παρεμποδιστών
ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΡΟΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Καθαρισμός Αντίδραση PCR με universal primers Καθαρισμός προϊόντος PCR για DGGE + - DGGE + Spike DNA - Καθαρισμός, αραιώσεις
Καθαρισμός DNA polysaccharides, urea, humic acids exhibit similar solubility to DNA they are not completely removed during classical extraction protocols (such as detergent, protease and phenolchloroform treatments) remain as contaminants in the final DNA preparations There is a central core with a high aromaticity andstrongcrosslinkage The peripheral functional groups are linked by bridge binding
Καθαρισμός DNA ion-exchange columns immunomagnetic separation size-exclusion chromatography anion-binding resins or spin columns
ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΡΟΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Καθαρισμός Αντίδραση PCR με universal primers Καθαρισμός προϊόντος PCR για DGGE + - DGGE + Spike DNA - Καθαρισμός, αραιώσεις
Αντίδραση PCR PCR is DNA replication in a test tube Invented by Kary Mullis 1983 Mullis and Faloona, 1987: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction Nobel Prize 1993
Αντίδραση PCR σύνθεση μονόκλωνων τμημάτων δεσοξυριβονουκλεοτιδίων (primers) συμπληρωματικών για τα δυο άκρα της αλληλουχίας / γονιδίου στόχου προκαλείται αποδιάταξη του δίκλωνου μορίου DNA, προσδένονται τα συμπληρωματικά μονόκλωνα μόρια στα άκρα της αλληλουχίας στόχου και η DNA πολυμεράση επιμηκύνει συνθέτοντας συμπληρωματική αλυσίδα επανάληψη της διαδικασίας οδηγεί σε εκθετικό πολλαπλασιασμό της αλληλουχίας στόχου ξεκινώντας από 1 αντίγραφο του γονιδίου μετά από 35 επαναλήψεις θα έχουμε 23 6 αντίγραφα (68. 10 9 )
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης DNA πολυμεράση
DNA πολυμεράση Θερμοσταθερό ένζυμο, μέγιστη ενεργότητα σε υψηλή θερμοκρασία Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Thermococcus litoralis ρη 8.2-9.0 σε 10mM Tris στους 25 o C Ενεργότητα σχεδόν διπλασιάζεται από τους 62 o C στους 72 o C The efficiency of nucleotide incorporation in DNA polymerization reactions can be determined by trichloroacetic acid (TCA) precipitation. TCA precipitates nucleic acid polymers longer than ~20 nucleotides and can therefore be used to separate radiolabeled nucleotides incorporated into nucleic acid from unincorporated label.
DNA πολυμεράση Συνήθως χρησιμοποιείται ποσότητα 1-1.5u Taq DNA Polymerase σε αντίδραση τελικού όγκου 50µl Υψηλότερες συγκεντρώσεις Taq DNA Polymerase ευθύνονται για σύνθεση μη ειδικών προϊόντων. Σε περίπτωση που υπάρχουν παρεμποδιστές στο μίγμα της αντίδρασης (e.g., if the template DNA used is not highly purified), μεγαλύτερες συγκεντρώσεις Taq DNA Polymerase (2-3u) είναι απαραίτητες για ικανοποιητική απόδοση.
