ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΦΥΚΗ

ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΥΨΗΛΗΣ ΠΡΟΣΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΑΞΙΑΣ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΦΥΚΗ A. Καραπατσιά 1, Γ. Πενλόγλου 1, Χ. Χατζηδούκας 1, Κ. Κυπαρισσίδης 1,2,* 1 Τμήμα Χημικών Μηχανικών, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.), Τ.Θ. 472, 54124, Θεσσαλονίκη 2 Ινστιτούτο Χημικών Διεργασιών και Ενεργειακών Πόρων (Ι.Δ.Ε.Π.), Εθνικό Κέντρο Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (E.K.E.T.A.), Τ.Θ. 60361, 57001, Θέρμη, Θεσσαλονίκη (*cypress@cperi.certh.gr) ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοχημικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας από μικροφύκη έχει προσελκύσει προσφάτως σημαντικό ερευνητικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον. Τα μικροφύκη έχουν τη δυνατότητα να παράγουν σημαντικές ποσότητες λιπιδίων, υδατανθράκων και πρωτεϊνών. Τα συστατικά αυτά, αφού ανακτηθούν και υποστούν κατάλληλη επεξεργασία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την βελτίωση της ποιότητας και τον εμπλουτισμό της ανθρώπινης διατροφής σε απαραίτητα συστατικά, να χρησιμοποιηθούν ως ζωοτροφές και ιχθυοτροφές, είτε ακόμη να αποτελέσουν δομικές μονάδες για τη σύνθεση προϊόντων χαμηλής αξίας-υψηλού όγκου κατανάλωσης, όπως βιοκαύσιμα, ή προϊόντων υψηλής αξίας-χαμηλού όγκου κατανάλωσης, όπως φαρμακευτικά, καλλυντικά, κ.ά. Η ταυτόχρονη παραγωγή του ευρύτερου δυνατού φάσματος βιοχημικών προϊόντων και βιοκαυσίμων από μικροφύκη και γενικότερα η αποτελεσματικότερη αξιοποίηση της βιομάζας τους κάτω από βέλτιστες συνθήκες, θεωρούνται ως προαπαιτούμενα για την οικονομική και αειφόρο λειτουργία βιομηχανικών διεργασιών παραγωγής και επεξεργασίας βιομάζας μικροφυκών. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιείται ταυτοποίηση των σημαντικότερων λειτουργικών παραμέτρων της καλλιέργειας μικροφυκών και μελετάται και αξιολογείται η επίδραση τους στη σύνθεση διαφορετικών βιοϋλικών, με εφαρμογή της μεθόδου στατιστικού πειραματικού σχεδιασμού Taguchi. Η ανάλυση ευαισθησίας των παραμέτρων αυτών, βασισμένη σε πειραματικά αποτελέσματα, παρέχει τις κατάλληλες πολιτικές λειτουργίας για την ενίσχυση της παραγωγής βιομάζας ή/και της συγκέντρωσης βιοπροϊόντων, αρχικά στην κλίμακα των κωνικών φιαλών. Η κλιμάκωση των βέλτιστων συνθηκών μελετήθηκε και πραγματοποιήθηκε με επιτυχία κατά τη μετάβαση από τις κωνικές φιάλες σε φωτό-βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας, όπου η συγκέντρωση βιομάζας και βιοϋλικών μεγιστοποιήθηκε. ΕΙΣΑΓΩΓΗ H χρήση μικροφυκών για τη συνδυαστική παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοϋλικών υψηλής προστιθέμενης αξίας αποτελεί μια ελπιδοφόρο και σύγχρονη πρακτική που χαρακτηρίζεται ως βιοδιυλιστήριο τρίτης γενιάς. Εκτός από την ποικιλότητα αναφορικά με το είδος των βιοπροϊόντων που μπορούν να παραχθούν από τα μικροφύκη, υπάρχουν κι άλλοι σημαντικοί διακριτοί λόγοι που καθιστούν τα μικροφύκη, ως αυτότροφους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς, σημαντική πηγή πρώτων υλών ενός βιοδιυλιστηρίου. Η δυνατότητα δέσμευσης και αξιοποίησης του CO 2 της ατμόσφαιρας (από τα μικροφύκη ως πηγής άνθρακα) με την επαγόμενη αειφορία στην παραγωγή των βιοπροϊόντων και την προοπτική περιορισμού του φαινομένου του θερμοκηπίου, καθώς και η δυνατότητα συνδιαχείρισης και επεξεργασίας αγροτικών ή/και βιομηχανικών λυμάτων υψηλής περιεκτικότητα σε νιτρικά και φωσφορικά άλατα, ταυτόχρονα με την καλλιέργεια μικροφυκών, αποτελούν τους πλέον σημαντικούς λόγους που προσδίδουν πρόσθετη αξία στη βιομάζα μικροφυκών [1]. Είναι σαφές ότι η ανάπτυξη της κυτταρικής βιομάζας