ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η επίδραση της καλλιέργειας εκκίνησης και της θέρμανσης στα μικροβιολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά καρπών πράσινης ελιάς ποικιλίας Κονσερβολιάς κατά την ζύμωση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Xρανιώτη Κ. Χαρίκλεια Χημικός Μηχανικός ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η επίδραση της καλλιέργειας εκκίνησης και της θέρμανσης στα μικροβιολογικά και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά καρπών πράσινης ελιάς ποικιλίας Κονσερβολιάς κατά την ζύμωση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Δ. Γερασόπουλος Επίκουρος Καθηγήτης ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Παρθένα Κοτζεκίδου-Ρουκά, Καθηγήτρια Μαρία Τσιμίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Δημήτριος Γερασόπουλος, Επίκουρος Καθηγητής ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

Ευχαριστίες Από αυτή τη θέση και μέσα σε λίγες γραμμές θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ανθρώπους που με βοήθησαν στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής. Πρώτα από όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή και επιστημονικό υπεύθυνο του παρόντος πονήματος, κ. Δημήτριο Γερασόπουλο που από την πρώτη ημέρα της συνεργασίας μας στάθηκε στο πλευρό μου και με βοήθησε σημαντικά στην ολοκλήρωσή του. H επιστημονική και συγγραφική του καθοδήγηση καθ όλη την διάρκεια της προσπάθειας αυτής ήταν πολύτιμη. Επίσης, αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω θερμά την Καθηγήτρια κ. Παρθένα Κοτζεκίδου-Ρουκά για τις ουσιώδεις υποδείξεις και τον χρόνο που μου προσέφερε. Θα ήταν μεγάλη μου παράληψη να μην αναφερθώ στην καθοριστική συμβολή της στην πραγματοποίηση των μικροβιολογικών αναλύσεων της παρούσας εργασίας. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Δήμητρα Παπαλιάγκα για την ηθική συμπαράσταση και την βοήθειά της. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τα αγαπημένα μου πρόσωπα, τους γονείς μου Κωνσταντίνο και Δήμητρα καθώς και την αδελφή μου Κατερίνα, που χωρίς την απέραντη αγάπη τους και την υλική και ηθική υποστήριξή τους δεν θα βρισκόμουν σ αυτή τη θέση. III

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ...1 2 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ...2 2.1 Παρασκευή πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου...2 2.2 Ρόλος καλλιεργειών εκκίνησης...12 2.3 Φαινολικές ενώσεις επιτραπέζιων ελιών.19 2.3.1 Eλαιοευρωπαΐνη... 24 2.4 Επίδραση της εφαρμογής θέρμανσης στην ποιότητα των επιτραπέζιων ελιών......26 2.5 Επίδραση αποθήκευσης σε ατμόσφαιρα CO2 στην ποιότητα των επιτραπέζιων ελιών...34 3 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...37 4 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...38 4.1 Φυτικό υλικό και επεμβάσεις...38 4.2 Εργαστηριακές Μετρήσεις... 40 5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ...45 5.1 Επίδραση της καλλιέργειας...45 5.2 Επίδραση της θέρμανσης...56 6 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...65 7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...67

3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης του τύπου, εργαστηριακή, εμπορική και χωρίς καλλιέργειας εκκίνησης σε ελιές που προηγουμένως υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς ΝaOH και της θέρμανσης στους 50 ο C για 0, 15 και 45 min, ακολουθούμενη από άμεση ζύμωση ή ζύμωση μετά από 1 ημέρα στην πορεία της ζύμωσης πράσινων ελιών ποικιλίας Κονσερβολιάς. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση στο μικροβιολογικό (προσδιορισμών γαλακτικών βακτηρίων, ζυμών και εντεροβακτηρίων) και φυσικοχημικό προφίλ (ph καρπού και άλμης, τιτλοδοτούμενη οξύτητα άλμης, φαινολικές ουσίες και αντιοξειδωτική δράση άλμης και καρπού) της ζύμωσης ελιών ποικιλίας Κονσερβολιάς καθώς και σε επιμέρους χαρακτηριστικά ποιότητας του καρπού όπως το χρώμα, η γεύση και η αντίσταση στην πίεση. 37

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ζύμωση των επιτραπέζιων ελιών αποτελεί μια απο τις αρχαιότερες εφαρμογές της βιοτεχνολογίας, η οποία ιστορικά πρωτοεμφανίστηκε στην περιοχή της Μεσογείου και στην συνέχεια επεκτάθηκε και σε άλλες περιοχές. Η παγκόσμια παραγωγή επιτραπέζιων ελιών ανέρχεται περίπου σε 2x10 6 τόνους ετησίως εκ των οποίων το 50% προέρχεται από την Ευρώπη με κύρια την συνεισφορά των χωρών: Ισπανία, Ιταλία και Ελλάδα (IOOC, 2002). Στη διεθνή αγορά υπάρχουν τρεις βασικοί εμπορικοί τύποι επεξεργασμένων επιτραπέζιων ελιών (Fernandez et al., 1997): Πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (50% της συνολικής παραγωγής) Φυσικώς μαύρες ελιές / Ελληνικού τύπου (25% της συνολικής παραγωγής) Φυσικώς μαύρες ελιές / California τύπου (25% της συνολικής παραγωγής, Οι πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου καταναλώνονται σε μεγάλες ποσότητες σε όλο τον κόσμο. Υπολογίζεται ότι η διεθνής παραγωγή ξεπερνά τους 120.000 τόνους κάθε χρόνο. Από την ποσότητα αυτή πάνω από 60.000 τόνους παρασκευάζονται στην Ισπανία και η υπόλοιπη ποσότητα παρασκευάζεται στις άλλες ελαιοπαραγωγικές χώρες. Οι επιτραπέζιες ελιές είναι το πιο σημαντικό από οικονομικής απόψεως ζυμούμενο προϊόν στην Ελλάδα. Κάθε χρόνο παρασκευάζονται 90.000-100.000 τόνοι επιτραπέζιων ελιών εκ των οποίων το 51% με βάση την Ισπανική μέθοδο (Doutsias et al., 2000). Η παραδοσιακή Ισπανικού τύπου μέθοδος περιλαμβάνει ένα στάδιο επεξεργασίας με άλκαλι (1,8-2 w/v NaOH) προς υδρόλυση της ελαιοευρωπαΐνης, υπεύθυνη για την πικρή γεύση, ακολουθούν εκπλύσεις προς απομάκρυνση των αλκαλικών κατάλοιπων και στην συνέχεια οι ελιές τοποθετούνται σε άλμη (6-8 % ΝaCl) όπου υπόκεινται σε αυθόρμητη ζύμωση. Για τη επιτυχή πορεία της ζύμωσης και την διασφάλιση της ποιότητας του τελικού προϊόντος έχουν προταθεί διάφορες λύσεις όπως η οξίνιση της άλμης με οργανικά οξέα, ο εμβολιασμός με καθαρή καλλιέργεια γαλακτοβακίλλων, η προσθήκη σακχάρων ή η χρήση άλμης από προηγούμενη ζύμωση (Panagou et Katsaboxakis, 2006). Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον έχει στραφεί σε εναλλακτικούς τρόπους εκπίκρανσης συμπεριλαμβανομένου της εφαρμογής θερμικού σοκ, της χρήσης καλλιεργειών εκκίνησης και της αποθήκευσης σε ατμόσφαιρα CO 2. Ωστόσο, η έρευνα επι του παρόντος περιορίζεται σε εργαστηριακή κλίμακα. 1

2. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1 Παρασκευή πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου. Οι επιτραπέζιες ελιές ανάλογα με την κατάστασή τους κατά τον χρόνο συλλογής, δηλαδή ανάλογα με το στάδιο ωρίμανσης, διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: στις πράσινες, στις μαύρες και στις ξανθές ή κόκκινες. Τα κύρια συστατικά του ελαιόκαρπου στα οποία οφείλει τις θρεπτικές ιδιότητές του ως τροφή είναι τα εξής (Αλυγιζάκης, 1982): Νερό σε αναλογία 50-60% (w/w) του νωπού βάρους Λιπαρές ουσίες σε αναλογία 15-30% του νωπού βάρους. Tα κυριότερα λιπαρά οξέα που περιέχονται είναι το ελαϊκό, το λινελαϊκό, το λινολενικό, το παλμιτικό και το στεατικό, η αναλογία των οποίων μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Άλλες λιπαρές ουσίες που περιέχονται κηρώδους μορφής (όπως η κουτίνη) διαποτίζουν την επιδερμίδα και την καθιστούν αδιάβροχη. Σάκχαρα κυρίως εξόζες, γλυκόζη φρουκτόζη σε ποσοστό 2-4 % του νωπού βάρους ανάλογα με την ποικιλία, και σε μικρό ποσοστό η σακχαρόζη. Η περιεκτικότητα σε απλά σάκχαρα καθορίζει την ικανότητα του καρπού να υποστεί γαλακτική ζύμωση. Πολυσακχαρίτες αδιάλυτοι στο νερό, όπως κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και κόμμεα που αποτελούν δομικά στοιχεία. Πηκτίνες βρίσκονται σε ποσοστό 1,5% της σάρκας και ευθύνονται για τη συνεκτικότητα του καρπού στα πρώτα στάδια ανάπτυξης. Πρωτεΐνες σε ποσοστό 2-5% του νωπού βάρους, περιέχουν όμως απαραίτητα για τη διατροφή του ανθρώπου αμινοξέα. Οργανικά οξέα σε ποσοστό 0,1-0,2% του νωπού βάρους, άνευ ιδιαίτερης σημασίας στην περίπτωση της επεξεργασίας με άλκαλι ενώ στην περίπτωση της φυσικής παρασκευής εμπλουτίζουν την άλμη και την οξινίζουν. Κυριότερα το κιτρικό, το μηλικό και το οξαλικό οξύ, τα οποία εξασφαλίζουν ομοιογενές ph γύρω στο 4,5-5. Ταννίνες σε πολύ μικρό ποσοστό 1,5 2% του βάρους της ελαιόμαζας που όμως συμβάλουν στη μείωση της πικρής γεύσης και αντιδρώντας με το σίδηρο δίνουν σύμπλοκα μελανού χρώματος. Ελαιοευρωπαΐνη, φαινόλη που απαντά κατ αποκλειστικότητα στους ιστούς του ελαιόδεντρου και δίνει την πικρή γεύση στην ελιά. Παίζει σημαντικό ρόλο στην 2

