Αρχές και µεθοδολογία της Βιοτεχνολογίας Κ.Ε. Κεραµάρης ρ. Βιολόγος
Ο όρος βιοτεχνολογία χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Ούγγρο Kark Ereky το 1919, για να περιγράψει τη «διαδικασία παραγωγής προϊόντων από ακατέργαστα υλικά µε τη βοήθεια ζωντανών οργανισµών».
Βιοτεχνολογία: αποτελεί συνδυασµό Επιστήµης και Τεχνολογίας µε στόχο την εφαρµογή των γνώσεων που έχουν αποκτηθεί από µελέτη των ζωντανών οργανισµών για την παραγωγή σε ευρεία κλίµακα χρήσιµων προϊόντων. Βιοτεχνολογία: είναι η χρήση ζωντανών οργανισµών προς όφελος του ανθρώπου. Η Βιοτεχνολογία στηρίζεται κυρίως σε τεχνικές καλλιέργειας και ανάπτυξης των µικροοργανισµών και σε τεχνικές ανασυνδυασµένου DNA.
Βιοτεχνολογία περιλαµβάνει την χρήση ζωντανών οργανισµών (ή προϊόντων τους) ή βιολογικών συστηµάτων-αντιδράσεων για την παραγωγή αγαθών, την εφαρµογή τεχνικών in vitro χειρισµού ή ανασυνδυασµού νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA), τεχνικών σύντηξης, κλωνοποίησης κυττάρων εκτός της ταξινοµικής οικογένειας που ξεπερνά τα φυσικά, φυσιολογικά ή αναπαραγωγικά όρια και δεν είναι τεχνικές που χρησιµοποιήθηκαν στην κλασική βελτίωση και επιλογή.
Τα βακτήρια είναι µονοκύτταροι οργανισµοί 1 βακτήριο = 1 κύτταρο = 1 αυτόνοµος οργανισµός
Μικροβιακές καλλιέργειες Ο ρυθµός ανάπτυξης ενός πληθυσµού µικροοργανισµών καθορίζεται από το χρόνο διπλασιασµού. Οι παράγοντες που επηρεάζουν το χρόνο διπλασιασµού είναι η διαθεσιµότητα θρεπτικών συστατικών, το ph, το O 2 και η θερµοκρασία.
Θρεπτικά συστατικά: άνθρακας (CO 2 ), άζωτο (αµµωνιακά, νιτρικά ιόντα), µεταλλικά ιόντα, νερό. ph: συνήθως 6-9, µε εξαιρέσεις, όπως το Lactobacillus 4-5. Παρουσία ή απουσία O 2 : υποχρεωτικά αερόβιοι (Mycobacterium), προαιρετικά αερόβιοι (µύκητες), υποχρεωτικά αναερόβιοι (Clostridium). Θερµοκρασία: Ψυχρόφιλα (-5 έως 20 ο C µε άριστη 13 o C), µεσόφιλα (18-48 ο C µε άριστη 39 o C), θερµόφιλα (40-68 ο C µε άριστη 60 o C), υπερθερµόφιλα (66-98 ο C και 80-110 ο C µε άριστη 88 o C και 105 o C). Οι περισσότεροι οργανισµοί αναπτύσσονται σε θερµοκρασία 20 45 o C, ενώ οι παθογόνοι σε θερµοκρασία 37 o C.
Καλλιέργεια µικροοργανισµών Για την καλλιέργεια βακτηρίων και µυκήτων πρωτοπόρος ο Louis Pasteur. Οι µικροοργανισµοί µπορούν να αναπτυχθούν στο εργαστήριο και σε µεγάλη κλίµακα στις βιοµηχανικές µονάδες κάτω από αυστηρά ελεγχόµενες συνθήκες καλλιέργειας. Τα τεχνητά θρεπτικά µέσα πρέπει να περιέχουν πηγή άνθρακα, αζώτου και ιόντα. Μπορεί να είναι υγρά ή στερεά. Τα στερεά θρεπτικά µέσα παρασκευάζονται µε ανάµιξη του υγρού θρεπτικού υλικού µε ένα πολυσακχαρίτη που προέρχεται από τα φύκη, το άγαρ. Το άγαρ είναι ρευστό σε θερµοκρασίες µεγαλύτερες από 45 o C και στερεοποιείται σε µικρότερες θερµοκρασίες. Μια καλλιέργεια ξεκινάει µε την προσθήκη µικρής ποσότητας κυττάρων στο θρεπτικό υλικό, µια διαδικασία που ονοµάζεται εµβολιασµός.
Η καλλιέργεια σε βιοµηχανική κλίµακα γίνεται στους ζυµωτήρες ή βιοαντιδραστήρες. Με απόλυτο έλεγχο των συνθηκών, σε φτηνές πηγές άνθρακα, όπως η µελάσα (παραπροϊόν επεξεργασίας καλαµοσάκχαρου ή σακχαρότευτλων), η καλλιέργεια ξεκινά µε εµβολιασµό. Με τον όρο ζύµωση εννοούµε τη διαδικασία ανάπτυξης µικροοργανισµών σε υγρό θρεπτικό υλικό κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες. Τα προϊόντα της ζύµωσης είναι είτε τα ίδια τα κύτταρα που ονοµάζονται βιοµάζα είτε προϊόντα των κυττάρων όπως πρωτεΐνες και αντιβιοτικά.