των μικροφυκών συνδέεται με την κατανάλωση διοξειδίου του άνθρακα, όμως ο ρυθμός συσσώρευσης του ενδοκυττάριου περιεχομένου των μικροφυκών και η σύσταση της βιομάζας τους καθορίζονται σημαντικά, τόσο από τις συνθήκες της καλλιέργειας, όσο και από την περίσσεια ή έλλειψη συγκεκριμένων διατροφικών συστατικών στο θρεπτικό μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας [2]. Συνεπώς, η βελτιστοποίηση της παραγωγής των βιοσυστατικών που παράγονται στο εσωτερικό των κυττάρων προϋποθέτει το συνδυασμό του κατάλληλου θρεπτικού μέσου με τις εξίσου κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας, (π.χ., προφίλ αερισμού και φωτισμού της καλλιέργειας) σε συγχρονισμό με τις φάσεις ανάπτυξης της καλλιέργειας [3]. Για τη μελέτη της συνδυαστικής δράσης των παραπάνω παραμέτρων στην καλλιέργεια μικροφυκών και την ελεγχόμενη παραγωγή επιθυμητών προϊόντων επιλέχθηκε ένα θαλάσσιο είδος μικροφυκών της οικογένειας Stichococcus. Για το συγκεκριμένο στέλεχος, δεδομένης της προέλευσης του (θαλασσινό και όχι γλυκό νερό), η αλατότητα του θρεπτικού μέσου αναμένεται να αποτελέσει ρυθμιστική παράμετρο στην ανάπτυξη του και θα επιλεγεί ως ξεχωριστή παράμετρος μελέτης. Σε θαλάσσια στελέχη όπως αυτό, η δέσμευση του αναγκαίου άνθρακα για την ανάπτυξη και για τις μεταβολικές τους δραστηριότητες πραγματοποιείται μέσω ενός μηχανισμού διάχυσης από την κυτταρική μεμβράνη, λόγω της διαφοράς ph στο κυτταρόπλασμα των θαλάσσιων μικροφυκών (7.0-7.2) με το εξωτερικό ph του περιβάλλοντος (θαλάσσιου ή χημικώς καθορισμένου), η οποία

ταυτόχρονα ενεργοποιεί τη σύνθεση προϊόντων στο εσωτερικό των κυττάρων [4]. Τα βιοσυστατικά που παράγονται ενδοκυττάρια από το επιλεγμένο στέλεχος μικροφυκών είναι κυρίως λιπίδια, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες. Τα λιπίδια (κυρίως ουδέτερα λιπίδια τριγλυκερίδια) αποτελούν πρώτη ύλη για παραγωγή βιοντίζελ, μέσω μετεστεροποίησης ή καταλυτικής υδρογονοεπεξεργασίας, ενώ μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ως διατροφικά συστατικά (ω-3 λιπαρά) καθώς και σε καλλυντικά προϊόντα. Οι πρωτεΐνες διαθέτουν υψηλή αξία καθώς χρησιμοποιούνται σε μικρές ποσότητες στη βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών. Τέλος, οι υδατάνθρακες είναι κατάλληλη πηγή μονομερών σακχάρων, που αποτελούν ιδανικές πρώτες ύλες για παραγωγή βιοκαυσίμων και βιοχημικών προϊόντων, μέσω ενζυμικών συνθέσεων ή μικροβιακών ζυμώσεων [1]. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιείται αξιολόγηση της δυνατότητας του επιλεγμένου στελέχους μικροφυκών να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή βιομάζας στο πλαίσιο λειτουργίας ενός βιοδιυλιστηρίου, που προϋποθέτει την καλλιέργεια τους στελέχους υπό τις βέλτιστες συνθήκες και τη μέγιστη δυνατή απόδοση για την ταυτόχρονη παραγωγή στοχευμένων βιοπροϊόντων υψηλής αξίας. Για τον εντοπισμό των βέλτιστων συνθηκών καλλιέργειας των μικροφυκών είναι αναγκαία η ανάλυση ευαισθησίας της επίδρασης των σημαντικότερων παραμέτρων στα ποιοτικά/ποσοτικά κριτήρια απόδοσης της καλλιέργειας. Η ανάλυση ευαισθησίας όμως σε ένα πολυπαραμετρικό σύστημα απαιτεί μεγάλο αριθμό χρονοβόρων πειραμάτων για τη συλλογή των απαραίτητων δεδομένων. Για την αποτελεσματικότερη παραγωγή, συλλογή, διαχείριση και αξιοποίηση των πειραματικών δεδομένων εφαρμόζεται ένας ολοκληρωτικός πειραματικός σχεδιασμός με εφαρμογή κατάλληλων στατιστικών μεθόδων. Πιο συγκεκριμένα, στην παρούσα εργασία επιλέχθηκε ο ορθογώνιος πειραματικός σχεδιασμός Taguchi, που επιτρέπει τη μελέτη και την αξιολόγηση ενός μεγάλου αριθμού παραμέτρων με τον ελάχιστο δυνατό αριθμό πειραμάτων, οδηγώντας σε ασφαλή συμπεράσματα με στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα της στατιστικής μελέτης που παρήχθησαν από την ανάλυση δεδομένων από πειράματα σε κωνικές φιάλες μεταφέρονται υπό κλίμακα σε φωτό-βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας στο πλαίσιο μεγέθυνσης της παραγωγικής διεργασίας. Για τη μετάβαση αυτή μελετώνται ποιες είναι οι λειτουργικές παράμετροι που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο και αναπτύσσεται η συλλογιστική αναπροσαρμογής των παραμέτρων αυτών για την ομαλή και επιτυχημένη κλιμάκωση της διεργασίας. