ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Μελέτη της βιολογικής δράσης επιμέρους περιοχών του αυξητικού παράγοντα HARP. Διπλωματική Εργασία Ιλόνα Μπινενμπάουμ Α. Μ.: 2984 ΠΑΤΡΑ Οκτώβριος 2012

Ο Επιβλέπων Καθηγητής Κατσώρης Παναγιώτης Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Κατσώρης Παναγιώτης Μίντζας Αναστάσιος Φλυτζάνης Κωνσταντίνος Καθηγητής Καθηγητής Αναπληρωτής Καθηγητής

Περιεχόμενα Περίληψη 7 Abstract 8 1. Εισαγωγή 9 1.1. Αυξητικοί παράγοντες 9 1.2. Καρκίνος 9 1.3. Ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων στον καρκίνο 10 1.4. Οικογένειες αυξητικών παραγόντων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη καρκίνου 12 1.5. Αυξητικοί παράγοντες που προσδένονται στην ηπαρίνη 14 1.6. Midkine 14 1.7. HARP 16 1.7.1 Tο γονίδιο της HARP 16 1.7.2. Δομή της HARP 17 1.7.3. Ιστοειδική έκφραση της HARP 20 1.7.4. Ρύθμιση της έκφρασης της HARP 22 1.7.5. Υποδοχείς και μηχανισμοί δράσης της HARP 24 1.7.6. Μόρια μεταγωγής σήματος 29 1.7.7 Βιολογικές δράσεις της HARP 31 1.7.8. Βιολογική δράση επιμέρους περιοχών της HARP 35 2. Σκοπός 38 3. Υλικά και Μέθοδοι 39 3.1. Καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου προστάτη PC3 39 3.2. Τροποποιημένες μορφές της HARP 39 3.3. Ανακαλλιέργεια κυττάρων 39 3.4. Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer 41 3.5. Κατάψυξη κυττάρων 41 3.6. Απόψυξη κυττάρων 42 3.7. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων με την μέθοδο κρυσταλλικού ιώδους (Crystal violet) 43

3.8. Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στην προσκόλληση των κυττάρων 44 3.9. Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 45 3.10. Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στην ενεργοποίηση μορίων μεταγωγής σήματος 47 3.11. Απομόνωση ολικού ακατέργαστου εκχυλίσματος πρωτεϊνών 47 3.12. Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS- PAGE) 48 3.13. Ανάλυση κατά Western 51 3.14. Εμφάνιση ανοσοστυπωμάτων 53 3.15. Ποσοτικοποίηση ανοσοστυπωμάτων 53 3.16. Αποδέσμευση αντισωμάτων και επαναχρησιμοποίηση ανοσοστυπωμάτων 53 3.17. Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων 54 4. Αποτελέσματα 55 4.1. Επίδραση των H9-59 και H60-110 στον πολλαπλασιασμό των PC3 κυττάρων 55 4.2. Επίδραση των H9-59 και H60-110 στην προσκόλληση των PC3 κυττάρων 56 4.3. Επίδραση των H9-59 και H60-110 στην φωσφορυλίωση των ERK1/2 58 5. Συζήτηση 60 6. Βιβλιογραφία 63

Περίληψη Η HARP είναι ένας αυξητικός παράγοντας με πλειοτροπική δράση που εμπλέκεται στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση πολλών ειδών κυττάρων καθώς και στην αγγειογένεση και την καρκινογένεση. Η HARP ασκεί τις δράσεις της μέσω των διαμεμβρανικών της υποδοχέων RPTPβ/ζ, ALK και Ν- συνδεκάνη. Η δομή της HARP αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές ομόλογες με τις επαναλαμβανόμενες περιοχές τύπου I της θρομβοσπονδίνης (Thrombospondin type I Repeat, TSR) και το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό της άκρο που έχουν τυχαία διαμόρφωση στο χώρο. Έχει βρεθεί ότι η HARP αποτελεί υπόστρωμα διάφορων πρωτεολυτικών ενζύμων και πεπτίδια της έχουν ανιχνευθεί στο υγρό θρεπτικό μέσο σε καλλιέργειες διαφόρων κυττάρων. Τα πεπτίδια της HARP μπορούν να έχουν διαφορετική ή και αντίθετη δράση από αυτή ολόκληρου του μορίου. Στo πλαίσιo της μελέτης των επιμέρους περιοχών της HARP που συμμετέχουν στις βιολογικές δράσεις της αλλά και της δράσης των πεπτιδίων που προκύπτουν από την πρωτεόλυσή της, σε αυτή την εργασία μελετήθηκε η δράση δύο ανασυνδυασμένων, τροποποιημένων μορφών της HARP που αντιστοιχούν στις κεντρικές TSR περιοχές, των H9-59 και H60-110, στον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση κυττάρων καρκίνου του προστάτη PC3 και στη φωσφορυλίωση των μορίων μεταγωγής σήματος ERK1/2. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι τα πολυπεπτίδια H9-59 και H60-110 καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3, ενώ επάγουν την προσκόλληση των ίδιων κυττάρων. Επιπλέον, τόσο το H9-59 όσο και το H60-110 επάγουν τη φωσφορυλίωση των ERK1/2. 7

Abstract HARP is a heparin- binding growth factor, which plays a key role in cell proliferawon, differenwawon and migrawon. HARP is also involved in angiogenesis and tumor growth and progression. HARP mediates its funcwons through its transmembrane receptors RPTPβ/ζ, ALK and N- syndecan. Structurally, HARP contains two TSR homologous domains and two basic clusters in its N and C- termini. It has been found that HARP is a substrate for several extracellular proteolywc enzymes and HARP pepwdes have been detected in condiwoned media of cells. HARP pepwdes oen have different or even opposite biological acwvity from the whole molecule. The aim of this project was to study the biological acwvity of two recombinant, truncated forms of HARP that correspond to the two TSR domains, H9-59 and H60-110, in order to contribute to the study of the HARP domains that mediate its biological acwviwes and also the biological acwvity of HARP pepwdes. The results of the study show that both H9-59 and H60-110 inhibit the proliferawon of PC3 cells but swmulate their adhesion. Moreover, both H9-59 and H60-110 swmulate the phosphorylawon of ERK1/2. 8

1. Εισαγωγή 1.1. Αυξητικοί παράγοντες Οι αυξητικοί παράγοντες είναι μέρος μιας μεγάλης ομάδας πολυπεπτιδίων που μεταδίδουν σήματα στο εσωτερικό των κυττάρων και επηρεάζουν την κυτταρική λειτουργία. Οι αυξητικοί παράγοντες μπορούν να διεγείρουν ή να καταστέλλουν την κυτταρική διαίρεση, διαφοροποίηση, μετανάστευση και την έκφραση γονιδίων. Ανάλογα με τη συγκέντρωση των αυξητικών παραγόντων στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων, μπορεί να ρυθμίζουν αρνητικά ή θετικά τη σύνθεση υποδοχέων. Συνήθως οι αυξητικοί παράγοντες βρίσκονται στο κύτταρο ως πρόδρομα ανενεργά μόρια και μπορούν να ενεργοποιηθούν με πρωτεόλυση ή μετά από πρόσδεση σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης. Ο ίδιος αυξητικός παράγοντας μπορεί να έχει διαφορετική δράση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Για παράδειγμα ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (Transforming Growth Factor- β, TGF- β) είναι διεγερτικός για τους ινοβλάστες αλλά κατασταλτικός για τα κερατινοκύτταρα. (Nimni, 1997) Ανάλογα με την απόσταση της θέσης σύνθεσης και της θέσης δράσης τους, οι αυξητικοί παράγοντες χωρίζονται σε ενδοκρινείς, παρακρινείς και αυτοκρινείς. Έχουν περιγραφεί εκατοντάδες αυξητικοί παράγοντες, μέχρι σήμερα, και έχουν ομαδοποιηθεί σε τουλάχιστον είκοσι οικογένειες βάσει δομικών ομολογιών. 1.2. Καρκίνος Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από μεταλλάξεις στο γονιδίωμα των κυττάρων. Εξαιτίας αυτών των μεταλλάξεων τα καρκινικά κύτταρα αποκτούν τη δυνατότητα ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού και σχηματίζουν όγκους. Ο καρκίνος ξεκινάει όταν ένα κύτταρο υποστεί μια μετάλλαξη που το οδηγεί να πολλαπλασιαστεί. Το κύτταρο αυτό μαζί με τα θυγατρικά του κύτταρα επειδή πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα δημιουργούν μια μάζα κυττάρων που ονομάζεται υπερπλασία. Μια επόμενη μετάλλαξη που επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προκαλεί αλλαγές στη μορφολογία τους οδηγεί στο σχηματισμό δυσπλασίας. Μία τρίτη μετάλλαξη σε ένα από τα κύτταρα οδηγεί σε ανώμαλη αύξηση και σε σχηματισμό in situ καρκινώματος. Αν τα κύτταρα αποκτήσουν και άλλες μεταλλάξεις που να επάγουν τη διείσδυση τους σε υποκείμενους ιστούς και τη μετάστασή τους ο όγκος χαρακτηρίζεται κακοήθης. Έξι βασικές αλλαγές στη φυσιολογία του κυττάρου οδηγούν στην ανάπτυξη καρκίνου. Αυτές είναι η απόκτηση της ικανότητας ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού, η απόκτηση αυτοεπάρκειας σε 9

