3. Εκτίµηση της ποσότητας DNA στους πυρήνες των κυττάρων

3. Εκτίµηση της ποσότητας DNA στους πυρήνες των κυττάρων 3.1 Ποσότητα DNA Τα µεγέθη των γενωµάτων των φυτικών ειδών µελετώνται τα τελευταία 50 χρόνια και τα δεδοµένα είναι καταγεγραµµένα σε βάσεις δεδοµένων. Οι τεχνικές που χρησιµοποιούνται για την µέτρηση τους είναι η χρώση Feulgen των πυρήνων µε ανάλυση απεικόνισης και η κυτταροµετρία ροής. Η ποσότητα του DNA στο απλοειδές γένωµα είναι χαρακτηριστική για κάθε οργανισµό και λέγεται τιµή C. Μονάδα µέτρησης είναι το pg= 965 Mb (M=10 6 ζεύγη νουκλεοτιδικών βάσεων). Η ποσότητα του DNA που περιέχεται σε ένα κυταρικο πυρήνα δεν παραµένει σταθερή αλλά µεταβάλλεται ανάλογα µε τη φάση ή το στάδιο του κυτταρικού κύκλου. Στο τέλος της µείωσης όταν έχουν δηµιουργηθεί οι γαµέτες η ποσότητα του DNA που περιέχεται στον πυρήνα είναι 1C µετά την γονιµοποίηση που δηµιουργείται ο ζυγώτης είναι 2C. Στην G1 φάση η ποσότητα 2C, στην S φάση µεταβάλλεται σε 4C, στην G2 φάση παραµένει 4C και κατά την διάρκεια των µιτωτικών διαιρέσεων από 4C γίνεται 2C. Στην µείωση κατά την ανάφαση Ι που γίνεται ο χωρισµός των χρωµατίδων από 2C γίνεται 1C. 1C είναι η ποσότητα του απλοειδούς γονιδιώµατος. Μαυροµατης Εικόνα 14 Ποσότητα DNA στον πυρήνα κατά την µείωση και την µίτωση 3.2 Παραλλακτικότητα DNA ποσότητας Οι τιµές C δείχνουν ότι οι σηµαντικές διαφορές στην ποσότητα του DNA του γενωµατος είναι υπαρκτές µεταξύ γενών και ειδών, παρόλο που υπάρχουν πολλές 1

οµοιότητες και πολύ µικρή διαφοροποίηση στις λειτουργίες. Αυτό το φαινόµενο ονοµάζεται παράδοξο της τιµής C. Εικόνα 15 Ποσότητα DNA του πυρήνα στα γένη Musa και Glycine Είναι γνωστό ότι ενώ υπάρχει θετική συσχέτιση µεταξύ του αριθµού των γονιδίων και της κατασκευαστικής πολυπλοκότητας των οργανισµών δεν υπάρχει αντιστοιχία της πολυπλοκότητας µε το µέγεθος του γονιδιώµατος. Έτσι µεγάλο γονιδίωµα δεν αντιστοιχεί απαραίτητα σε πολύπλοκο οργανισµό. Σήµερα έχει βρεθεί ότι το µεγαλύτερο µέρος του DNA των ευκαριωτικών οργανισµών δεν είναι λειτουργικό και µπορεί να διαφέρει σε ποσοστό από ειδος σε ειδος χωρίς να επηρεάζει ενεργά γονίδια. Υπολογίζεται ότι για κάθε οργανισµό το 30 έως το 90 % του συνολικού DNA είναι µη λειτουργικό. Έχει επίσης βρεθεί ότι η ποσότητα του DNA σχετίζεται µε τον βαθµό πλοειδίας. Η ποσότητα του DNA είναι συνήθως υψηλότερη στα γυµνόσπερµα από ότι στα ξυλώδη αγγειόσπερµα. Οι υψηλότερες τιµές βρέθηκαν στα είδη Pinus και Cycads. Ο Benett δηµιούργησε κάποιους κανόνες µετά από ανάλυση σε 271 αγγειόσπερµα. Τα ετήσια είδη έχουν κατά µέσο όρο σηµαντικά λιγότερο DNA σε σχέση µε τα πολυετή είδη. Ισχύει για µονοκοτυλήδονα και δικοτυλήδονα. Τα διπλοειδή ετήσια είδη εµφανίζουν πολύ µικρή παραλλακτικότητα στην ποσότητα του DNA ενώ τα πολυετή που πολλά από τα οποία είναι πολυπλοειδή εµφανίζουν µεγάλη παραλλακτικότητα. 2

