TheraScreen : Κιτ µετάλλαξης K-RAS Για την ανίχνευση 7 µεταλλάξεων στο γονίδιο K-RAS

TheraScreen : Κιτ µετάλλαξης K-RAS Για την ανίχνευση 7 µεταλλάξεων στο γονίδιο K-RAS Για χρήση µε το Roche LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (Αρ. καταλόγου: 05015278001) Και το Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (Αρ. είδους: 4351105) Περιλαµβάνει το εγχειρίδιο χρήσης για το LightCycler Adapt Software v1.1 της Roche Diagnostics (αρ. καταλόγου 05474914001) για το TheraScreen : Κιτ µετάλλαξης K-RAS CE-IVD Οδηγίες χρήσης Κωδικοί προϊόντων Μέγεθος κιτ Κωδικός προϊόντος DxS Αρ. παραγγελίας Roche Diagnostics 20 αντιδράσεις KR-21 05366216190 80 αντιδράσεις KR-22 05366224190 Έκδοση οδηγιών: DU001g Ηµεροµηνία αναθεώρησης: Μάιος 2009 Αποθηκεύστε το προϊόν στους -18 C έως -25 C Αριθµός 1 από 43

Περιεχόµενα 1. Προβλεπόµενη χρήση / Ενδείξεις χρήσης...3 2. Σύνοψη και επεξήγηση της εξέτασης...3 3. Αρχές τεχνολογίας...4 4. Αντιδραστήρια...6 5. ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ...7 6. Αποθήκευση, σταθερότητα και συνθήκες µεταφοράς...9 7. Όργανο... 10 8. είγµατα... 10 9. Πρωτόκολλο ανίχνευσης µετάλλαξης K-RAS... 15 10. Περιορισµοί της εξέτασης... 29 11. Χαρακτηριστικά απόδοσης ανάλυσης... 30 12. Τεχνική υποστήριξη... 39 13. Στοιχεία κατασκευαστή και διανοµέα... 40 14. Ηµεροµηνία τελευταίας έκδοσης... 40 15. Βιβλιογραφία... 41 Σηµειώσεις για τον αγοραστή:... 43 Αριθµός 2 από 43

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: ιαβάστε προσεκτικά τις παρούσες οδηγίες και εξοικειωθείτε µε όλα τα συστατικά του Κιτ K-RAS πριν από τη χρήση. 1. Προβλεπόµενη χρήση / Ενδείξεις χρήσης Προβλεπόµενη χρήση Το DxS TheraScreen : Κιτ µετάλλαξης K-RAS (Κιτ K-RAS) είναι µια in vitro διαγνωστική εξέταση που προορίζεται για την ανίχνευση επτά σωµατικών µεταλλάξεων του ογκογονιδίου K-RAS και παρέχει µια ποιοτική αξιολόγηση της κατάστασης µετάλλαξης. Το Κιτ K-RAS θα πρέπει να χρησιµοποιείται από εκπαιδευµένο προσωπικό σε επαγγελµατικό εργαστηριακό περιβάλλον µε δείγµατα DNA που έχουν εξαχθεί από µονιµοποιηµένο σε φορµόλη και εγκλεισµένο σε παραφίνη ορθοκολικό ιστό. Ενδείξεις χρήσης Τα αποτελέσµατα του Κιτ K-RAS προορίζονται για υποβοήθηση του κλινικού ιατρού στον προσδιορισµό ασθενών µε ορθοκολικό καρκίνο που ενδέχεται να µην επωφεληθούν από θεραπείες έναντι του υποδοχέα επιδερµικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), όπως panitumumab or cetuximab. Το Κιτ K-RAS δεν προορίζεται για τη διάγνωση ορθοκολικού καρκίνου. Θα πρέπει να χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε άλλους σχετικούς προγνωστικούς παράγοντες για την επιλογή των κατάλληλων ασθενών για θεραπείες αντι-egfr βάσει της κατάστασης µετάλλαξης του ασθενή. Η κατάσταση µετάλλαξης του ασθενή θα πρέπει να αξιολογείται από έναν κλινικό ιατρό, σε συνδυασµό µε άλλους παράγοντες νόσου, για τη λήψη αποφάσεων σχετικά µε τη θεραπεία. Οι αποφάσεις αυτές για καρκινοπαθείς ασθενείς δεν θα πρέπει να βασίζονται αποκλειστικά στην κατάσταση µετάλλαξης του K-RAS. 2. Σύνοψη και επεξήγηση της εξέτασης Το κιτ K-RAS είναι ένα διαγνωστικό προϊόν που φέρει τη σήµανση CE σύµφωνα µε την Οδηγία 98/79/ΕΚ της Ευρωπαϊκής Ένωσης περί in vitro διαγνωστικών ιατροτεχνολογικών προϊόντων. Οι µεταλλάξεις στο ογκογονίδιο K-RAS απαντώνται συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους (1-4). Η παρουσία αυτών των µεταλλάξεων σχετίζεται µε έλλειψη απόκρισης σε συγκεκριµένες καρκινικές θεραπείες µε αναστολείς του EGFR, σε ασθενείς µε µεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο (5-10)(14-21). Η ανίχνευση επτά µεταλλάξεων στο γονίδιο K-RAS µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε υπόβαθρο γενοµικού DNA άγριου τύπου (wild-type) µε ανάλυση PCR πραγµατικού χρόνου βάσει της τεχνολογίας DxS Scorpions. Η µέθοδος αυτή είναι εξαιρετικά επιλεκτική. Εφόσον υπάρχει επαρκής αριθµός αντιγράφων DNA, είναι δυνατή η ανίχνευση µετάλλαξης 1% περίπου σε υπόβαθρο γενοµικού DNA άγριου τύπου (wild-type). Το Κιτ K-RAS θα ανιχνεύσει επτά µεταλλάξεις του K-RAS στα κωδικόνια 12 και 13 του ογκογονιδίου K-RAS, όπως αναφέρεται στον πίνακα 1. Αριθµός 3 από 43

Πίνακας 1: Μεταλλάξεις του K-RAS που ανιχνεύονται από το Κιτ DxS Οι αριθµοί COSMIC ID προέρχονται από το Catalogue of Somatic Mutations in Cancer http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ Μετάλλαξη Αλλαγή βάσης Cosmic ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532 3. Αρχές τεχνολογίας Το Κιτ K-RAS συνδυάζει δύο τεχνολογίες, τις τεχνολογίες ARMS και Scorpions (11, 12, 13), για την ανίχνευση µεταλλάξεων σε αναλύσεις PCR πραγµατικού χρόνου. ARMS Ειδική για αλληλόµορφα ή µεταλλάξεις ενίσχυση επιτυγχάνεται µε την τεχνολογία ARMS. Η Taq DNA πολυµεράση είναι εξαιρετικά αποτελεσµατική στο διαχωρισµό µεταξύ αντιστοίχισης και εσφαλµένης αντιστοίχισης στο 3 -άκρο ενός εκκινητή PCR. Ειδικές µεταλλαγµένες αλληλουχίες µπορούν να υποβληθούν σε επιλεκτική ενίσχυση, ακόµη και σε δείγµατα στα οποία η πλειοψηφία των αλληλουχιών δεν παρουσιάζουν µετάλλαξη όπως: Όταν υπάρχει πλήρης αντιστοίχιση του εκκινητή, η ενίσχυση πραγµατοποιείται µε πλήρη αποτελεσµατικότητα. Όταν υπάρχει εσφαλµένη αντιστοίχιση της 3 -βάσης, πραγµατοποιείται µόνο ενίσχυση υποβάθρου χαµηλού επιπέδου. Scorpions Η ανίχνευση ενίσχυσης πραγµατοποιείται χρησιµοποιώντας την τεχνολογία Scorpions. Η τεχνολογία Scorpions συνίσταται από διλειτουργικά µόρια που περιέχουν έναν εκκινητή PCR οµοιοπολικά συνδεδεµένο µε έναν ιχνηθέτη. Το φθορισµοφόρο στον ιχνηθέτη αυτό αλληλεπιδρά µε έναν παρεµποδιστή, που επίσης περιλαµβάνεται στον ιχνηθέτη, ο οποίος µειώνει το φθορισµό. Κατά τη διάρκεια µιας αντίδρασης PCR, όταν ο ιχνηθέτης δεσµεύεται στον κλώνο (amplicon), το φθορισµοφόρο και ο παρεµποδιστής διαχωρίζονται. Το αποτέλεσµα είναι µια αύξηση στο φθορισµό από το σωληνάριο αντίδρασης. Αριθµός 4 από 43

