ΑΣΚΗΣΗ 2 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΓΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΥΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ(SDS-PAGE)

ΑΣΚΗΣΗ 2 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΓΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΥΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ(SDS-PAGE) Σκοπός της παρούσας άσκησης είναι ο διαχωρισμός μίγματος πρωτεϊνών ομογενοποιήματος κυττάρων με βάση το μοριακό τους βάρος (με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE), καθώς και η ανίχνευση συγκεκριμένης πρωτεΐνης, της φωσφολιπάσης Α Φ, στο μίγμα αυτό, με ανοσοαποτύπωση (western blotting). Τα στάδια που θα ακολουθηθούν είναι: 1. Παρασκευή του δείγματος. Συγκεκριμένα θα γίνει ομογενοποίηση των κυττάρων και εκχύλιση των πρωτεϊνών. 2. Προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford για ποσοτικοποίηση του υλικού. 3. Διαχωρισμός του μίγματος των πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση υπό μετουσιωτικές συνθήκες. Αρχή της μεθόδου Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης αποτελεί μέθοδο διαχωρισμού μιγμάτων πρωτεϊνών και άλλων φορτισμένων μακρομορίων, όπως DΝΑ και RΝΑ, στα επί μέρους συστατικά του δείγματος, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Tα φορτισμένα μόρια κινούνται διαμέσου των πόρων ενός πήγματος πολυμερούς (gel). Για χαμηλό αριθμό Reynolds (τιμή τριβής) και μέτριας έντασης ηλεκτρικό πεδίο, η ταχύτητα (v) των επί μέρους πολυπεπτιδίων στο πήγμα εξαρτάται από τη διαφορά δυναμικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης q, σύμφωνα με την εξίσωση: v = E q/f 204

Όπου: v: η ταχύτητα μετακίνησης της πρωτεΐνης Ε: η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου q/f: η ηλεκτροφορητική κινητικότητα (electrophoretic mobility) σταθερά για πήγμα δεδομένης σύστασης f: σταθερά που εξαρτάται από τη μάζα, το σχήμα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πήγματος μέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Οι πρωτεΐνες μπορούν να διαχωρισθούν ηλεκτροφορητικά ανάλογα με το φυσικό τους φορτίο, οπότε μετακινούνται προς την άνοδο ή την κάθοδο, ανάλογα με το αν είναι θετικά ή αρνητικά φορτισμένες, αντίστοιχα. Η τεχνική αυτή ονομάζεται φυσική ηλεκτροφόρηση (native electrophoresis) και εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ολόκληρων πρωτεϊνικών συγκροτημάτων (ακόμα και με περισσότερες της μιας υπομονάδες). Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα και κατά συνέπεια ο διαχωρισμός στηρίζεται στο φορτίο και στο μέγεθος της κάθε πρωτεΐνης. Πιο ευρεία χρήση έχει η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε συνθήκες αποδιάταξης ή μετουσίωσης (denaturation) του μορίου, παρουσία περίσσειας αρνητικού φορτίου, που εξασφαλίζεται από το SDS, το οποίο έχει και επιφανειοδραστικές ιδιότητες. Η τεχνική ονομάζεται ηλεκτροφόρηση πήγματος πολυακρυλαμιδίου-sds υπό μετουσιωτικές συνθήκες (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE). Ως αποδιατακτικό μέσο χρησιμοποιείται το δωδεκυλοθειϊκό νατρίο (SDS), ένα ανιοντικό απορρυπαντικό που καταστρέφει σχεδόν όλες τις μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις μιας πρωτεΐνης. Το SDS, εκτός του ότι αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες, δεσμεύεται πάνω σ αυτές με καθορισμένη κατά βάρος αναλογία (1.4g SDS/g πρωτεΐνης) ή σε αναλογία μορίων SDS προς αμινοξέα (1:2). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από την αλληλεπίδραση με το SDS είναι επιμήκη, με σαφή και καθορισμένη δομή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Πέραν του SDS, για την ολοκλήρωση της μετουσίωσης, γίνεται κατεργασία με χημικές ενώσεις που ανάγουν δισουλφιδικούς δεσμούς (β-μερκαπτοαιθανόλη ή διθειοθρεϊτόλη) και βρασμό, οπότε διαχωρίζονται και οι υπομονάδες μιας πρωτεΐνης. Το πήγμα (gel) πολυακρυλαμιδίου σχηματίζεται κατά τον συμπολυμερισμό ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και δις-ακρυλαμιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH-CH 2 ). Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πολυμερές πλέγμα με πόρους, το μέγεθος των οποίων εξαρτάται από τον βαθμό πολυμερισμού και από τη συγκέντρωση των μονομερών στο διάλυμα. Η δημιουργία του πλέγματος γίνεται μέσω του μηχανισμού των ελευθέρων ριζών με την προσθήκη υπερθειϊκού αμμωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8 για την έναρξη του μηχανισμού και του φωτοχημικού καταλύτη τετραμεθυλοαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) για τη διάδοσή του. 205