Τα εφήµερα ετήσια είδη έχουν κατά µέσο όρο λιγότερο DNA από ότι τα ετήσια µε µη εφήµερα άνθη. Το περιεχόµενο σε DNA των υποχρεωτικά πολυετών µονοκοτυλήδονων είναι σηµαντικά υψηλότερο από µη υποχρεωτικά πολυετών. εν υπάρχουν διαφορές µεταξύ των ετήσιων και των µη υποχρεωτικά πολυετών. Αυτοί οι συσχετισµοί οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι η ποσότητα του DNA των φυτών σχετίζεται µε την διάρκεια της ανάπτυξης. Τα ετήσια είδη αναπτύσσονται συνήθως πολύ γρήγορα, οι κύκλοι της µίτωσης ακολουθούν ο ένας τον άλλον πολύ γρήγορα και η µείωση είναι σύντοµη. Αυτές οι συνθήκες µπορούν να πραγµατοποιηθούν µόνο µε µικρή ποσότητα DNA στους πυρήνες. Είδη µε πολύ DNA είναι για αυτό υποχρεωτικά πολυετή σε περιοχές µε µικρή διάρκεια στη βλάστηση. Παρόλα αυτά ένας πολυετής κύκλος ζωής δεν προκαλεί απαραίτητα µεγάλες ποσότητες DNA. Κάποια πολυετή περιέχουν µικρή ποσότητα DNA. Το 1985 ο Grime απέδειξε ξανά ότι η ποσότητα του DNA και ο αριθµός των πληροφοριών που περιεχόταν στο γενωµα είναι ανεξάρτητες και ότι η ποσότητα του DNA σχετίζεται µε την δηµιουργία ριζών και την ανάπτυξη των φύλλων. Όλα τα εαρινά φυτά στην Αγγλία χαρακτηρίζονται από µεγάλη ποσότητα DNA και έντονη ανάπτυξη φύλλων που αρχικά βασίζεται στην επιµήκυνση των ήδη υπαρχόντων ιστών. Συνέπεια αυτού είναι τα είδη αυτά να έχουν ένα οικολογικό πλεονέκτηµα ακόµη και σε κρύες εποχές. Είδη µε µικρή ποσότητα DNA έχουν άλλον συγχρονισµό. Η ανάπτυξη τους σαν συνέπεια της κυτταρικής διαίρεσης, πραγµατοποιείται αργότερα, σε περισσότερο ευνοϊκές συνθήκες και η επιµήκυνση τους δεν παίζει τον πρωταρχικό ρόλο που έχει στα εαρινά είδη φυτών. Πηγή 5 Peter v. Sengbusch, Botany online: Cytophotometric analysis of the DNA of nucleus Για να αναλυθούν οι αλληλουχίες του DNA και να ερευνηθεί το παράδοξο της τιµής C µελετήθηκε η κινητική επανασύνδεσης των DNA µορίων στους ευκαριωτικούς οργανισµούς µε την εξής διαδικασία : Σπάσιµο του DNA σε κοµµάτια των 800 έως 1200 βάσεων Αποδιάταξης του DNA Επανασύνδεση του DNA 3