Ανάλυση δεδοµένων: Μέθοδος Ct Οι αναλύσεις πραγµατικού χρόνου Scorpions χρησιµοποιούν τον απαιτούµενο αριθµό κύκλων PCR για την ανίχνευση ενός σήµατος φθορισµού άνω του σήµατος υποβάθρου ως µέτρηση των µορίων-στόχων που υπάρχουν κατά την έναρξη της αντίδρασης. Το σηµείο ανίχνευσης του σήµατος άνω του φθορισµού υποβάθρου ονοµάζεται "τιµή κατωφλίου κύκλου" (Ct). Οι τιµές Ct δείγµατος υπολογίζονται ως η διαφορά µεταξύ της τιµής Ct της ανάλυσης µετάλλαξης και της τιµής Ct της ανάλυσης ορού ελέγχου από το ίδιο δείγµα. Τα δείγµατα ταξινοµούνται ως θετικά για µετάλλαξη, εάν η τιµή Ct που δίνουν είναι κάτω από την τιµή Ct 1% για τη συγκεκριµένη ανάλυση. Άνω της τιµής αυτής, το δείγµα ενδέχεται να περιέχει µετάλλαξη µικρότερη από 1% (εκτός των ορίων των αναλύσεων) ή να είναι αρνητικό για µετάλλαξη. Όταν χρησιµοποιούνται εκκινητές ARMS, ενδέχεται να παρατηρηθεί ανεπαρκής εκκίνηση, µε αποτέλεσµα να παρέχεται όψιµη τιµή Ct υποβάθρου από DNA που δεν περιέχει µετάλλαξη. Όλες οι τιµές Ct που υπολογίζονται από την ενίσχυση υποβάθρου θα είναι µεγαλύτερες από τις τιµές Ct 1% και το δείγµα θα ταξινοµηθεί ως αρνητικό για µετάλλαξη. Το Κιτ K-RAS φέρει τη σήµανση CE για in vitro διαγνωστική χρήση είτε µε το Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR System (Instrument II) (LightCycler 480 Instrument), 96 βυθισµάτων, αρ. είδους της Roche: 05015278001 είτε µε το Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System, αρ. είδους 4351105 (ABI7500). Για το LightCycler 480 Instrument, το Κιτ K-RAS πρέπει να χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε το LightCycler Adapt Software v1.1 για το Κιτ µετάλλαξης K-RAS TheraScreen CE-IVD (LightCycler Adapt Software). Το λογισµικό αυτό έχει αναπτυχθεί για αυτοµατοποίηση της διαδικασίας προσδιορισµού ενός θετικού ή αρνητικού διαγράµµατος ενίσχυσης και υπολογίζει την κατάλληλη τιµή κατωφλίου από την οποία θα προκύψουν οι τιµές Ct. Οι τιµές αυτές χρησιµοποιούνται για τον υπολογισµό των τιµών Ct δείγµατος, οι οποίες συγκρίνονται µε τις τιµές αναφοράς 1%. Το λογισµικό αναφέρει ένα θετικό ή αρνητικό αποτέλεσµα µετάλλαξης και εξαλείφει τον υποκειµενικό παράγοντα από την ανάλυση και την ερµηνεία των δεδοµένων του Κιτ K-RAS. Μορφή κιτ K-RAS Το Κιτ K-RAS περιλαµβάνει οκτώ αναλύσεις. Μία ανάλυση ορού ελέγχου. Επτά αναλύσεις µετάλλαξης. Όλα τα µείγµατα αντίδρασης περιλαµβάνουν µια ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου (εσωτερικό πρότυπο ελέγχου), επισηµασµένης µε HEX (για ανίχνευση από τον ανιχνευτή JOE στο ABI7500). Αριθµός 5 από 43

Η ανάλυση αυτή ελέγχει εάν υπάρχουν αναστολείς που ενδέχεται να οδηγήσουν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα. Ανάλυση ορού ελέγχου Η ανάλυση ορού ελέγχου, που είναι επισηµασµένη µε FAM, χρησιµοποιείται για την αξιολόγηση του συνόλου του DNA σε ένα δείγµα. Η ανάλυση ορού ελέγχου ενισχύει µια περιοχή του εξονίου 4 του γονιδίου K-RAS. Οι εκκινητές και ο ιχνηθέτης έχουν σχεδιαστεί µε τέτοιο τρόπο, ώστε να αποφεύγουν τυχόν γνωστούς πολυµορφισµούς του K-RAS. Αναλύσεις µετάλλαξης Κάθε ανάλυση µετάλλαξης, που είναι επισηµασµένη µε FAM, περιέχει έναν εκκινητή Scorpion και έναν εκκινητή ARMS, για διαχωρισµό µεταξύ του DNA άγριου τύπου (wild-type) και του µεταλλαγµένου DNA που ανιχνεύεται από µια ανάλυση PCR πραγµατικού χρόνου. 4. Αντιδραστήρια Το παρόν Κιτ K-RAS περιέχει επαρκή αντιδραστήρια για ποιοτική αξιολόγηση των δειγµάτων και εκτέλεση των αναλύσεων K-RAS για έως 20 ή 80 αντιδράσεις, ανεξάρτητα από το µέγεθος του κιτ. Μέγεθος κιτ Κωδικός προϊόντος DxS Αρ. παραγγελίας Roche Diagnostics 20 αντιδράσεις KR-21 05366216190 80 αντιδράσεις KR-22 05366224190 Ο αριθµός δειγµάτων που µπορούν να υποβληθούν σε εξέταση εξαρτάται από το µέγεθος της παρτίδας δειγµάτων. Πίνακας 2: Περιεχόµενα κιτ K-RAS Παρεχόµενα αντιδραστήρια 20 αντιδράσεις 80 αντιδράσεις Σωληνάριο Όγκος Όγκος Μείγµα αντίδρασης ορού ελέγχου 1300 µl 5200 µl 1 Μείγµα αντίδρασης 12ALA 650 µl 2600 µl 2 Μείγµα αντίδρασης 12ASP 650 µl 2600 µl 3 Μείγµα αντίδρασης 12ARG 650 µl 2600 µl 4 Μείγµα αντίδρασης 12CYS 650 µl 2600 µl 5 Μείγµα αντίδρασης 12SER 650 µl 2600 µl 6 Μείγµα αντίδρασης 12VAL 650 µl 2600 µl 7 Μείγµα αντίδρασης 13ASP 650 µl 2600 µl 8 Αναµεµειγµένο πρότυπο 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA πολυµεράση 60 µl 240 µl 10 Αριθµός 6 από 43

Εξοπλισµός και αντιδραστήρια που δεν παρέχονται µε το κιτ K-RAS Ο χρήστης θα χρειαστεί τον παρακάτω εξοπλισµό και αναλώσιµα: Το LightCycler 480 Instrument ή το ABI7500 Real-time PCR Machine, µε τις δυνατότητες κυκλοποίησης που ορίζονται στην ενότητα 9, "Πρωτόκολλο ανίχνευσης µετάλλαξης K-RAS". Το LightCycler Adapt Software v1.1 από την Roche Diagnostics (αρ. καταλόγου 05474914001). Πλάκες PCR ελεύθερες από DNAse 0,2 ml (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96, αρ. καταλόγου 04729692 001 ή ABI MicroAmp Optical 96-well reaction Plate, αρ. είδους 4306737, µε MicroAmp Optical Adhesive Film, αρ. είδους 4311971). Αποστειρωµένα σωληνάρια για προετοιµασία κύριων µειγµάτων. Ειδικές πιπέτες για προετοιµασία µείγµατος PCR. Ειδικές πιπέτες για διοχέτευση προτύπου DNA. Αποστειρωµένο H 2 O ελεύθερο από νουκλεάση. 5. ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Για in Vitro διαγνωστική χρήση. Το Κιτ K-RAS δεν προορίζεται για τον έλεγχο ή τη διάγνωση κανενός τύπου καρκίνου, συµπεριλαµβανοµένου του ορθοκολικού καρκίνου. Θα πρέπει να χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε άλλους σχετικούς προγνωστικούς παράγοντες για την επιλογή ασθενών που δεν θα επωφεληθούν από καρκινικές θεραπείες αντι-egfr. Η θεραπεία για καρκινοπαθείς ασθενείς δεν θα πρέπει να βασίζεται αποκλειστικά στην κατάσταση µετάλλαξης του γονιδίου K-RAS. Ο κλινικός ιατρός θα πρέπει να λαµβάνει υπόψη την κατάσταση µετάλλαξης του ασθενή σε συνδυασµό µε άλλους παράγοντες νόσου. Τα περιεχόµενα του Κιτ K-RAS µπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως 8 φορές χωρίς να επηρεαστεί αρνητικά η απόδοση της ανάλυσης. ΜΗΝ καταψύχετε και αποψύχετε τα αντιδραστήρια του Κιτ K-RAS περισσότερες από 8 φορές. Λάβετε υπόψη ότι τα νεοπλασµατικά δείγµατα δεν είναι οµοιογενή και τα δεδοµένα από ένα δείγµα της νεοπλασίας ενδέχεται να µη συµφωνούν µε άλλες τοµές της ίδιας νεοπλασίας. Επίσης, τα νεοπλασµατικά δείγµατα ενδέχεται να περιέχουν µη νεοπλασµατικό ιστό. Το DNA από µη νεοπλασµατικό ιστό δεν αναµένεται να περιέχει τις µεταλλάξεις του K-RAS που ανιχνεύονται από το Κιτ K-RAS. Από όλες τις αναλύσεις του Κιτ K-RAS δηµιουργούνται προϊόντα PCR µικρού µήκους. Ωστόσο, το Κιτ K-RAS δεν είναι αποτελεσµατικό, όταν το DNA είναι ιδιαίτερα κατακερµατισµένο. Η αξιολόγηση του DNA θα πρέπει να βασίζεται στην PCR και ενδέχεται να διαφέρει από την ποσοτικοποίηση βάσει των ενδείξεων οπτικής πυκνότητας. Αριθµός 7 από 43