μηνύματα αυξητικών παραγόντων, η απώλεια απόκρισης σε αντιμιτογόνα μηνύματα, η απόκτηση αντίστασης στην απόπτωση, η απόκτηση της ικανότητας επαγωγής αγγειογένεσης και η απόκτηση της ικανότητας διείσδυσης και μετάστασης. 1.3. Ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων στον καρκίνο Η εμπλοκή των αυξητικών παραγόντων στον καρκίνο είχε φανεί από πρώιμες έρευνες που έδειχναν μειωμένη απαίτηση ορού για την καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων (Dulbecco and Stoker, 1970). Η μειωμένη ή και καθόλου ανάγκη των καρκινικών κυττάρων για εξωγενείς αυξητικούς παράγοντες μπορεί να εξηγηθεί με αυτοκρινή ή παρακρινή έκκριση των παραγόντων. Όντως, πολλοί τύποι καρκινικών κυττάρων συνθέτουν αυξητικούς παράγοντες στους οποίους αποκρίνονται (Sporn and Tadaro, 1980). Επιπλέον, στα καρκινικά κύτταρα υποδοχείς αυξητικών παραγόντων μπορεί να υπερεκφράζονται, όπως για παράδειγμα ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) στον καρκίνο του κεφαλιού ή να έχουν υποστεί μεταλλάξεις που οδηγούν σε ενεργοποίηση ανεξάρτητη από την παρουσία του προσδέματος τους. Τέτοιες μεταλλάξεις συναντώνται στον EFGR σε όγκους του εγκεφάλου (Huang et al. 1997). Αυξητικοί παράγοντες όπως ο αυξητικός παράγοντας που μοιάζει με την ινσουλίνη 1 (Insuline like Growth Factor, IGF- 1) μπορούν να ενισχύουν την αντίσταση των κυττάρων στην απόπτωση. Η επέκταση του όγκου μπορεί να γίνει μετά από καταστροφή της βασικής μεμβράνης των περιβαλλόντων αγγείων. Οι αυξητικοί παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στη καταστροφή της βασικής μεμβράνης, στη διείσδυση των καρκινικών κυττάρων στο κυκλοφορικό ή το λεμφικό σύστημα και στην εγκατάσταση τους σε νέες θέσεις σε άλλα όργανα. Ο TGF- β και άλλοι αυξητικοί παράγοντες όπως ο ηπατικός αυξητικός παράγοντας (Hepatocyte Growth Factor, HGF) και ο αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factor, FGF) ενισχύουν τη διεισδυτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων αυξάνοντας την έκφραση εκκρινόμενων πρωτεασών όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP- 2 και MMP- 9 και μειώνοντας την έκφραση αναστολέων των πρωτεασών (Stetler- Stevenson, 1999). Παράλληλα οι αυξητικοί παράγοντες προκαλούν αλλαγές στην προσκόλληση των κυττάρων όπως η απώλεια της επιθηλιακής E- καντερίνης και αντικατάσταση της τενσίνης- 3, που συνδέει τον κυτταροσκελετό με την εξωκυττάρια ύλη, με τενσίνη- 4 ή cten, ένα μέλος της οικογένειας των τενσινών στην οποία λείπει η περιοχή πρόσδεσης της ακτίνης ενισχύοντας έτσι την κυτταρική μετανάστευση (Kaltz et al., 2007). Οι αυξητικοί παράγοντες TGF- β και EGF προκαλούν την έκφραση ισχυρών αναστολέων της E- καντερίνης. 10

Παρακρινείς αλληλεπιδράσεις μεταξύ καρκινικών κυττάρων, μακροφάγων και ενδοθηλιακών κυττάρων διευκολύνουν τη διείσδυση των καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία. Κύτταρα καρκίνου του μαστού εκκρίνουν το διεγερτικό παράγοντα αποικιών μακροφάγων (Colony Swmulawng Factor- 1, CSF- 1) που προσελκύει μακροφάγα στους όγκους και αυξάνει την τοπική έκκριση αυξητικών παραγόντων από τα μακροφάγα. Οι υποξικές και φλεγμονώδεις συνθήκες που επικρατούν γύρω από τον όγκο αυξάνουν την έκφραση του TGF- β από τα μακροφάγα (Goswami, 2005). Αφού βρεθούν στην κυκλοφορία τα καρκινικά κύτταρα προσδένονται σε αιμοπετάλια όπου λαμβάνουν μιτογόνα μηνύματα όπως ο αυξητικός παράγοντας αιμοπεταλίων (Platelet Derived Growth Factor, PDGF) και προστατεύονται από τη δράση φυσικών φονικών κυττάρων (Nierodzik and Karpatkin, 2006). Τέλος, για την ανάπτυξη ενός όγκου σε μέγεθος μεγαλύτερο από λίγα χιλιοστά απαιτείται η ανάπτυξη νέων αγγείων. Αυξητικοί παράγοντες όπως οι αυξητικοί παράγοντες του αγγειακού ενδοθηλίου (Vascular Endothelial Growth Factors, VEGFs), οι αυξητικοί παράγοντες ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factors, FGFs) και ο TGF- β παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της αγγειογένεσης και ανταγωνιστές του VEGF περιορίζουν την αγγειογένεση. Εικόνα 1: Τα στάδια ανάπτυξης καρκίνου και ο ρόλος των αυξητικών παραγόντων (Witsch et al., 2010) 11

1.4. Οικογένειες αυξητικών παραγόντων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη καρκίνου Οικογένεια των IGFs Η οικογένεια των IGFs αποτελείται από δύο αυξητικούς παράγοντες, τους IGF1 και IGF2, δύο μεμβρανικούς υποδοχείς, των υποδοχέα του IGF1 (IGF1 Receptor, IGF1R) και τον υποδοχέα του IGF2 (IGF2 Receptor, IGF2R), και έξι πρωτεΐνες που προσδένονται στον IGF με υψηλή συγγένεια, τις IGFBP1-6 (IGF Binding Proteins 1-6). Ο IGF1 παράγεται στο συκώτι και παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη. Σχεδόν όλα τα μόρια IGF1 βρίσκονται προσδεδεμένα σε μία IGFBP που εμποδίζει τη βιολογική του δράση. Η ενεργοποίηση του IGF1 γίνεται με πρόσδεση του στον υποδοχέα IGF1R ή στον υποδοχέα της ινσουλίνης (με χαμηλή συγγένεια). Ο IGF2 προσδένεται τόσο στον IGF1R όσο και στον IGF2R. Μελέτες σε κυτταρικές σειρές ποντικών με μη λειτουργικό IGF1R έδειξαν ανθεκτικότητα σε κακοήθεις μεταλλάξεις από διάφορα γνωστά ογκογόνα (Sell et al., 1994). Αν και οι IGF δεν παράγουν ισχυρά ογκογόνα σήματα φαίνεται να είναι απαραίτητοι για την επιβίωση των μεταλλαγμένων κυττάρων. Οι υποδοχείς των IGF εκφράζονται στους περισσότερους τύπους όγκων και μεταδίδουν ισχυρά αντιαποπτωτικά σήματα. Οικογένεια του TGF- β Ο TGF- β υπάρχει σε τρεις ισομορφές (TGF- β1, TGF- β2 και TGF- β3) και η υπόλοιπη οικογένεια περιλαμβάνει 30 επιπλέον κυτταροκίνες. Ο TGF- β μπορεί να δρα με αυτοκρινή τρόπο και να ελέγχει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τον κυτταρικό θάνατο στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους. Οι υποδοχείς του TGF- β παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης μεταδίδοντας σήμα μέσω του SMAD μονοπατιού ή της DAXX (Death Associated Protein 6) πρωτεΐνης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες ο TGF- β οδηγεί τα κύτταρα σε απόπτωση ή διαφοροποίηση. Κατά την καρκινογένεση όμως μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του όγκου. Μετάδοση σήματος μέσω διαφορετικών μονοπατιών από τα κανονικά του TGF- β επάγει τη διείσδυση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων (Moustakas and Heldin, 2005). Ο TGF- β φαίνεται να έχει και αγγειογενετική δράση καθώς ρυθμίζει την έκφραση και την ενεργότητα αγγειογενετικών παραγόντων όπως ο FGF ή ο VEGF (Goumans et al., 2003). 12