Ο ρυθµός επανασύνδεσης εξαρτάται από την συγκέντρωση του DNA και τον χρόνο και εκφράζεται σαν τιµή Cοt. Το επανασυνδεδεµένο DNA σε σχέση µε την λογαριθµική τιµή Cοt δηµιουργούν µια καµπύλη ενός γραφήµατος στο οποίο παρατηρούµε την επανασύνδεση διάφορων αλληλουχιών του DNA σε σχέση µε τον χρόνο. Μαυροµατης 4. Μέθοδος κυτταροµετριά ροής 4.1 Κυτταροµετριά ροής Από το πρώτο µισό του προηγούµενου αιώνα, οι επιστήµονες είχαν εργαστεί πάνω στην πιστοποίηση ή τον προσδιορισµό της ποσότητας κυττάρων στα συστήµατα των µικροσκοπίων, που συνήθως είναι βασισµένη σε µετρήσεις απορρόφησης ή µετάδοσης. Στις αρχές της δεκαετίας του '50, οι τεχνικές που αναπτύχθηκαν επιτάχυναν αυτές τις µετρήσεις και προσάρµοσαν τη µικροσκόπηση για να αναλύσουν αυτόµατα τα κύτταρα σε ροή. Αυτές οι τεχνικές θα γινόντουσαν αργότερα γνωστές ως κυτταροµετρια ροής. elab - European Laboratory Scientist magazine.htm Η κυτταροµετρία ροής είναι µια τεχνική που χρησιµοποιείται για αρίθµηση, εξέταση και εύρεση µικροσκοπικών µορίων που αιωρούνται σε ρεύµα κάποιου υγρού. Επιτρέπει την ταυτόχρονη παραµετρική ανάλυση φυσικών και χηµικών χαρακτηριστικών κυττάρων που ρέουν σε έναν οπτικό η ηλεκτρονικό ανιχνευτή. Wikipedia Μέσα στα τελευταία δεκαπέντε έτη το ενδιαφέρον για να χρησιµοποιηθεί η κυτταροµετρία ροής για τον προσδιορισµό της ποσότητας του DNA του πυρήνα των φυτών συνεχώς αυξανόταν. Οι προηγούµενες χρησιµοποιηµένες συµβατικοί µέθοδοι υπολογισµού χρωµοσωµάτων αντικαταστώνται όλο και περισσότερο από τις τεχνικές του κυτταροµετρητή ροής. Η ανάλυση του DNA των φυτών έγινε σηµαντικά γρηγορότερη, ακριβέστερη και καταλληλότερη µε την χρήση των κυτταρόµετρων ροής υιοθετώντας τη χρώση φθορισµού των πυρήνων των φυτών. Εκτός από τη χρήση στην εφαρµοσµένη και βασική έρευνα αποδείχθηκε εξαιρετικά χρήσιµο στις πολυάριθµες εφαρµογές στην βελτίωση των φυτών. Αυτό οφείλεται στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του από την άποψη της ταχύτητας και της ακρίβειας και άνοιξε νέες ερευνητικές και βελτιωτικές προοπτικές που επιτρέπουν 4

την ανάλυση του πυρηνικού DNA εκατοντάδων δειγµάτων µέσα σε σύντοµο χρόνο µε ελάχιστο εργατικοδυναµικό. www.partec.de/partec/flowcytometry6.html Η κυτταροµετρια ροής είναι µια ισχυρή τεχνική µε την οποία αναλύονται µεγάλοι πληθυσµοί µεµονωµένων κυττάρων. Ο µηχανισµός περιλαµβάνει την είσοδο των µεµονωµένων κυττάρων διάµεσου της πορείας µιας ακτίνας λέιζερ. Το φως που διασκορπίζεται από κάθε κύτταρο µπορεί να παράγει πληροφορίες σχετικές µε το µέγεθος και την πυκνότητα των κυττάρων. Επιπλέον, τα κύτταρα µπορούν να µαρκαριστούν µε χρωστικές φθορισµού εξειδικευµένες για τις δοµές (π.χ. DNA) ή τις φυσιολογικές συνθήκες (π.