Παρέχεται πρόσθετο µείγµα αντίδρασης ορού ελέγχου για αξιολόγηση της ποιότητας και της ποσότητας του DNA σε δείγµατα πριν από την ανάλυση του Κιτ K-RAS. Τα αντιδραστήρια για το Κιτ K-RAS έχουν αραιωθεί σε βέλτιστο βαθµό. εν συνιστάται περαιτέρω αραίωση του αντιδραστηρίου, καθώς κάτι τέτοιο θα οδηγήσει σε µείωση της απόδοσης. εν συνιστάται η χρήση όγκων αντίδρασης κάτω από 25 µl, καθώς στην περίπτωση αυτή αυξάνεται ο κίνδυνος ψευδώς αρνητικών αποτελεσµάτων. Όλα τα αντιδραστήρια του Κιτ K-RAS έχουν παρασκευαστεί ειδικά για χρήση µε τις εξετάσεις που αναφέρονται. Τα αντιδραστήρια του Κιτ K-RAS δεν πρέπει να αντικαθίστανται, ώστε να διατηρηθεί βέλτιστη απόδοση. Για να διασφαλιστεί βέλτιστη δραστηριότητα και απόδοση των εκκινητών Scorpions (όπως σε όλα τα επισηµασµένα µε φθορισµό µόρια), οι εκκινητές θα πρέπει να προστατεύονται από το φως, ώστε να αποφευχθεί η φωτολεύκανση. Απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή της µόλυνσης των αντιδράσεων PCR µε συνθετικό υλικό ελέγχου. Συνιστάται η χρήση ξεχωριστών, ειδικών πιπετών για την προετοιµασία των µειγµάτων αντίδρασης και την προσθήκη του προτύπου DNA. Η προετοιµασία και η διοχέτευση των µειγµάτων αντίδρασης θα πρέπει να πραγµατοποιείται σε ξεχωριστό χώρο από την προσθήκη του προτύπου. Τα σωληνάρια δεν πρέπει να ανοίγονται ποτέ µετά από µια αντίδραση PCR. Κάθε ανάλυση που περιλαµβάνεται στο Κιτ K-RAS έχει τα δικά της χαρακτηριστικά. Ο υπολογισµός των αποτελεσµάτων πρέπει να πραγµατοποιείται σύµφωνα µε τις σωστές παραµέτρους ανάλυσης (ανατρέξτε στην ενότητα ερµηνείας αναφοράς/δεδοµένων). Οι τιµές Ct µετάλλαξης 38 και άνω πρέπει να ταξινοµούνται ως αρνητικές ή κάτω των ορίων του κιτ. Οι αναλύσεις περιλαµβάνουν µια αντίδραση εξωγενούς ορού ελέγχου (εσωτερικό πρότυπο ελέγχου) επιπρόσθετα της αντίδρασης ενδιαφέροντος (ανατρέξτε στην ενότητα "Αρχές τεχνολογίας"). Εάν και οι δύο αναλύσεις δεν είναι επιτυχείς, τα δεδοµένα πρέπει να απορρίπτονται, καθώς ενδέχεται να υπάρχουν αναστολείς που µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα. Η αραίωση του δείγµατος µπορεί να µειώσει τη δράση των αναστολέων, ωστόσο πρέπει να σηµειωθεί ότι στην περίπτωση αυτή θα αραιωθεί και το DNA. Αριθµός 8 από 43

Πρέπει να λαµβάνονται γενικές εργαστηριακές προφυλάξεις, συµπεριλαµβανοµένων ενδεικτικά των εξής: a) Μην εκτελείτε αναρρόφηση µε πιπέτα από το στόµα b) Στους χώρους χειρισµού δειγµάτων ή αντιδραστηρίων του κιτ απαγορεύεται το κάπνισµα και η κατανάλωση τροφίµων και ποτών c) Πλένετε τα χέρια µετά την εκτέλεση της εξέτασης Χρησιµοποιείτε µόνο την Taq πολυµεράση (Taq) που παρέχεται µε το κιτ και µην την αντικαθιστάτε µε Taq πολυµεράση άλλων κιτ ίδιου ή διαφορετικού τύπου ή µε Taq πολυµεράση άλλου προµηθευτή. Αποψύχετε µόνο τα απαιτούµενα αντιδραστήρια για κάθε ανάλυση. Μην αποψύχετε ολόκληρο το κιτ κάθε φορά, ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο αριθµός κύκλων κατάψυξης/απόψυξης. Πληροφορίες ασφαλείας Προσοχή: Όλες οι χηµικές ουσίες και τα βιολογικά υλικά θα πρέπει να θεωρούνται εν δυνάµει επικίνδυνα. Τα δείγµατα είναι εν δυνάµει µολυσµατικά και ο χειρισµός τους θα πρέπει να είναι ανάλογος. Το Κιτ K-RAS θα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο από άτοµα που έχουν εκπαιδευτεί στη χρήση των κατάλληλων εργαστηριακών τεχνικών. Κατά το χειρισµό των συστατικών του παρόντος Κιτ K-RAS, φοράτε πάντα κατάλληλη εργαστηριακή ποδιά, αναλώσιµα γάντια και προστατευτικά γυαλιά. Μετά τη χρήση, τα συστατικά του Κιτ K-RAS θα πρέπει να απορρίπτονται όπως τα κλινικά απόβλητα. 6. Αποθήκευση, σταθερότητα και συνθήκες µεταφοράς Αποθήκευση Τα περιεχόµενα του Κιτ K-RAS θα πρέπει να αποθηκεύονται αµέσως µετά την παραλαβή στους -18 C έως -25 C, σε καταψύκτη σταθερής θερµοκρασίας, σε σκοτεινό χώρο. Αποφεύγετε τις περιττές καταψύξειςαποψύξεις των περιεχοµένων του Κιτ K-RAS. Σταθερότητα Μη χρησιµοποιείτε το Κιτ K-RAS µετά την αναγραφόµενη ηµεροµηνία λήξης. Τα περιεχόµενα του Κιτ K-RAS παραµένουν σταθερά µέχρι την ηµεροµηνία λήξης, όταν αποθηκεύονται υπό τις συνιστώµενες συνθήκες αποθήκευσης, στην αρχική συσκευασία. Τα περιεχόµενα του Κιτ K-RAS µπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως 8 φορές χωρίς να επηρεαστεί αρνητικά η απόδοση της ανάλυσης. ΜΗΝ καταψύχετε και αποψύχετε τα αντιδραστήρια του Κιτ K-RAS περισσότερες από 8 φορές. Αριθµός 9 από 43