Επειδή το φορτίο ανά μονάδα μάζας είναι περίπου σταθερό (λόγω του SDS) και οι υδροδυναμικές ιδιότητες κάθε μορίου είναι συνάρτηση μόνο του μοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων εξαρτάται αποκλειστικά αποκλειστικά από το μοριακό τους βάρος. Στην τεχνική αυτή χρησιμοποιούνται δυο διαφορετικά πήγματα, το πήγμα επιστοίβασης (stacking gel), που είναι υπεύθυνο για τη συμπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγματος σε μια πολύ λεπτή στοιβάδα και το πήγμα διαχωρισμού (separating gel), που είναι υπεύθυνο για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους μέσα σ αυτό. Τα διαλύματα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο gel διαφέρουν ως προς το ph και τη σύσταση τους. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΉ ΠΟΡΕΊΑ Υλικά-Συσκευές Κυανούν της βρωμοφαινόλης Coomassie Brilliant Blue R-250 Υπερθειϊκό αμμώνιο (Ammonium Persulfate, APS) Δωδεκυλο θειικό νάτριο (Sodium dodecyl sulphate, SDS) Δις-ακρυλαμίδιο (Bis N, N -Methylene-bis acrylamide) Ακρυλαμίδιο (Acrylamide) Γλυκερόλη (Glycerol) TEMED Υπερθειικό αμμώνιο (Ammoniun persulfate) 2x διάλυμα φόρτωσης με SDS και μερκαπτοαιθανόλη Γλυκίνη (Glycine) Μερκαπτοαιθανόλη (2-mercaptoethanol) Πρότυπο διάλυμα πρωτεϊνών με συγκεκριμένα μοριακά βάρη Trizma Base Μεθανόλη Οξεικό Οξύ παγόμορφο Aπόλυτη Αιθανόλη Υδροχλωρικό οξύ 4Ν (για ρύθμιση ph) Σελοφάν για το στέγνωμα των gels Συσκευή ηλεκτροφόρησης 206

Διαλύματα 1. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (Electrode Buffer ή Running Buffer) Διάλυμα 10x : 0.025M Tris-base, 0.192Μ γλυκίνης, 0.1% SDS, ph 8.3 Διαλύονται 36g Tris-base, 172.8g γλυκίνης και 12g SDS σε νερό και ρυθμίζεται το ph σε 8.3. Ο όγκος συμπληρώνεται στα 1200mL. Φυλάσσεται στους 4 ο C. 2. Ρυθμιστικό διάλυμα 0.5M Trizma base ph 6.8 Διαλύονται 6.0g Trizma base σε 100mL νερού. Ρυθμίζεται το ph στην τιμή 6.8 με διάλυμα 4N HCl. Το διάλυμα φυλάσσεται στο στους 4 o C. 3. Διάλυμα 10% SDS Διαλύονται 10g SDS σε 100mL νερού. Το διάλυμα φυλάσσεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 4. Διάλυμα 10% υπερθεϊικού αμμωνίου (APS) Διαλύονται 0.1g υπερθεϊικού αμμωνίου σε 1mL νερού. Το διάλυμα παρασκευάζεται λίγο πριν τη χρήση του. 5. Διάλυμα 30% ακρυλαμιδίου / δις ακρυλαμιδίου (BIS) [A/bisA] 29.2g ακρυλαμιδίου και 0.8g δις-ακρυλαμιδίου διαλύονται σε 100mL νερού. Το διάλυμα διηθείται και φυλάσσεται σε σκουρόχρωμο φιαλίδιο στους 4 ο C. 6. Διάλυμα κυανού της βρωμοφαινόλης 0.05% (w/v) 2.5mg κυανού της βρωμοφαινόλης διαλύονται σε 5mL νερού. 7. Διάλυμα 12% αιθανόλης Αναμιγνύονται 60mL αιθανόλης με 440mL νερού και το διάλυμα φυλάσσεται στους 4 C. 8. Διάλυμα χρωστικής 1% κυανούν του Coomassie R-250 (Staining Buffer) 2g κυανούν του Coomassie R-250 διαλύονται σε 200mL νερού. Το διάλυμα αναδεύεται και διηθείται. Φυλάσσεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 9. Διάλυμα χρώσης πήγματος Αναμιγνύονται 250mL μεθανόλης, 50mL οξεικού οξέος και 62.5mL διαλύματος 1% κυανούν του Coomassie R-250. Ο όγκος ρυθμίζεται στα 500mL. 10. Διάλυμα αποχρωματισμού (Destaining Buffer) Αναμιγνύονται 300mL μεθανόλης, 50mL οξεικού οξέος και 650mL νερού. 11. Διάλυμα φόρτωσης των δειγμάτων Aναμιγνύονται 0.3028g Trizma base, 0.5g SDS, 5mL γλυκερόλης, 1mL μερκαπτοαιθανόλης και 5mg κυανούν της βρωμοφαινόλης. Ο όγκος συμπληρώνεται στα 50mL με νερό και το ph ρυθμίζεται 207