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το στέλεχος Stichococcus sp. απομονώθηκε από τη θαλάσσια περιοχής της Κρήτης, ταυτοποιήθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη ανάπτυξης καλλιέργειας μικροφυκών σε κωνικές φιάλες και φωτόβιοαντιδραστήρα. Για τις καλλιέργειες στην κλίμακα των κωνικών φιαλών επιλέχθηκαν προς μελέτη τρία διαφορετικά θρεπτικά μέσα ανάπτυξης που διαφοροποιούνται κυρίως ως προς την περιεκτικότητα τους σε άλας NaNO 3, που χρησιμοποιείται ως πηγή αζώτου. Τα τρία μέσα αξιολογήθηκαν βιβλιογραφικά κατάλληλα για το συγκεκριμένο στέλεχος. Συγκεκριμένα το πρώτο θρεπτικό μέσο ήταν το Synthetic Effluent (SE) που προσομοιώνει ένα βιομηχανικό απόβλητο και αντιπροσωπεύει ένα φτωχό μέσο ανάπτυξης στη συγκεκριμένη μελέτη (η σύσταση του SE σε mg/l είναι: NaNO 3 63.4, (NH 4 ) 2 SO 4 61.1, KH 2 PO 4 11.1, FeCl 3 6H 2 O 3.5, FeSO 4 3.23, Na 2 EDTA 2 H 2 O 4.36, CuSO 4 5H 2 O 9.8 10-3, Na 2 MoO 4 2H 2 O 6.3 10-3, ZnSO 4 7H 2 O 2.2 10-2, CoCl 2 6 H 2 O 0.01, MnCl 2 4H 2 O 0.18). Επιπρόσθετα, το Bold Basal (BB) χρησιμοποιήθηκε ως ένα δεύτερο θρεπτικό μέσο ανάπτυξης επαρκούς περιεκτικότητας σε άλας NaNO 3, ενώ τέλος μελετήθηκε και ένα τροποποιημένο μέσο ανάπτυξης, το Modified Bold Basal-3N+Vitamins (MBB-3N+V), εκπροσωπώντας ένα πλούσιο μέσο με τριπλάσια ποσότητα πηγής αζώτου από το ΒΒ και με προσθήκη βιταμινών. Εκτός από τη σύσταση του μέσου ανάπτυξης, με ιδιαίτερη έμφαση στην περιεκτικότητα της πηγής του αζώτου, τέσσερις ακόμη λειτουργικές παράμετροι κρίθηκαν καθοριστικής σημασίας στην πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας, συγκεκριμένα, (i) η ένταση του φωτός, (ii) ο ρυθμός αερισμού της καλλιέργειας, (iii) ο ρυθμός τροφοδοσίας CO 2, και (iv) η συγκέντρωση αλατότητας του μέσου ανάπτυξης. Για τη μελέτη της επίδρασης των πέντε συνολικά λειτουργικών παραμέτρων εφαρμόστηκε ένα πειραματικός σχεδιασμός μικτών επιπέδων κατά Taguchi (L 18 : 1 παράμετρος 2 επίπεδα, 4 παράμετροι 3 επίπεδα), όπως παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Αναλυτικότερα, η επίδραση των τεσσάρων παραμέτρων μελετήθηκε σε τρία επίπεδα διακύμανσης και η πέμπτη παράμετρος, η ένταση του φωτός, μελετήθηκε σε δύο επίπεδα διακύμανσης. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε κωνικές φιάλες 500 ml (Erlenmeyer flasks) με συνολικό όγκο καλλιέργειας 165 ml σε ομογενώς φωτιζόμενο ανακινούμενο επωαστήρα στους 25 o C, σταθερή ταχύτητα ανάδευσης 80 rpm και περίοδο φωτισμού-σκότους 16-8 h. Σε όλες τις κωνικές φιάλες το αρχικό ph της καλλιέργειας ρυθμίστηκε στη βιβλιογραφικά προσδιορισμένη ως βέλτιστη τιμή 6.5 [5,6]. Για τις καλλιέργειες με μέσο ανάπτυξης το SE η ρύθμιση του ph πραγματοποιήθηκε με χρήση εξωτερικών αποστειρωμένων διαλυμάτων 0.1 Μ HCl και NaOH, ενώ στην περίπτωση των καλλιεργειών με θρεπτικό μέσο το BB είτε το ΜBB-3Ν+V, η ρύθμιση του ph έγινε χρησιμοποιώντας κατάλληλη αναλογία των φωσφορικών αλάτων (Κ 2 HPO 4 και KH 2 PO 4 ) που εμπεριέχονται στο μέσο. Όλες οι καλλιέργειες εμβολιάστηκαν με 15 ml από την ίδια προκαλλιέργεια. Ο συνολικός χρόνος επώασης για όλες τις καλλιέργειες ήταν 15 ημέρες ενώ δείγματα προς ανάλυση λαμβάνονταν υπό αποστειρωμένες συνθήκες από όλες τις καλλιέργειες κάθε 5 ημέρες.