Συνθήκες µεταφοράς Τα περιεχόµενα του Κιτ K-RAS µεταφέρονται σε ξηρό πάγο και θα πρέπει να είναι καταψυγµένα κατά την παραλαβή. Εάν το Κιτ K-RAS δεν είναι καταψυγµένο κατά την παραλαβή, εάν η εξωτερική συσκευασία έχει ανοίξει κατά τη µεταφορά ή εάν στο κιβώτιο αποστολής δεν περιλαµβάνονται το δελτίο συσκευασίας, οι οδηγίες χρήσης ή τα αντιδραστήρια, επικοινωνήστε µε το τοπικό γραφείο της Roche Diagnostics. Ανατρέξτε στην ενότητα 12, "Τεχνική υποστήριξη", για τα στοιχεία επικοινωνίας. 7. Όργανο Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του οργάνου για πλήρεις οδηγίες σχετικά µε την εγκατάσταση και τη χρήση του οργάνου PCR πραγµατικού χρόνου. 8. είγµατα Το υλικό δείγµατος πρέπει να είναι ανθρώπινο γενοµικό DNA, που εξάγεται από δείγµατα ορθοκολικής νεοπλασίας, µονιµοποιηµένα σε φορµόλη και εγκλεισµένα σε παραφίνη. Συλλογή και προετοιµασία δειγµάτων 1. Μεταφορά δειγµάτων: Τυπική µεθοδολογία παθολογίας για διασφάλιση της ποιότητας των δειγµάτων. 2. Συνιστώµενη διαδικασία εξαγωγής δειγµάτων: Εξαγωγή DNA, χρησιµοποιώντας το κιτ ιστού Qiagen QIAamp DNA FFPE (αρ. καταλόγου 56404). Πρέπει να εφαρµόζονται οι παρακάτω τροποποιήσεις στο πρωτόκολλο Qiagen: Οι τοµές FFPE πρέπει να συλλέγονται σε γυάλινες αντικειµενοφόρους πλάκες. Η περίσσεια παραφίνης πρέπει να αποµακρύνεται µε απόξεση από τις τοµές ιστού χρησιµοποιώντας καινούριο, αποστειρωµένο νυστέρι. Το υλικό απόξεσης των τοµών ιστού πρέπει να µεταφέρεται σε σωληνάρια µικροφυγόκεντρου χρησιµοποιώντας καινούριο νυστέρι για κάθε δείγµα προς εξαγωγή. Η διάσπαση της πρωτεϊνάσης K πρέπει να συνεχίζεται µέχρι την ολοκλήρωση. Για τη διαδικασία αυτή ενδέχεται να απαιτούνται έως 48 ώρες. Η έκλουση των δειγµάτων πρέπει να πραγµατοποιείται σε 200 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ATE από το κιτ εξαγωγής Qiagen. Τυχόν εναλλακτικές µέθοδοι προετοιµασίας δείγµατος πρέπει να επαληθεύονται από τον τελικό χρήστη. 3. Αποθήκευση εξαχθέντος DNA: Αποθηκεύστε το στους -20 C πριν από την ανάλυση. Αριθµός 10 από 43

Πρωτόκολλο αξιολόγησης δειγµάτων Το πρόσθετο µείγµα ανάλυσης ορού ελέγχου που παρέχεται µε το Κιτ K-RAS πρέπει να χρησιµοποιείται για την αξιολόγηση του συνόλου του DNA σε ένα δείγµα. Η ανάλυση ορού ελέγχου ενισχύει µια περιοχή του εξονίου 4 του γονιδίου K-RAS. Τα δείγµατα θα πρέπει να προετοιµάζονται µόνο µε την ανάλυση ορού ελέγχου χρησιµοποιώντας το αναµεµειγµένο πρότυπο ως θετικό ορό ελέγχου και το νερό ως ορό ελέγχου χωρίς πρότυπο. Λάβετε υπόψη ότι για βέλτιστη χρήση των αντιδραστηρίων του Κιτ K-RAS, τα δείγµατα θα πρέπει να εξετάζονται σε παρτίδες. Όλες οι αναλύσεις του πειράµατος πρέπει να περιέχουν ορούς ελέγχου. Εάν τα δείγµατα υποβληθούν σε εξέταση µεµονωµένα, θα χρησιµοποιηθούν περισσότερα αντιδραστήρια και θα µειωθεί ο αριθµός των δειγµάτων που µπορούν να εξεταστούν µε το Κιτ K-RAS. Πρωτόκολλο αξιολόγησης δειγµάτων - Προετοιµασία πλάκας 1. Αποψύξτε το µείγµα αντίδρασης ορού ελέγχου και το αναµεµειγµένο πρότυπο από το Κιτ K-RAS σε θερµοκρασία δωµατίου. Αναµείξτε κάθε διάλυµα ανακινώντας κάθε σωληνάριο 10 φορές µετά την απόψυξη, ώστε να αποφευχθεί η δηµιουργία τοπικών συγκεντρώσεων αλάτων. Προετοιµάστε επαρκή µείγµατα για τα δείγµατα DNA, µία αντίδραση αναµεµειγµένου προτύπου και µία αντίδραση ορού ελέγχου χωρίς πρότυπο, καθώς και 2 επιπλέον αντιδράσεις. 2. Για την προετοιµασία του κύριου µείγµατος, χρησιµοποιήστε τις ποσότητες αντιδραστηρίων ανά αντίδραση που αναφέρονται στον πίνακα 3. Πίνακας 3: Όγκοι κύριου µείγµατος αναλύσεων ορών ελέγχου Ανάλυση Ανάλυση ορού ελέγχου Κύριο µείγµα Μείγµα αντίδρασης Taq (µl)x1 (µl)x1 19,8 0,2 3. ΜΗ στροβιλίζετε την Taq πολυµεράση ή τυχόν µείγµατα αντίδρασης που περιέχουν Taq πολυµεράση, καθώς µπορεί να προκληθεί αδρανοποίηση του ενζύµου. 4. Βεβαιωθείτε ότι η Taq πολυµεράση βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη χρήση. Περιστρέψτε το φιαλίδιο, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλη η Taq πολυµεράση έχει συγκεντρωθεί στον πυθµένα του φιαλιδίου και, στη συνέχεια, διοχετεύστε την τοποθετώντας το άκρο της πιπέτας ακριβώς κάτω από την επιφάνεια της Taq πολυµεράσης, ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος επικάλυψης του άκρου µε υπερβολική ποσότητα Taq πολυµεράσης. 5. Αναµείξτε το κύριο µείγµα αναρροφώντας και διοχετεύοντας προσεκτικά µε πιπέτα. Αριθµός 11 από 43

6. Προσθέστε αµέσως 20 µl του κύριου µείγµατος ορού ελέγχου σε κάθε βύθισµα αντίδρασης. 7. Προσθέστε αµέσως 5 µl δείγµατος, αναµεµειγµένου προτύπου ή νερού (για τους ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο) στα βυθίσµατα αντίδρασης. 8. Η πλάκα πρέπει να έχει προετοιµαστεί προσθέτοντας το αναµεµειγµένο πρότυπο στο βύθισµα A1 και τον ορό ελέγχου χωρίς πρότυπο (νερό) στο A2. Όλα τα υπόλοιπα βυθίσµατα που χρησιµοποιούνται πρέπει να περιέχουν δείγµατα. 9. Σφραγίστε και περιστρέψτε για σύντοµο διάστηµα την πλάκα PCR, ώστε τα αντιδραστήρια να συγκεντρωθούν στον πυθµένα των βυθισµάτων. 10. Ακολουθήστε τις οδηγίες ρύθµισης του οργάνου για την κατάλληλη πλατφόρµα. Πρωτόκολλο αξιολόγησης δειγµάτων - Ρύθµιση του LightCycler 480 Instrument 1. Τοποθετήστε αµέσως την πλάκα στο LightCycler 480 Instrument. 2. Επιλέξτε το εικονίδιο του LightCycler 480 Software στην επιφάνεια εργασίας του σταθµού εργασίας που είναι συνδεδεµένος στο όργανο. Συνδεθείτε στο λογισµικό και από την οθόνη Overview, επιλέξτε New Experiment from Template. Από τα εµφανιζόµενα πρότυπα ανάλυσης, επιλέξτε K-RAS LC480II Run Template. Αυτό το πρότυπο έχει τις παρακάτω παραµέτρους: 1. Ο τύπος ανίχνευσης είναι DxS IVD Assays. 2. Ο όγκος αντίδρασης είναι 25. 3. Αρχικό βήµα αναµονής στους 95 C για 4 λεπτά. 4. Ενίσχυση 2 βηµάτων για 45 κύκλους µε αποδιάταξη στους 95 C για 30 δευτερόλεπτα και υβριδισµό στους 60 C για 1 λεπτό. Μία µόνο λήψη φθορισµού στο βήµα 60 C. 3. Επιλέξτε την καρτέλα Sample Editor και στο Step 1: Select Workflow, επιλέξτε το πλαίσιο ελέγχου Abs Quant. Στην περιοχή Select Filter Combinations, βεβαιωθείτε ότι είναι επιλεγµένα και τα δύο φίλτρα (465-510 nm και 533-580 nm). Καταχωρήστε τα ονόµατα των δειγµάτων στο Step 2 και στο Step 3. Για την παράµετρο "Quantification Sample Type", θα πρέπει να επιλέξετε τη ρύθµιση unknown. Η στήλη αντιγράφου θα πρέπει να παραµείνει κενή. 4. Επιλέξτε το κουµπί Experiment και κάντε κλικ στο κουµπί Start Run, για να αποθηκεύσετε το πείραµα και να ξεκινήσει η κυκλοποίηση. Αριθµός 12 από 43