Οικογένεια των VEGFs Οι VEGFs ρυθμίζουν την αγγειογένεση. Η οικογένεια αποτελείται από πέντε γλυκοπρωτεΐνες, τις VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD και PlGF. Τα μέλη της οικογένειας προσδένονται σε έναν τουλάχιστον από τρεις υποδοχείς του VEGF, τους VEGFR- 1, VEGFR- 2 και VEGFR- 3. Έκφραση των VEGFR- 1 και VEGFR- 2 έχει εντοπιστεί σε πολλούς συμπαγείς όγκους. Οι VEGFRs ελέγχουν την αγγειογένεση μέσω ταυτόχρονης μετάδοσης σήματος μέσω διαφορετικών μονοπατιών. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η διαπερατότητα των αγγείων διεγείρεται από το μονοπάτι της PKC, η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός από το μονοπάτι της Akt και των MAP κινασών (Mitogen Acwvator Protein Kinases, MAPK) και η μετανάστευση από το μονοπάτι της Src. Εκτός από την αγγειογενετική δράση οι VEGF επηρεάζουν με αυτοκρινή τρόπο λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων όπως η επιβίωση, η μετανάστευση και η διείσδυση (Kowanetz and Ferrara, 2006). Οικογένεια του FGF Οι FGFs, συνιστούν μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες πολυπεπτιδικών αυξητικών παραγόντων. Μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί 23 διαφορετικοί FGFs, οι οποίοι παρουσιάζουν 35-50% ομολογία ως προς την αμινοξική αλληλουχία. Οι FGFs επηρεάζουν μια πλειάδα κυτταρικών λειτουργιών, όπως ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση κυττάρων μεσοδερμικής και νευροεξωδερμικής προέλευσης. Κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη ρυθμίζουν την οργανογένεση ιδιαίτερα στο νευρικό σύστημα, τα άκρα και τον προστάτη. Στο ενήλικο άτομο, οι FGFs παίζουν σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες όπως η επούλωση πληγών, η αιματοποίηση, η αγγειογένεση και η ανάπτυξη φλεγμονής. Εκτός από την αγγειογενετική τους δράση, οι FGFs διεγείρουν τη μεταναστευτική και διεισδυτική ικανότητα μιας ποικιλίας τύπων καρκινικών κυττάρων όπως του προστάτη, των νεφρών, του μαστού και του παγκρέατος (Powers et al., 2000). Οικογένεια του EGF Η οικογένεια αποτελείται από έντεκα αυξητικούς παράγοντες που περιέχουν μια συντηρημένη EGF περιοχή. Όλα τα μέλη της οικογένειας προσδένονται σε μια ομάδα τεσσάρων υποδοχέων κινασών τυροσίνης, τους ErbB- 1 έως 4/EGFR. Τουλάχιστον ένα μέλος της ErbB οικογένειας έχει ταυτοποιηθεί σε παραπάνω από το 20% των συμπαγών όγκων (Jeuken et al., 2009). 13

1.5. Αυξητικοί παράγοντες που προσδένονται στην ηπαρίνη Αυξητικοί παράγοντες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αύξηση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων συχνά προσδένονται σε γλυκοζαμινογλυκάνες της εξωκυττάριας ύλης. Οι αυξητικοί αυτοί παράγοντες ονομάζονται συνολικά παράγοντες που προσδένονται στην ηπαρίνη (Heparin Binding Growth Factors, HBGFs). Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει μια πλειάδα αυξητικών παραγόντων όπως οι FGFs, VEGF, PIGF, HGF, TGF- β, PDGF, HARP (Heparin Affin Regulatory Pepwde) και MK (midkine). Η HARP απομονώθηκε πρώτη φορά από εγκέφαλο βοός και χαρακτηρίστηκε σαν νέα πρωτεΐνη που προσδένεται στην ηπαρίνη (Bohlen et al., 1988). Αν και έχει βιοχημικές ιδιότητες χαρακτηριστικές των HBGFs, ο χημικός χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης έχει δείξει ότι δεν σχετίζεται δομικά με κανένα γνωστό μέλος της οικογένειας των FGFs και είναι ξεχωριστό μόριο. Έχει βρεθεί ότι η HARP έχει 50% ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία με ένα άλλο HBGF, τη Midkine (MK). Οι δύο αυτές δομικά και πιθανόν λειτουργικά παρόμοιες πρωτεΐνες αποτελούν μία κλάση διακριτή από τους υπόλοιπους HBGFs την οικογένεια HARP/MK. 1.6. Midkine Η Midkine ταυτοποιήθηκε πρώτη φορά ως γονίδιο επαγόμενο από το ρετινοϊκό οξύ σε έμβρυα ποντικού ενώ σε ενήλικα άτομα εντοπίστηκε μόνο στα νεφρά (Kadomatsu et al., 1988). Eίναι μια πρωτεΐνη 13 kda, πλούσια σε βασικά αμινοξέα και περιέχει δέκα συντηρημένες κυστεΐνες, που όλες φαίνεται να συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Η πρωτεΐνη αποτελείται από δύο περιοχές και κάθε περιοχή περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β- πτυχώσεις που συγκρατούνται με δισουλφιδικούς δεσμούς (Fabri et al., 1993). 14

Εικόνα 2: Η δομή της καρβοξυτελικής και της αμινοτελικής περιοχής της midkine. Οι περικυκλωμένες περιοχές είναι θέσεις πρόσδεσης στην ηπαρίνη. (Muramatsu T., 2002) Η MK έχει ποικίλες βιολογικές δράσεις. Επάγει την ανάπτυξη διάφορων τύπων κύτταρων και εμπλέκεται σε διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων επιθηλίου- μεσεγχύματος κατά την ανάπτυξη (Mitsiadis et al., 1995). Στο νευρικό σύστημα η MK ενισχύει την επιβίωση και την προέκταση νευριτών και επάγει τη νευρωνική διαφοροποίηση (Michikawa et al., 1993). Η MK έχει συσχετιστεί με την καρκινογένεση και την ανάπτυξη όγκων. Το mrna της παρουσιάζει αυξημένη έκφραση σε διάφορους κακοήθεις όγκους σε σχέση με τον αντίστοιχο φυσιολογικό ιστό, όπως στον καρκίνο του οισοφάγου, του στομάχου, του μαστού, του θυροειδή, του πνεύμονα και του προστάτη, στο γλοιοβλάστωμα και σε άλλους όγκους του εγκεφάλου (Tsutsui et al., 1993). Σε πειραματικά συστήματα, αντινοηματικά mk ολιγονουκλεοτίδια καταστέλλουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων (Takei et al., 2001). Η MK συσχετίζεται και με άλλες ασθένειες. Εμπλέκεται στη μετανάστευση φλεγμονωδών λευκοκυττάρων (Horiba et al., 2000) και εμποδίζει τη μόλυνση από HIV προσδενόμενη στη νουκλεολίνη στην επιφάνεια του κυττάρου (Callebaut et al., 2001). Οι N- syndecans, οι PTP (Protein Tyrosine Phosphatase), η LRP (Low density lipoprotein Receptor related Protein) και ο ALK (Anaplaswc Lymphoma Kinase) έχουν ταυτοποιηθεί ως υποδοχείς υψηλής συγγένειας της MK στη βιβλιογραφία. Εκτός από αυτούς η MK φαίνεται να προσδένεται με χαμηλή συγγένεια και στη νουκλεολίνη (Take et al., 1994). 15

1.7. HARP Η HARP (UniProt ID: P21246) έχει περιγραφεί από διάφορες ερευνητικές ομάδες και έχει πάρει διάφορες ονομασίες: HBGF- 8 (Ηeparin Βinding Growth Factor 8) (Milner et al., 1989), HBNF (Heparin Binding Neurotrophic Factor) (Kovesdi et al., 1990), HBBM (Heparin Binding Brain Mitogen) (Huber et al., 1990), OSF- 1 (Osteoblast Specific Factor- 1) (Tezuka et al., 1990), PTN (Pleiotrophin) (Li et al., 1990) και HARP (Heparin Affin Regulatory Pepwde) (Courty et al., 1991). Η HARP απομονώθηκε αρχικά από εγκέφαλο βοός με την τεχνική απομόνωσης του FGF (Bohlen et al., 1988). Επόμενες απομονώσεις της έγιναν από εγκεφάλους ανθρώπου, κοτόπουλου και αρουραίου (Huber et al., 1990), μήτρα βοός (Milner et al., 1989), εγκέφαλο ενήλικου βοός (Courty et al., 1991), καρδιά κοτόπουλου (Hampton et al., 1992), και από υγρό θρεπτικό μέσο ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του μαστού (Wellstein et al., 1992). 1.7.1 Tο γονίδιο της HARP Το γονίδιο της HARP (Gene ID: 5764) στον άνθρωπο έχει μέγεθος τουλάχιστον 65 kb και περιλαμβάνει τέσσερα ιντρόνια. Το ώριμο mrna της αποτελείται από 1650 νουκλεοτίδια και η κωδικοποιημένη πρωτεΐνη από 168 αμινοξέα. Τα πρώτα 32 αμινοξέα αποτελούν ένα υδρόφοβο πεπτίδιο σινιάλο. Η 5 - αμετάφραστη περιοχή (5 - UTR) περιλαμβάνεται στο εξώνιο 1, το πεπτίδιο σινιάλο και τα πρώτα έξι αμινοτελικά αμινοξέα του μορίου στο εξώνιο 2. Το εξώνιο 3 κωδικοποιεί 57 αμινοξέα (αμινοξέα 7-64) στα οποία περιλαμβάνονται έξι από τις δέκα κυστεΐνες του μορίου. Οι υπόλοιπες 4 κυστεΐνες κωδικοποιούνται από το εξώνιο 4 που αντιστοιχεί σε 53 αμινοξέα. Στο εξώνιο 5 κωδικοποιούνται τα 17 καρβοξυτελικά αμινοξέα και περιλαμβάνονται το κωδικόνιο λήξης TAA και η 3 - αμετάφραστη περιοχή (3 - UTR) (Kretschmer et al., 1993). Στον ποντικό έχουν εντοπιστεί δύο επιπλέον 5 - UTR αλληλουχίες και μπορεί να γίνεται ρύθμιση μέσω δύο διαφορετικών υποκινητών (Sato et al., 1997). Εικόνα 3: Απεικόνιση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP (Li et al., 1992) 16