παρασκευή επιτραπέζιων ελιών γιατί ανάλογα με την παραμένουσα ποσότητα αυτής προσδίδονται στο προϊόν ειδικά χαρακτηριστικά. Χρωστικές ουσίες σε πολύ μικρή αναλογία, λιποδιαλυτές, κυρίως χλωροφύλλες και καροτενοειδή, και υδατοδιαλυτές κυρίως ανθοκυάνες. Ανόργανα συστατικά σε πολύ μικρή αναλογία: Ca, K, Na, Mg, Mn, Fe, Zn, Cl και P, τα οποία συμμετέχουν ως δομικά στοιχεία επηρεάζοντας έτσι την διαπερατότητα των μεμβρανών και εξασφαλίζοντας τη ρυθμιστική ικανότητα εντός του κυττάρου. Η τεχνολογία για την παρασκευή πράσινων επιτραπέζιων ελιών Ισπανικού τύπου περιγράφεται στο διάγραμμα ροής που ακολουθεί (Romero et al., 2004): Νωπό προϊόν Διαλογή Επίκρανση: Εμβάπτιση σε δ/μα NaOH (1-2,5 %) Διαλογή των καρπών κατά μέγεθος Συσκευασία Έκπλυση Εμβάπτιση σε διάλυμα NaCl Γαλακτική ζύμωση Σχήμα 2.1.1 Διάγραμμα ροής παραγωγής πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου (Romero et al., 2004). Τα στάδια της εκπίκρανσης, της έκπλυσης και της ζύμωσης παίζουν σημαντικό ρόλο στην ποιότητα του τελικού προϊόντος. Αναλυτικότερα : α) Το στάδιο της εκπίκρανσης του ελαιόκαρπου: Η εκπίκρανση του πράσινου ελαιόκαρπου γίνεται με υδατικό διάλυμα καυστικού νατρίου μέσα στο οποίο τοποθετείται ο ελαιόκαρπος, όπου και παραμένει μέχρι να διεισδύσει το διάλυμα αυτό σχεδόν μέχρι τον πυρήνα. Κύριος σκοπός της επεξεργασίας αυτής είναι η υδρόλυση της πικρής ουσίας, της ελαιοευρωπαΐνης, σε σχετικά σύντομο 3

χρονικό διάστημα. Με την υδρόλυση της ελαιοευρωπαΐνης απελευθερώνεται και μια ποσότητα σακχάρων, η οποία υποβοηθά τη γαλακτική ζύμωση με την αφομοίωσή της από τους μικροοργανισμούς της γαλακτικής ζύμωσης. Η εκπίκρανση για αυτούς τους λόγους παίζει σημαντικό ρόλο στην παρασκευή επιτραπέζιων ελιών κατά το Ισπανικό σύστημα. Η ιδανικότερη διείσδυση του καυστικού νατρίου στον καρπό είναι μέχρι βάθους από 2/3 έως 3/4 της απόστασης από την επιδερμίδα μέχρι τον πυρήνα. Το στάδιο της εκπίκρανσης εξαρτάται από την συγκέντρωση του αλκαλικού διαλύματος που θα χρησιμοποιηθεί, τη θερμοκρασία, την ποικιλία και το μέγεθος του ελαιόκαρπου (Αλυγιζάκης, 1982). β ) Το στάδιο της έκπλυσης του ελαιόκαρπου: Η ακολουθούσα την εκπίκρανση έκπλυση του ελαιόκαρπου συνίσταται στην απομάκρυνση του αλκαλικού διαλύματος και στην αφαίρεση του καυστικού νατρίου που έχει προσροφηθεί από το σάρκωμα του ελαιόκαρπου. Μετά την απομάκρυνση του καυστικού νατρίου από τον ελαιόκαρπο και την τοποθέτησή του στο νερό ιόντα ΟΗ - και Na + που βρίσκονται μέσα στο σάρκωμα του καρπού εισέρχονται στο νερό μέχρι να αποκατασταθεί ισορροπία μεταξύ των ιόντων που βρίσκονται στο σάρκωμα και αυτών που εισχωρούν στο νερό. Η αποκατάσταση της ισορροπίας εξαρτάται από την θερμοκρασία, το μέγεθος του καρπού, τη συνεκτικότητα του σαρκώματος, την ποιότητα του νερού που χρησιμοποιείται στις πλύσεις, την έκθεση του ελαιόκαρπου στον ατμοσφαιρικό αέρα και από την τεχνική της έκπλυσης που θα εφαρμοστεί (Αλυγιζάκης, 1982). γ) Το στάδιο της ζύμωσης: Κατά το στάδιο αυτό ο ελαιόκαρπος τοποθετείται σε διάλυμα άλμης (NaCl 5 6 %) μέσα στο οποίο γίνεται η γαλακτική ζύμωση. Η συγκέντρωση της άλμης παίζει βασικό ρόλο στη ζύμωση και στη συντήρηση των επιτραπέζιων ελιών. Η σταθεροποίηση του χλωριούχου νατρίου της άλμης στα επιθυμητά επίπεδα είναι επίσης απαραίτητη προϋπόθεση για την ομαλή διεξαγωγή της ζύμωσης. Η γαλακτική ζύμωση των ελιών είναι αναερόβια ζύμωση για αυτό τον λόγο τα δοχεία της ζύμωσης πρέπει να κλείνονται αεροστεγώς με μεγάλη επιμέλεια ώστε να αποφεύγονται δευτερογενείς ζυμώσεις. Σε πολλές περιπτώσεις και κυρίως όταν η ζύμωση δεν εξελίσσεται φυσιολογικά γίνεται εμβολιασμός της άλμης με καθαρές 4

καλλιέργειες γαλακτοβακίλλων. Οι μικροοργανισμοί ανάλογα με την ποσότητα των σακχάρων που μετατρέπουν σε γαλακτικό οξύ, διακρίνονται σε ομοζυμωτικούς και ετεροζυμωτικούς (Αλυγιζάκης, 1982). Θεωρητικά, οι ομοζυμωτικοί μικροοργανισμοί μετατρέπουν όλα τα σάκχαρα, ενώ οι ετεροζυμωτικοί τα μισά περίπου σε γαλακτικό οξύ, σύμφωνα με τις παρακάτω αντιδράσεις (Κυριτσάκης, 1980): C 6 H 12 O 6 2C 6 H 12 O 6 ομοζυμωτικοί 15-30 ο C ετεροζυμωτικοί 18-40 ο C 2CH 3 CH(OH)COOH CH 3 CH(OH)COOH + CH 3 COOH + HCOOH + 2CH 3 CH 2 OH + CO 2 + CO Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν την γαλακτική ζύμωση όπως είναι το ph, η περιεκτικότητα της άλμης σε NaCl, το είδος των μικροοργανισμών που αναπτύσσονται στα δοχεία ζύμωσης και η θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Επίσης, ο βαθμός ωριμότητας του καρπού και η σακχαροπεριεκτικότητα κατά το στάδιο της συγκομιδής επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τη ζύμωση. Επομένως, η συγκομιδή θα πρέπει να γίνεται μόλις συμπληρωθεί η ανάπτυξη του καρπού και πριν προχωρήσει η ωρίμανση γιατί σε προχωρημένο στάδιο ωριμότητας είναι δύσκολη η επεξεργασία του καρπού και έχουν ελλατωθεί τα σάκχαρα. Η τεχνολογία που ακολουθείται σε κάθε στάδιο επεξεργασίας διαφέρει από χώρα σε χώρα ακόμα και από εργοστάσιο σε εργοστάσιο, γιατί υπεισέρχονται πολλοί παράγοντες, όπως είναι οι κλιματολογικές συνθήκες κάθε τόπου, οι ειδικές συνθήκες που αντιμετωπίζει κάθε εργοστάσιο, η ποικιλία, οι οικονομικές συνθήκες κλπ. Για παράδειγμα η συγκέντρωση του καυστικού νατρίου στο στάδιο της εκπίκρανσης εξαρτάται από την ποικιλία και η τεχνική των πλύσεων επηρεάζεται πολλές φορές από την παροχή νερού που διαθέτει το εργοστάσιο. Ο χρόνος εκπίκρανσης εξαρτάται από την θερμοκρασία δηλ. από τις κλιματολογικές συνθήκες. Η αυτοματοποίηση εξ άλλου όλου του κυκλώματος εξαρτάται από την οικονομική δυνατότητα του εργοστασίου. Σε όλα τα στάδια επεξεργασίας για την παρασκευή των επιτραπέζιων ελιών υπεισέρχονται διάφοροι παράγοντες από τους οποίους εξαρτάται η ποιότητα των ελιών που θα παρασκευαστεί. Στους παράγοντες αυτούς ανήκουν οι αλλοιώσεις και οι ασθένειες του καρπού, η θερμοκρασία της ζύμωσης, η συγκέντρωση του χλωριούχου νατρίου και των άλλων διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται κλπ. (Αλυγιζάκης, 1982). 5