Πίνακας 1. Πειραματικός σχεδιασμός Taguchi για τη μελέτη πέντε διαφορετικών παραγόντων σε μικτά επίπεδα (L 18 ) κατά την καλλιέργεια του Stichococcus sp. Παράμετρος Επίπεδο 1 Επίπεδο 2 Επίπεδο 3 Ένταση Φωτισμού (Lux) 3600 7200 - Αερισμός Καλλιέργειας (l/min) 0 0.1 0.2 Παροχή 10% CO 2 (l/min) 0 0.025 0.05 Θρεπτικό Μέσο (Πηγή Αζώτου) (g/l) 0.06 0.25 0.75 Αλατότητα (NaCl) (g/l) 0.25 17.5 35 Για τη μελέτη της πορείας ανάπτυξης των καλλιεργειών, δείγματα συνολικού όγκου 40 ml διαχωρίζονταν σε ισομερείς ποσότητες και επεξεργάζονταν αναλόγως για τη μέτρηση της συγκέντρωσης ξηρής κυτταρικής βιομάζας, του πρωτεϊνικού περιεχομένου, του λιπιδικού περιεχομένου και του περιεχομένου υδατανθράκων (% κ.β. ξηρής κυτταρικής βιομάζας). Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της ξηρής βιομάζας του στελέχους Stichococcus sp. έγινε διήθηση 10 ml της καλλιέργειας με προζυγισμένο φίλτρο υαλώδους μικροϊνών (Whatman 934-ΑΗ) με πορώδες 1.5 μm, το οποίο ξηράθηκε στους 50 ο C. Η εκχύλιση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε σε διάλυμα 0.5 Ν ΝaOH με 5% CH 3 OH και προσθήκη φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος 0.05 Μ με παράλληλη χρήση υπερήχων για 10 min, σύμφωνα με προϋπάρχοντα πρωτόκολλα [7]. Η μέτρηση των πρωτεϊνών βασίστηκε στα αντιδραστήρια MicroBCA kit (ThermoScientific) και η περιεκτικότητα τους προσδιορίστηκε με χρήση φασματοφωτόμετρου μικροπλακών. Επιπρόσθετα, η εκχύλιση των λιπιδίων πραγματοποιήθηκε με διάλυμα χλωροφορμίου-μεθανόλης 2:1 και σύγχρονη χρήση υπερήχων για 10 min, σύμφωνα με μια τροποποιημένη εφαρμογή της μεθοδολογίας του Folch (1956), όπως ακριβώς εντοπίστηκε βιβλιογραφικά [8]. Τέλος, για την ανάκτηση και την ακόλουθη ποσοτική ανάλυση των υδατανθράκων εφαρμόστηκε εκχύλιση με HCl 2.5 M για 3 h στους 100 ο C και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος φαινόλης-θειικού οξέος [9]. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Από το στατιστικό σχεδιασμό πειραμάτων Taguchi για το σύνολο των πέντε λειτουργικών παραμέτρων και των επιπέδων διακύμανσης τους προέκυψαν 18 διαφορετικά πειράματα. Οι ακριβείς συνθήκες των πειραμάτων περιγράφονται συνοπτικά στον Πίνακα 2. Για την αξιολόγηση των επιλεγμένων λειτουργικών παραμέτρων και την ανάλυση ευαισθησίας της καλλιέργειας στις παραμέτρους αυτές ορίστηκαν τέσσερα κριτήρια απόδοσης της καλλιέργειας: (i) η τελική συγκέντρωση της ξηρής βιομάζας, ως δείκτης ανάπτυξης της καλλιέργειας, (ii) η τελική συγκέντρωση των πρωτεϊνών, (iii) η τελική συγκέντρωση των λιπιδίων, και (iv) η τελική συγκέντρωση των υδατανθράκων, ως δείκτες παραγωγικότητας και εκλεκτικής απόδοσης της καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα των πειραματικών μετρήσεων για το σύνολο των 18 πειραμάτων σε κωνικές φιάλες για την ξηρή βιομάζα και τα ενδοκυττάρια προϊόντα παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Τα αποτελέσματα αυτά αναλύθηκαν στατιστικά με τη βοήθεια του λογισμικού πακέτου Minitab 17.0 και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστοι συνδυασμοί των μελετώμενων παραμέτρων που μεγιστοποιούν καθένα από τα παραπάνω κριτήρια απόδοσης ξεχωριστά. Πίνακας 2. Λειτουργικές συνθήκες των πειραμάτων που προέκυψαν από το στατιστικό σχεδιασμό Taguchi. # Πειράματος Φωτισμός (Lux) Αερισμός (l/min) CO 2 (l/min) Άζωτο (g/l) Αλατότητα (g/l) 1 3600 0 0 0.06 i 0.25 2 3600 0 0.025 0.25 ii 17.5 3 3600 0 0.05 0.75 iii 35 4 3600 0.1 0 0.06 17.5 5 3600 0.1 0.025 0.25 35 6 3600 0.1 0.05 0.75 0.25 7 3600 0.2 0 0.25 0.25 8 3600 0.2 0.025 0.75 17.5 9 3600 0.2 0.05 0.06 35 10 7200 0 0 0.75 35 11 7200 0 0.025 0.06 0.25 12 7200 0 0.05 0.25 17.5 13 7200 0.1 0 0.25 35 14 7200 0.1 0.025 0.75 0.25