5. Όταν ολοκληρωθεί η ανάλυση, επιλέξτε την καρτέλα Analysis και την παράµετρο Abs Quant/2nd Derivative Max από το παράθυρο Create New Analysis. Αποδεχτείτε τις προεπιλεγµένες τιµές από την οθόνη Create New Analysis. Βεβαιωθείτε ότι το κουµπί Filter Comb είναι 465-510 και επιλέξτε το κουµπί Calculate. Οι τιµές Ct εµφανίζονται στον πίνακα Samples. 6. Επιλέξτε το κουµπί Filter Comb και αλλάξτε τα φίλτρα σε 533-580 nm. Επιλέξτε το κουµπί Calculate και υπολογίστε τις τιµές Ct εξωγενούς ορού ελέγχου από τον πίνακα Samples. Πρωτόκολλο αξιολόγησης δειγµάτων - Ρύθµιση του ABI7500 Instrument 1. Τοποθετήστε αµέσως την πλάκα στο ABI7500 instrument. 2. Επιλέξτε το εικονίδιο του 7500 System Software στην επιφάνεια εργασίας του σταθµού εργασίας που είναι συνδεδεµένος στο όργανο. Ανοίξτε ένα νέο αρχείο ανάλυσης από το µενού "file" στο 7500 Sequence Detection Software έκδοση 1.4. 3. Στην περιοχή Assay, επιλέξτε Standard Curve (Absolute Quantification). Στην περιοχή Run Mode, επιλέξτε Standard 7500. 4. Μεταβείτε στο παράθυρο ρύθµισης ανιχνευτή επιλέγοντας το κουµπί Next. Προσθέστε τους ανιχνευτές FAM και JOE στη λίστα ανιχνευτών, επιλέγοντας τη ρύθµιση none για τους παρεµποδιστές. Εάν οι ανιχνευτές αυτοί δεν υπάρχουν ήδη, επιλέξτε το κουµπί New Detectors και ρυθµίστε τους ανιχνευτές FAM και JOE, ορίζοντας τη ρύθµιση none για τον παρεµποδιστή. 5. Ρυθµίστε την παράµετρο Passive Reference σε None και επιλέξτε το κουµπί Next. 6. Επιλέξτε ολόκληρη την πλάκα και τα πλαίσια ελέγχου για τους ανιχνευτές FAM και JOE, ώστε να βεβαιωθείτε ότι παρακολουθούνται και οι δύο χρωστικές σε κάθε βύθισµα. Επιλέξτε το κουµπί Finish. 7. Στην καρτέλα Instrument, ρυθµίστε την κυκλοποίηση όπως αναφέρεται στον πίνακα 4. Πίνακας 4: Συνθήκες κυκλοποίησης ABI7500 Θερµοκρασία Χρόνος Κύκλοι Συλλογή δεδοµένων Στάδιο 1 95 o C 4 min 1 Στάδιο 2 95 o C 30 sec 60 o C 1 min 40 FAM, JOE Αριθµός 13 από 43

8. Επιλέξτε το κουµπί Start, για να αποθηκεύσετε το πείραµα και να ξεκινήσει η κυκλοποίηση. 9. Όταν ολοκληρωθεί η ανάλυση, βεβαιωθείτε ότι η παράµετρος "passive reference" έχει οριστεί στη ρύθµιση none στην οθόνη "well inspector". Στην καρτέλα "Amplification Plot", επιλέξτε όλα τα βυθίσµατα που χρησιµοποιούνται, καθώς και τη χρωστική JOE από το πτυσσόµενο µενού ανιχνευτών. 10. Ελέγξτε το σήµα JOE από κάθε δείγµα και συγκρίνετέ το µε το δείγµα JOE στο βύθισµα NTC. Σηµειώστε τυχόν δείγµατα µε καµπύλη όψιµης ενίσχυσης ή µη επιτυχή ενίσχυση για τον εξωγενή ορό ελέγχου σε σύγκριση µε το NTC. 11. Στην καρτέλα "Amplification Plot", επιλέξτε όλα τα βυθίσµατα που χρησιµοποιούνται, καθώς και τη χρωστική FAM από το πτυσσόµενο µενού ανιχνευτών. Χρησιµοποιήστε τη ρύθµιση αυτόµατης γραµµής αναφοράς και χειροκίνητου υπολογισµού Ct και, στη συνέχεια, ρυθµίστε χειροκίνητα την τιµή κατωφλίου στο µέσο της εκθετικής φάσης, χρησιµοποιώντας τη λογαριθµική κλίµακα για τον άξονα Y, όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο χρήσης του ABI7500. 12. Επιλέξτε το κουµπί Analyse για υπολογισµό των τιµών Ct. Ερµηνεία αξιολόγησης δειγµάτων Αξιολογήστε τις τιµές NTC Ct, ώστε να βεβαιωθείτε ότι δεν υπάρχει µόλυνση που προκαλεί θετική ενίσχυση στο κανάλι FAM (τιµή Ct κάτω από 40) ή µη επιτυχής αντίδραση εξωγενούς ορού ελέγχου στο κανάλι HEX (καµία τιµή Ct), γεγονός που υποδεικνύει πρόβληµα ρύθµισης. Το αναµεµειγµένο πρότυπο θα πρέπει να δίνει τιµή Ct ανάλυσης ορού ελέγχου (κανάλι FAM) 26-29 στο ABI7500 και 29 στο LightCycler 480 Instrument. Τα δεδοµένα δεν θα πρέπει να χρησιµοποιούνται, εάν ένας από αυτούς τους 2 ορούς ελέγχου ανάλυσης δεν είναι επιτυχής. Τιµή Ct ανάλυσης ορού ελέγχου 29-35: Η ερµηνεία των αποτελεσµάτων πρέπει να γίνεται µε προσοχή, καθώς ενδέχεται να µην ανιχνευτούν µεταλλάξεις εξαιρετικά χαµηλού επιπέδου. Τιµή Ct ανάλυσης ορού ελέγχου 35-38: Στα δείγµατα αυτά υπάρχουν πολύ λίγα ενισχύσιµα αντίγραφα DNA και οι µεταλλάξεις θα ανιχνευτούν πιθανότατα µόνο εάν τα περισσότερα αντίγραφα είναι µεταλλαγµένα. Τιµή Ct ανάλυσης ορού ελέγχου 38: Απορρίψτε το δείγµα, καθώς υπάρχει ελάχιστο DNA και το Κιτ K-RAS δεν θα µπορέσει να ανιχνεύσει µεταλλάξεις. Λάβετε υπόψη ότι εάν ένα δείγµα παρέχει τιµή Ct ανάλυσης όψιµου ορού ελέγχου, η τιµή Ct εξωγενούς ορού ελέγχου του δείγµατος θα πρέπει να συγκρίνεται µε τον εξωγενή ορό ελέγχου του NTC. Εάν ο εξωγενής ορός ελέγχου του δείγµατος είναι όψιµος ή αρνητικός, σε σύγκριση µε το NTC, ενδέχεται να υπάρχει αναστολέας. Αριθµός 14 από 43

Μπορείτε να µειώσετε τη δράση του αναστολέα αραιώνοντας το δείγµα, ωστόσο στην περίπτωση αυτή θα αραιωθεί και το DNA. Αραίωση δειγµάτων: Μια τιµή Ct ορού ελέγχου < 24 θα προκαλέσει υπερφόρτωση των αναλύσεων µετάλλαξης. Τα δείγµατα µε τιµή Ct ορού ελέγχου < 24 πρέπει να αραιώνονται. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι για το LightCycler 480 Instrument, οι τιµές Ct που προκύπτουν µε τη µέθοδο της 2 ης παραγώγου ενδέχεται να είναι ελαφρώς διαφορετικές από εκείνες που λαµβάνονται µε το LightCycler Adapt Software. Συνιστάται η αραίωση των συµπυκνωµένων δειγµάτων, ώστε οι τιµές τους να βρίσκονται εντός του εύρους > 24 και < 29 (τιµές Ct βάσει του 7500 Sequence Detection Software ή του LightCycler 480 Instrument Software) λαµβάνοντας υπόψη ότι η τιµή Ct αυξάνεται κατά 1 όταν εκτελείται αραίωση ½. 9. Πρωτόκολλο ανίχνευσης µετάλλαξης K-RAS ιαβάστε προσεκτικά τις παρούσες οδηγίες και εξοικειωθείτε µε όλα τα συστατικά του Κιτ K-RAS πριν από τη χρήση. Για να χρησιµοποιήσετε αποτελεσµατικά το Κιτ K-RAS, τα δείγµατα πρέπει να εξετάζονται σε παρτίδες των 10 (για πλήρωση µίας πλάκας 96 βυθισµάτων). Εάν το µέγεθος παρτίδας είναι µικρότερο, θα υποβληθούν σε εξέταση λιγότερα δείγµατα µε το Κιτ K-RAS. Προετοιµασία πειράµατος για το LightCycler 480 Instrument Για κάθε δείγµα DNA, οι αναλύσεις ορού ελέγχου και µετάλλαξης πρέπει να πραγµατοποιηθούν στην ίδια ανάλυση PCR, ώστε να αποφευχθούν διακυµάνσεις µεταξύ αναλύσεων. 1. Αποψύξτε τα µείγµατα αντίδρασης και το αναµεµειγµένο πρότυπο από το Κιτ K-RAS σε θερµοκρασία δωµατίου. Αναµείξτε κάθε διάλυµα ανακινώντας κάθε σωληνάριο 10 φορές µετά την απόψυξη, ώστε να αποφευχθεί η δηµιουργία τοπικών συγκεντρώσεων αλάτων. Προετοιµάστε επαρκή µείγµατα για τα δείγµατα DNA, το αναµεµειγµένο πρότυπο και τους ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο, καθώς και 2 επιπλέον αντιδράσεις ανά µείγµα όπως αναφέρεται στον πίνακα 5. Πίνακας 5: Όγκοι κύριου µείγµατος K-RAS Ανάλυση Ανάλυση ορού ελέγχου Αναλύσεις µετάλλαξης Μείγµα αντίδρασης (µl)x1 Κύρια µείγµατα Μείγµα Taq (µl)x1 αντίδρασης (µl) ανά πλάκα (x14) Taq (µl) ανά πλάκα (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 Αριθµός 15 από 43