στην τιμή 6.8. Το διάλυμα χωρίζεται ανά 0.5mL σε πλαστικούς σωλήνες και φυλάσσεται στους -20 C. 12. Διάλυμα Μεταφοράς (Transfer Buffer) Διάλυμα 10x: 6g Tris-base, 28.8g Glycine και 20mL διαλύματος SDS 10%. Ο όγκος συμπληρώνεται στα 1200mL. Διάλυμα 1x: 100mL από 10x και 200mL CH 3 OH μέχρι τα 1,000mL. Α. Παρασκευή των πηγμάτων Πήγμα διαχωρισμού (separating gel) 15% 2.5mL dh 2 O, 2.5mL ρυθμιστικό διάλυμα Tris 1.5M, ph 8.8, 100μL 10% SDS, 5mL A/bisA, 100μL 10% APS και 10μL TEMED. Tο μίγμα του πήγματος τοποθετείται ανάμεσα στις δύο γυάλινες πλάκες της συσκευής σταθεροποίησης των πηγμάτων. Προσθέτουμε Η 2 Ο στο πάνω μέρος του πήγματος για την προστασία του από τον αέρα. Το μίγμα αφήνεται να πολυμερισθεί σε θερμοκρασία δωματίου (~25 C). Πήγμα επιστοίβασης (stacking gel) 6.1mL dh 2 O, 2.5mL ρυθμιστικό διάλυμα Tris 0.5 M, ph 6.8, 100μL 10% SDS, 1.3mL A/bisA, 100μL 10% APS και 10μL TEMED. Απορρίπτουμε το Η 2 Ο με διηθητικό χαρτί. Μεταξύ των γυάλινων πλακών και πάνω από το πήγμα διαδρομής τοποθετείται το πήγμα επιστοίβασης και τοποθετούνται χτενάκια ώστε μόλις το πήγμα επιστοίβασης πολυμεριστεί να δημιουργηθούν οι θέσεις εισαγωγής των δειγμάτων. Β. Κατεργασία και τοποθέτηση των δειγμάτων Στα εκχυλίσματα πρωτεϊνών (που έχουν προκύψει από τους ομογενοποιημένους ιστούς ή καλλιέργειες κυττάρων) μετράται η συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης (προσδιορισμός κατα Bradford). Κατάλληλη ποσότητα δείγματος (~5μg πρωτεΐνης, όπως προσδιορίσθηκε κατά Bradford) μεταφέρεται σε eppendorf και προστίθεται μισή ποσότητα διαλύματος φόρτωσης (sample buffer). Τα δείγματα τοποθετούνται σε ειδικά στηρίγματα και θερμαίνονται σε υδατόλουτρο στους 100 C για 5min για να γίνει η μετουσίωση των πρωτεϊνών. Ο χώρος μεταξύ των 2 πηγμάτων και ο χώρος της συσκευής πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (Running Buffer 1x). Τα δείγματα παραλαμβάνονται και τοποθετούνται αργά με αυτόματη πιπέτα και με ειδικό 208

ρύγχος μεγάλης απόληξης, στις ειδικές θέσεις που έχουν δημιουργηθεί από τα χτενάκια, οι οποίες είναι γεμάτες με ρυθμιστικό διάλυμα. Σε μία από τις θέσεις τοποθετείται δείγμα 1μL από το πρότυπο διάλυμα. Το πέρας της ηλεκτροφόρησης διαπιστώνεται όταν η κυανή χρωστική που περιέχεται σε όλα τα δείγματα φτάσει στο τέλος του πήγματος διαδρομής περίπου 75min. Συνθήκες ηλεκτροφόρησης (Τροφοδοσία) : 150Volt, 150mA. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ 1. H μέθοδος της ηλεκτροφόρησης SDS είναι γρήγορη, ευαίσθητη και έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα. 2. Οι απαιτούμενες ελάχιστες ποσότητες πρωτεΐνης: 0.1μg για χρώση με Coomassie και 0.02μg για χρώση με άργυρο. 3. Το APS και TEMED τοποθετούνται τελευταία. 4. Πήγμα 15% είναι κατάλληλο για πρωτεΐνες μοριακής μάζας 12-43 kda. 5. Προσέχουμε στη συσκευή τα μικρά τζάμια να είναι προς την εσωτερική πλευρά και τα μεγάλα προς την εξωτερική. 209