15 7200 0.1 0.05 0.06 17.5 16 7200 0.2 0 0.75 17.5 17 7200 0.2 0.025 0.06 35 18 7200 0.2 0.05 0.25 0.25 Μέσο ανάπτυξης: i Synthetic Effluent (SE), ii Bold Basal (BB), iii Modified Bold Basal (MBB-3N+V). Αναφορικά με τη μεγιστοποίηση της κυτταρικής ανάπτυξης (συγκέντρωση βιομάζας) παρουσίασαν σημαντική επίδραση στο τελικό αποτέλεσμα οι διακυμάνσεις και των πέντε παραμέτρων. Η κατάταξη σημαντικότητας όμως των παραμέτρων αυτών, σύμφωνα με τη στατιστική ανάλυση του σχεδιασμού Taguchi, υπέδειξε ότι ο αερισμός της καλλιέργειας καθώς και η παροχή διοξειδίου του άνθρακα έχουν τον καθοριστικότερο ρόλο στη διαμόρφωση του τελικού αποτελέσματος, ενώ η μέγιστη αναμενόμενη συγκέντρωση ξηρής βιομάζας ανέρχεται σε 4.38 g/l υπό τις βέλτιστες τμές των πέντε παραμέτρων. Επίσης, στην τελική συγκέντρωση των υδατανθράκων οι μελετώμενες παράμετροι φαίνεται να επιδρούν με την ίδια σειρά σημαντικότητας, όπως και στην περίπτωση της ξηρής βιομάζας με μοναδική εξαίρεση την αντίστροφη σειρά των δύο λιγότερων σημαντικών παραμέτρων, του φωτισμού και της αλατότητας. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης των υδατανθράκων που μπορεί να επιτευχθεί υπό τις βέλτιστες συνθήκες είναι 1.24 g/l. Σε αντιδιαστολή με την ξηρή βιομάζα και τους υδατάνθρακες, η παροχή διοξειδίου του άνθρακα και η συγκέντρωση του αζώτου εντοπίστηκαν ως οι πιο σημαντικοί παράγοντες για τη σύνθεση υψηλού λιπιδικού περιεχομένου. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης των λιπιδίων που μπορεί να επιτευχθεί υπό τις αντίστοιχες βέλτιστες συνθήκες είναι 0.33 g/l. Τέλος, αναφορικά με το πρωτεϊνικό περιεχόμενο των κυττάρων του Stichococcus sp., η μέγιστη τιμή που αναμένεται είναι 0.41 g/l και καθορίζεται πρωταρχικά, τόσο από τη συγκέντρωση του αζώτου, όσο και από την αλατότητα του θρεπτικού μέσου. Η κατάταξη του συνόλου των παραμέτρων για την επίδραση τους στη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης του κάθε βιοϋλικού, καθώς και στη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της βιομάζας, όπως επίσης και οι βέλτιστοι συνδυασμοί των τιμών των παραμέτρων που οδηγούν στη μέγιστη τιμή των τεσσάρων κριτηρίων απόδοσης της καλλιέργειας, προβάλλονται στον Πίνακα 4. Πίνακας 3. Συγκεντρωτικός πίνακας αποτελεσμάτων για το ποσοστιαίο περιεχόμενο (%) και τη συγκέντρωση (g/l) των υδατανθράκων (CHS), των πρωτεϊνών (PRTNS), των λιπιδίων (LPDS), του αθροίσματος των περιεχομένων (TOTAL) και την ξηρή κυτταρική βιομάζα (DCW) του Stichococcus sp., για το σύνολο των πειραματικών χειρισμών κατά το σχεδιασμό Taguchi. # CHS CHS PRTNS PRTNS LPDS LPDS TOTAL TOTAL DCW (%) (g/l) (%) (g/l) (%) (g/l) (%) (g/l) (g/l) 1 24.32 0.224 18.28 0.169 13.94 0.129 56.54 0.522 0.923 2 30.31 0.327 12.78 0.138 1.88 0.020 44.97 0.486 1.080 3 27.44 0.522 9.40 0.179 7.74 0.147 44.57 0.849 1.904 4 38.78 0.383 7.41 0.073 20.10 0.198 66.29 0.654 0.987 5 29.88 0.828 5.32 0.148 3.00 0.083 38.19 1.059 2.773 6 40.08 1.041 14.96 0.389 12.59 0.327 67.63 1.757 2.597 7 41.08 0.281 20.12 0.138 14.26 0.098 75.47 0.516 0.684 8 30.02 1.083 11.24 0.405 6.85 0.247 48.12 1.735 3.606 9 30.88 0.634 3.55 0.073 9.74 0.200 44.17 0.907 2.054 10 21.01 0.396 6.28 0.118 2.02 0.038 29.31 0.552 1.884 11 37.94 0.356 11.43 0.107 9.90 0.093 59.27 0.557 0.939 12 24.82 0.674 4.85 0.132 8.98 0.244 38.65 1.050 2.717 13 27.50 0.979 3.81 0.136 5.50 0.196 36.81 1.310 3.560 14 28.35 1.178 8.68 0.361 1.60 0.067 38.63 1.605 4.155 15 22.00 0.553 3.79 0.095 2.39 0.060 28.18 0.708 2.512 16 20.73 0.328 13.47 0.213 12.19 0.193 46.39 0.733 1.581 17 24.26 0.846 2.03 0.071 1.94 0.068 28.23 0.984 3.486 18 17.06 0.435 6.17 0.157 4.61 0.118 27.85 0.711 2.552 Πίνακας 4. Συγκεντρωτικός πίνακας κατάταξης των πέντε παραμέτρων του πειραματικού σχεδιασμού και συγκεντρωτικών αποτελεσμάτων για τους βέλτιστους συνδυασμούς παραμέτρων που οδηγούν σε μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης των βιοϋλικών που παράγονται κατά την καλλιέργεια του Stichococcus sp. Παράγοντα ς Απόκρισης Φωτισμ ός (Lux) Aερισμό ς (l/min) CO 2 (l/min ) Άζωτο (g/l NaNo 3 ) Αλατότη τα (g/l NaCl) Κριτήριο Ξηρή Βιομάζα, 4 1 2 3 5 Κατάταξη