2. ΜΗ στροβιλίζετε την Taq πολυµεράση ή τυχόν µείγµατα αντίδρασης που περιέχουν Taq πολυµεράση, καθώς µπορεί να προκληθεί αδρανοποίηση του ενζύµου. 3. Βεβαιωθείτε ότι η Taq πολυµεράση βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη χρήση. Περιστρέψτε το φιαλίδιο, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλη η Taq πολυµεράση έχει συγκεντρωθεί στον πυθµένα του φιαλιδίου και, στη συνέχεια, διοχετεύστε την τοποθετώντας το άκρο της πιπέτας ακριβώς κάτω από την επιφάνεια της Taq πολυµεράσης, ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος επικάλυψης του άκρου µε υπερβολική ποσότητα Taq πολυµεράσης. 4. Αναµείξτε τα κύρια µείγµατα αναρροφώντας και διοχετεύοντας προσεκτικά µε πιπέτα. 5. Προσθέστε αµέσως 20 µl των κύριων µειγµάτων στα βυθίσµατα αντίδρασης. 6. Προσθέστε αµέσως 5 µl δείγµατος, αναµεµειγµένου προτύπου ή νερού (για τους ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο) στα βυθίσµατα αντίδρασης. Κάθε δείγµα DNA πρέπει να υποβληθεί σε εξέταση τόσο µε την ανάλυση ορού ελέγχου όσο και µε όλες τις αναλύσεις µετάλλαξης. Η διάταξη της πλάκας αναφέρεται στον πίνακα 6. Πίνακας 6: ιάταξη πλάκας κιτ K-RAS διάταξη 96 βυθισµάτων Ανάλυση 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Αναµεµειγµένο Ορός πρότυπο ελέγχου B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL Η 13ASP Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 7. Σφραγίστε και περιστρέψτε για σύντοµο διάστηµα την πλάκα PCR, ώστε τα αντιδραστήρια να συγκεντρωθούν στον πυθµένα των βυθισµάτων. 8. Τοποθετήστε αµέσως την πλάκα στο LightCycler 480 instrument. Αριθµός 16 από 43

Ρύθµιση LightCycler 480 Instrument 1. Επιλέξτε το εικονίδιο του LightCycler 480 software στην επιφάνεια εργασίας του σταθµού εργασίας που είναι συνδεδεµένος στο όργανο. Συνδεθείτε στο λογισµικό και από τη σελίδα "overview", επιλέξτε New Experiment from Template. 2. Επιλέξτε το K-RAS LC480II Run Template από τη λίστα "Run Templates" (για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε στην ενότητα αξιολόγησης δειγµάτων για το LightCycler 480 Instrument). 3. Επιλέξτε την καρτέλα Sample Editor και στο Step 1: Select Workflow, επιλέξτε το πλαίσιο ελέγχου Abs Quant. Στην περιοχή Select Filter Combinations, βεβαιωθείτε ότι είναι επιλεγµένα και τα δύο φίλτρα (465-510 nm και 533-580 nm). Καταχωρήστε τα ονόµατα των δειγµάτων στο Step 2 και στο Step 3. Στη στήλη 1, το όνοµα του δείγµατος πρέπει να είναι "Mixed Standard". Στη στήλη 2, το όνοµα του δείγµατος πρέπει να είναι NTC. Στις στήλες 3-12, πρέπει να καταχωρηθούν τα ονόµατα των δειγµάτων. Τα ονόµατα πρέπει να είναι ίδια για όλα τα βυθίσµατα στη στήλη 1. Για την παράµετρο "Quantification Sample Type", επιλέξτε τη ρύθµιση unknown. Η στήλη αντιγράφου θα πρέπει να παραµείνει κενή, καθώς τα αντίγραφα δεν λαµβάνονται υπόψη από το LightCycler Adapt Software. 4. Επιλέξτε το κουµπί Experiment και κάντε κλικ στο κουµπί Start Run, για να αποθηκεύσετε το πείραµα και να ξεκινήσει η κυκλοποίηση. Ανάλυση δειγµάτων στο LightCycler 480 Instrument 1. Όταν ολοκληρωθεί η ανάλυση στο LightCycler 480 Instrument, χρησιµοποιώντας το παράθυρο πλοήγησης, εξάγετε το πείραµα (αρχείο.ixo) σε κατάλληλη θέση όπου µπορεί να έχει πρόσβαση το LightCycler Adapt Software. 2. ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Το LightCycler Adapt Software έχει εγκριθεί για χρήση σε ένα µόνο σύστηµα υπολογιστή που αποτελείται από µία µονάδα ελέγχου (σταθµός εργασίας), η οποία παρέχεται από την Roche Diagnostics για χρήση µε ένα µόνο LightCycler 480 Instrument II. Το LightCycler Adapt Software επιτρέπεται επί του παρόντος να χρησιµοποιείται µόνο µε µονάδα ελέγχου που αποτελεί "ανεξάρτητο" υπολογιστή (δηλ. δεν ανήκει σε δίκτυο). Απαγορεύεται η χρήση άλλου υπολογιστή, καθώς η λειτουργία του λογισµικού ενδέχεται να µην είναι η αναµενόµενη. 3. Ανοίξτε το LightCycler Adapt Software κάνοντας κλικ στο εικονίδιο του LightCycler Adapt Software στην επιφάνεια εργασίας του σταθµού εργασίας και συµπληρώστε το πεδίο "username". Θα πρέπει να καταχωρηθεί το όνοµα "report author". Αριθµός 17 από 43

4. Στο κύριο παράθυρο, χρησιµοποιήστε το κουµπί φυλλοµετρητή, για να επιλέξετε ένα µόνο αρχείο ανάλυσης του LightCycler 480 Instrument (Για να καταργήσετε µια επιλογή, πρέπει να κλείσετε και να ανοίξετε το λογισµικό). 5. Επιλέξτε έναν τύπο αναφοράς (pdf ή csv). Εάν επιλέξετε τον τύπο csv, δηµιουργείται αυτόµατα µια πρόσθετη έκδοση σε pdf. 6. Επιλέξτε το Analyse, για να δηµιουργήσετε µια αναφορά αποτελεσµάτων. Η αναφορά αποθηκεύεται αυτόµατα στο φάκελο που περιλαµβάνει το αρχείο ανάλυσης και έχει το ίδιο όνοµα µε το αρχείο ανάλυσης. 7. Η αναφορά θα εµφανιστεί αυτόµατα. 8. Το αποτέλεσµα που αναφέρεται εµφανίζεται στη στήλη Mutation Status του Sample Result Table. Ερµηνεία αναφοράς του LightCycler Adapt Software 1. Η αναφορά του LightCycler Adapt Software περιλαµβάνει γενικές πληροφορίες σχετικά µε την ανάλυση. 1.1. Ο συντάκτης αναφοράς είναι το άτοµο που εκτέλεσε το λογισµικό και δηµιούργησε την αναφορά. 1.2. Αναγράφεται η ηµεροµηνία και η ώρα της ανάλυσης. 2. Η αναφορά παρέχει µια επισκόπηση της ανάλυσης που περιλαµβάνει το όνοµα του αρχείου ανάλυσης που χρησιµοποιήθηκε, το αρχείο ορισµού αλγόριθµου και την αλληλουχία αλγόριθµου. Τα στοιχεία του αλγόριθµου είναι προκαθορισµένα και δεν µπορούν να τροποποιηθούν. 3. Η περιοχή αποτελεσµάτων περιλαµβάνει το πλήρες όνοµα και την πλήρη διαδροµή της ανάλυσης του LightCycler 480 Instrument, καθώς και τα εξής στοιχεία: 3.1. Σειριακός αριθµός του LightCycler 480 Instrument. 3.2. Instrument Name-αναγνωριστικό στοιχείο του LightCycler 480 Instrument στο LightCycler 480 Instrument software. 3.3. Run Date-ηµεροµηνία και ώρα ανάλυσης στο LightCycler 480 Instrument. 3.4. Run Operator-το όνοµα του ατόµου που ήταν συνδεδεµένο στο LightCycler 480 Instrument software όταν εκτελέστηκε το πείραµα. 3.5. Experiment Name-το όνοµα αρχείου ανάλυσης. 3.6. Software Version-η έκδοση του λογισµικού που χρησιµοποιήθηκε στο LightCycler 480 Instrument. 3.7. Lot Number-ο αριθµός που καταχωρήθηκε στο πεδίο Lot No στην οθόνη ρύθµισης του LightCycler 480 Instrument software. 4. Η διάταξη πλάκας περιλαµβάνει τα ονόµατα δειγµάτων από την οθόνη επεξεργασίας δειγµάτων του LightCycler 480 Instrument. Αριθµός 18 από 43