Τι είναι Βιοαντιδραστήρες??? Βιοαντιδραστήρες είναι κατασκευές στις οποίες επιτελούνται βιοµηχανικές διεργασίες υλικών µε τη δράση ζωντανών κυττάρων (π.χ. µικροοργανισµών) ή ενζύµων. Οι βιοαντιδραστήρες διακρίνονται σε: σε εκείνους όπου γίνονται ζυµώσεις µε ζωντανά κύτταρα και σε αυτούς που επιτελούνται διεργασίες µε χρήση βιολογικών συστηµάτων, π.χ. ένζυµα
Χρήση Μικροοργανισµών στη Βιοτεχνολογία Βιοαντιδραστήρες για παραγωγή προϊόντων Παρασκευή εµβολίων και αντιβιοτικών Παραγωγή γενετικά τροποποιηµένων φυτών και ζώων Βιο-αποικοδόµηση και αποκατάσταση περιβάλλοντος
Παραγωγή αλκαλοειδών, νουκλεοτιδίων και στεροειδών Φαρµακολογικώς ενεργά αλκαλοειδή παράγονται από µύκητες Claviceps σε βιοαντιδραστήρες. Αν και ο χηµικός τρόπος σύνθεσης τους είναι πολύπλοκος, η παραγωγή τους από µικροοργανισµούς σε βιοαντιδραστήρες είναι εύκολη και υψηλών αποδόσεων, 5g / λίτρο. Νουκλεοτίδια και νουκλεοζίτες (GMP, IMP, XMP) παράγονται βιοµηχανικά από µικροοργανισµούς, χρησιµοποιούνται κυρίως ως πρόσθετα τροφών, π.χ. 300 τόνοι GMP, IMP παράγονταιστηνιαπωνία. ιάφορα στεροειδή παράγονται κατά ανάλογο τρόπο, τα περισσότερα από αυτά χρησιµοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς, π.χ. οιστρογόνα, προγεστερόνη, ανδρογόνα, αντισυλληπτικά, κορτιζόνη, καταπραϋντικά, αντικαρκινικά, αντιφλεγµονώδη, κά
Τρόποι καλλιέργειας ύο τρόποι ζύµωσης η κλειστή και η συνεχής καλλιέργεια. Κλειστή καλλιέργεια: εµβολιασµός µε αρχική καλλιέργεια µικροοργανισµών σε ορισµένη ποσότητα θρεπτικού υλικού. Η καλλιέργεια συνεχίζεται έως την παραγωγή του επιθυµητού προϊόντος. Οι φάσεις ανάπτυξης είναι η λανθάνουσα, η εκθετική, η στατική και η φάση θανάτου. Η διαδοχή των φάσεων είναι συγκεκριµένη, η διάρκεια κάθε φάσης διαφέρει ανάλογα µε το είδος του µικροοργανισµού. Τα επιθυµητά προϊόντα παράγονται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης ή της στατικής φάσης ανάπτυξης του µικροοργανισµού. Συνεχής καλλιέργεια: Γίνεται συνεχής τροφοδότηση µε θρεπτικά συστατικά, ενώ ταυτόχρονα αποµακρύνονται κύτταρα και άχρηστα προϊόντα.
Καθαρισµός και παραλαβή προϊόντων Ο καθαρισµός του προϊόντος που παραλαµβάνεται από το βιοαντιδραστήρα. Αρχικά γίνεται διαχωρισµός των υγρών από τα στερεά συστατικά και τα κύτταρα, συνήθως µε διήθηση ή φυγοκέντρηση. Το επιθυµητό προϊόν µπορεί να βρίσκεται στα υγρά ή στα στερεά συστατικά, από όπου παραλαµβάνεται µε κατάλληλες µεθόδους.
Βιοτεχνολογικές εφαρµογές των µικροοργανισµών 1. Παραγωγή κυττάρων παραγωγή πρωτεϊνών, εµβολίων. 2. Παραγωγή ενώσεων χαµηλού µοριακού βάρους, πρωτογενείς µεταβολίτες, δευτερογενείς µεταβολίτες, µετατροπή οργανικών ενώσεων. 3. Παραγωγή ενώσεων υψηλού µοριακού βάρους, πολυσακχαρίτες, λιπίδια, πρωτεΐνες. 4. ιαδικασίες εξαρτώµενες από το µεταβολισµό του µικροοργανισµού, βιοαποικοδόµηση / οξείδωση αποβλήτων και απορριµµάτων, εκχύλιση µετάλλων.