DCW 7200 0.1 0.025 0.75 35 Βέλτιστη Τιμή Πρωτεΐνες, 5 4 3 1 2 Κατάταξη PRTNS 3600 0.1 0.025 0.75 0.25 Βέλτιστη Τιμή Λιπίδια, 4 3 1 2 5 Κατάταξη LPDS 3600 0.1 0.050 0.75 17.5 Βέλτιστη Τιμή Υδατάνθρακες, 5 1 2 3 4 Κατάταξη CHS 7200 0.1 0.025 0.75 35 Βέλτιστη Τιμή Σε αρμονία με το προφίλ λειτουργίας ενός βιοδιυλιστηρίου, όπου το στέλεχος Stichococcus sp. χρησιμοποιείται ως πηγή βιομάζας, θα ήταν επιθυμητή η βέλτιστη συμπαραγωγή όλων των προϊόντων. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε μελέτη προσδιορισμού του βέλτιστου συνδυασμού των λειτουργικών πειραματικών με κριτήριο τη μεγιστοποίηση της τελικής συνολικής συγκέντρωσης όλων των βιοϋλικών. Οι βέλτιστες συνθήκες, όπως προκύπτουν από το Διάγραμμα Κύριων Επιδράσεων του Σχήματος 1, αντιστοιχούν σε φωτισμό ίσο με 3600 lux, αερισμό ίσο με 0.1 l/min, παροχή CO 2 ίση με 0.025 l/min, συγκέντρωση νιτρικού νατρίου ίση με 0.75 g/l και αλατότητα 0.25 g/l. Διεξαγωγή της καλλιέργειας για διάστημα 15 ημερών με το δεδομένο προφίλ λειτουργίας αναμένεται να έχει τις ακόλουθες αποδόσεις: τελική συγκέντρωση κυτταρικής βιομάζας ίση με 2.99 g/l και συνολικό περιεχόμενο βιοϋλικών 60.15%, το οποίο αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 1.80 g/l. Το συνολικό περιεχόμενο βιοϋλικών αναλύεται στα επιμέρους συστατικά ως εξής: 35.83% υδατάνθρακες (1.07 g/l), 13.50% πρωτεΐνες (0.40 g/l) και 10.67% λιπίδια (0.32 g/l). Συγκέντρωση Συνολικών Προϊόντων (g/l) 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 Επίπεδο Φωτισμός Αερισμός CO 2 Άζωτο Αλατότητα : 1 3600 0 0 0.06 0.25 : 2 7200 0.1 0.025 0.25 17.5 : 3 0.2 0.5 0.75 35 0.5 Φωτισμός Αερισμός CO2 Άζωτο Αλατότητα Σχήμα 1. Διάγραμμα Κύριων Επιδράσεων των πέντε μελετώμενων παραμέτρων για τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης του συνόλου των βιοϋλικών κατά την καλλιέργεια του Stichococcus sp. Ενδεικτικα, τα πειραματικά αποτελέσματα αυτής της μελέτης αντιπαραβάλλονται με αντίστοιχες μετρήσεις που αναφέρονται βιβλιογραφικά για την ανάπτυξης της βιομάζας σε καλλιέργεια μικροφυκών αναφορικά είτε με στελέχη της οικογένειας (Stichococcus), είτε με στέλεχη Chlorella vulgaris, που είναι είδος ευρέως μελετημένο. Παρατειρείται ότι τα μικροφύκη εμφανίζουν γενικά συντηρητικές τιμές κυτταρικής ανάπτυξης. Συγκεκριμένα οι Crofcheck et al. αναφέρουν για το στέλεχος Chlorella vulgaris ξηρή κυτταρική βιομάζα σε εύρος τιμών 0.5-3 g/l, όπου η διακύμανση των τιμών οφείλεται σε διαφορετική παροχή διοξειδίου του άνθρακα (2% και 20% αντίστοιχα) [3]. Για το ίδιο στέλεχος οι Ursu et al. αναφέρουν ποσοστιαίο περιεχόμενο πρωτεϊνών με εύρος από 10% έως 53% κ.β.[10].αντίστοιχα, στην παρούσα εργασία το μέγιστο τελικό πρωτεϊνικό περιεχόμενο που βρέθηκε από το στατιστική ανάλυση ήταν 11.24% κ.β. που αντιστοιχούσε σε συγκέντρωση πρωτεϊνών 0.41 g/l, ωστόσο σε στάδια ανάπτυξης της καλλιέργειας με επάρκεια της πηγής του αζώτου, το πρωτεϊνικό περιεχόμενο ξεπέρσε το 40%. Επιπρόσθετα οι Olivieri et al. αναφέρουν συγκέντρωση βιομάζας κατά την καλλιέργεια του Stichococcus bacillaris με τιμές ανάμεσα σε 4-5.1 g/l, αλλά για ημι-συνεχή λειτουργία [5]. Τελικός σκοπός της μελέτης, μετά την ανάλυση ευαισθησίας της καλλιέργειας στις επιλεγμένες λειτουργικές παραμέτρους, είναι ο προκαταρκτικός σχεδιασμός της κλιμάκωσης της διεργασίας από τις κωνικές φιάλες στο επίπεδο ενός φωτό-βιοαντιδραστήρα. Στο πλαίσιο αυτό, οι βέλτιστες συνθήκες που μεγιστοποιούν τη συγκέντρωση των συνολικών προϊόντων, εφαρμόστηκαν για τη διεξαγωγή καλλιέργειας του στελέχους Stichococcus sp. σε φωτό-βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας 5 λίτρων (Fermac 320, Electrolab). Κατά την κλιμάκωση της καλλιέργειας ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στα προφίλ ανάδευσης και φωτισμού του φωτό-