5. Το Run Summary Result εµφανίζεται όταν η ανάλυση έχει προσδιοριστεί ως έγκυρη ή άκυρη. Αυτό εξαρτάται από τους ορούς ελέγχου ανάλυσης στις στήλες 1 και 2. 6. Οροί ελέγχου ανάλυσης 6.1. Το LightCycler Adapt Software υπολογίζει αυτόµατα την τιµή Ct για το αναµεµειγµένο πρότυπο χρησιµοποιώντας τον τύπο Ct µετάλλαξης-ct ορού ελέγχου= Ct 6.2. Το LightCycler Adapt Software συγκρίνει τις τιµές µε τις αναµενόµενες τιµές που αναφέρονται στον πίνακα 7. Πίνακας 7: Αναµενόµενες τιµές Ct του LightCycler Adapt Software Ανάλυση Ct αναµεµειγµένου προτύπου 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. Αναφέρονται οι τιµές Ct και Ct. 6.4. Για τους ορούς ελέγχου ανάλυσης στις στήλες 1 και 2 εµφανίζονται οι παρακάτω ενδείξεις/προειδοποιήσεις: Πίνακας 8: Ενδείξεις/προειδοποιήσεις του LightCycler Adapt Software για τους ορούς ελέγχου ανάλυσης Ένδειξη/Προειδοποίηση CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Σηµασία Η τιµή FAM Ct για την ανάλυση ορού ελέγχου είναι εκτός εύρους Για το αναµεµειγµένο πρότυπο, ο εξωγενής ορός ελέγχου έχει τιµή Ct<30 ή είναι αρνητικός, όταν το αποτέλεσµα FAM είναι αρνητικό Οι τιµές Ct µετάλλαξης είναι εκτός του καθορισµένου εύρους Η αντίδραση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής σε ένα NTC Η αντίδραση FAM έχει θετική τιµή Ct σε ένα NTC 6.4.1. Η σηµασία των ενδείξεων/προειδοποιήσεων περιγράφεται πιο λεπτοµερώς παρακάτω: Αριθµός 19 από 43

6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE-Η ανάλυση ορού ελέγχου για το αναµεµειγµένο πρότυπο πρέπει να έχει τιµή Ct 26,60 ± 2. Εάν η ανάλυση δεν είναι εντός του εύρους αυτού, εµφανίζεται αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση για όλα τα βυθίσµατα αναµεµειγµένου προτύπου, καθώς δεν υπολογίζονται οι τιµές Ct και το αναµεµειγµένο πρότυπο είναι άκυρο. Αυτό σηµαίνει ότι η ανάλυση ορού ελέγχου δεν εκτελείται σωστά. 6.4.1.2. EXO_FAIL-Αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση εµφανίζεται, εάν η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου σε ένα από τα βυθίσµατα αναµεµειγµένου προτύπου έχει τιµή κάτω από 30, καθώς το γεγονός αυτό ενδέχεται να υποδεικνύει µόλυνση PCR στο συγκεκριµένο µείγµα. Επίσης, η ένδειξη/προειδοποίηση EXO_FAIL εµφανίζεται, εάν η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής όταν υπάρχει αποτυχία µιας αντίδρασης FAM σε ένα από τα βυθίσµατα αναµεµειγµένου προτύπου. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι υπάρχει πρόσβαση µε τη συγκεκριµένη ανάλυση που µπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα. Το αναµεµειγµένο πρότυπο θεωρείται ήδη άκυρο λόγω αποτυχίας της αντίδρασης FAM. 6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE-Εάν οι τιµές Ct αναµεµειγµένου προτύπου είναι εντός ±2,00 των τιµών που παρέχονται στον πίνακα 7, η κατάσταση θεωρείται από το λογισµικό έγκυρη. Εάν η τιµή Ct είναι εκτός του αναµενόµενου εύρους, η κατάσταση θα είναι άκυρη και θα εµφανιστεί αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι υπάρχει πρόβληµα µε µια ανάλυση που µπορεί να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσµατα. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID-Στα βυθίσµατα ορού ελέγχου χωρίς πρότυπο, η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου πρέπει να δίνει θετικό αποτέλεσµα και στα 8 βυθίσµατα (Ct < 41). Εάν προκύψει αρνητικό αποτέλεσµα, εµφανίζεται αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση και η κατάσταση αναφέρεται ως άκυρη. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι υπάρχει πρόβληµα µε την ανάλυση που µπορεί να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσµατα. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID-Στα 8 βυθίσµατα ορού ελέγχου χωρίς πρότυπο, το αποτέλεσµα FAM πρέπει να είναι αρνητικό (Ct > 38). Τυχόν ενίσχυση υποδεικνύει µόλυνση. Εάν προκύψει θετικό αποτέλεσµα, θα εµφανιστεί αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση και ο ορός ελέγχου χωρίς πρότυπο θα θεωρηθεί άκυρος. 6.5. Εάν αναφερθεί άκυρη κατάσταση για ένα από τα βυθίσµατα αναµεµειγµένου προτύπου ή ορού ελέγχου χωρίς πρότυπο, στο πεδίο "Run Summary Result" θα εµφανιστεί η ένδειξη Run Invalid. Αριθµός 20 από 43

Στην περιοχή Sample Result Table, θα αναφέρονται τα ονόµατα των δειγµάτων και οι τιµές Ct ορού ελέγχου, ωστόσο η κατάσταση µετάλλαξης θα είναι invalid. Το αναµεµειγµένο πρότυπο υποδεικνύει ότι όλες οι αναλύσεις εκτελούνται σωστά. Σε αντίθετη περίπτωση, µπορεί να προκληθούν ψευδώς θετικοί ή ψευδώς αρνητικοί προσδιορισµοί µετάλλαξης. Ο ορός ελέγχου χωρίς πρότυπο υποδεικνύει ότι δεν υπάρχει µόλυνση στα κύρια µείγµατα και ότι ο εξωγενής ορός ελέγχου λειτουργεί όπως αναµένεται. 6.6. Στην απίθανη περίπτωση που το LightCycler Adapt Software εµφανίσει ένα µήνυµα σφάλµατος, ανατρέξτε στην ενότητα 12, "Τεχνική υποστήριξη". 7. Αποτελέσµατα δειγµάτων 7.1. Στην περιοχή Sample Result Table, αναφέρονται τα ονόµατα δειγµάτων από το LightCycler 480 Instrument και οι τιµές Ct ανάλυσης ορού ελέγχου. 7.2. Το LightCycler 480 Adapt Software θα υπολογίσει τις τιµές Ct και θα καθορίσει εάν ένα δείγµα είναι θετικό ή αρνητικό για µετάλλαξη βάσει των τιµών αναφοράς 1% που παρέχονται στον πίνακα 9. Πίνακας 9: Τιµές αναφοράς 1% του LightCycler Adapt Software Ανάλυση 1% delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9,09 7.3. Εάν η τιµή Ct µετάλλαξης για ένα δείγµα είναι κάτω από την αντίστοιχη τιµή αναφοράς Ct 1%, το δείγµα θεωρείται θετικό για µετάλλαξη. Το LightCycler Adapt Software θα αναφέρει τη µετάλλαξη που υπάρχει, ωστόσο µόνο µία µετάλλαξη µπορεί να αναφερθεί. Εάν υπάρχουν 2 θετικές τιµές Ct, θα αναφερθεί µόνο η µικρότερη τιµή. Θεωρείται ότι η δεύτερη τιµή έχει προκύψει λόγω διασταυρούµενης αντιδραστικότητας ενός εκκινητή µετάλλαξης που προκαλεί δέσµευση και εκκίνηση από διαφορετική µετάλλαξη. Σε σπάνιες περιπτώσεις στις οποίες υπάρχει διπλή µετάλλαξη, η κλινική απόφαση είναι ίδια όπως στην περίπτωση µίας µόνο µετάλλαξης. 7.4. Εάν οι τιµές Ct δείγµατος υπερβαίνουν τις τιµές Ct 1%, το δείγµα αναφέρεται ως αρνητικό για µετάλλαξη (ενδέχεται να περιέχει µετάλλαξη, ωστόσο σε επίπεδο κάτω των ορίων του κιτ). Αριθµός 21 από 43