Η ανάλυση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου έδειξε την απουσία TATA περιοχής και την ύπαρξη μιας CCAAT περιοχής 91 bp ανοδικά του σημείου έναρξης της αντιγραφής. Η αλληλουχία CCAAT εμφανίζεται συχνά σε περιοχές υποκινητών γονιδίων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη. Έχουν ταυτοποιηθεί δύο θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα AP- 1 και μία του GT- 1 καθώς και θέσεις πρόσδεσης των MyoD, NFkB, CArG, AP2 και CBP (Kretschmer et al., 1993). 1.7.2. Δομή της HARP Η πρωτογενής δομή της HARP αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα οποία περιλαμβάνουν μια υδρόφοβη περιοχή 32 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο που αντιστοιχεί στο πεπτίδιο σινιάλο. Η ώριμη μορφή της πρωτεΐνης αντιστοιχεί σε ένα πολυπεπτίδιο 136 αμινοξέων. Από NIH3T3 κύτταρα μετασχηματισμένα με το cdna της HARP και από ενδοθηλιακά κύτταρα ματιού βοός έχει απομονωθεί και μια δεύτερη μορφή του μορίου. Η νέα αυτή μορφή αντιπροσώπευε το 10% της ολικής ποσότητας HARP και περιελάμβανε τρία επιπρόσθετα αμινοξέα στο αμινοτελικό της άκρο (Laaroubi et al., 1994). Η ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης έδειξε ότι είναι πλούσια σε κατιονικά αμινοξέα που αποτελούν το 24% των αμινοξέων (20.6% λυσίνη και 3.7% αργινίνη) και σε κυστεΐνη (7.4%). Η περιεκτικότητα της πρωτεΐνης σε τρυπτοφάνη είναι επίσης ιδιαίτερα υψηλή (2.9%) (Kuo et al., 1990). Το μοριακό βάρος της HARP όπως προσδιορίστηκε με φασματοφωτομετρία μάζας είναι 15,291 kda, τιμή που βρίσκεται κοντά στο αναμενόμενο μοριακό βάρος βάσει της αμινοξικής αλληλουχίας της που είναι 15,289 kda, που δείχνει ότι δεν υπάρχουν άλλες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης πέρα από την απομάκρυνση του πεπτιδίου σινιάλου. Το φαινομενικό μοριακό βάρος της HARP μετά από SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση αντιστοιχεί σε 18 kda. Η διαφορά αυτή πιθανόν οφείλεται στην υψηλή περιεκτικότητα της HARP σε βασικά αμινοξέα (Kuo et al., 1990). Το ισοηλεκτρικό σημείο (pi) της HARP όπως υπολογίστηκε από ισοηλεκτρική εστίαση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου ήταν 7.1 (Rauvala, 1989), όμως αυτή η τιμή διαφέρει από την θεωρητικά υπολογιζόμενη που είναι 9.66 (ExPASy), κάτι που πιθανόν οφείλεται σε ομοιόμορφη κατανομή των αρνητικών και θετικών φορτίων στη επιφάνεια του μορίου. Το μόριο της HARP περιέχει 10 κυστεΐνες. Οι μελέτες έχουν καταλήξει στο ότι όλες οι κυστεΐνες συμμετέχουν σε δισουλφιδικούς δεσμούς. Οι δισουλφιδικοί δεσμοί δημιουργούνται μεταξύ των Cys15- Cys44, Cys23- Cys53, Cys30- Cys57, Cys67- Cys99 και Cys77- Cys109 (Fabri et al., 1992) και προσδίδουν σταθερότητα στο μόριο της HARP σε αλλαγές στο ph και σε παρουσία οργανικών διαλυτών. 17

Eικόνα 4: Αμινοξική αλληλουχία της HARP. Το υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στο πεπτίδιο σινιάλο, με * σημειώνεται το σημείο που πραγματοποιείται η πέψη για την απομάκρυνση του πεπτιδίου. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα για την τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης αλλά η οργάνωση των δισουλφιδικών δεσμών υποδεικνύει την ύπαρξη δύο κεντρικών περιοχών, μία προς το αμινοτελικό και μία προς το καρβοξυτελικό άκρο (Hulmes et al., 1993). Μελέτες με NMR σε ανασυνδυασμένη HARP που παράχθηκε σε E.coli δείχνουν ότι κάθε κεντρική περιοχή περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β- πτυχώσεις, που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 18-27, 32-39, 48-57, 70-78, 83-91 και 101-110, και συνδέονται μεταξύ τους με έναν ελαστικό σύνδεσμο. Οι δύο περιοχές αναδιπλώνονται ανεξάρτητα σε διάλυμα και δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (Raulo et al., 2005). Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου, που είναι πλούσια σε λυσίνες, δεν έχουν συγκεκριμένη διαμόρφωση στο χώρο αλλά σχηματίζουν τυχαίες περιελίξεις. Μελέτες με CD και NMR φασματοσκοπία έδειξαν ότι η HARP υφίσταται δομική αλλαγή μετά από την πρόσδεσή της σε ηπαρίνη και ότι η πρόσδεση γίνεται κυρίως μέσω των β- πτυχωτών περιοχών της πρωτεΐνης (Kilpelainen et al. 2000). Μελέτη των κεντρικών περιοχών της HARP έδειξε ότι είναι ομόλογες με τις επαναλαμβανόμενες περιοχές τύπου I της θρομβοσπονδίνης (Thrombospondin type I Repeat, TSR). Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 41 πρωτεΐνες με TSR περιοχές στο ανθρώπινο γονιδίωμα και όλες είναι εκκρινόμενες πρωτεΐνες ή βρίσκονται στην εξωκυτταρική περιοχή διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Γενικά, πρωτεΐνες που περιέχουν TSRs εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση και επικοινωνία, στην αναστολή της αγγειογένεσης, στην πρόσδεση γλυκοζαμινογλυκανών και στην αναστολή των μεταλλοπρωτεϊνασών. Οι TSR περιοχές αποτελούνται από 60 περίπου αμινοξέα, από τα οποία 12 είναι υψηλά συντηρημένα. Περιλαμβάνουν δύο ή τρία κατάλοιπα τρυπτοφάνης που χωρίζονται από δύο με τέσσερα αμινοξέα (W**W**W), η αλληλουχία αυτή έχει θεωρηθεί η περιοχή πρόσδεσης των γλυκοζαμινογλυκανών (Guo et al., 1992). Οι περισσότερες TSRs περιέχουν έξι κυστεΐνες. Οι θέσεις των γεφυρών κυστεϊνών στη HARP ταιριάζουν με το TSR μοτίβο και η αλληλουχία των αμινοξέων παρουσιάζει το συντηρημένο μοτίβο κυστεΐνης/ τρυπτοφάνης. 18

Εικόνα 5: Σχηματική αναπαράσταση του μορίου της HARP. Διακρίνονται οι δύο κεντρικές περιοχές του μορίου, που περιλαμβάνουν από τρεις αντιπαράλληλες β- πτυχωτές επιφάνειες, τα δύο άκρα του μορίου, που έχουν τυχαία διαμόρφωση και οι κυστεΐνες που συμμετέχουν στο σχηματισμό των δισουλφιδικών δεσμών (Papadimitriou et al. 2004). Η HARP έχει περίπου 50% ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία με την MK (Merenmies and Rauvala, 1990). Η καρβοξυτελική κεντρική έχει τη μεγαλύτερη ομοιότητα και είναι εξελικτικά η πιο συντηρημένη περιοχή. Η HARP έχει βρεθεί σε πολλά είδη από τη Drosophila μέχρι τον άνθρωπο και η δομή της είναι ιδιαίτερα συντηρημένη μεταξύ των ειδών. Για παράδειγμα, η HARP ανθρώπου και ποντικού διαφέρουν σε ένα μόνο αμινοξύ και οι δέκα κυστεΐνες είναι συντηρημένες σε όλα τα σπονδυλωτά. Εικόνα 6: Δομική σύγκριση της ανθρώπινης HARP με την ανθρώπινη MK. 19