βιοαντιδραστήρα κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης. Η σημαντικότητα της συνδυαστικής δράσης αυτών των δύο παραμέτρων είναι ιδιαίτερα μεγάλη για τη σωστή ανάπτυξη των μικροφυκών [11], παρά το γεγονός ότι από τη μελέτη που προηγήθηκε σρ μιρκρότερη κλίμακα δεν διαφάνηκε η πλήρης της έκταση, καθώς στα πειράματα στις κωνικές φιάλες ο ρυθμός ανάδευσης και η ένταση του φωτός ήταν σε επάρκεια καθόλα τα στάδια ανάπτυξης της καλλιέργειας. Από την άλλη πλευρά, στο περιβάλλον ενός φωτό-βιοαντιδραστήρα, η εξασφάλιση της αναγκαίας έντασης φωτισμού για το σύνολο του όγκου της καλλιέργειας αποτελεί πιο απαιτητικό εγχείρημα. Η μεταφορά του προφίλ φωτισμού με τρόπο ώστε να είναι επαρκής σε κάθε χρονική στιγμή της καλλιέργειας είναι πολύ κρίσιμη για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που καταγράφηκαν σε μικρότερη κλίμακα. Το δυναμικό προφίλ της πορείας ανάπτυξης της καλλιέργειας και της συσσώρευσης των προϊόντων παρουσιάζεται σε σχέση με τις τιμές της συγκέντρωσης των βιοϋλικών στο Σχήμα 2 και σε σχέση με τις τιμές του ποσοστιαίου περιεχομένου στο Σχήμα 3. Τα αποτελέσματα του βιοαντιδραστήρα παρουσιάζονται για διάστημα 15 ημερών καλλιέργειας, κατά αναλογία με τα πειράματα στις κωνικές φιάλες. Αξίζει να σημειωθεί ότι καταγράφηκαν τιμές ελάχιστα αυξημένες από τις κωνικές φιάλες. Συγκεκριμένα, η βιομάζα αυξήθηκε στην τιμή 3.15 g/l (από 2.99 g/l), λόγω πιθανά καλύτερης εφαρμογής του προφίλ αερισμού και της παροχής CO 2 στο κλειστό περιβάλλον του φωτό-βιοαντιδραστήρα. Η συγκέντρωση των λιπιδίων παρουσίασε ελάχιστη μείωση, για την οποία δεν έχει διευκρινιστεί η προέλευση της, ενώ συνολικά η καλλιέργεια στο βιοαντιδραστήρα κρίθηκε ότι εξελίχθηκε πολύ κοντά στο προφίλ λειτουργίας των κωνικών φιαλών, υποδεικνύοντας την επίτευξης μια ικανοποιητικής κλιμάκωσης της διεργασίας. Συγκέντρωση (g/l) 3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 Βιομάζα Υδατάνθρακες Πρωτεΐνες Λιπίδια Συνολικά 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Χρόνος (days) Σχήμα 2. Δυναμικό προφίλ των συγκεντρώσεων βιομάζας και βιοπροϊόντων κατά την καλλιέργεια του Stichococcus sp. υπό βέλτιστες συνθήκες, σε φωτό-βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας.

100 90 80 Υδατάνθρακες Πρωτεΐνες Λιπίδια Συνολικά Περιεχόμενο (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Χρόνος (days) Σχήμα 3. Δυναμικό προφίλ του ποσοστιαίου περιεχομένου βιοπροϊόντων κατά την καλλιέργεια του Stichococcus sp. υπό βέλτιστες συνθήκες, σε φωτό-βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η χρήση βιομάζας μικροφυκών στο πλαίσιο της λειτουργίας ενός βιοδιυλιστηρίου, όπου επιδιώκεται αξιοποίηση όλων των κλασμάτων της βιομάζας, προϋποθέτει ικανοποιητική και ελεγχόμενη συμπαραγωγή των περιεχόμενων ενδοκυττάριων προϊόντων. Στην παρούσα μελέτη έγινε προσέγγιση του συγκεκριμένου στόχου σε δύο στάδια. Αρχικά αναγνωρίσθηκαν οι σημαντικότερες λειτουργικές παράμετροι της διεργασίας καλλιέργειας μικροφυκών και πραγματοποιήθηκε ανάλυση ευαισθησίας της καλλιέργειας στις παραμέτρους αυτές, με συγκεκριμένα κριτήρια απόδοσης και παραγωγικότητας που αφορούν τα τρία πιο σημαντικά ενδοκυττάρια συστατικά, τους υδατάνθρακες, τις πρωτεΐνες και τα λιπίδια. Η ανάλυση αυτή εφαρμόστηκε για το θαλάσσιο στέλεχος μικροφυκών Stichococcus sp. Διαπιστώθηκε ότι η παραγωγή υδατανθράκων κατά την καλλιέργεια του συγκεκριμένου στελέχους ευνοείται από το ίδιο προφίλ των λειτουργικών παραμέτρων που ευνοεί και την αύξηση της κυτταρικής βιομάζας, με κρίσιμες παραμέτρους το ρυθμό αερισμού της καλλιέργειας και την παροχή CO 2. Για τις πρωτεΐνες