χ. ph). Ο φθορισµός που προκύπτει από τα κύτταρα µπορεί να καταγραφεί ψηφιακά και να ποσοτικοποιηθεί. Το κυτταροµετρο ροής που χρησιµοποιείται για αυτήν την έρευνα είναι σε θέση να ταξινοµήσει τα κύτταρα που κατέχουν καθορισµένα ως προς τον χρήστη γνωρίσµατα. Τα ταξινοµηµένα κύτταρα µπορούν να εξεταστούν περαιτέρω µικροσκοπικά, ή να επιστρέψουν πίσω στην καλλιέργεια για µετέπειτα αναλύσεις. www.plant.uoguelph.ca/research/plantbio/techn.htm Εικόνα 16 Αρχή κυτταροµετρίας ροής Η χρώση του DNA γίνεται µε ουσίες φθορισµού του DNA όπως το DAPI, τις χρωστικές ουσίες Hoechst, το ιωδιούχο προπίδιο και πολλά άλλα. επειδή το DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) αποδεικνύεται καλύτερο για τη χρώση του DNA χρησιµοποιειται στο µεγαλύτερο µέρος των εφαρµογών. Το DAPI συνδυάζει γρήγορη και εύκολη χρώση των δειγµάτων όσον αφορά την χρώση µε υψηλά αποτελέσµατα και µε χαµηλό κόστος. Επιπλέον, επειδή είναι ακίνδυνο, ο χειρισµός του είναι ευκολότερος και καταλληλότερος σε σχέση µε το χειρισµό άλλων χρωστικών ουσιών του DNA. Εφ' όσον µας ενδιαφέρει η περιεκτικότητα σε DNA των φυτών µέσα στην 5

ίδια ταξινοµική οικογένεια, η εξειδίκευση του Α-Τ DAPI δεν προκαλεί τα λάθη πλοειδιας. Αποτέλεσµα της µακροχρόνιας εµπειρίας στην ανάλυση του DNA των φυτών είναι η ύπαρξη πολλών χρωστικών για την ανάλυση πλοειδιας, την ανάλυση DNA υψηλής ακρίβειας και για τον απόλυτο προσδιορισµό του µεγέθους γονιδιώµατος. Εικόνα 17 Σύγκριση της ποσότητας του πυρήνα σε DNA µε διάφορες χρωστικές Οποιοδήποτε µέρος των φυτών περιέχει πυρήνες, όπως τα σπορόφυτα, οι ρίζες, τα λουλούδια ή οι σπόροι µπορούν να χρησιµοποιηθούν. Το πολύ συχνά αναλυθέν υλικό είναι ιστός φύλλων. Εντούτοις, για συγκεκριµένες εφαρµογές πρέπει να χρησιµοποιηθούν συγκεκριµένοι ιστοί όπως µικροσπόρια ή γύρη, έµβρυα και ενδοσπέρµιο ή πρωτοπλάστες. Με όλα τα είδη υλικού η διαδικασία προετοιµασιών είναι βασισµένη στην εξαγωγή άθικτων πυρήνων και έπειτα ακολουθεί ο φθορισµού τους. www.partec.de/partec/flowcytometry6.html Κατά τη µέτρηση της ποσότητας του DNA του πυρήνα πρέπει να λαµβάνονται υπόψη τα παρακάτω µέτρα : Σαφή χρώση µόνο του DNA του πυρήνα. Η χρώση Feulgen αποδείχθηκε ιδιαίτερα χρήσιµη για αυτό το σκοπό. Οι τυποποιηµένες συνθήκες της τεχνικής (ελεγχόµενη θερµοκρασία, κατάλληλη συγκέντρωση των αντιδραστηρίων, διάρκεια φθορισµού και υδρόλυσης) είναι σηµαντικό να ακολουθούνται ακριβώς. Η χρώση παρόλο που µπορεί να γίνει µε ακρίβεια, δεν παράγει ποτέ απόλυτα, τα αναµενόµενα αποτελέσµατα στα πειράµατα. Το ποσοστό του σφάλµατος είναι πολύ υψηλό. Τα αποτελέσµατα κάθε µέτρησης θα πρέπει εποµένως να συγκρίνονται µε κάποιο πρότυπο. Συνήθως, οι διπλοειδείς πυρήνες της άκρης της ρίζας του είδους 6