Μικροβιολογικοί παράγοντες της ζύμωσης Κατά την διάρκεια της φυσικής ζύμωσης σε πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου διακρίνονται τέσσερις φάσεις. Κάθε μία χαρακτηρίζεται από την ανάπτυξη διαφορετικού μικροβιακού πληθυσμού που επιφέρει αντίστοιχα διαφορετικές αλλαγές στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του μέσου. Η διάρκεια της κάθε φάσης καθώς και η ανάπτυξη των διαφόρων μικροοργανισμών εξαρτάται από τους εξής παράγοντες: Προκατεργασίες της ελιάς (επεξεργασία με άλκαλι, τεχνικές έκπλυσης και αρχική σύσταση της άλμης) Δυναμικότητα των ζυμωτήρων και κατά συνέπεια αναλογία καρπού/άλμης Κλιματολογικές και περιβαλλοντικές συνθήκες Ποικιλία ελιών Συνθήκες υγιεινής του εργοστασίου και του εξοπλισμού. Φάσεις ζύμωσης: 1 η φάση Διαρκεί από την έναρξη της ζύμωσης, δηλαδή από την τοποθέτηση των καρπών στην άλμη μέχρι την ανάπτυξη των γαλακτοβακίλλων, περίπου 48-72 h. Είναι ιδιαίτερα σημαντική για την μετέπειτα ομαλή πορεία της ζύμωσης. Επομένως, οι αλλαγές κατά την διάρκεια αυτής της φάσης θα πρέπει να ελέγχονται αυστηρά έτσι ώστε να παρέχονται οι απαραίτητες συνθήκες για την ενίσχυση της ανάπτυξης των επιθυμητών μικροοργανισμών με παράλληλη αναστολή της ανάπτυξης αλλοιωγόνων βακτηρίων. Πολλοί από τους μιροοργανισμούς που είναι παρόντες κατά την διάρκεια των πρώτων ωρών προέρχονται από τους ζυμωτήρες, τις σωληνώσεις, τις αντλίες και από συσκευές που έρχονται σε επαφή με την άλμη και τις ελιές. Είδη μικροοργανισμών που έχουν ταυτοποιηθεί ανήκουν στα γένη: Βacillus, Micrococcus και σε πολλά αρνητικά κατά Gram βακτήρια, κυρίως της οικογένειας Εnterobacteriaceae. Τα πιο αντιπροσωπευτικά ειδή αρνητικών κατά Gram βακτηριών που έχουν απομονωθεί από πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου παρουσιάζονται στον πίνακα 2.1.1. Στο τέλος αυτής της φάσης παρατηρείται επίσης ανάπτυξη θετικών κατά Gram βακτηρίων. Είναι σκόπιμο να αποφεύγονται επιμολύνσεις με ανεπιθύμητους μικροοργανισμούς κατά την διάρκεια αυτής της φάσης με την εφαρμογή όσο το δυνατό καλύτερων συνθηκών υγιεινής κατά την διάρκεια των διαφόρων χειρισμών. Ωστόσο, η παρουσία 6

ενός ορισμένου πληθυσμού αρνητικών κατά Gram βακτηρίων θεωρείται φυσιολογική μιας και βοηθά στην μείωση του ph που είναι αναγκαία για την ανάπτυξη των γαλακτοβακίλλων (Fernandez et al., 1997). Πίνακας 2.1.1Είδη αρνητικών κατά Gram βακτηρίων που έχουν απομονωθεί από πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (Fernandez Diez et al., 1985). Είδη αρνητικών κατά Gram βακτηρίων Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Escherichia coli Aeromonas hydrophila Flavobacterium diffusum Flavobacterium balustinum 2 η φάση Η φάση αυτή ξεκινά όταν το ph του μέσου έχει μειωθεί στην τιμή 6 και συνήθως διαρκεί σχεδόν 2 εβδομάδες. Κατά την διάρκεια αυτής της φάσης ο πληθυσμός των γαλακτοκόκκων αυξάνει, ωστόσο στο τέλος της φάσης μειώνεται. Ο πληθυσμός των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων μειώνεται προοδευτικά καθ όλη την διάρκεια της φάσης ενώ η πλήρης εξαφάνισή τους σηματοδοτεί το τέλος αυτής της φάσης. Γενικά, τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια δεν επιβιώνουν μετά από 20-25 ημέρες, ωστόσο περαιτέρω επιβίωσή τους μπορεί να προκαλέσει αλλοίωση λόγω παραγωγής αερίου. Χαρακτηριστικοί μικροοργανισμοί αυτής της φάσης είναι οι γαλακτοκόκοι του γένους Pediococcus (ομοζυμωτικοί) και του γένους Leuconostoc (ετεροζυμωτικοί). Το γένος Streptococcus (ομοζυμωτικοί), επίσης παρόν, δεν θεωρείται σημαντικό. Η ανάπτυξη των παραπάνω μικροοργανισμών παράλληλα με την δράση των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων επηρεάζει την οξύτητα του τελικού προϊόντος. Οι κυριότεροι μικροοργανισμοί που έχουν ταυτοποιηθεί στην φάση αυτή καθώς επίσης και η διάρκεια ανάπτυξής τους φαίνεται στον πίνακα 2.1.2 που ακολουθεί (Fernandez et al., 1997). Πίνακας 2.1.2 Μικροοργανισμοί που απομονώθηκαν από πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (Fernandez Diez et al., 1985). Μικροοργανισμοί Διάστημα ανάπτυξης (ημέρες) Lactococcus lactis 6-7 Pediococcus urinae-equi 4-23 Leuconostoc paramesenteroides 4-55 7

3 η φάση Αυτή η φάση χαρακτηρίζεται από την έντονη ανάπτυξη των γαλακτοβακίλλων κυρίως του Lactobacillus plantarum ο οποίος υπό κανονικές συνθήκες κυριαρχεί και είναι υπεύθυνος για την ζύμωση των πράσινων ελιών. Ωστόσο έχουν ταυτοποιηθεί και άλλα είδη όπως L. casei, L.fermentum. L.cellobiosus, L. coryniformis και L.brevis, η παρουσία των οποίων εξαρτάται από την ποικιλία της ελιάς. Λόγω της ανάπτυξης του Lactobacillus plantarum που είναι και ο επικρατέστερος μικροοργανισμός παρατηρείται μια σταθερή αύξηση της οξύτητας καθόλη τη διάρκεια της ζύμωσης με επακόλουθη μείωση του ph σε τιμές γύρω στο 4 ή και χαμηλότερα. Ο αριθμός των γαλακτοβακίλλων μειώνεται όταν τα θρεπτικά συστατικά του υποστρώματος εξαντληθούν και το ph φτάσει σε τόσο χαμηλές τιμές που καθιστούν αδύνατη ακόμη και την ανάπτυξη του Lactobacillus plantarum, του πιο ανθεκτικού γαλακτοβακίλου που ολοκληρώνει τις περισσότερες ζυμώσεις των λαχανικών (Fernandez et al., 1997). Πίνακας 2.1.3 Είδη ζυμών που έχουν απομονωθεί από πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (Fernandez Diez et al., 1985). Candida krusei Είδη ζυμών Hansenula anomala Saccharomyces chevaloeri Candida parapsilosis Hansenula subpelliculosa Candida pseudotropicalis Candida tropicalis Saccharomyces cerevisiae 4 η φάση Κατά την διάρκεια της τέταρτης φάσης το είδος Propionibacterium είναι το μοναδικό που αναπτύσσεται εάν η συγκέντρωση του άλατος στην άλμη δεν ελεχθεί κατάλληλα κατά την αποθήκευση. Η φάση αυτή ξεκινά αφού έχει τελειώσει η κύρια ζύμωση και χαρακτηρίζεται από την αύξηση στην τιμή του ph και την μείωση του γαλακτικού οξέος. Τα βακτήρια που έχουν απομονωθεί είναι τα Propionibacterium acnes και P.acidi-propioni, τα οποία εξαιτίας της ικανότητας τους να μεταβολίζουν το 8