βρέθηκε ότι η παραγωγή τους προϋποθέτει τη συνεχή διαθεσιμότητα πηγής αζώτου σε μέσο ανάπτυξης με χαμηλή αλατότητα. Η εξάντληση του αζώτου σημαίνει και την άμεση διακοπή της παραγωγή τους, ενώ εντείνεται η παραγωγή των υδατανθράκων αυξάνοντας την εκλεκτικότητα του μεταβολισμού του προσλαμβανόμενου CO 2 προς το προϊόν αυτό. Από την άλλη πλευρά, η παραγωγή των λιπιδίων φαίνεται να ευνοείται από την παρουσία πηγής αζώτου στο μέσο ανάπτυξης ενώ καθοριστικής σημασίας είναι η υψηλή παροχή CO 2 στο μέσο ανάπτυξης. Η συνεισφορά του αζώτου είναι έμμεση και εκδηλώνεται μέσω της ευνοϊκής της δράσης για την αύξηση της ξηρής βιομάζας. Γενικότερα, ο ρόλος του φωτισμού για το σύνολο των προϊόντων είναι καθοριστικός και φαίνεται να είναι η παράμετρος που ρυθμίζει αν θα ενταθεί η παραγωγή των υδατανθράκων ή των λιπιδίων, μετά την παύση της παραγωγής των πρωτεϊνών. Στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιήθηκε μελέτη της δυνατότητας κλιμάκωσης της καλλιέργειας του Stichococcus sp. σε εργαστηριακό φωτό-βιοαντιδραστήρα. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκε η πληροφορία και η κατανόηση που αναπτύχθηκε για το ρόλο των καθοριστικών λειτουργικών παραμέτρων της καλλιέργειας μέσα από τη στατιστική επεξεργασία ενός σημαντικού εύρους πειραματικών δεδομένων. Το βέλτιστο λειτουργικό προφίλ της καλλιέργειας αναπαρήχθη ικανοποιητικά στον εργαστηριακό φωτό-βιοαντιδραστήρα καταδεικνύοντας τις κρίσιμες παραμέτρους και την κατάλληλη στρατηγική για τη μεγέθυνση της διεργασίας, χτίζοντας έτσι την προοπτική για προοδευτική κλιμάκωση σε πιλοτικό και τελικά σε βιομηχανικό επίπεδο. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού έργου «Αειφόρος Παραγωγή Βιοκαυσίμων και Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας Βιοχημικών Προϊόντων με Χρήση Μικροφυκών - [MICROLAGAE-BIO- PRODUCTS]», χρηματοδοτούμενο από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ), Εθνικό Στρατηγικό Πλαίσιο Αναφοράς (ΕΣΠΑ) 2007-2013, ΕΠ Ανταγωνιστικότητα & Επιχειρηματικότητα (ΕΠΑΝ ΙΙ). Οι συγγραφείς εκφράζουν θερμές ευχαριστίες προς το Εργαστήριο Βιοχημικής Μηχανικής & Περιβαλλοντικής Βιοτεχνολογίας του Τμήματος Μηχανικών Περιβάλλοντος του Πολυτεχνείου Κρήτης για την προσφορά του στελέχους μικροφυκών Stichococcus sp.

ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΕΝΩΣΗ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΤΑΜΕΙΟ ΠΕΡΙΦΕΡΕΙΑΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων, Πολιτισμού και Αθλητισμού ΓΓΕΤ ΕΥΔΕ-ΕΤΑΚ Ε. Π. Ανταγωνιστικότητα και Επιχειρηματικότητα (ΕΠΑΝ ΙΙ), ΠΕΠ Μακεδονίας Θράκης, ΠΕΠ Κρήτης και Νήσων Αιγαίου, ΠΕΠ Θεσσαλίας Στερεάς Ελλάδας Ηπείρου, ΠΕΠ Αττικής ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Gonzalez-Delgado A.-D. and Kafarov V., J. Ciencia Technol. Futur., 4:27 (2011). [2]. Sayre R., BioScience. 60:722 (2010). [3]. Crofcheck C., E. X., Shea A., Montross M., Crocker M., Andrews R., J. Biochem. Tech. 4:589 (2012). [4]. Moazami-Goudarzi M. and Colman B., Plant, Cell and Environment. 34:1465 (2011). [5]. Olivieri G., Gargano I., Andreozzi R., Marotta, R., Marzocchella A., Pinto G., Pollio A., Biochem. Eng. J. 74:8 (2013). [6]. Olivieri G., Gargano I., Andreozzi R., Marotta R., Marzocchella A., Pinto G., Pollio A., Chemic. Eng. Transactions 27:127 (2012). [7]. Gerde J.A., Wang T., Yao L., Jung S., Johnson L.A., lamsal B., Algal Research. 2:145 (2013). [8]. Folch J., Lees M., Stanley S.H., Isolation of total tissue lipids. p.497 (1956). [9]. Kochert A.G., Handbook of Phycological Methods:Physiological and Biochemical Methods, Cambridge University Press. p.95 (1978). [10]. Ursu A.V., Marcati A., Sayd T., Sante-Lhoutellier V., Djelveh G., Michaud P., Bior. Technol. 157:134 (2014). [11]. Kim J., Lam, S.M.N. & Kim, K.Y., Αlgae, 28:355 (2013).