allium cepa που περιέχει 33,5 PG DNA [1pg = 1 picogram = 10-12 γ] χρησιµοποιούνται σαν πρότυπο. Η επιλογή των πυρήνων θα πρέπει να γίνεται µε τη µεγάλη προσοχή, δεδοµένου ότι η πολυπλοειδία είναι πολύ συχνή κατά τη διάρκεια της οργανογένεσης και της διαφοροποίησης των ιστών καθώς και το ποσοστό των διπλασιασµών του DNA κατά τη διάρκεια της φάσης S του κύκλου των κυττάρων. Για αυτό συνήθως οι πυρήνες αναλύονται στην τελόφαση των µεριστωµατικών ιστών. Πηγή 5 Peter v. Sengbusch, Botany online: Cytophotometric analysis of the DNA of nucleus 4.2 Κυτταροµετρητής ροής (Flow cytometry) Τα πρώτα κυτταροµετρα ροής ήταν γενικά πειραµατικές συσκευές. Τα σύγχρονα όργανα έχουν συνήθως πολλά λέιζερ και ανιχνευτές φθορισµού (συνήθως ένα εµπορικό όργανο έχει 4 λέιζερ και 18 ανιχνευτές φθορισµού). Η αύξηση του αριθµού των λέιζερ και ανιχνευτών επιτρέπει το πολλαπλάσιο µαρκάρισµα των δειγµάτων, και µπορεί να προσδιορίσει ακριβέστερα έναν πληθυσµό στόχο από το φαινότυπό τους. Ορισµένα όργανα µπορούν να πάρουν ακόµη και ψηφιακές εικόνες µεµονωµένων κυττάρων, που επιτρέπουν την ανάλυση των θέσεων των σηµάτων φθορισµού µέσα ή στην επιφάνεια των κυττάρων. Τα στοιχεία που παράγονται από τα κυτταροµετρα ροής µπορούν να σχεδιαστούν σε µια διάσταση, για να παράγουν ιστόγραµµα, ή σε δύο διαστάσεις ή ακόµα και σε τρεις διαστάσεις. Οι περιοχές σε αυτά τα διαγράµµατα µπορούν να χωριστούν διαδοχικά, βασισµένες στην ένταση του φθορισµού, δηµιουργώντας µια σειρά υποσύνολα αποµόνωσης, που καλούνται "πύλες". Τα συγκεκριµένα πρωτόκολλα υπάρχουν για διαγνωστικούς και κλινικούς λόγους ειδικά σε σχέση µε την αιµατολογία. Τα διαγράµµατα γίνονται συχνά σε λογαριθµικές κλίµακες. Επειδή τα φάσµατα εκποµπής των διαφορετικών χρωστικών ουσιών φθορισµού επικαλύπτονται, τα σήµατα στους ανιχνευτές πρέπει να αντισταθµιστούν ηλεκτρονικά καθώς επίσης και υπολογιστικά. Wikipedia Τα κυτταρόµετρα ροής είναι σε θέση να αναλύσουν αρκετές χιλιάδες µόρια κάθε δευτερόλεπτο, σε "πραγµατικό χρόνο", και µπορούν ενεργά να χωρίσουν και να αποµονώσουν τα µόρια διευκρινίζοντας τις ιδιότητες τους. Ένα κυτταρόµετρο ροής είναι παρόµοιο µε ένα µικροσκόπιο, εκτός από το ότι αντί να παράγει µια εικόνα του 7

κυττάρου, το κυτταρόµετρο ροής µπορεί µετά από καθορισµό των παραµέτρων (για µεγάλο αριθµό κυττάρων) να προσδιορίσει την ποσότητα των κυττάρων αυτόµατα. Για να αναλύσει στερεά αποµονωµένα κύτταρα πρέπει πρώτα να προετοιµαστούν κατάλληλα. Wikipedia Το δείγµα του ιστού χωρίζεται στα κύτταρα του και κρατιέται σε έναν δοκιµαστικό σωλήνα, ο οποίος τοποθετείται στο κυτταροµετρο ροής. Το υγρό που περιέχεται στα κύτταρα του δοκιµαστικού σωλήνα αντλείται από το θάλαµο ροής. Τα µόρια στο ρεύµα ροής διασκορπίζουν το φως. Ταυτόχρονα, εάν τα µόρια έχουν προηγουµένως δεχτεί χρώση µε χρωστική ουσία φθορισµού µε την απορρόφηση του φωτός, εµφανίζεται εκποµπή φθορισµού στο δείγµα. Μερικά µόρια µπορεί να περιέχουν φυσικές χρωστικές (π.