γαλακτικό οξύ θεωρούνται ακόλουθοι των γαλακτοβακίλων. Οι κύριοι μεταβολίτες τους είναι το προπιονικό και το οξικό οξύ. Η έκταση αυτής της φάσης είναι μεταβλητή προκαλώντας μια μικρή αύξηση στη τιμή του ph κατά 0,1 με 0,2 μονάδες. Μόνο όταν η ζύμωση παρουσιάσει ανωμαλίες τα προπιονικά βακτήρια είναι σε αφθονία προκαλώντας αύξηση του ph κατα 0,4 μονάδες ή και παραπάνω, οδηγώντας σε αλλοίωση. Προς αποφυγή ενδεχόμενης αλλοίωσης συνιστάται η διατήρηση της συγκέντρωσης του άλατος στην άλμη στο 8% και του ph σε τιμές κάτω του 4 (Fernandez et al., 1997). Παρουσία ζυμών κατά τη διάρκεια της ζύμωσης O ρόλος των ζυμών στη μικροχλωρίδα καθώς και στα χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος αποτελεί αντικείμενο μελέτης διαφόρων ερευνητών. Οι ζύμες συνυπάρχουν με τα γαλακτικά βακτήρια καθ όλη τη διάρκεια της ζύμωσης συνεισφέροντας στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται τα πιο συχνά απαντώμενα είδη. Οι ερευνητές Ruiz-Barba & Diaz, 1995 έδειξαν ότι κάποια είδη ζυμών μπορούν να ασκήσουν ευεργετικό ρόλο στην ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων κατά την διάρκεια της ζύμωσης μέσω της παραγωγής βιταμινών του συμπλέγματος Β, οι οποίες αποτελούν θρεπτικά συστατικά του Lactobacillus plantarum. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται τα στελέχη των ζυμών που απομονώθηκαν από τη ζύμωση πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου και παρήγαγαν βιταμίνες του συμπλέγματος Β. Πίνακας 2.1.4 Βιταμίνες του συμπλέγματος Β (ng/ml) που παράγονται από ζύμες οι οποίες απομονώθηκαν κατά την ζύμωση πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου (Ruiz-Barba & Diaz, 1995). Στέλεχος ζύμης Βιοτίνη Νικοτινικό οξύ Παντοθενικό οξύ Βιταμίνη Β 6 Saccharomyces cerevisiae 1/11/4 - - - 4.8 / 4.6 Candida diddensiae 1/14/2-95.3 / 85.7 417.8 / 332.2 4.8 / 4.8 Lodderomyces elongisporus 1/14/3-88.2 / 73.2 143.9 / 82.1 - Pichia membranaefaciens 1/64/1 0.74 / 0.72 - - 1.3 / 1.1 Pichia salictaria 1/71/1 2.63 / 0.63-1948.8/1863.2 2.9 / 2.3 Candida parapsilosis 2/11/2-112.1 / 85.3 192.0 / 180.0 - Pichia farinose 2/64/2-248.6 / 88.2 1086.6/722 - Pichia membanaefaciens 2/91/2 1.75 / 0.75 272.2 / 105 264.7 / 141.5 2.56 / 2.36 9

Επίσης, έχει βρεθεί ότι παράγουν αρωματικές ουσίες οι οποίες συμβάλλουν στην διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του τελικού προϊόντος (Ciafardini G. et al., 2005). Σε μελέτες που σχετίζονται με τις επιβλαβείς επιδράσεις τους, έχει αποδειχθεί ότι ζύμες του γένους Saccharomyces (S. οleaginosus), Hansenula (H. anomala) και Rhodotorula παρουσιάζουν πηκτινολυτική δράση προκαλώντας το μαλάκωμα του καρπού (Vaughn et al., 1972). Κατά τη διάρκεια της ζύμωσης πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου έχουν επίσης βρεθεί οξειδωτικές ζύμες λόγω της επαφής της επιφάνειας με τον αέρα. Καθώς ο μεταβολισμός τους χρησιμοποιεί το γαλακτικό οξύ προκαλείται σημαντική αύξηση στο ph που οδηγεί σε αλλοίωση του προϊόντος μέσων φαινομένων παραγωγής αερίου, «gas-pocket». Είδη οξειδωτικών ζυμών που έχουν απομονωθεί από πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου παρουσιάζονται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 2.1.5 Είδη οξειδωτικών ζυμών που έχουν απομονωθεί από πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (Fernandez Diez et al., 1985). Είδη οξειδωτικών ζυμών Candida valida Pichia membranaefaciens Candida zeylanoides Candida rugosa Η αλλοίωση του προϊόντος λόγω ανάπτυξης οξειδωτικών ζυμών μπορεί να αποφευχθεί μέσω κατάλληλου ερμειτικού κλεισίματος των ζυμωτήρων ικανού να διατηρήσει τις επιθυμητές αναερόβιες συνθήκες. Σε μελέτη των Marquina et al., 1992 βρέθηκε ότι οι ζύμες που υπήρχαν στην άλμη παρουσίαζαν λιπολυτική δράση. Τέλος, ζύμες οι οποίες παράγουν το ένζυμο β- γλυκοσιδάση μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την μικροβιολογική εκπίκρανση των ελιών, συγκεκριμένα το στέλεχος Candida wickerhami 1542 (β-γλυκοσιδάση-θετικό, λιπάση-αρνητικό) οδηγεί στη παραγωγή ελιών άριστης ποιότητας (Ciafardini et al., 2005). Έλεγχος της ζύμωσης Οι αναλύσεις που γίνονται για την παρακολούθηση της πορείας της ζύμωσης είναι: η μέτρηση του ph, η περιεκτικότητα σε αλάτι (%, w/v), η τιτλοδοτούμενη οξύτητα (% γαλακτικού οξέος, w/v), η συνολική οξύτητα (meq /l) και τα ανάγοντα σάκχαρα (% 10

γλυκόζη, w/v). Οι μικροβιολογικές αναλύσεις είναι γενικά χρήσιμες εάν το εργοστάσιο έχει τη δυνατότητα διεξαγωγής τους. Η ελεύθερη οξύτητα και το ph είναι οι πιο σημαντικοί παράγοντες, οι οποίοι ελέγχουν τη ζύμωση από την έναρξή της και θα πρέπει να ελέγχονται τακτικά κατά τους πρώτους μήνες της διαδικασίας. Η συνολική οξύτητα φτάνει σε ισορροπία (σάρκα άλμη) περίπου 20 μέρες μετά την τοποθέτηση των ελιών στην άλμη. Η ποσότητα των αναγόντων σακχάρων μετά το τέλος της ζύμωσης σχετίζεται με την ελεύθερη οξύτητα. Ο προσδιορισμός τους είναι επίσης σημαντικός πριν από την προσθήκη καλλιέργειας εκκίνησης, των διορθωτικών επεμβάσεων για την αύξηση της παραγωγής του γαλακτικού οξέος και τη συσκευασία. Οι μικροβιολογικές αναλύσεις συνιστώνται κυρίως στις περιπτώσεις της μη ομαλής διεξαγωγής της ζύμωσης. (Fernandez et al., 1997). 2.2 Ρόλος καλλιεργειών εκκίνησης Η σωστή ζύμωση των πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου βασίζεται στην παρουσία και γρήγορη ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων. Η φυσική μικροχλωρίδα των ελιών καταστρέφεται κατά τη διάρκεια της εκπίκρανσης, οπότε αν δεν προστεθεί επαρκής ποσότητα γαλακτικής καλλιέργειας η διεξαγωγή της ζύμωσης δεν θα είναι επιτυχής καθώς θα αναπτυχθούν ανεπιθύμητοι μικροοργανισμοί που θα προκαλέσουν αλλοιώσεις στους καρπούς. Για το λόγο αυτό συχνά συνιστάται η χρήση γαλακτικής καλλιέργειας εκκίνησης (Fernandez et al., 1997). Η χρήση των καλλιεργειών εκκίνησης στην ζύμωση των πράσινων ελιών προτάθηκε αρχικά από τον Gruess (1937) και στην συνέχεια μελετήθηκε εκτεταμένα από πολλούς ερευνητές και πλήθος αποτελεσμάτων συγκλίνουν στην διεξαγωγή ομαλής ζύμωσης και στην βελτιστοποίηση του παραγόμενου προϊόντος. Παρά όμως το παραπάνω γεγονός η χρήση τους στην βιομηχανία τροφίμων είναι ακόμη σχετικά περιορισμένη. Μια καλλιέργεια εκκίνησης είναι αποτελεσματική όταν βρίσκεται σε επαρκή ποσότητα και είναι η κατάλληλη για το χρησιμοποιούμενο προϊόν. Το μέσο στο οποίο θα προστεθεί η καλλιέργεια θα πρέπει να έχει ορισμένα χαρακτηριστικά όπως: κατάλληλη συγκέντρωση αλατιού στην άλμη διαθέσιμα τα απαραίτητα συστατικά για τη ζύμωση την παρουσία ουσιών που ευνοούν την ανάπτυξη των βακτηρίων (αμινοξέα και βιταμίνες) 11