1.7.3. Ιστοειδική έκφραση της HARP Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η HARP εκφράζεται σε πλειάδα νευροεξωδερμικών και μεσοδερμικών ιστών κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη ποντικού (Nakamoto et al., 1992), αρουραίου (Rauvala et al., 1994) και κοτόπουλου (Vigny et al., 1989). Η έκφραση της HARP διαφοροποιείται μεταξύ της εμβρυϊκής ανάπτυξης και της ανάπτυξης μετά τη γέννηση, με ένα μέγιστο έκφρασης κατά την περίοδο αμέσως μετά τη γέννηση στον εγκέφαλο. Η HARP έχει επίσης εντοπιστεί στην καρδιά, τη μήτρα, τους χόνδρους (Neame et al., 1993), τις μήνιγγες (Mailleux et al., 1992), την ίριδα, τους όρχεις και σε θέσεις όπου γίνονται αλληλεπιδράσεις μεταξύ επιθηλίου και μεσεγχύματος όπως οι πνεύμονες και τα νεφρά (Mitsiadis et al., 1995). Το πρότυπο έκφρασής της υποδεικνύει σημαντικές λειτουργίες που αφορούν στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των ιστών, τη νευρογένεση, την κυτταρική μετανάστευση και την αλληλεπίδραση επιθηλίου- μεσεγχύματος. Η παρουσία της HARP σε ιστούς ενήλικων ατόμων όπως τα κύτταρα Leydig, τα κύτταρα της γλοίας και οι νευρώνες δείχνουν ότι συνεχίζει να παίζει ρόλο στη φυσιολογία και μετά την ενηλικίωση. Νευρικό σύστημα Η HARP εκφράζεται ισχυρά στον εγκέφαλο αρουραίων κατά τη γέννηση και για τις επόμενες 7-10 ημέρες. Η έκφραση της μειώνεται κατά την ηλικία των 14-19 ημερών και μόλις που εντοπίζεται σε νεαρά ενήλικα (Rauvala, 1989). Η χρονική περίοδος υψηλής έκφρασης της HARP αντιστοιχεί σε ραγδαία ανάπτυξη του εγκεφάλου, κατά την οποία αναπτύσσονται οι δενδρίτες και οι νευράξονες. Το γονίδιο εκφράζεται ειδικά ανά τύπο κυττάρου και κυρίως στον εγκεφαλικό φλοιό (Rauvala et al., 1994). Το mrna εντοπίζεται τόσο σε νευρώνες όσο και σε κύτταρα γλοίας και φαίνεται ότι η HARP εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση νευρώνων- γλοίας κατά την ανάπτυξη. Στα ενήλικα άτομα η έκφραση της HARP περιορίζεται σε νευρώνες του ιπποκάμπου και του φλοιού (Wanaka et al., 1993). Η χωρική και χρονική ρύθμιση της έκφρασης της HARP στον αναπτυσσόμενο φλοιό και θάλαμο έχει συσχετιστεί με την ανάπτυξη της θαλαμο- φλοιικής οδού (Kinnunen et al., 1999). Στον άνθρωπο έχει περιγραφεί παρουσία του mrna της HARP στις μήνιγγες και σε μηνιγγιώματα (Mailleux et al., 1992). Χόνδροι και οστά Το mrna της HARP απομονώθηκε από την κυτταρική σειρά MC3T3 που προέρχεται από οστεοσάρκωμα ποντικού (Tezuka et al., 1990) και η πρωτεΐνη έχει απομονωθεί από μυελό των οστών (Zhou et al., 1992). Επίσης έχει απομονωθεί από ιστό χόνδρου εμβρύου και νεογέννητου 20

βοός (Neame et al., 1993). Η HARP εντοπίζεται και σε περιοχές όπου οστικά αρχέγονα κύτταρα στρατολογούνται για να αρχίσουν την παραγωγή οστεοειδούς (Imai et al., 1998). Όργανα και ιστοί με αλληλεπίδραση επιθηλίου- μεσεγχύματος Τα όργανα των σπονδυλωτών τυπικά αποτελούνται από δύο τύπους ιστών, τον επιθηλιακό και το μεσεγχυματικό. Η αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο ιστών, που συνήθως είναι παρακρινής, είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και τη λειτουργία των οργάνων. Η HARP έχει εντοπιστεί στο μεσέγχυμα πολλών οργάνων που διαμορφώνονται μέσω αυτής της αλληλεπίδρασης. Μελέτες έχουν ταυτοποιήσει την παρουσία της HARP στις καταβολές των άκρων, στις θέσεις των θυλάκων τριχών, σε αισθητικά όργανα, στο αναπνευστικό, το πεπτικό, το ουρογεννητικό και το σκελετικό σύστημα (Mitsiadis et al., 1995). Η HARP έχει εντοπιστεί σε διάφορες κυτταρικές σειρές θηλαστικών που προέρχονται από μαστό, προστάτη, μυ και ωοθήκες. Στον ιστό του μαστού το mrna της HARP ήταν εντοπισμένο στα κυψελιδικά μυοεπιθηλιακά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον το ότι το mrna δεν συνεντοπίζεται με την πρωτεΐνη, αν και το mrna εντοπίζεται αποκλειστικά στα μυοεπιθηλιακά κύτταρα και όχι στα επιθηλιακά η πρωτεΐνη έχει εντοπιστεί τόσο στα μυοεπιθηλιακά κύτταρα όσο και στα επιθηλιακά. Αυτή η παρατήρηση υποδεικνύει ότι η HARP μπορεί να απελευθερώνεται από τα μυοεπιθηλιακά κύτταρα και να δρα με παρακρινή τρόπο στα παρακείμενα ενδοθηλιακά (Ledoux et al., 1997). Ο εντοπισμός της HARP στους μαστικούς αδένες οδήγησε στη μελέτη της βιολογικής της δράσης σε αυτό το όργανο και της παρουσίας της στο μητρικό γάλα. Η HARP εντοπίστηκε στο μητρικό γάλα σε υψηλή συγκέντρωση τις μέρες 1-4 μετά τον τοκετό που μειώνεται 8 ημέρες μετά τον τοκετό. Η διαφορά αυτή πιθανόν εξηγείται από ορμονικές αλλαγές κατά το θηλασμό (Bernard- Pierrot et al., 2004). Πειράματα in situ υβριδοποίησης έδειξαν ότι το mrna της HARP και η πρωτεΐνη εντοπίζονται στα λεία μυϊκά κύτταρα του μυομητρίου και των αγγείων του ενδομητρίου και στα επιθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών του ενδομητρίου της μήτρας αρουραίου. Μόνο η πρωτεΐνη εντοπίστηκε σε κύτταρα σε επιθηλιακά κύτταρα του αυλού, γεγονός που πάλι υποδηλώνει παρακρινή μηχανισμό δράσης του μορίου (Milhiet et al., 1992). Στο αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα η HARP έχει βρεθεί να σχετίζεται με τον προστάτη και έχει εντοπιστεί στα λεία μυϊκά κύτταρα του προστάτη. Υψηλή έκφραση παρατηρήθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου του προστάτη, αλλά όχι σε φυσιολογικό προστάτη ή καλοήθη υπερπλασία (Vacherot et al., 1999). 21