χ. χλωροφύλλη) που επάνω στη διέγερση φθορίζονται. Ο διεσπαρµένος εκπεµπόµενος φθορισµός συλλέγεται από το φακό πίσω από τον οποίο τοποθετηθούνται τα οπτικά φίλτρα. Αυτά χρησιµοποιούνται για να εµποδίσουν το µήκος κύµατος της διέγερσης για τη µέτρηση φθορισµού και, εάν είναι απαραίτητο, για να εµποδίσουν την εκποµπή φθορισµού κατά την ταυτόχρονη µέτρηση δύο ή περισσότερων χρωστικών ουσιών φθορισµού. Οι ανιχνευτές (συνήθως σωλήνες πολλαπλασιαστών φωτός) µετατρέπουν τα φωτεινά σήµατα σε ηλεκτρικά, τα οποία ενισχύονται από έναν γραµµικό ή λογαριθµικό ενισχυτή. Μετά από την ενίσχυση, το ηλεκτρονικό σήµα µεταλλάσσεται για περαιτέρω επεξεργασία και αποθήκευση σε υπολογιστές. Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης παρουσιάζονται συνήθως υπό µορφή ιστογράµµου το οποίο απεικονίζει την ένταση του φθορισµού µεταξύ των µορίων στο δείγµα. www.ueb.cas.cz Ένα χαρακτηριστικό κυτταροµετρο ροής αποτελείται από διάφορα βασικά µέρη : µια πηγή φωτός, ένα οπτικό σώµα, ανιχνευτές φωτός και επεξεργαστές που µετατρέπουν τα φωτεινά σήµατα σε ηλεκτρικό αναλογικό σήµα, µε αναλογικούς ψηφιακούς µετατροπείς, και ένα σύστηµα ηλεκτρονικών υπολογιστών για την ανάλυση και την αποθήκευση των ψηφιοποιηµένων δεδοµένων. 8

Εικόνα 19 Σχηµατική εικόνα ενός κυτταρόµετρου ροής µε µια πηγή φωτός και δυο ανιχνευτές www.ueb.cas.cz Θάλαµος ροής ή χώρος ροής (ακροφύσιο) είναι η καρδιά ενός κυτταρόµετρου ροής. Τα µεµονωµένα µόρια διέρχονται από το ακροφύσιο σε ένα περιβάλλον ρευστού υγρού που κινείται µε µεγαλύτερη ταχύτητα. Η προκύπτουσα επιτάχυνση στο στόµιο αναγκάζει τα µόρια να κατευθύνονται ένα στην κέντρο του ρευστού που υπάρχει στο χώρο ροής. Αυτή η διαδικασία καλείται υδροδυναµική εστίαση. Οι χαρακτηριστικές διάµετροι στοµίων ποικίλουν από 50-100 µm, µε συνέπεια να δηµιουργούν ταχύτητες µεταξύ 1-10 m/s. Τα µόρια µέσα στο ρεύµα κατόπιν διαπερνούνται από την εστίαση µιας έντονης ακτίνας φωτός και εκτιµώνται. www.ueb.cas.cz Τα κύτταρα διατρέχουν το θάλαµο ροής ένα πολύ γρήγορα, περίπου 10.000 κύτταρα σε 20 δευτερόλεπτα ή 500 κύτταρα ανά δευτερόλεπτο. Αυτή η δυναµική κίνηση παρουσιάζει τα κύτταρα που κινούνται σε αργή κίνηση. 9