το κατάλληλο pη στην άλμη την σωστή θερμοκρασία απουσία ανασταλτικών ουσιών κατάλληλη ποικιλία ελιάς Η πιο πιθανή αιτία για την αποτυχία δράσης μιας καλλιέργειας εκκίνησης είναι η επιλογή ακατάλληλων συνθηκών ζύμωσης. Φαίνεται λοιπόν ότι η επιτυχία της ζύμωσης δεν εξαρτάται μόνο από την προσθήκη ή όχι της καλλιέργειας εκκίνησης. Παρ όλα αυτά υπάρχουν κάποια χαρακτηριστικά που θα πρέπει να έχει μια καλλιέργεια εκκίνησης για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην ζύμωση των πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου. Αυτά είναι τα εξής: Αντοχή στην ανασταλτική δράση των πολυφαινολών. Χαμηλή απαίτηση σε θρεπτικά συστατικά. Επιβίωση έναντι άγριων στελεχών του ίδιου είδους. Πιθανή ανασταλτική δράση έναντι ανεπιθύμητων μικροοργανισμών. Αντοχή σε υψηλές συγκεντρώσεις αλατιού και σε ακραίες τιμές ph (τόσο σε όξινο όσο και σε αλκαλικό). Γρήγορη παραγωγή οξέος και πλήρης χρησιμοποίηση των θρεπτικών συστατικών. Καλή διατήρηση των χαρακτηριστικών ιδιοτήτων της καλλιέργειας μετά από κατάψυξη ή λυοφυλίωση. (Fernandez et al., 1997) Τα στελέχη των καλλιεργειών δεν θα πρέπει να παρουσιάζουν παθογόνο ή τοξική δράση. Γρήγορος ρυθμός ανάπτυξης έτσι ώστε να εξασφαλισθεί η κυριαρχία τους σε σύντομο χρονικό διάστημα. Ομοζυμωτικό μεταβολισμό. Ικανότητα ανάπτυξης σε χαμηλές θερμοκρασίες. Παραγωγή βακτηριοσινών Προβιοτικές ιδιότητες (Buckenhuskes, 1993) Σε περίπτωση που η επεξεργασία του ελαιόκαρπου γίνεται σωστά όσον αφορά την εκπίκρανση και την έκπλυση, οι περιβαλλοντικές συνθήκες, ιδιαίτερα η θερμοκρασία, είναι οι απαιτούμενες και υπάρχει σε αφθονία η φυσική μικροχλωρίδα γαλακτικών βακτηρίων στον καρπό τότε δεν υπάρχει ανάγκη προσθήκης καλλιέργειας εκκίνησης. Σε άλλες όμως περιπτώσεις συνιστάται η προσθήκη καλλιέργειας εκκίνησης. Ο εμβολιασμός αποσκοπεί στην προσθήκη τόσης ποσότητας καλλιέργειας στο υγρό της ζύμωσης ώστε ο πληθυσμός της προστιθέμενης καλλιέργειας να ανέλθει στα 10 6 κύτταρα / ml μετά από λίγες μέρες ζύμωσης (όταν το ph του μέσου είναι περίπου στην τιμή 6). 12

Καθώς η άλμη περιέχει ήδη παρόμοιους μικροοργανισμούς ως μέρος της αυτόχθονης μικροχλωρίδας, παρατηρείται ανταγωνισμός μεταξύ του εμβολίου και των «άγριων» στελεχών. Η χρήση καλλιεργειών εκκίνησης παρουσιάζει τα εξής πλεονεκτήματα: Ευνοεί την ομαλή πορεία της ζύμωσης Ευνοεί τον καλύτερο έλεγχο των οργανοληπτικών και φυσικοχημικών χαρακτηριστικών του τελικού προϊόντος Μειώνει το χρόνο ανάπτυξης των γαλακτικών βακτηρίων και γενικά το χρόνο ζύμωσης Περιορίζει την πιθανότητα να «κολλήσει» η ζύμωση (stuck) (Fernandez et al., 1997) Οδηγεί στην πλήρη αξιοποίηση των σακχάρων, εμποδίζοντας δευτερογενείς ζυμώσεις Αναδεικνύει το δραστικό ρόλο των γαλακτικών βακτηρίων που είναι επιθυμητός αφού ορισμένα είδη ζυμών θεωρούνται υπεύθυνα για την παραγωγή αερίου και την δομή του καρπού Προκαλεί αύξηση του ορίου ζωής του παραγόμενου προϊόντος (Borcakli et al., 1995) Κατά τη ζύμωση των ελιών είναι αναγκαίο να ευνοηθεί η ανάπτυξη του Lactobacillus plantarum, ο οποίος θεωρείται απαραίτητος για την παραγωγή του γαλακτικού οξέος που χρειάζεται για την συντήρησή τους καθώς και για την ανάπτυξη της χαρακτηριστικής τους γεύση. Ωστόσο, οι αρχικές συνθήκες συνήθως ασκούν περιοριστική δράση στην ανάπτυξη των επιθυμητών μικροοργανισμών (Rodriguez de la Borolla et al., 1979 / 1981). O πληθυσμός του L.plantarum γενικά συνυπάρχει με τον πληθυσμό των ζυμών μέχρι το τέλος της ζύμωσης και κατά την διάρκεια της αποθήκευσης (Ruiz-Barba, 1991/1994). Σε μερικές περιπτώσεις, το γαλακτικό οξύ δεν παράγεται στις ποσότητες που απαιτείται για την συντήρηση των ελιών με αποτέλεσμα την αλλοίωση του προϊόντος (Garrido-Fernandez et al., 1995). Υπό αυτό το πρίσμα, η χρήση κατάλληλων καλλιεργειών εκκίνησης του L.plantarum παρέχει τη δυνατότητα καλυτέρευσης του μικροβιολογικού ελέγχου της διαδικασίας, αυξάνει την απόδοση σε γαλακτικό οξύ, οδηγώντας στην παραγωγή πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου υψηλής ποιότητας. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό για την επιτυχή χρήση του L.plantarum ως καλλιέργειας εκκίνησης είναι η κυριαρχία του έναντι της ενδογενούς μικροχλωρίδας. Η κυριαρχία του μπορεί να επιτευχθεί μέσω της γρήγορης ανάπτυξής του στις συνθήκες της ζύμωσης και της ικανότητας παραγωγής ανταγωνιστικών ουσιών (Ruiz-Barba, et al., 13

1994). Στις ανταγωνιστικές ουσίες ανήκουν οι κύριοι μεταβολίτες όπως το γαλακτικό και οξικό οξύ, η αιθανόλη και το διοξείδιο του άνθρακα και αντιμικροβιακές ουσίες όπως το βενζοϊκό οξύ, υπεροξείδιο του υδρογόνου, διακετύλιο και βακτηριοσίνες (Delgrado et al., 2001). Σύμφωνα με τους ερευνητές Piard & Desmazeaud (1991), τα επίπεδα παραγωγής και οι αναλογίες των ουσιών αυτών εξαρτώνται από το στέλεχος, την σύνθεση του μέσου και από φυσικές παραμέτρους. Οι βακτηριοσίνες αποτελούν εξωκυτταρικές αντιμικροβιακές ουσίες πρωτεϊνικής φύσεως. Συχνά κωδικοποιούνται από γονίδια που εντοπίζονται σε πλασμίδια. Η παραγωγή βακτηριοσινών παρατηρείται καθ όλη την διάρκεια της ζύμωσης. Το στέλεχος L.plantarum LPCO10 έχει αποδειχθεί ότι παράγει 2 βακτηριοσίνες: την plantaricin S (pls) και την plantaricin T (pls), οι οποίες είναι δραστικές έναντι φυσικών ανταγωνιστών του L.plantarum καθώς επίσης και έναντι βακτηρίων που προκαλούν αλλοίωση. Το στέλεχος αυτό έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στις ζυμώσεις ενώ θεωρείται ότι η ικανότητά του να παράγει βακτηριοσίνες διευκολύνει την κυριαρχία του έναντι του φυσικού μικροβιακού πληθυσμού (Sanchez et al., 2003). Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρεται το φάσμα δράσης των βακτηριοσινών έναντι ανταγωνιστικών βακτηρίων του L.plantarum και βακτηρίων αλλοίωσης. Πίνακας 2.2.1 Φάσμα δράσης των βακτηριοσινών (Diaz et al., 1993) Μικροοργανισμοί Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus fermentum Lactococcus lactis subsp.cremoris Lactococcus lactis subsp.lactis Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranicum Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Leuconostoc paramesenteroides Micrococcus sp. Pediococcus sp. Pediococcus pentosaceus Streptococcus thermophilus Clostridium tyrobutyricum Enterococcus faecalis Propionibacterium Lactobacillus helveticus Lactobacillus sakei Εάν και το επικρατέστερο είδος θεωρείται ο L. plantarum σε μελέτη των ερευνητών Randazzo et al., 2004 με εφαρμογή μοριακών τεχνικών προέκυψε ότι κατά την φυσική 14

