ΓΕΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Μαντώ Κυριακού 2015
Μικροβιακή αύξηση Σε καθαρές καλλιέργειες: η σύνθεση των μακρομορίων ενός μο εξαρτάται από τον ρυθμό που αυξάνεται και τη φύση των συνθηκών αύξησης (π.χ. την επίδραση της συγκ. του υποστρώματος) Μικροοργανισμοί: μερικές φορές παρουσιάζουν διαφορετικούς φαινότυπους ανάλογα με τις συνθήκες περιβάλλοντος οδήγησε σε λανθασμένη ταυτοποίηση κάποιων στελεχών
Μικροβιακή αύξηση Το περιβάλλον επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων με την αντίστοιχη ενεργοποίηση π.χ. άλλων ενζύμων, δηλ. εάν υπάρχουν εναλλακτικές οδοί για την ίδια μεταβολική λειτουργία, θα επικρατήσει εκείνη που υπαγορεύει το περιβάλλον
Μελέτη της μικροβιακής αύξησης o Μονοκύτταροι οργανισμοί: ισχύουν γενικά οι αρχές της εκθετικής αύξησης o Μελέτη της αύξησης σε: κλειστά συστήματα αύξησης και συνεχείς καλλιέργειες
Κλειστή καλλιέργεια (batch culture) Η εκκίνηση συνοδεύεται με περίσσεια όλων των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών και η αύξηση προχωρά με τον μέγιστο δυνατό ρυθμό εν γίνεται καμία προσθήκη ή αφαίρεση υλικού μέχρι που κάποιο συστατικό γίνεται περιοριστικός παράγοντας ή αποτελεί τοξικό παράγοντα λόγω αύξησης της συγκέντρωσής του
Συνεχής καλλιέργεια (continuous culture) Γίνονται συνεχείς, ή ασυνεχείς προσθήκες θρεπτικού υλικού, έτσι ώστε όλα τα θρεπτικά συστατικά να είναι σε περίσσεια Επίσης απομακρύνονται τα μεταβολικά προϊόντα, έτσι ώστε να μην αποβεί κάποιο τοξικό στα μικροβιακά κύτταρα
Ανάγκη ύπαρξης κατάλληλων μαθηματικών μοντέλων Παρελθόν: μελέτη της αύξησης κυρίως σε καθαρές καλλιέργειες, δηλ. πληθυσμοί με ένα είδος κυττάρων : σημαντικό για την κατανόηση των βασικών μηχανισμών (1ο βήμα) Πλέον: ανάγκη για μελέτη της αύξησης σε μικτούς πληθυσμούς σχέσεις ανταγωνιστικές ως προς το υπόστρωμα: αντικείμενο της Μικροβιακής Οικολογίας (αληθινό περιβάλλον π.χ. τρόφιμα, μικροχλωρίδα εντέρου)
Μελέτη της αύξησης σε πληθυσμούς και όχι σε μεμονωμένα κύτταρα! Αύξηση ενός μικροβιακού πληθυσμού αύξηση του αριθμού των μικροβιακών κυττάρων αύξηση της μικροβιακής μάζας (βιομάζα) Ρυθμός αύξησης: μεταβολή της βιομάζας στη μονάδα του χρόνου Χρόνος γενεάς: χρονικό διάστημα που απαιτείται για την παραγωγή δύο κυττάρων από ένα
Αύξηση και σύνθεση των μακρομορίων Στην εκθετική αύξηση όλα τα βιομόρια συντίθενται με τον ίδιο ρυθμό (ισορροπημένη αύξηση) Μεταφορά της καλλιέργειας σε πλουσιότερο υλικό: αύξηση σύνθεσης του RNA, αργότερα αύξηση της σύνθεσης των πρωτεϊνών και του DNA και τελικά αύξηση του ρυθμού της κυτταρικής διαίρεσης Κλειδί ελέγχου του ρυθμού αύξησης: σύνθεση του RNA (rrna( rrna)