1.7.4. Ρύθμιση της έκφρασης της HARP Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου harp ρυθμίζονται αυστηρά κατά την ανάπτυξη και τα επίπεδα έκφρασης στους ενήλικες είναι σταθερά και περιορισμένα σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους. Αυξάνονται όμως σημαντικά σε φλεγμονές, σε επούλωση τραυμάτων και σε πολλές παθολογικές καταστάσεις. Το γονίδιο harp είναι PDGF- επαγόμενο, η μεταγραφή του γονιδίου επάγεται από τον PDGF σε υποξική ατμόσφαιρα, σε ηπατικά κύτταρα (Antoine et al., 2005). Εντυπωσιακά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου βρέθηκαν σε μακροφάγα και αστροκύτταρα σε περιοχές νεοαναπτυσσόμενων αγγείων και σε ενδοθηλιακά κύτταρα νεοσχηματισμένων αγγείων μετά από ισχαιμικό επεισόδιο του εγκεφάλου σε ενήλικες αρουραίους (Yeh et al., 1998). Η αύξηση της έκφρασης της HARP σε κύτταρα σε περιοχές τραυματισμών ακολουθεί εκείνη του PDGF, υποστηρίζοντας και πάλι την άποψη ότι η έκφραση της HARP επάγεται από τον PDGF. Επιπλέον, η έκφραση της HARP αυξάνεται σημαντικά σε αστροκύτταρα γύρω από ιπποκαμπικό τραύμα (Takeda et al., 1995) και σε θέσεις νεοαγγειογένεσης στον κερατοειδή (Usui et al., 2004). Το γονίδιο αυξορυθμίζεται και σε εμφράγματα του μυοκαρδίου (Christman et al., 2005) και στην επιφάνεια τραυματισμένων οστών (Imai et al., 1998) ενώ η HARP δεν εντοπίζεται σε οστά ενηλίκων ατόμων υπό φυσιολογικές συνθήκες, υποδεικνύοντας συμμετοχή της στην επούλωση τραυματισμών στα οστά. Μετά από μηχανική διέγερση σε οστικά κύτταρα παρατηρήθηκε ταχεία μείωση της έκφρασης της HARP (Liedert et al., 2006). Σε γυναίκες με ενδομητρίωση έχουν εντοπιστεί υψηλότερα επίπεδα της HARP στο ενδομήτριο σε σύγκριση με γυναίκες που δεν έχουν ενδομητρίωση (Chung et al., 2002). Σε BALB/c 3T3 κύτταρα, η έκφραση της HARP είναι αυξημένη και μειώνεται αισθητά μετά από επίδραση με FGF2 (Meremnies and Rauvala, 1992). Αντίθετα, σε NIH3T3 κύτταρα η επίδραση με FGF οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mrna της HARP (Li et al., 1992). Επιπρόσθετα, στα NIH3T3 κύτταρα η έκφραση της HARP έχει συσχετιστεί με την αναστολή της ανάπτυξης καθώς η έκφρασή της μεγιστοποιείται 2-4 μέρες μετά την πλήρωση του τρυβλίου κυτταροκαλλιέργειας και καταστέλλεται όταν τα κύτταρα μετασχηματισθούν με ras ή άλλα ογκογόνα (Corbley, 1997). Αύξηση της έκφρασης του γονιδίου μετά από επίδραση με ρετινοϊκό οξύ παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου εμβρυϊκού καρκινώματος NF2/D1 (Kretschmer et al., 1991), αλλά όχι σε κύτταρα NIH3T3 (Li et al., 1992) ή οστεοβλάστες (Tamura et al., 1994). Οι θέσεις έκφρασης της HARP επικαλύπτονται σε μεγάλο βαθμό με αυτές της MK, αν και το mk γονίδιο εκφράζεται νωρίτερα κατά την ανάπτυξη από το harp. Μελέτες έχουν αναφέρει ότι η HARP και η MK είναι δύο πρωτεΐνες που δεν έχουν μόνο δομική και λειτουργική ομολογία αλλά ότι το γονίδιο mk ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου harp (Herradon et al., 2005). Έχει 22

επίσης αναφερθεί σημαντική αύξηση στην έκφραση της HARP σε ποντίκια με γενετική έλλειψη MK - /- με υψηλό βαθμό ειδικότητας θέσης. Η ορμονική ρύθμιση της έκφρασης του mrna της HARP έχει διερευνηθεί σε διάφορες οστεοβλαστικές κυτταρικές σειρές και τα επίπεδα του μειορυθμίζονται με επίδραση της βιταμίνης D3, υποδεικνύοντας πιθανή εμπλοκή της HARP στην εξαρτώμενη από βιταμίνη D ρύθμιση του μεταβολισμού των οστών (Tamura et al., 1994). Η έκφραση του mrna της HARP αυξορυθμίζεται από διυδρό- τεστοστερόνη, τεστοστερόνη και οιστρογόνα ανδρογόνα και καταστέλλεται από anadron, έναν ειδικό αναστολέα ανδρογόνων, σε καλλιέργεια επιθηλιακών κυττάρων προστάτη (Vacherot et al., 1995). Σε μήτρα αρουραίου, διακυμάνσεις στην έκφραση του mrna της HARP παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια του οιστρικού κύκλου, με μέγιστη έκφραση κατά το δίοιστρο, τη φάση του κύκλου που κυριαρχείται από προγεστερόνη, γεγονός που υποδεικνύει ορμονική ρύθμιση. In vivo πειράματα με θηλυκούς αρουραίους στους οποίους είχαν αφαιρεθεί οι ωοθήκες έδειξαν επίσης αύξηση του mrna της HARP μετά από επίδραση με προγεστερόνη (Milhiet et al., 1998). Παθολογικές καταστάσεις Σε αντίθεση με το περιορισμένο πρότυπο έκφρασης στους φυσιολογικούς ενήλικους ιστούς, η έκφραση της HARP αυξάνεται σημαντικά στους περισσότερους όγκους. Η HARP έχει απομονωθεί από υγρό θρεπτικό μέσο κυττάρων καρκίνου του μαστού (MDA- MB- 231) (Wellstein et al., 1992). Το mrna της παρουσιάζει υψηλή έκφραση σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινων διάφορων όγκων, όπως από νευροβλάστωμα (SK- N- SH, NBL- S, SH- ST5Y) (Nakagawara et al., 1995), γλοιοβλάστωμα (U87MG, U373MG, LN229) (Lu et al., 2005), καρκίνο του παγκρέατος (Colo357, Panc89) (Weber et al., 2000), καρκίνο του μαστού (MDA- MB- 231, MDA- MB- 361, T47Dco, Hs- 578T), καρκίνο του προστάτη (PC3) (Fang et al., 1992), καρκίνωμα των ωοθηκών (A1827, PA- 1) (Riegel and Wellstein, 1994), καρκίνο του πνεύμονα (NCI- H187, NCI- H146) (Jager et al., 1997), χοριοκαρκίνωμα (Schulte et al., 1996), μελάνωμα (1205LU) (Czubayko et al., 1996) αλλά όχι σε μη καρκινικά κύτταρα. Υψηλά επίπεδα HARP στον ορό έχουν εντοπιστεί σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (Klomp et al., 2002), του πνεύμονα (Jager et al., 2002), των όρχεων (Aigner et al., 2003) και σε αστροκύτωμα (Ulbricht et al., 2003). Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση του γονιδίου της HARP ρυθμίζεται από το μονοπάτι PTEN/ PI3K/AKT και η απώλεια του PTEN οδηγεί σε υπερέκφραση της HARP in vitro σε κυτταροκαλλιέργειες και in vivo σε μαστικούς όγκους (Li et al., 2006). Το PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog) είναι σημαντικός καταστολέας της καρκινογένεσης και μειωμένη έκφραση του pten γονιδίου συναντάται σε πολλούς ανθρώπινους όγκους όπως το γλοιοβλάστωμα, και ο 23

καρκίνος του προστάτη, του ενδομητρίου, του πνεύμονα και του μαστού. Συνεπώς, η υπερέκφραση του harp γονιδίου μπορεί να συνεισφέρει στην καρκινογένεση λόγω απώλειας του PTEN. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν γίνει για να δείξουν την αλληλεπίδραση διαφορετικών αυξητικών παραγόντων και ρυθμιστών της ανάπτυξης στον καρκίνο του προστάτη. Στην κυτταρική σειρά LNCaP που αποτελεί μοντέλο μελέτης του καρκίνου του προστάτη και στην οποία η HARP παρουσιάζει αυτοκρινή δράση, έχει δειχτεί σημαντική συσχέτιση μεταξύ του FGF2 και της HARP στη ρύθμιση του καρκίνου του προστάτη. Ο FGF2 επάγει αρχικά την ενεργοποίηση της NADP(H) υπεροξειδάσης που παράγει Η 2 Ο 2, και ως αποτέλεσμα επάγει την έκφραση της HARP στα LNCaP κύτταρα (Hatziapostolou et al., 2006). H HARP φαίνεται να διαμεσολαβεί τη δράση του FGF2 στα LNCaP κύτταρα. Παρόμοια ρύθμιση επαγόμενη από FGF έχει παρατηρηθεί και στα PC3 κύτταρα (Connoly and Rose, 1998). Εικόνα 7: Επαγόμενη από τον FGF- 2 ρύθμιση του harp γονιδίου σε LNCaP κύτταρα (Hatziapostolou et al., 2006) 1.7.5. Υποδοχείς και μηχανισμοί δράσης της HARP Πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης Η HARP παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Η πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη θεωρείται ότι γίνεται κυρίως με τις δύο TSR περιοχές (Kilpelainen et al., 2000). Αναλύσεις έχουν δείξει ότι οι μεμονωμένες TSR περιοχές (N- TSR (αμινοξέα 13-58) και C- TSR (αμινοξέα 65-110)) προσδένονται αδύναμα στην ηπαρίνη και ο ελαστικός σύνδεσμος μεταξύ τους (59-64) δεν παίζει ρόλο στην πρόσδεση υψηλής συγγένειας. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι απαιτείται συνεργατική δράση των δύο TSR περιοχών για ισχυρή πρόσδεση. Αν και οι πλούσιες σε λυσίνη αμινο- και καρβοξυ- τελικές περιοχές έχουν υψηλό φορτίο, δεν συνεισφέρουν στην πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη. Το τμήμα που περιλαμβάνει και τις δύο TSR περιοχές (αμινοξέα 13-111) έχει 24