ζύμωση ελιών ποικιλίας Σικελίας το 50% των στελεχών που απομονώθηκαν ανήκαν στον είδος Lactobacillus casei, το οποίο θεωρήθηκε το επικρατέστερο. Το αποτέλεσμα αυτό που αποτελεί μια νέα ανακάλυψη μιας και δεν έχει αναφερθεί από άλλους ερευνητές, υποδεικνύει ότι οι συνθήκες που επικρατούν κατά τη φυσική ζύμωση των πράσινων ελιών είναι τόσο σημαντικές που μπορούν να επηρεάσουν το είδος του μικροοργανισμού που τελικά θα κυριαρχήσει. Ως προς την χρήση καλλιεργειών εκκίνησης, σε μελέτη των de Castro et al., 2002 προτείνεται η χρήση στελεχών του βακτηρίου Enterococcus casseliflavus σε συνδυασμό με στελέχη του Lactobacillus pentosus ως καλλιέργειες εκκίνησης κατά τη ζύμωση πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου ποικιλίας Manzanillo. Η κατεργασία των ελιών περιελάμβανε επεξεργασία με 1,87 % (w/v) NaOH για 6,25 h στους 22-24 ο C, έκπλυσή τους με νερό βρύσης για 14,25 h και στην συνέχεια τοποθέτησή τους σε ζυμωτήρες με 10,06 % (w/v) NaCl. H μελέτη του συνδυασμού των παραπάνω στελεχών έδειξε μια πιο γρήγορη έναρξη της ζύμωσης συγκρινόμενη με τη φυσική ζύμωση. Τέλος, το πλεονέκτημα της χρήσης αυτού του συστήματος εμβολιασμού έγγυται στην αντοχή του Enterococcus casseliflavus στο αρχικό υψηλό ph. Oι αρχικές συνθήκες της άλμης είναι πολύ σημαντικές για την πορεία της ζύμωσης και τη δράση της καλλιέργειας εκκίνησης για το σκοπό αυτό οι ερευνητές Sanchez et al., 2003 μελέτησαν τις βέλτιστες αρχικές συνθήκες της άλμης που θα επέτρεπαν την παραγωγή υψηλής ποσότητας γαλακτικού οξέος χρησιμοποιώντας ως καλλιέργεια εκκίνησης το στέλεχος L. plantarum LPCO10 σε ελιές ποικιλίας Manzanillo, οι οποίες επεξεργάστηκαν με NaOH (2,1% w/v) κατά τη μέθοδο του Ισπανικού τύπου. Οι συνθήκες, οι οποίες προτείνονται και σε βιομηχανική κλίμακα περιλαμβάνουν τα εξής: 4% NaCl μέγεθος εμβολίου 10 7 CFU/ml (ή άνω) χρήση οξικού οξέος για διόρθωση της αρχικής βασικής τιμής του ph στην τιμή 4. Καθοριστικός είναι επίσης ο τύπος της επεξεργασίας που εφαρμόζεται τόσο στο φυσικοχημικό όσο και στο μικροβιολογικό προφίλ της ζύμωσης. Οι ερευνητές Marsillio et al., 2005 εξέτασαν την επίδραση του τύπου της επεξεργασίας στην πορεία της ζύμωσης ελιών ποικιλίας Αscolana tenera. Οι ελιές επεξεργάστηκαν με βάση την Ισπανική μέθοδο (SSP=Spanish-style processing), την Ελληνική μέθοδο με φυσική ζύμωση (GSPs=Greek-style spontaneus 15

processing) και την Ελληνική μέθοδο με χρήση ως καλλιέργειας εκκίνησης το στέλεχος Lactobacillus plantarum B1(GSPi = Greek-style inoculated processing). Στο σχήμα που ακολουθεί παρουσιάζεται το φυσικοχημικό τους προφίλ, όπου όπως φαίνεται η χρήση της καλλιέργειας εκκίνησης στην περίπτωση της επεξεργασίας με την Ελληνική μέθοδο οδήγησε σε μεγαλύτερη μείωση του ph, η οποία συνοδεύτηκε από ανάλογη αύξηση της τιτλοδοτούμενης οξύτητας. Σχήμα 2.2.1 Εξέλιξη του ph και της τιτλοδοτούμενης οξύτητας κατά τη διάρκεια της ζύμωσης: ph SSP ( ),TTA SSP ( ), ph GSP-s ( ), TTA GSP-s ( ), ph GSP-I ( ), TTA GSP-I ( ) (Marsillio et al., 2005). Στο σχήμα που ακολουθεί παρουσιάζεται το μικροβιολογικό προφίλ. Όπως φαίνεται στο σχήμα, οι ζύμες ήταν παρούσες σε όλες τις περιπτώσεις και ο πληθυσμός τους αύξανε καθώς προχωρούσε η ζύμωση. Η παρουσία των ζυμών κατά την διάρκεια της ζύμωσης ενισχύει την μεταβολική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων. Κατά την επεξεργασία με βάση την Ισπανική μέθοδο, οι ζύμες ανταγωνίζονται την ενδογενή μικροχλωρίδα των γαλακτικών βακτηρίων κυριαρχώντας μετά από 30 ημέρες, γεγονός που εξηγεί την χαμηλή οξύτητα που καταγράφηκε στην περίπτωση αυτή. Κατά την επεξεργασία με βάση την Ελληνική μέθοδο με φυσική ζύμωση, οι ζύμες κυριάρχησαν των γαλακτικών βακτηρίων αντίθετα στην περίπτωση χρήσης καλλιέργειας ο πληθυσμός τους ήταν χαμηλότερος. Αν και τα γαλακτικά βακτήρια ήταν παρόντα σε όλες τις μεταχειρήσεις κυριάρχησαν μόνο στην περίπτωση της χρήσης καλλιέργειας, όπου ο πληθυσμός τους ανήλθε στην τιμή των 10 9 CFU/ml. Αυτό είχε επίδραση στο φυσικοχημικό προφίλ, αυξάνοντας το επίπεδο της οξύτητας. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν την άμεση επίδραση των συνθηκών επεξεργασίας στην πορεία της ζύμωσης. 16

(a) (b) Σχήμα 2.2.2 Εξέλιξη του μικροβιακού πληθυσμού στις μεταχειρήσεις SSP (a) και GSP (b) (Marsillio et al., 2005). Ως προς τις προβιοτικές ιδιότητες των μικροοργανισμών οι ερευνητές Lavermicocca et al., 2005 μελέτησαν 7 στελέχη που ανήκουν στα προβιοτικά είδη Lactobacillus rhamnosus, L.paracasei, Bifidobacterium bifidum και B.longum ως προς την ικανότητα επιβίωσής τους στην επιφάνεια των ελιών σε 5 διαφορετικά δείγματα επιτραπέζιων ελιών (πράσινων και μαύρων). Επίσης, εξετάσθηκε η καταλληλότητα των ελιών ως βιολογικό μέσο, μέσω του οποίου τα στελέχη διέρχονται από τον πεπτικό σωλήνα, διατηρώντας τις αποικίες τους. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στο πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 2.2.2 Στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν (Lavermicocca et al., 2005). Στελέχη Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 (ή εμπορική ονομασία Lactobacillus GG) Lactobacillus rhamnosus IMPC11 Lactobacillus rhamnosus IMPC19 Lactobacillus paracasei IMPC2.1 Lactobacillus paracasei IMPC4.1 Bifidobacterium bifidum ATCC 15616 Bifidobacterium longum ATCC 15708 Τα παραπάνω στελέχη επιλέχθησαν λόγω της αντοχής που παρουσιάζουν στο γαστρικό υγρό. Πραγματοποιήθηκαν επιπλέον αναλύσεις κοπράνων σε εθελοντές μετά από κατανάλωση 10-15 ελιών για δάστημα 15 ημερών, η μελέτη των οποίων έδειξε ότι οι επιτραπέζιες ελιές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέσο μεταφοράς των βακτηριακών κυττάρων στον ανθρώπινο πεπτικό σωλήνα, κάτι που προκαλεί ενδιαφέρον και απαιτεί περαιτέρω έρευνα μιας και μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή ενός νέος προϊόντος με προβιοτικές ιδιότητες που θα παρουσιάζει την ικανότητα αναστολής των παθογόνων 17

μικροοργανισμών και θα προστατεύει τον άνθρωπο από γαστρεντερικές παθήσεις. Με χρήση ηλεκρονικής μικροσκοπίας σάρωσης, παρατηρήθηκε η επιφάνεια των ελιών στην οποία φαίνεται η προσκόλληση των βακτηρίων. Όπως φαίνεται στο σχήμα που ακολουθεί τα βακτηριακά κύτταρα των L. rhamnosus και L. paracasei παρουσιάζουν μια κανονική κατανομή ενώ τα κύτταρα του Bifidobacterium τείνουν να συσσωματωθούν. Ειδικότερα, στο στέλεχος B. longum ATCC 15708, τα κύτταρά του προσκολλώνται στην επιφάνεια της ελιάς μέσω μικρών συσσωματωμάτων άμορφου υλικού ενώ τα κύτταρα του B. bifidum ATCC 15616 σχηματίζουν συσσωματώματα τύπου τσαμπιού, (cluster) στην επιφάνεια των ελιών. Σχήμα 2.2.3 Αποικίες των βακτηριακών κυττάρων στην επιφάνεια ων ελιών: Lactobacillus GG (a), L. paracasei IMPC2.1(b), B. longum ATCC 15708 (c), B. bifidum ATCC 15616 (d), μη-εμβολιασμένη επιφάνεια ελιάς (e). 2.3 Φαινολικές ενώσεις επιτραπέζιων ελιών Οι επιτραπέζιες ελιές αποτελούν πηγές φαινολικών ενώσεων με σημαντικές βιολογικές ιδιότητες (Boskou & Visioli, 2003). Το φαινολικό κλάσμα των επιτραπέζιων 18