Παραδείγµατα εφαρµογών µικροοργανισµών Bacillus thuringiensis: Μικροβιακά εντοµοκτόνα Lactobacillus sp: Αρχικές καλλιέργειες για τη ζύµωση γαλακτοκοµικών προϊόντων. Streptococcus cremoris: βιοµηχανοποίηση γαλακτοκοµικών προϊόντων Penicillium roqueforti: Εµβολιάσµατα για την παραγωγή τυριών Rhizobium sp.: Εµβολιάσµατα που προάγουν την καθήλωση του αζώτου Pseudomonas syrigae: ηµιουργία τεχνητού χιονιού. Μεταλλαγµένα στελέχη για προστασία των φυτών από τους παγετούς
Οι µικροοργανισµοί χρησιµοποιούνται στη βιοµηχανία για να παράγουν µια µεγάλη ποικιλία ενώσεων που διακρίνονται σε: Πρωτογενείς µεταβολίτες, οι οποίοι παράγονται κατά τη φάση ανάπτυξης (λογαριθµική φάση ) των µικροοργανισµών ευτερογενείς µεταβολίτες που παράγονται κατά τη στατική ή φάση στασιµότητας των µικροοργανισµών
Τι είναι ευτερογενείς Μεταβολίτες??? Είναι µόρια που συνθέτονται από µικροοργανισµούς κατά την τελευταία φάση ανάπτυξής τους, δηλ. στη φάση στασιµότητας. Οι δευτερογενείς µεταβολίτες δεν απαιτούνται για την ανάπτυξη και η πραγµατική τους λειτουργία δεν είναι πλήρως γνωστή. Οι πιο γνωστοί δευτερογενείς µεταβολίτες είναι τα αντιβιοτικά που παρεµποδίζουν την ανάπτυξη άλλων µικροοργανισµών, προσδίδοντας οικολογικό πλεονέκτηµα στους παραγωγούς των. Σήµερα περισσότερα από 2500 αντιβιοτικές ουσίες παράγονται από βακτήρια γνωστά ως Ακτινοµύκητες.
Παραγωγή Αρωµατικών Ουσιών Αρωµατικές ουσίες είναι τα συστατικά που είναι πτητικές ενώσεις και απαντώνται στις τροφές και στα αρώµατα δίνοντας χαρακτηριστική οσµή. Οι αρωµατικές ουσίες είναι φυσικές αν προέρχονται από φυσικά προϊόντα. Σήµερα 50-100 αρωµατικές ουσίες παράγονται από µικροοργανισµούς. Βανιλλίνη: Φυσική, από τον καρπό της βανίλλιας (~ $4,000/kg) Παρασκευή µε ζύµωση φυσικών προϊόντων (π.χ. στιλβένιο, ευγενόλη) (~ $1,000/kg) Παρόµοια µε τη φυσική, παράγεται όµως από µικροοργανισµούς (~ $12/kg)
Αρωµατικές ύλες και παραγωγή τυριών Κατά την ωρίµανση τυριών χρησιµοποιούνται καθαρές καλλιέργειες βακτηρίων π.χ. Brevibacterium, Microbacterium µε πλήθος οσµηρών συστατικών, όπως λιπαρά οξέα, αλκοόλες, µεθυλοκετόνες και κυκλικές ενώσεις. Η εµφάνιση του χρώµατος συνδέεται συχνά µε τη δράση ενζύµων όπως λιπάσες και πρωτεάσες. Οι συγκεντρώσεις των προϊόντων αποικοδόµησης των ενζύµων αυτών καθορίζουν το άρωµα της κάθε ποικιλίας τυριού Π.χ.Penicilliumroqueforti προσδίδει χαρακτηριστικό άρωµα τυριού τύπου ροκφόρ.
Εµβόλια 1. Συµβατά = Κλασικά νεκρά στελέχη ιών ή βακτηρίων εξασθενηµένα στελέχη ιών 2. Ανασυνδυασµένα, νέας τεχνολογίας κλωνοποίηση γονιδίων (π.χ. πρωτεϊνες καλύµµατος ιού) µεταλλαξογένεση γονιδίων «κλειδιά» παραγωγή φορέων µε ανασυνδυασµένο DNA
Παραγωγή ανασυνδυασµένων εµβολίων Ωφέλη: 1. Πιο ασφαλή από τα κλασικά εµβόλια που περιέχουν εξασθενηµένα στελέχη µολυσµατικού µικροοργανισµού. 2. Σταθερή αναπαραγωγή και έλεγχος σε κάθε στάδιο της κατασκευή τους. 3. Χορήγηση σε µεγάλες δόσεις χωρίς παρενέργειες. 4. Γρήγορη παρασκευή 2-3 µήνες, σε αντίθεση µε 6-9 µήνες για τα συµβατά. 5. Χαµηλό κόστος παραγωγής. 6. Πολλαπλές χρήσεις, εµβολιασµός αποµονωµένων πληθυσµών εµβολιασµός ζώων µε δολώµατα, προστασία αγρίων ζώων από επιδηµίες (πχ. λύσσα, ιλαρά) εµβολιασµός κτηνοτροφικών και πτηνοτροφικών µονάδων
Ζύµωση στερεάς φάσης στο εργαστήριο
Ζυµωτήρας Paddle Mixer (Αναµίκτης πτερυγίων)