την ίδια συγγένεια με την ηπαρίνη με ολόκληρο το μόριο (Raulo et al., 2005). Επιπλέον η HARP παρουσιάζει μικρότερου βαθμού συγγένεια με τη θειική χονδροϊτίνη και τη θειική δερματάνη (Vacherot et al., 1999). Η αλληλεπίδραση με ηπαρίνη φαίνεται να προκαλεί το διμερισμό της HARP, ο οποίος είναι απαραίτητος για την ενεργοποίηση των υποδοχέων κινασών τυροσινών. Η θειική χονδροϊτίνη και η θειική δερματάνη επίσης οδηγούν σε διμερισμό της HARP αλλά σε σαφώς μικρότερο βαθμό. Ο μηχανισμός του διμερισμού φαίνεται να εμπλέκεται στη μιτογόνο και αγγειογενετική δράση της HARP και το διμερές να είναι η βιολογικά ενεργή μορφή της HARP που ενεργοποιεί τους υποδοχείς της (Bernard- Pierrot et al., 2002). Έχει δειχτεί ότι εξωγενείς γλυκοζαμινογλυκάνες σε συγκεντρώσεις που επάγουν το διμερισμό ενισχύουν τη μιτογόνο δράση της HARP (Vacherot et al., 1999). Συνδεκάνη Ο πρώτος υποδοχέας της HARP που ταυτοποιήθηκε ήταν η πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης Ν- συνδεκάνη (SDC3 ή συνδεκάνη- 3) μεγέθους 200 kda (Raulo et al., 1994). Απομονώθηκε από εγκεφαλικούς νευρώνες σε καλλιέργεια με χρωματογραφία συγγένειας, με τη HARP στη σταθερή φάση. Η SDC3 βρέθηκε ότι περιέχει αλυσίδες θειικής ηπαράνης προσδεδεμένες στην πρωτεΐνη, με μοριακό βάρος 120 kda. H πρόσδεση της SDC3 στη HARP αναστέλλεται από την ηπαρίνη υποδεικνύοντας ότι η πρόσδεση διαμεσολαβείται από τις αλυσίδες θειικής ηπαράνης. FGF2 σε διάλυμα δρα ανταγωνιστικά στην HARP για πρόσδεση στη SDC3 και φαίνεται ότι η HARP και ο FGF2 προσδένονται στις ίδιες υδατανθρακικές δομές της SDC3 (Raulo et al., 1994). Η SDC3 εκφράζεται ισχυρά σε αναπτυσσόμενους νευρικούς ιστούς (Carey et al., 1992) και στον κρόταφο έχει βρεθεί συνέκφραση της SDC3 με την HARP κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Έχει προταθεί ότι η SDC3 διαμεσολαβεί τη δράση της HARP στην προέκταση νευριτών μέσω του μονοπατιού Src- κορτακτίνης (Kinnunen et al., 1998). Οι συνδεκάνες έχουν δομικά ποικίλες εξωκυτταρικές δομές. Αν και, οι συνδεκάνες φέρουν κυρίως πλευρικές αλυσίδες θειικής ηπαράνης, η συνδεκάνη- 1 και η συνδεκάνη- 4 έχουν επιπλέον αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης και έχει αναφερθεί ισχυρή πρόσδεση της HARP και στις δύο αυτές συνδεκάνες (Mitsiadis et al., 1995). Μετά από απομάκρυνση των αλυσίδων θειικής ηπαράνης παρατηρήθηκε πλήρης απώλεια της πρόσδεσης του FGF2 σε αυτές τις συνδεκάνες αλλά η HARP και η MK μπορούσαν ακόμα να αλληλεπιδράσουν μαζί τους. Επιπλέον, η συνδεκάνη- 1 έχει βρεθεί να εμπλέκεται στην πρόσδεση της HARP και της MK. Έχει προταθεί η θεωρία ότι οι αλυσίδες της θειικής χονδροϊτίνης επιταχύνουν την πρόσδεση και την απελευθέρωση των FGF2, HARP και MK στις αλυσίδες θειικής ηπαράνης και ότι σχηματίζουν ένα σύμπλοκο για τη μεταφορά του αυξητικού παράγοντα στον υποδοχέα του (Deepa et al., 2004). Σε πολλά συστήματα 25

αλληλεπίδρασης επιθηλίου- μεσεγχύματος η HARP, η MK, οι FGFs και η συνδεκάνη- 1 συνεντοπίζονται και φαίνεται να αλληλεπιδρούν κατά την ανάπτυξη (Mitsiadis et al., 1995). Φωσφακάνη Η πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης φωσφακάνη ή 6B4 πρωτεογλυκάνη αντιστοιχεί στην εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ (Receptor Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ). Ο RPTPβ/ζ αποτελείται από μια μεγάλη αμινοτελική, εξωκυτταρική περιοχή που φέρει αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης, μία μοναδική διαμεμβρανική περιοχή και μία ενδοκυτταρική περιοχή με ενεργότητα φωσφατάσης τυροσίνης (Levy et al., 1993). Εναλλακτικό μάτισμα του mrna παράγει τρεις ισομορφές του RPTPβ/ζ: μία διαμεμβρανική εκτενής μορφή, μία διαμεμβρανική βραχεία μορφή και μία εκκρινόμενη μορφή. Εικόνα 8: Οι τρεις ισομορφές του RPTPβ/ζ (Lorente et al., 2005). Αναλύσεις έχουν δείξει ότι η HARP προσδένεται στη φωσφακάνη σε δύο περιοχές, μία με υψηλή συγγένεια και μία με χαμηλή συγγένεια. Η πρόσδεση της HARP στη φωσφακάνη εξαρτάται από τις αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης καθώς απομάκρυνση της θειικής χονδροϊτίνης οδήγησε σε σημαντική μείωση της συγγένειας πρόσδεσης και στις δύο περιοχές (Maeda et al., 1996). Το μονοπάτι μετάδοσης σήματος των HARP/RPTPβ/ζ αποτελείται από ένα μοναδικό μηχανισμό, μετά από πρόσδεση της HARP θεωρείται ότι ο RPTPβ/ζ διμερίζεται, αυτοαποφωσφορυλιώνεται και απενεργοποιείται η ενεργότητα φωσφατάσης τυροσίνης του. Οι κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες β- κατενίνη (Meng et al., 2000 και β- αντουσίνη και η κινάση Fyn της οικογένειας τως Src κινασών (Pariser et al., 2005) αποτελούν υποστρώματα του RPTPβ/ζ και η πρόσδεση της HARP στον 26

RPTPβ/ζ αυξάνει τη φωσφορυλίωση αυτών των πρωτεϊνών. Η αύξηση της φωσφορυλίωσης της β- κατενίνης εμποδίζει την αλληλεπίδραση της με τις καντερίνες με αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση των συνδέσεων πρόσδεσης και η αύξηση της φωσφορυλίωσης της β- αντουσίνης αποσταθεροποιεί τον κυτταροσκελετό. Ο RPTPβ/ζ εκφράζεται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Levy et al., 1993) και εμπλέκεται στην επαγωγή μετανάστευσης φλοιικών νευρώνων από τη HARP. Αντισώματα έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής του καταστέλλουν τη διαμεσολαβούμενη από HARP μετανάστευση των νευρώνων (Maeda and Noda, 1998). O RPTPβ/ζ και η HARP υπερεκφράζονται σε ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα (Ulbricht et al., 2003). Πειράματα μειορύθμισης της συσσώρευσης του RPTPβ/ζ με RNAi έχουν δείξει τον λειτουργικό ρόλο του RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από HARP απτοτακτική μετανάστευση των κυττάρων, στα γλοιοβλαστώματα (Ulbricht et al., 2006). Αν και λίγα είναι γνωστά για το λειτουργικό της ρόλο, μία άλλη πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης, η νευροκάνη που συντίθεται στους νευρώνες, έχει ταυτοποιηθεί ότι αλληλεπιδρά με τη HARP (Milev et al., 1998). Εικόνα 9: Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών μονοπατιών μετάδοσης σήματος που ενεργοποιούνται μετά τη δέσμευση της HARP στον RPTPβ/ζ (Mikelis et al., 2007). Κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplasyc Lymphoma Kinase, ALK) O ALK είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης που ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων ινσουλίνης. O ALK ανακαλύφθηκε πρώτη φορά ως χιμαιρική πρωτεΐνη με 27