ελιών είναι πολύ σύνθετο και ποικίλλει τόσο σε ποιότητα όσο και σε ποσότητα καθώς εξαρτάται από την μέθοδο επεξεργασίας (Romero et al., 2004), τον τρόπο άρδευσης (Patumi et al., 2002) και από τον βαθμό ωρίμανσης του καρπού (Ryan et al., 1999). Οι φαινολικές ενώσεις ανήκουν στην κατηγορία των φυσικών αντιοξειδωτικών και διαδραματίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην διατροφή του ανθρώπου (Boskou & Visioli, 2003). H πρόσληψή τους έχει ευεργετική επίδραση στην ανθρώπινη υγεία μιας και η αντιοξειδωτική τους δράση έχει συσχετισθεί με μείωση της πιθανότητας καρδιακών παθήσεων (Tapiero et al., 2002), με διάφορους τύπους καρκίνου (Trichopoulou & Lagion, 1997) καθώς και με φλεγμονώδη νοσήματα (Andrikopoulos et al., 2002). Οι πιο σημαντικές φαινολικές ενώσεις του καρπού της ελιάς είναι η ελαιοευρωπαΐνη, η υδροξυτυροσόλη, ο βερμπασκοζίτης, η τυροσόλη και το π-κουμαρικό οξύ, οι συντακτικοί τύποι των οποίων παρουσιάζονται παρακάτω. υδροξυτυροσόλη βερμπασκοζίτης τυροσόλη π-κουμαρικό οξύ Βανιλλικό οξύ ελαιοευρωπαΐνη Σχήμα 2.3.1 Συντακτικοί τύποι των σημαντικότερων φαινολικών ενώσεων που απαντώνται στον καρπό της ελιάς (Soni et al., 2006/Bianchi et al., 2003) Οι πιο σημαντικές αλλαγές στο φαινολικό κλάσμα οφείλονται στην μείωση των επιπέδων της ελαιοευρωπαΐνης κατά την ανάπτυξη του καρπού και στην αύξηση της τυροσόλης και της υδροξυτυροσόλης (Ryan et al., 1999). Το φαινολικό περιεχόμενο καθώς και το προφίλ εξαρτάται αρχικά από την ποικιλία. Σε μελέτη των Blekas et al., 19

2002 εκτιμήθηκε το φαινολικό περιεχόμενο ελιών διαθέσιμων στην Ελληνική αγορά ποικιλίας Κονσερβολιάς, Καλαμών και Θάσου. Βάση των αποτελεσμάτων το περιέχομενο σε φαινόλες κυμάνθηκε από 178-1718 mg/kg. Οι ελιές Καλαμών παρουσίασαν το υψηλότερο περιεχόμενο σε φαινόλες (μέση τιμή=1046 mg/kg) πιθανόν λόγω της ήπιας επεξεργασίας τους. Χαμηλότερες μέσες τιμές καταγράφησαν στις μαύρες ελιές Ελληνικού τύπου (708 mg/kg) και στις πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (632 mg/kg). Ακολούθησε λεπτομερής ανάλυση του φαινολικού προφίλ με χρήση RP-HPLC. Yψηλά επίπεδα υδροξυτυροσόλης καταγράφησαν στις ελιές Καλαμών (250-760 mg/kg), ακολούθησαν οι πράσινες ελιές Ισπανικού τύπου (170-510 mg/kg) και οι μαύρες ελιές Ελληνικού τύπου (100-340 mg/kg). Βάση των επιπέδων της υδροξυτυροσόλης προκύπτει το συμπέρασμα ότι οι επιτραπέζιες ελιές αποτελούν καλή πηγή της παραπάνω βιοφαινόλης, γεγονός ιδιαίτερα σημαντικό από διατροφικής απόψεως μιας και η μόνη εναλλακτική πηγή υδροξυτυροσόλης είναι το παρθένο ελαιόλαδο. Σε μελέτη των Boskou et al., 2006 εξετάσθηκαν οι επιτραπέζιες ελιές όπως οι ελιές Κρήτης, Καλαμών, Άμφισσας, Τσακιστές και Θρούμπες Κρήτης και διαπιστώθηκε ότι αποτελούν μια πολύ καλή πηγή φαινολικών ουσιών. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζεται το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο, το οποίο διαφοροποιείται με βάση την ποικιλία. Πίνακας 2.3.1 Συνολικό πολυφαινολικό περιεχόμενο, εκφρασμένο σε mg C.A./100gr σάρκας (Βοskou et al., 2006). Τύπος Σάρκα Τσακιστές 145 Άμφισσας 82 Καλαμών 155 Κρήτης 130 Θρούμπες Κρήτης 171 Ακολούθησε λεπτομερής ανάλυση του φαινολικού προφίλ με χρήση αέριας χρωματογραφίας. Τόσο στην σάρκα όσο και στον πυρήνα ανιχνεύτηκαν οι φαινολικές ενώσεις: τυροσόλη, υδροξυτυροσόλη καθώς και τα φαινολικά οξέα, καφεϊικο οξύ, φερουλικό οξύ, π-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ, π-υδροξυ-φαινυλοξικό οξύ, π-υδροξυφαινυλοπροπανοϊκό οξύ, πρωτοκατεχικό οξύ, π-κουμαρικό οξύ, κιναμμωμικό οξύ, 3,4 διυδροξυ-φαινυλοξικό οξύ και βανιλλικό οξύ. Βάση των αποτελεσμάτων η υδροξυτυροσόλη παρουσιάζει τα υψηλότερα επίπεδα, ακολουθούν το ελενολικο οξύ και η τυροσόλη. Η ποικιλία των Τσακιστών ελιών έχει την υψηλότερη συγκέντρωση σε υδροξυτυροσόλη (114 mg/100g) ενώ οι ελιές Θρούμπες 20

Κρήτης έχουν τη χαμηλότερη (2 mg/100g). Τα επίπεδα του ελενολικού οξέος κυμάνθηκαν μεταξύ των τιμών 12 και 18 mg/100g και της τυροσόλης από 1 έως 21 mg/100g. Στις ελιές Θρούμπες Κρήτης προσδιορίσθηκε το χαμηλότερο φαινολικό περιεχόμενο. Το πιο πλούσιο σε ποσότητα και ποιότητα φαινολικό περιεχόμενο προσδιορίσθηκε στην ποικιλία των Τσακιστών ελιών, ακολούθησαν οι ελιές Άμφισσας, Καλαμών, Κρήτης και Θρούμπα Κρήτης. Εκτός από την ποικιλία της ελιάς σημαντική είναι και η επίδραση του τύπου της επεξεργασίας στο περιεχόμενο σε πολυφαινόλες. Κατά την διάρκεια της επεξεργασίας των ελιών, οι πολυφαινόλες υφίστανται χημικές αλλαγές και γενικά παρατηρείται μείωσή τους. Οι Romero et al., 2004 μελέτησαν την επίδραση στο φαινολικό περιεχόμενο των τριών βασικών τύπων επεξεργασίας: Ισπανικού τύπου επεξεργασία, California τύπου και Ελληνικού τύπου. Αναλυτικότερα, το είδος της ποικιλίας καθώς και ο τύπος επεξεργασίας που μελετήθηκαν παρουσιάζεται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 2.3.2 Δείγματα επιτραπέζιων ελιών που εξετάσθηκαν (Romero et al., 2004). Τύπος Ποικιλία Κωδικός επεξεργασίας Ισπανικού τύπου Gordal GG Ισπανικού τύπου Manzanilla GM Ισπανικού τύπου Hojiblanca GH Ισπανικού τύπου Manzanilla GMP Ισπανικού τύπου Hojiblanca GHP Ισπανικού τύπου Manzanilla GMSA Ισπανικού τύπου Manzanilla GMSP California τύπου Hojiblanca RH California τύπου Cacerena RC Ελληνικού τύπου Kalamata BGK Ελληνικού τύπου Thassos BG Ως προς την Ισπανικού τύπου επεξεργασία, τα κύρια στάδια είναι η εκπίκρανση των ελιών σε αλκαλικές συνθήκες μέσω της οποίας υδρολύεται η ελαιοευρωπαΐνη προς υδροξυτυροσόλη και γλυκοσίδιο του ελενολικού οξέος και η επακόλουθη γαλακτική ζύμωση κατά την διάρκεια της οποίας δεν μεταβάλλεται η φαινολική σύσταση (Brenes et al., 1995). Η επεξεργασία των μαύρων ελιών βάση του California τύπου περιλαμβάνει την διατήρηση των καρπών σε άλμη και την μετέπειτα οξείδωσή τους σε αέρα υπό αλκαλικές συνθήκες. Οι μεταβολές που παρατηρούνται κατά την εφαρμογή αυτής της μεθόδου περιλαμβάνουν την διάχυση των πολυφαινολών κυρίως της ελαιοευρωπαΐνης 21

από την σάρκα στην άλμη και την οξείδωση και τον πολυμερισμό των όρθο-διφαινολών (Vinzcenzo et al., 2001). Κατά την Ελληνικού τύπου επεξεργασία, οι μαύρες ελιές συλλέγονται όταν είναι πλήρως ώριμες και τοποθετούνται απ ευθείας στην άλμη. Οι κύριες αλλαγές που παρατηρούνται στις πολυφαινόλες είναι η όξινη υδρόλυση της ελαιοευρωπαΐνης και ο πολυμερισμός των ανθοκυανινών που συνεισφέρει στην σταθερότητα του χρώματος (Romero et al., 2004). Με χρήση HPLC προέκυψαν τα παρακάτω χαρακτηριστικά χρωματογραφήματα που αφορούν τους τρεις βασικούς προαναφερθέντες τύπους επεξεργασίας. Ισπανικού τύπου Ελληνικού τύπου California τύπου Σχήμα 2.3.2 Χρωματογραφήματα των φαινολικών ενώσεων. Κορυφές: υδροξυτυροσόλη (1), σαλιδροσίδιο (2), τυροσόλη (3) και βερμπασκοσίδιο (4), (Romero et al., 2004). 22