DNA πολυμεράση Διατήρηση στους -20 o C, συνήθως σε 50% glycerol το ένζυμο δεν πρέπει να βρεθεί ποτέ σε θερμοκρασία δωματίου Συνιστάται η χρήση ειδικής αυτόματης πιπέτας αποκλειστικά για το χειρισμό του ενζύμου
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης Ρυθμιστικό διάλυμα
Ρυθμιστικό διάλυμα Συνήθως περιέχει : KCl, (NH 4 ) 2 SO 4, Tris (ph 9) and Triton X Tween 20 or NP-40 Η συγκέντρωση αλάτων συνεπάγεται χαμηλή ταχύτητα αποδιάταξης για μεγάλα τμήματα DNA, οδηγώντας σε επιλεκτικό πολλαπλασιασμό των μικρότερου μήκους τμημάτων Τα μη ιονικά απορρυπαντικά σταθεροποιούν τη δομή του ενζύμου και παρεμποδίζουν το σχηματισμό υπερελίκων κατά την αποδιάταξη
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης dntps
dntps παροχή ενέργειας για την αντίδραση παροχή νουκλεοτιδίων για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας Η συγκέντρωση του κάθε dntp στο μίγμα της αντίδρασης είναι συνήθως 200 µm όλα τα δεσοξυριβονουκλεοτίδια (datp, dctp, dgtp, dttp), πρέπει να βρίσκονται σε ίσες ποσότητες στο μίγμα πλεόνασμα του ενός οδηγεί σε σημαντικό ποσοστό σφαλμάτων κατά την αντιγραφή
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης MgCl 2
MgCl 2 Mg 2+ σχηματίζουν σύμπλοκα με τα dntps, primers και DNA, οπότε η άριστη συγκέντρωσή τους πρέπει να προσδιορίζεται για κάθε διαφορετικό πείραμα. Η δράση της Taq polymerase απαιτεί παρουσία ελεύθερων ιόντων. Για το λόγο αυτό αν αυξηθεί η συγκεντρωση των dntps είναι πιθανή η μείωση της απόδοσης της αντίδρασης (Mg + gets "trapped") Πολύ χαμηλή συγκέντρωση Mg 2+ οδηγεί σε χαμηλή απόδοση PCR προϊόντος, ενώ πολύ υψηλή συγκέντρωση οδηγεί σε σχηματισμό μη ειδικών προϊόντων. Η συνήθης ποσότητα MgCl2 είναι 1-4 mm, κάτω από συνηθισμένες συνθήκες αντίδρασης
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης Ολιγονουκλεοτίδια (primers)
primers Οι primers συνήθως αποτελούνται από 15-30 νουκλεοτίδια. Μεγαλύτερο μήκος εξασφαλίζει μεγαλύτερη εξειδίκευση Η περιεκτικότητα σε GC πρέπει να είναι 40-60%. Τα νουκλεοτίδια G και C πρέπει να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στο μήκος του ολιγονουκλεοτιδίου. Ο primer δεν πρέπει να περιέχει περιοχές συμπληρωματικές μεταξύ τους ή με περιοχές άλλου primer της αντίδρασης για την αποφυγή σχηματισμού διμερών και «φουρκετών»
primers The melting temperature of flanking primers should not differ by more than 5 C, so the GC content and length must be chosen accordingly. All possible sites of complementarity between primers and the template DNA should be noted. If primers are degenerate, at least 3 conservative nucleotides must be located at the primer's 3'-end.
primers Estimation of the melting and annealing temperatures of primer: If the primer is shorter than 25 nucleotides, the approx. melting temperature (Tm) is calculated using the following formula: Tm= 4 (G + C) + 2 (A + T) G, C, A, T - number of respective nucleotides in the primer. Annealing temperature should be approx. 5 C lower than the melting temperature.
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης Πρόσθετα διαλύματα βελτιστοποίησης συνθηκών
Πρόσθετα διαλύματα βελτιστοποίησης συνθηκών DMSO at 2-10% may be necessary for amplification of some templates. Ηowever 10% DMSO can reduce Taq polymerase activity by up to 50% so it should not be used routinely. DMSO is thought to reduce secondary structure and is particularly useful for GC rich templates. Formamide is generally used at 1-5% and 10% formamide is reported to have no effect on the activity of Taq polymerase.
Αντίδραση PCR Σύσταση της αντίδρασης DNA
DNA Template quality and PCR product size both affect the amount of DNA you need to add. Usually the amount of template DNA is in the range of 0.01-1ng for plasmid or phage DNA and 0.1-1µg for genomic DNA, for a total reaction mixture of 50µl. Higher amounts of template DNA usually increase the yield of nonspecific PCR products
ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ Αποδιάταξη Αποδιάταξη των αρχικών αλυσίδων ώστε να αρχίσει η αντιγραφή
ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ Πρόσδεση Annealing προσκόληση των primers στις συμπληρωματικές θέσεις των μητρικών αλυσίδων
ΣΤΑΔΙΑ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ Επιμήκυνση Σχηματισμός της νέας αλυσίδας με ενσωμάτωση των δεσοξυριβονουκλεοτιδίων η δράση του ενζύμου γίνεται με φορά 5 3
ΑΠΟΦΥΓΗ ΜΟΛΥΝΣΕΩΝ DNA sample preparation, reaction mixture assemblage and the PCR process, in addition to the subsequent reaction product analysis, should be performed in separate areas. A Laminar Flow Cabinet equipped with a UV lamp is recommended for preparing the reaction mixture. Fresh gloves should be worn for DNA purification and each reaction set-up.