Εικόνα 20 Θάλαµος ροής www.ueb.cas.cz Λέιζερ - µια µικρή ακτίνα λέιζερ δυνατού φωτός χτυπά τα κύτταρα καθώς περνούν µέσω του θαλάµου ροής. Ο τρόπος που το φως αντανακλάται από κάθε κύτταρο δίνει τις πληροφορίες για τα φυσικά χαρακτηριστικά του κυττάρου. Το φως που αντανακλάται µακριά στις µικρές γωνίες καλείται µπροστινή διασπορά. Το φως που αντανακλάται µακριά σε άλλες κατευθύνσεις καλείται πλευρική διάχυση Εικόνα 21 Λέιζερ Ανιχνευτής φωτός - ο ανιχνευτής φωτός επεξεργάζεται τα φωτεινά σήµατα και στέλνει τις πληροφορίες στον υπολογιστή. Η µπροστινή διασπορά δηλώνει το µέγεθος του κυττάρου. Η πλευρική διάχυση δηλώνει εάν το κύτταρο περιέχει µικρά τεµάχια (granules). Κάθε τύπος κυττάρου στο ανοσοποιητικό σύστηµα έχει έναν µοναδικό συνδυασµό µετρήσεων µπροστινής και πλευρικής διάχυσης, που επιτρέπουν την µέτρηση του αριθµού κάθε τύπου κυττάρου. Φίλτρα - τα φίλτρα κατευθύνουν το φως που εκπέµπεται από τις χρωστικές φθορισµού στους ανιχνευτές χρώµατος. Ανιχνευτές χρώµατος - καθώς τα κύτταρα περνούν µέσω του λέιζερ, οι χρωστικές φθορισµού που συνδέονται µε τα κύτταρα απορροφούν το φως και 10

εκπέµπουν έπειτα ένα συγκεκριµένο χρώµα φωτός ανάλογα µε τον τύπο της χρωστικής. Οι χρωστικές στα κύτταρα ενεργούν σαν κωδικός καθώς περνούν από τον ανιχνευτή. Σε αυτήν την περίπτωση, υπάρχουν δύο τύποι δεικτών φθορισµού : κίτρινος και πράσινος. Οποιοδήποτε κύτταρο µπορεί να έχει το ένα, και τα δύο ή κανέναν από τους δείκτες στην επιφάνειά του. Οι ανιχνευτές χρώµατος συλλέγουν τα διαφορετικά χρώµατα του φωτός που εκπέµπονται από τις χρωστικές φθορισµού. Το σήµα των χρωστικών στέλνεται στον υπολογιστή. Υπολογιστής - τα στοιχεία από τον ανιχνευτή φωτός και τους ανιχνευτές χρώµατος στέλνεται σε έναν υπολογιστή και σχεδιάζεται µια γραφική παράσταση http : // www.ehsc.edu/ How does a flow cytometer work? 4.3 Εφαρµογές Ο όγκος και η µορφολογική πολυπλοκότητα των κυττάρων. Οι χρωστικές ουσίες κυττάρων όπως η χλωροφύλλη ή η φυκοερυθρίνη. Το DNA (ανάλυση κυτταρικών κύκλων, πολλαπλασιασµός κινητικών κυττάρων). Το RNA. Η ανάλυση των χρωµοσωµάτων και η ταξινόµηση τους (κατασκευή βιβλιοθηκών, χρώση χρωµοσωµάτων). Η πρωτεϊνική έκφραση και ο εντοπισµός τους. Τα διαγενετικά προϊόντα in vivo, ιδιαίτερα οι πράσινες πρωτεΐνες φθορισµού ή σχετικές πρωτεΐνες φθορισµού. Τα ενδοκυτταρικά αντιγόνα (διάφορες κυτοκινίνες, δευτερογενείς µεταβολίτες). Τα αντιγόνα του πυρήνα. Η ενζυµατική δραστηριότητα. Το PH, το ενδοκυτταρικά ιονισµένο ασβέστιο, το µαγνήσιο και την πιθανή ρευστότητα των µεµβρανών. Την απόπτωση (προσδιορισµός της ποσότητας, µέτρηση της υποβάθµισης του DNA, το δυναµικό των µιτοχονδριακών µεµβρανών, αλλαγές της διαπερατότητας). Την βιωσιµότητα των κυττάρων. 11