Στο σχήμα τέλος που ακολουθεί παρουσιάζεται το συνολικό πολυφαινολικό περιεχόμενο με την συνεισφορά τόσο της υδατικής όσο και της λιπαρής φάσης του καρπού. Όπως φαίνεται στο σχήμα ανάλογα με την ποικιλία και τον τύπο επεξεργασίας προκύπτει και η τελική διαμόρφωση του συνολικού πολυφαινολικού περιεχομένου. Σχήμα 2.3.3 Επίδραση της ποικιλίας και της μεθόδου επεξεργασίας στο συνολικό πολυφαινολικό περιεχόμενο (Romero et al., 2004). 2.3.1 Ελαιοευρωπαΐνη Η ελαιοευρωπαΐνη ανήκει στα τερπενοειδή και συγκεκριμένα στα γλυκοσιδικά σεκοϊριδοειδή που περιέχουν ένα μόριο γλυκόζης (Konno et al., 1999). Η ελαιοευρωπαΐνη είναι μια πολική υδατοδιαλυτή ένωση με αποτέλεσμα να εκχυλίζεται μαζί με τις άλλες υδατοδιαλυτές ουσίες του καρπού σε υδατικό περιβάλλον. Είναι διαλυτή στην αιθανόλη, αλλά ευαίσθητη σε αλκαλικό περιβάλλον (Garrido-Fernandez and Vaughn, 1978). Η ελαιοευρωπαΐνη είναι ένας διπλός εστέρας της γλυκόζης και αποτελείται από ένα μόριο γλυκόζης, ένα μόριο υδροξυτυροσόλης και ένα μόριο ακόρεστου οξέος εμπειρικού τύπου C 10 H 16 O 3, το ελενολικό οξύ. Η επεξεργασία της ελιάς με άλκαλι έχει σαν αποτέλεσμα την διάσπαση της ελαιοευρωπαΐνης σε προϊόντα αλκαλικής υδρόλυσης εξαφανίζοντας έτσι την πικρή γεύση. Η εφαρμογή του αλκάλεος διασπά τον εστερικό δεσμό μεταξύ του γλυκοσιδίου του ελενολικού οξέος και της υδροξυτυροσόλης και μας δίνει τις δυο ενώσεις όπως φαίνεται και στο σχήμα 2.3.1. Στη συνέχεια το γλυκοσίδιο του ελενολικού οξέος, που αποτελεί ιδιαίτερα ασταθή ένωση, διασπάται σε ελαφρώς όξινες συνθήκες και δίνει ένα μόριο γλυκόζης και ένα μόριο ελενολικού οξέος. Η γλυκόζη αμέσως μετά την 23

απελευθέρωσή της καταναλώνεται από τους υπάρχοντες μικροοργανισμούς ως πηγή άνθρακα (Brenes and De Castro, 1998). Η διάσπαση της ελαιοευρωπαΐνης μπορεί να οφείλεται όμως και στην διάσπαση του γλυκοζιτικού της δεσμού. Αυτό γίνεται μέσω της δράσης του ενζύμου β- γλυκοσιδάση που διασπά την ελαιοευρωπαΐνη σε ένα μόριο γλυκόζης και σε ένα μόριο αγλυκόνης που διατηρεί όμως την πικρή γεύση (Walter et al., 1973). Το δεύτερο στάδιο της διεργασίας είναι η διάσπαση της αγλυκόνης σε υδροξυτυροσόλη και ελενολικό οξύ μέσω της δράσης του ενζύμου εστεράση που υπάρχει φυσικά στον καρπό της ελιάς. Με τον τρόπο αυτό εξαφανίζεται η πικρή γεύση (Marsilio et al., 1998). Στο σχήμα 2.3.2 φαίνεται η πορεία της βιοαποικοδόμησης της ελαιοευρωπαΐνης. ΟΗ - Γλυκοσίδιο του ελενολικού οξέος Η + Η + Υδροξυτυροσόλη Ελενολικό οξύ Γλυκόζη Σχήμα 2.3.1.1 Διάσπαση της ελαιοευρωπαΐνης κατά την επεξεργασία με αλκαλικό διάλυμα (Brenes and De Castro, 1998). 24

β-γλυκοσιδάση Γλυκόζη Αγλυκόνη της ελαιοευρωπαΐνης εστεράση Ελενολικό οξύ Υδοξυτυροσόλη Σχήμα 2.3.1.2 Βιοαποικοδόμηση της ελαιοευρωπαΐνης (Marsilio et al., 1997). 2.4 Επίδραση της εφαρμογής θέρμανσης στην ποιότητα των επιτραπέζιων ελιών Η διαδικασία επεξεργασίας πράσινων ελιών Ισπανικού τύπου όπως προαναφέρθηκε περιλαμβάνει αρχικά την κατεργασία με άλκαλι, η οποία υδρολύει την ελευρωπαϊνη και 25

αυξάνει την διαπερατότητα της επιδερμίδας του καρπού οδηγόντας στη διαρροή των συστατικών της σάρκας στο περιβάλλον υγρό της άλμης (Fernandez et al.,1997). Στη συνέχεια, μετά από την έκπλυση ξεκινά αυθόρμητα η γαλακτική ζύμωση στην άλμη (παρουσία NaCl και χαμηλής τάσης οξυγόνου) με την κυριαρχία των γαλακτικών βακτηρίων. Ανάμεσα στα γαλακτικά βακτήρια, ο Lactobacillus plantarum θα πρέπει να είναι ο επικρατέστερος μικροοργανισμός για επιτυχή ζύμωση (Adams and Moss, 1995). Τα γαλακτικά βακτήρια καταναλώνουν τα σάκχαρα του καρπού, τα οποία είναι παρόντα στην άλμη και παράγουν κυρίως γαλακτικό οξύ και σε μικρότερο ποσοστό άλλα οξέα οδηγόντας σε μείωση του ph (Adams, 1990). H πτώση του ph είναι καθοριστικός παράγοντας για την επιτυχή πορεία της ζύμωσης (Spyropoulou et al., 2001). Ωστόσο, οι ελαιόκαρποι μερικές φορές δεν περιέχουν επαρκή ζυμούμενα σάκχαρα ειδικά μετά την επεξεργασία με άλκαλι με αποτέλεσμα η φυσική μικροχλωρίδα των γαλακτικών βακτηρίων να αδυνατεί να αναπτυχθεί και να κυριαρχήσει (Vaughn, 1982). Επιπλέον, εάν η πτώση του ph κατά την διάρκεια των πρώτων ημερών της ζύμωσης δεν είναι αρκετά γρήγορη επιτρέπει στο πληθυσμό των εντεροβακτηρίων να φτάσει σε υψηλές τιμές, αλλοιώνοντας έτσι το τελικό προϊόν (Fernandez, 1997). Για να ξεπεραστούν τα προβλήματα αυτά έχουν προταθεί διάφορες λύσεις όπως: η χρήση καλλιεργειών εκκίνησης (η οποία μελετήθηκε στο τμήμα 2.2), η προσθήκη σακχάρων, η οξίνιση της άλμης, η προσθήκη αλατιού και η εφαρμογή θερμικού σοκ στις ελιές ( Montano et al., 1993, Ruiz-Barba et al., 1994, Sanchez et al., 2001, de Castro et al., 2002 & Panagou et al., 2003). Αρχικά, η εφαρμογή θερμικού σοκ σε ελιές μελετήθηκε από τους Etchells et al., (1966) σε ελιές ποικιλίας Manzanillo, οι οποίες λόγω της χαμηλής τους περιεκτικότητας σε ζυμώμενα σάκχαρα παρουσιάζουν δυσκολίες κατά τη ζύμωση. Η χρήση θερμικού σοκ, 74 ο C για 3min, είχε εντυπωσιακά αποτελέσματα κατά τη διεξαγωγή της ζύμωσης οδηγώντας σε αύξηση τόσο της παραγώμενης ποσότητας γαλακτικού οξέος όσο και του ρυθμού παραγωγής αυτού. Στο σχήμα 2.4.1 φαίνεται η επίδραση του θερμικού σοκ στην αύξηση της παραγωγής του γαλακτικού οξέος, η οποία συνοδεύτηκε από αντίστοιχη μείωση της τιμής του ph. 26

Σχήμα 2.4.1 Επίδραση του θερμικού σοκ, 74 ο C για 3min, στην παραγωγή γαλακτικού οξέος και στην τιμή του ph (Etchells et al., 1966). Επιπλέον, κατά την μελέτη της επίδρασης της προσθήκης στην άλμη γαλακτικού οξέος, δεξτρόζης και συνδυασμό αυτών των δύο, η εφαρμογή θερμικού σοκ είχε καλύτερα αποτελέσματα σε όλες τις παραπάνω επεμβάσεις σε σχέση με εκείνα από τις δοκιμές στις αποίες δεν εφαρμόστηκε (Σχήμα 2.4.2). Σχήμα 2.4.2 Παραγωγή γαλακτικού οξέος κατά την διάρκεια ζύμωσης με ή χωρίς προσθήκη γαλακτικού οξέος, δεξτρόζης ή συνδυασμό αυτών των δυο σε θερμικά και μη επεξεργασμένες ελιές τύπου Manzanillo (Etchells et al., 1966). 27