ΑΠΟΦΥΓΗ ΜΟΛΥΝΣΕΩΝ The use of dedicated vessels and positive displacement pipettes or tips with aerosol filters for both DNA sample and reaction mixture preparation, is strongly recommended. The reagents for PCR should be prepared separately and used solely for this purpose. Autoclaving of all solutions, except dntps, primers and Taq DNA Polymerase is recommended. Solutions should be aliquotedinsmallportionsandstoredindesignatedpcr areas. Aliquots should be stored separately from other DNA samples. A control reaction, omiting template DNA, should always be performed, to confirm the absence of contamination.
incorrect PCR product size (primer design) mis-priming too low annealing temperature redundant sequences no PCR product ΑΛΛΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ. no priming too high annealing temperature primer dimers complementary sequence in primers and they ll anneal too much template forgot enzyme forgot dntps too much/too little MgCl 2
ΑΛΛΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ. PCR product with errors wrong temperature annealing extension too much/too little MgCl 2 affects polymerase proof reading complex sequence GGG repeats low fidelity enzyme
ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΡΟΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Καθαρισμός Αντίδραση PCR με universal primers Καθαρισμός προϊόντος PCR για DGGE + - DGGE + Spike DNA - Καθαρισμός, αραιώσεις
Όταν η αντίδραση PCR με universal primers δε δίνει προϊόν. Σχεδιασμένοι με στόχο υψηλά συντηρημένη περιοχή του 16S rrna των βακτηρίων μικρή απόδοση της τεχνικής απομόνωσης του DNA DNA «κακής» ποιότητας Spike DNA Στην αντίδραση προστίθεται επιπλέον ποσότητα DNA υψηλής καθαρότητας αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει παρουσία παρεμποδιστών στο δείγμα
ΓΕΝΙΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΡΟΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Απομόνωση ολικού βακτηριακού DNA Καθαρισμός Αντίδραση PCR με universal primers Καθαρισμός προϊόντος PCR για DGGE + - DGGE + Spike DNA - Καθαρισμός, αραιώσεις
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αποδιατακτικού παράγοντα υπό κλίση Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Α Tm = 75 o C Β Tm = 60 o C σε κάθε δίκλωνο μόριο DNA υπάρχουν περιοχές (domains) μήκους 25 200 bp με διαφορετικά σημεία τήξης (Τm) ένα μόριο 100 1000 bp διαθέτει 2 έως 5 τέτοιες περιοχες
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αποδιατακτικού παράγοντα υπό κλίση Α Tm = 75 o C Β Tm = 60 o C το Τm εξαρτάται από τη σύσταση σε GC και από τη θερμοδυναμική σταθερότητα της διπλής έλικας η θερμοδυναμική σταθερότητα καθορίζεται από την ακριβή αλληλουχία βάσεων στη συγκεκριμένη περιοχή αλλαγή σε μια μόνο βάση συνεπάγεται αλλαγή του Τm τουλάχιστον κατά 1 o C
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αποδιατακτικού παράγοντα υπό κλίση Αύξηση συγκέντρωσης αποδιατακτικού παράγοντα (φορμαμίδιο + ουρία) η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία ίση με το χαμηλότερο Τm τα μόρια κινούνται ανάμεσα από τους πόρους της ακρυλαμίδης αρχικά ως δίκλωνα
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αποδιατακτικού παράγοντα υπό κλίση Αύξηση συγκέντρωσης αποδιατακτικού παράγοντα (φορμαμίδιο + ουρία) όταν οι αποδιατακτικές συνθήκες εξισωθούν με το Τm μιας περιοχής, αυτή αποδιατάσσεται επιβραδύνοντας το μόριο όσο μεγαλύτερο είναι το μήκος της περιοχής με το χαμηλότερο Τm σε ένα μόριο, τόσο πιο ψηλά στο πήκτωμα θα αρχίσει η επιβράδυνσή του
Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αποδιατακτικού παράγοντα υπό κλίση Με κατάλληλη επιλογή των συνθηκών αποδιάταξης (κλίση, θερμοκρασία) είναι δυνατός ο διαχωρισμός ακόμα και μορίων που διαφέρουν σε μια μόνο βάση Οι primers που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση μιας περιοχής που στη συνέχεια θα αναλυθεί σε DGGE φέρουν μια GC ουρά στο 5 ή 3 άκρο τους, ώστε να αποφευχθεί η πλήρης αποδιάταξη του μορίου