τη νουκλεοφοσμίνη (NPM- ALK) σε κύτταρα αναπλαστικού λεμφώματος (ALCL) (Morris et al., 1997). Η NPM- ALK περιέχει την αμινοτελική περιοχή της NPM συντηγμένη με την καρβοξυτελική, καταλυτική περιοχή του ALK. Οι συχνές χρωμοσωματικές μετατοπίσεις και συντήξεις της κυτταροπλασματικής του περιοχής με διάφορα άλλα κυτταροπλασματικά μόρια αποτελούν χαρακτηριστικό του ALK. Δύο μορφές του ALK έχουν ταυτοποιηθεί, μία των 220 kda και μία των 140 kda που προκύπτει μετά από πέψη του. Το θραύσμα των 80 kda απελευθερώνεται στο υγρό θρεπτικό μέσο της κυτταροκαλλιέργειας (Moog- Lutz et al., 2005). Η HARP έχει προταθεί ως πιθανό πρόσδεμα του ALK και έχει δειχτεί ότι αλληλεπιδρά με την εξωκυτταρική περιοχή του (Bernard- Pierrot et al., 2001) αλλά αυτό δεν έχει επιβεβαιωθεί από άλλες μελέτες (Motegi et al., 2004) και παραμένει αμφιλεγόμενο. Μία πρόσφατη μελέτη παρουσίασε ένα διαφορετικό μοντέλο ενεργοποίησης του ALK. Σε αυτή τη μελέτη προτείνεται ότι η HARP επάγει την φωσφορυλίωση του ALK μέσω του μονοπατιού μετάδοσης σήματος των HARP- RPTPβ/ζ χωρίς να αλληλεπιδρά η ίδια με τον ALK. Ο ALK αποφωσφορυλιώνεται από τον RPTRβ/ζ σε κύτταρα απουσία HARP. Η επίδραση με HARP οδηγεί στην απενεργοποίηση του RPTRβ/ζ και ο ανενεργός RPTRβ/ζ δεν μπορεί πλέον να αποφωσφορυλιώσει τον ALK που αυτοφωσφορυλιώνεται. Έτσι η φωσφορυλίωση του ALK αυξάνεται (Perez- Pinera et al., 2007). Εικόνα 10: Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών μονοπατιών μετάδοσης σήματος που ενεργοποιούνται μετά τη δέσμευση της HARP στον ALK (Mikelis et al., 2007). Το πρότυπο έκφρασης του ALK είναι ιστοειδικά και χρονοειδικά παρόμοιο με αυτό της HARP. Έχει αναφερθεί ότι στη μιτογόνο δράση της HARP παρατηρείται φωσφορυλίωση υποστρωμάτων του 28

ALK όπως η PKC- γ και η PI3 κινάση (Stoica et al., 2001). Η PI3 κινάση συμμετέχει και στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού ενδοθηλιακών κυττάρων από τη HARP (Sou ou et al., 2001). Αντίθετα η αντιαποπτωτική δράση της HARP μέσω του ALK σε NIH3T3 κύτταρα εξαρτάται από το MAPK μονοπάτι, αλλά όχι από την PI3 κινάση (Bowden et al., 2002). Σε γλοιοβλαστώματα, ο ALK υπερεκφράζεται όπως και η HARP και η καταστολή της έκφρασης του ALK με τη χρήση ριβοζοενζύμων σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος και καρκίνου του μαστού εμποδίζει την επαγόμενη από HARP φωσφορυλίωση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Akt και οδηγεί σε επαγωγή της απόπτωσης και καταστολή της ανάπτυξης όγκων σε αθυμικά ποντίκια (Powers et al., 2002). Νουκλεολίνη Εκτός από τη δράση της μέσω υποδοχέων η HARP φαίνεται να δρα και απ ευθείας εντός των κυττάρων. Η HARP προσδένεται στη νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας και ενδοκυτταρώνεται μέσω μιας ενεργητικής διαδικασίας ανεξάρτητης από πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης ή χονδροϊτίνης. Η νουκλεολίνη είναι μία μεμβρανική πρωτεΐνη του κυττάρου που εμπλέκεται στην πρόσδεση του ιού HIV στα κύτταρα και έχει δράση πρωτεΐνης μεταφορέα μεταξύ του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα. Η HARP εμποδίζει την πρόσδεση του ιού στα κύτταρα λόγω της δυνατότητας της να προσδένει τη νουκλεολίνη. Οι περιοχές β- φύλλων έχουν βρεθεί να είναι υπεύθυνες για αυτή τη δράση και ειδικότερα η καρβοξυτελική κεντρική περιοχή (αμινοξέα 60-110) (Said et al. 2005) 1.7.6. Μόρια μεταγωγής σήματος Src Η Src είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης που αποτελείται από τη Src, τη Fyn και τη Yes με μεγάλο εύρος έκφρασης και τις Lck, Hck, Fgr, Lyn, Ykr, και Blc που παρουσιάζουν ιστοειδική έκφραση. Στα θηλαστικά, οι πρωτεΐνες της Src οικογένειας έχουν παρόμοια δομή, με μοριακό βάρος που κυμαίνεται από 52-62 kda. Κάθε μέλος αποτελείται από μια αμινοτελική περιοχή (αμινοξέα 1-17) που αποτελεί θέση μυριστυλίωσης και παλμυτυλίωσης και που είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση της Src στην πλασματική μεμβράνη. Ακολουθείται από μια μη συντηρημένη, μοναδική περιοχή (αμινοξέα 18-84), η οποία θεωρείται υπεύθυνη για την ειδική πρόσδεση σε συγκεκριμένους υποδοχείς και πρωτεΐνες- στόχους. Τα αμινοξέα 85-140 αντιστοιχούν σε μία SH 3 ρυθμιστική περιοχή που αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες πλούσιες σε προλίνη, 29

ρυθμίζοντας την καταλυτική δράση, τη θέση της πρωτεΐνης στο κύτταρο και την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες- στόχους. H Src διαθέτει και δεύτερη ρυθμιστική περιοχή, την SH 2, (αμινοξέα 141-260), που αλληλεπιδρά με φωσφορυλιωμένες τυροσίνες και καθορίζει το εύρος των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με αυτήν. Η περιοχή που αποτελείται από τα αμινοξέα 261-516 είναι υπεύθυνη για τη δράση κινάσης τυροσίνης και η καρβοξυτελική περιοχή (αμινοξέα 517-536) έχει ρυθμιστικό ρόλο (Abram and Courtneidge, 2000). Η φωσφορυλίωση της Src στην Tyr- 527 του καρβοξυτελικού άκρου από την Csk οδηγεί στην αλληλεπίδραση αυτής της περιοχής με την SH 2 περιοχή, με αποτέλεσμα την αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της και την απενεργοποίηση της. Το ίδιο αποτέλεσμα έχει και η αλληλεπίδραση της SH 3 περιοχής με την καταλυτική περιοχή ή τον σύνδεσμο μεταξύ της SH 2 και της καταλυτικής περιοχής. Φωσφορυλίωση της Tyr- 416 και αποφωσφορυλίωση της Tyr- 527 οδηγεί στην ενεργοποίηση της Src, που επιτρέπει στις SH 2 και SH 3 περιοχές να αλληλεπιδράσουν με άλλα μόρια επηρεάζοντας τη μεταγωγή σήματος. Αρκετές φωσφατάσες, όπως η PTP- α, η PTP1 και η SHP- 1 έχουν την ικανότητα ρύθμισης της Src. Η PTP- α και η PTP1B σε in vivo και in vitro πειράματα μπορούν να αποφωσφορυλιώσουν την Tyr- 527. Σε ενεργοποίηση της Src οδηγεί και η πρόσδεση της SH 3 περιοχής στον PDGFR και η αλληλεπίδραση με τη FAK (Cole et al., 2003). Εικόνα 11: Σχηματική αναπαράσταση της κινάσης Src (Cole et al., 2003). Η Src ενεργοποιείται από υποδοχείς με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης και συμμετέχει στη μεταγωγή σήματος από αυτούς τους υποδοχείς. Επιπλέον, η Src μπορεί να ενεργοποιηθεί από μόρια της εξωκυττάριας ύλης, με διαμεσολάβηση των ιντεγκρινών. Η Src συμμετέχει στην προσκόλληση των κυττάρων και στην αναδιοργάνωση των εστιών προσκόλλησης, αλληλεπιδρώντας με τη κινάση εστιακής προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase, FAK). Έχει βρεθεί ότι η Src δεσμεύεται και φωσφορυλιώνει τη FAK, συμμετέχοντας στους μηχανισμούς της κυτταρικής μετανάστευσης. Η κυτταρική μετανάστευση επάγεται και από μεταγωγή σήματος μέσω του μονοπατιού των MAP κινασών, το οποίο μπορεί να ενεργοποιήσει η Src (Abram and Courtneidge, 2000). Η Src συμμετέχει και στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Ήταν το πρώτο ογκογονίδιο που ανακαλύφθηκε και έχει σημαντικό ρόλο στη μετάσταση. Μέσω του μονοπατιού των ERK, επάγει τη μεταγραφή των μεταλλοπρωτεϊνασών οι οποίες αποικοδομούν την εξωκυττάρια ύλη (Mon et al., 2006). 30