Τον έλεγχο της διαπερατότητας των κυττάρων. 4.3.1 Εφαρµογή της κυτταροµετρίας ροής στα φυτικά είδη Το δείγµα που αναλύεται µε κυτταροµετρια ροής πρέπει να είναι υπό µορφή µεµονωµένων µορίων. εδοµένου ότι τα φυτά είναι σύνθετοι οργανισµοί, πρέπει να αναπτυχθούν µέθοδοι για προετοιµασία άθικτων κυττάρων και οργανιδίων. Οι φυτικοί πρωτοπλάστες, οι αποµονωµένοι πυρήνες και τα χρωµοσώµατα µπορούν να αναλυθούν: Ανάλυση φυτικών πρωτοπλαστών Μέγεθος πρωτοπλαστών, βιοσύνθεση κυτταρικών τοιχωµάτων, περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη, περιεκτικότητα σε αλκαλοειδή, περιεκτικότητα σε DNA, περιεκτικότητα σε RNA, περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, αλληλεπίδραση πρωτοπλαστών-µικροβίων, έκφραση της µεµβράνης του πλάσµατος, ταξινόµηση των προϊόντων τήξης των πρωτοπλαστών - παραγωγή των σωµατικών υβριδίων. Ανάλυση των αποµονωµένων πυρήνων Περιεκτικότητα σε DNA, σύνθεση βάσεων DNA, σύνθεση DNA, περιεκτικότητα σε RNA, περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, δοµή χρωµατίνης, ταξινόµηση µεγάλων ποσοτήτων πυρήνων. Ανάλυση των αποµονωµένων χρωµοσωµάτων Μέγεθος χρωµοσωµάτων, εύρεση κεντροµερους, περιεκτικότητα σε DNA, αναλογία AT:GC, ταξινόµηση πολλών χρωµοσωµάτων για την αποµόνωση γονιδίων και χαρτογράφηση. Ανάλυση του περιεχοµένου του πυρήνα σε DNA Πολλά πρωτόκολλα του κυτταροµετρητή ροής έχουν αναπτυχθεί για την ανάλυση του DNA του πυρήνα των φυτών. Αυτά περιλαµβάνουν την προετοιµασία εξαγωγής άθικτων πυρήνων, την χρώση των πυρήνων µε ειδικές χρωστικές για το DNA, και την ανάλυση της έντασης φθορισµού των χρωµατιζόµενων πυρήνων µε ένα κυτταροµετρο ροής. 12

4.3.2 Εφαρµογές στο περιεχόµενο του πυρήνα των φυτών ανάλυση πλοειδίας ανάλυση ενδοπλοειδίας ανάλυση κυτταρικού κύκλου προσδιορισµός του περιεχοµένου του πυρήνα σε DNA προσδιορισµός του φύλου των φυτών ανάλυση της επίδρασης ακτινοβολίας ανάλυση της δοµής της χρωµατίνης www.ueb.cas.cz 5. Βιβλιογραφία Μαυροµάτης Α., Πανεπιστηµιακές Παραδόσεις Γενετικής Φυτών, Βόλος 2003 Mouras et al., "Localization of tranferred genes in genetically modified plants". Adnanced methods in plant breeding and biotechnology by David R. Murray, UK 2003 "Karyotype Analysis". Plant Cytogenetics, second edition Http 1: // Botany online: Classics genetics. Chromosomal Structures Peter v. Sengbusch, 2007 Http 2: // en.wikipedia.org / Wiki / Karyotype, 2006 Http 3: // en.wikipedia.org / Wiki Classic Karyotype, 2006 Http4: // en.wikipedia.org / Wiki Spectral Karyotype, 2006 Http5 : // bio.eng.asaka, 2007 Http6 : // www.101science.com 13