Μικροβιακή αύξηση σε κλειστό περιβάλλον (batch culture) A) Αύξηση σε μη-περιοριστικές συνθήκες περιβάλλοντος (εκθετική αύξηση) Ρυθμός αύξησης της βιομάζας & ρυθμός αύξησης των κυττάρων: επιταχύνεται με το χρόνο Εάν υπάρχουν ήδη στο περιβάλλον προσχηματισμένοι πρόδρομοι των βιομορίων η αύξηση είναι πιο γρήγορη
Εκθετική αύξηση του E.coli
Χρόνος διπλασιασμού της καλλιέργειας (g) Αναφέρεται και ως μέσος χρόνος διπλασιασμού της καλλιέργειας ή μέσος χρόνος γενεάς: χρόνος που χρειάζεται για να συμπληρωθεί μια γενεά και να διπλασιαστεί το μέγεθος του πληθυσμού Σταθερές συνθήκες παραμένει σταθερός Μονάδες χρόνου : συνήθως ώρες
Μέγεθος του πληθυσμού Εξαρτάται από: Αρχικό εμβόλιο (N 0 ) και από Χρόνο αύξησης (t) Το μέγεθος του πληθυσμού (N) μετά από χρόνο t, εξαρτάται από το αρχικό εμβόλιο και μπορεί να εκφραστεί από τη μαθηματική σχέση: N= N 0 *2 t/g Εάν γίνει t=g τότε ο πληθυσμός γίνεται N=2N 0 ηλαδή: ο χρόνος διπλασιασμού είναι ο χρόνος που απαιτείται για να ολοκληρωθεί μία γενεά
Εάν λογαριθμίσουμε την εκθετική συνάρτηση: N= N 0 *2 t/g lnn= lnn 0 + ln2 2 *t/g lnn /t - lnn 0 /t = ln2/g ln2=0.693 Έτσι η εκθετική συνάρτηση μπορεί να περιγραφεί με γραμμική σχέση με σταθερή κλίση 0.693/g
Εάν παρατηρήσουμε ένα αρχικό πληθυσμό (εμβόλιο) N 0 μετά από χρονικό διάστημα dt θα δούμε ότι μόνο ένα μικρό μέρος των κυττάρων του έχει διαιρεθεί με συνέπεια την αύξηση του μεγέθους του πληθυσμού κατά dn, ενώ κάποια άλλα βρίσκονται σε φάση διαίρεσης και άλλα είναι στο μέγιστο όγκο τους ένας μικροβιακός πληθυσμός δεν περιέχει συνήθως κύτταρα που βρίσκονται όλα στην ίδια φάση έχουν διαφορετικό μέγεθος Σπάνια: συγχρονισμένες καλλιέργειες: κύτταρα που βρίσκονται όλα στο ίδιο στάδιο του κυτταρικού κύκλου
o o Εάν το dn παραμένει σταθερό τότε εξαρτάται από τον αρχικό πληθυσμό N 0 και ο ρυθμός αύξησης του πληθυσμού είναι ανάλογος του αρχικού πληθυσμού (εμβολίου) dn/dt= = k*nk 0 k: σταθερά του ρυθμού αύξησης Μονάδες μέτρησης: αντίστροφου χρόνου (h -1 ) Εξαρτάται από τον τύπο του μο και από τις φυσικοχημικές συνθήκες του περιβάλλοντος της καλλιέργειας
Σε άριστες συνθήκες: η σταθερά του ρυθμού αύξησης γίνεται μέγιστη k=k max Ν=Ν 0 *e kt lnν=ln lnν 0 +k*t lnn-lnn 0 = k*t k= lnn/t- lnn 0 /t Συγκρίνοντας με την προηγούμενη συνάρτηση: lnn /t - lnn 0 /t = ln2/g Προκύπτει ότι: k= ln2/g k=0.693/ g ηλαδή η σταθερά του ρυθμού αύξησης είναι αντίστροφη του χρόνου διπλασιασμού της καλλιέργειας
Βασικές εξισώσεις αύξησης N= N 0 *2 t/g N=N 0 *e kt Βασικές παράμετροι αύξησης k max g
Αύξηση σε περιοριστικές συνθήκες περιβάλλοντος o o Η εκθετική αύξηση μπορεί να συνεχιστεί σε ένα κλειστό περιβάλλον μέχρι κάποια χρονική στιγμή εξάντληση κάποιου θρεπτικού συστατικού, συσσώρευση κάποιου μεταβολίτη που γίνεται τοξικός για το μο Βασικές εξισώσεις αύξησης δεν αποτελούν ολοκληρωμένο μοντέλο αύξησης στη φύση
Υπόθεση από τους Stanier και συνεργάτες:
Κλειστός κύκλος αύξησης της καλλιέργειας Αναδευόμενες καλλιέργειες στο εργαστήριο Φάσεις της αύξησης: λανθάνουσα, υστέρησης επιτάχυνσης, εκθετική, επιβράδυνσης, στασιμότητας θανάτου
Λανθάνουσα φάση: φάση που πιθανά προσαρμόζεται ο πληθυσμός π.χ. σύνθεση νέων ενζύμων (k=0) Φάση επιτάχυνσης: αρχή της ανάπτυξης του μο (k>0) Εκθετική φάση: πολύ σύντομη χρονικά. Η μόνη για την οποία ισχύουν οι βασικές εξισώσεις αύξησης (k=k max ) Φάση επιβράδυνσης: μειώνεται ο ειδικός ρυθμός αύξησης (k<kmax) Φάση στασιμότητας: ο πληθυσμός παραμένει μεταβολικά ενεργός, αλλά η ενεργή αύξηση έχει παύσει (k=0). Φάση θανάτου: μείωση της βιωσιμότητας του πληθυσμού
Καμπύλη αύξησης σε κλειστή καλλιέργεια
ιαυξία Φαινόμενο που εμφανίζεται όταν σε καθαρή καλλιέργεια στο θρεπτικό υλικό υπάρχουν δύο πηγές C, ή N κατανάλωση της πρώτης και μετά της δεύτερης
Άμεσες μετρήσεις της μικροβιακής αύξησης Μετρήσεις του συνολικού αριθμού των κυττάρων Μετρήσεις δείκτη βιωσιμότητας
Μέτρηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων Άμεση μικροσκοπική καταμέτρηση
Μέτρηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων
Μέτρηση δείκτη βιωσιμότητας Μέτρηση μόνο των βιώσιμων κυττάρων: ικανών να διαιρεθούν και να σχηματίσουν αποικίες Παραδοχή! Κάθε βιώσιμο κύτταρο μπορεί να δώσει μία αποικία
Μέθοδος υγρής επίστρωσης σε τρυβλίο Ομογενοποίηση του δείγματος Μεταφορά από κάθε αραίωση συγκεκριμένου όγκου δείγματος με ασηπτική τεχνική (1, 0.1mL ml)
Μεταφορά σε τρυβλίο με το κατάλληλο υπόστρωμα Επίστρωση σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου με ειδικό ραβδάκι ή με μπατονέτα
Επώαση των τρυβλίων Καταμέτρηση των αποικιών & υπολογισμός του αρχικού βιώσιμου μικροβιακού φορτίου
Μέθοδος αραίωσης του εμβολίου Συγκεκριμένος όγκος εμβολίου εισάγεται σε άδειο αποστειρωμένο τρυβλίο και προστίθεται τηγμένο θρεπτικό υλικό
Έμμεσες μετρήσεις της μικροβιακής αύξησης Θολερότητα Μέτρηση ξηρής βιομάζας Μέτρηση μικροβιακής πρωτείνης Μέτρηση συγκεκριμένης ενζυμικής δραστηριότητας (φυσιολογική δραστηριότητα ενός μικροβιακού πληθυσμού) Μέτρηση συγκεκριμένου γενετικού στοιχείου
Έμμεσες μετρήσεις της μικροβιακής αύξησης Θολερότητα Εναιώρημα κυττάρων φαίνεται θολό, διότι τα κύτταρα σκεδάζουν το φως που διέρχεται. Μέτρηση με φωτόμετρο ή φασματοφωτόμετρο Μονάδες οπτικής πυκνότητας (OD) Χάραξη πρότυπης καμπύλης
Ευχαριστώ!!