7.5. Ενδείξεις/Προειδοποιήσεις 7.5.1. Το LightCycler Adapt Software εµφανίζει διάφορες ενδείξεις/προειδοποιήσεις για τα δείγµατα στην περιοχή Sample Result Table όπως περιγράφεται στον πίνακα 10. Πίνακας 10: Ενδείξεις/προειδοποιήσεις δειγµάτων του LightCycler Adapt Software Ένδειξη/Προειδοποίηση Σηµασία REP_DILUTION Η τιµή Ct ορού ελέγχου είναι κάτω από 24. CONF_LEVEL Η τιµή Ct ορού ελέγχου είναι πάνω από 28,9 και δεν αναφέρεται µετάλλαξη. LIMITED Η τιµή Ct ορού ελέγχου είναι πάνω από 35. EXO_FAIL Η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής, όταν η αντίδραση FAM δεν είναι επίσης επιτυχής σε µια αντίδραση µετάλλαξης ή η τιµή Ct εξωγενούς ορού ελέγχου είναι κάτω από 30. FAIL Το λογισµικό δεν µπορεί να προσδιορίσει µια καµπύλη ως θετική ή αρνητική. 7.5.2. Η σηµασία των ενδείξεων/προειδοποιήσεων περιγράφεται πιο λεπτοµερώς παρακάτω: 7.5.2.1. REP_DILUTION-Τιµή Ct ορού ελέγχου < 24. Οι αναλύσεις είναι έγκυρες όταν το επίπεδο DNA δίνει τιµή Ct ορού ελέγχου 24 και άνω. Εάν ένα δείγµα δίνει χαµηλότερη τιµή Ct ανάλυσης ορού ελέγχου, θα πρέπει να αραιωθεί, ώστε να διασφαλιστεί ότι βρίσκεται εντός του έγκυρου εύρους εργασίας. 7.5.2.2. CONF_LEVEL-Τιµή Ct ορού ελέγχου > 28,9. Σε ένα αρνητικό δείγµα µε τιµή Ct ορού ελέγχου > 28,9, εµφανίζεται η ένδειξη/προειδοποίηση CONF_LEVEL. Οι τιµές Ct µετάλλαξης ταξινοµούνται ως αρνητικές ή εκτός των ορίων του κιτ, εάν είναι µεγαλύτερες ή ίσες µε 38. Πρέπει να παρέχεται τιµή Ct ορού ελέγχου 28,9 ή µικρότερη, ώστε το DNA να επαρκεί για ανίχνευση µετάλλαξης 1%, βάσει των τιµών αναφοράς 1% και της τιµής αναφοράς Ct 38. Εάν η τιµή Ct ορού ελέγχου είναι µεγαλύτερη από 28,9 και ανιχνευτεί µετάλλαξη, η θετική µετάλλαξη αναφέρεται και αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση δεν εµφανίζεται, καθώς είναι βέβαιο ότι το συγκεκριµένο δείγµα περιέχει µετάλλαξη. Ωστόσο, εάν η τιµή Ct ορού ελέγχου είναι µεγαλύτερη από 28,9 και το δείγµα φαίνεται αρνητικό για µετάλλαξη, αυτή η ένδειξη/προειδοποίηση εµφανίζεται, καθώς ενδέχεται να µην ήταν δυνατή η ανίχνευση µεταλλάξεων χαµηλού επιπέδου. Όταν η τιµή Ct ορού ελέγχου αυξάνεται πάνω από 28,9, η ευαισθησία της ανίχνευσης µετάλλαξης µειώνεται. Αριθµός 22 από 43

7.5.2.3. LIMITED-Τιµή Ct ορού ελέγχου > 35. Υποδεικνύει ότι η διαθέσιµη ποσότητα ενισχύσιµου DNA είναι εξαιρετικά µικρή και, συνεπώς, µπορούν να ανιχνευτούν µόνο µεταλλάξεις υψηλού ποσοστού. Στα δείγµατα µε την ένδειξη LIMITED, εάν µια θετική µετάλλαξη δίνει τιµή Ct < 38, η κατάσταση µετάλλαξης θεωρείται έγκυρη και η µετάλλαξη θα αναφερθεί. Η παρουσία µεταλλάξεων χαµηλού επιπέδου σε ένα δείγµα µε αρνητικό αποτέλεσµα και ένδειξη/προειδοποίηση LIMITED δεν µπορεί να αποκλειστεί. 7.5.2.4. EXO_FAIL-Το λογισµικό ελέγχει εάν έχει εκτελεστεί ενίσχυση της ανάλυσης εξωγενούς ορού ελέγχου, ώστε να καθοριστεί, εάν θα µπορούσε να υπάρχει αναστολέας που µπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικό αποτέλεσµα. Χρησιµοποιείται η παρακάτω µεθοδολογία: a. Η αντίδραση εξωγενούς ορού ελέγχου θα αξιολογηθεί µόνο στα βυθίσµατα αντίδρασης µετάλλαξης και όχι στο βύθισµα ανάλυσης ορού ελέγχου, µε εξαίρεση τις στήλες αναµεµειγµένου προτύπου και NTC (ανατρέξτε στο σηµείο 6) ή εάν υπάρχει τιµή Ct εξωγενούς ορού ελέγχου < 30. b. Εάν ανιχνευτεί θετική µετάλλαξη, αλλά η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής στο θετικό για µετάλλαξη βύθισµα, η ένδειξη/προειδοποίηση EXO_FAIL δεν εµφανίζεται, καθώς θα µπορούσε να υπάρχει ανταγωνιστική αναστολή από την αντίδραση FAM. Η κατάσταση µετάλλαξης είναι έγκυρη. c. Εάν ανιχνευτεί θετική µετάλλαξη για ένα δείγµα σε ένα βύθισµα µετάλλαξης και η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής σε ένα άλλο βύθισµα για το ίδιο δείγµα, θα αναφερθεί η µετάλλαξη για το πρώτο βύθισµα και το αποτέλεσµα θα είναι έγκυρο. Ωστόσο, η ένδειξη/προειδοποίηση EXO_FAIL θα εµφανιστεί. Η ένδειξη αυτή υποδεικνύει ότι υπάρχει πρόβληµα µε την ανάλυση στο βύθισµα στο οποίο η ανάλυση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής και ενδέχεται να υπάρχει µετάλλαξη στο συγκεκριµένο βύθισµα που δεν έχει ανιχνευτεί. Είναι πιθανό η µετάλλαξη που έχει προσδιοριστεί να οφείλεται σε διασταυρούµενη αντιδραστικότητα µεταξύ των αναλύσεων και να µην πρόκειται για πραγµατική µετάλλαξη που δεν έχει ανιχνευτεί. Ωστόσο, η κατάσταση µετάλλαξης στην ανάλυση µε θετική µετάλλαξη παραµένει έγκυρη, καθώς είναι σαφές ότι υπάρχει µετάλλαξη και η κλινική απόφαση παραµένει ίδια, ανεξάρτητα από τον τύπο της µετάλλαξης που υπάρχει. Αριθµός 23 από 43

d. Εάν το δείγµα είναι αρνητικό, αλλά η αντίδραση εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχής σε µια από τις αναλύσεις µετάλλαξης, θα εµφανιστεί η ένδειξη/προειδοποίηση EXO_FAIL και η κατάσταση θα είναι άκυρη. Είναι πιθανό να υπάρχει µετάλλαξη που δεν έχει ανιχνευτεί. e. Εάν η τιµή Ct εξωγενούς ορού ελέγχου είναι < 30 σε ένα από τα 8 βυθίσµατα, θα εµφανιστεί η ένδειξη/προειδοποίηση EXO_FAIL και η κατάσταση θα είναι άκυρη. Είναι πιθανό να υπάρχει µόλυνση των προϊόντων PCR στη συγκεκριµένη ανάλυση. f. Μπορείτε να ελέγξετε το αρχείο ανάλυσης του LightCycler 480 Instrument, για να διαπιστώσετε ποια είναι η πιθανή αιτία για την αποτυχία της ανάλυσης εξωγενούς ορού ελέγχου. Εάν όλες οι αντιδράσεις εξωγενούς ορού ελέγχου δεν είναι επιτυχείς σε µια στήλη, µπορεί να υπάρχει αναστολέας. Εάν υπάρχει αποτυχία σε 1 µόνο βύθισµα, ενδέχεται να υπάρχει πρόβληµα στην προετοιµασία της πλάκας. 7.5.2.5. FAIL-Η ένδειξη/προειδοποίηση FAIL εµφανίζεται, όταν το λογισµικό δεν µπορεί να προσδιορίσει µια καµπύλη ενίσχυσης ως θετική ή αρνητική, για παράδειγµα, εάν το σχήµα της καµπύλης δεν είναι φυσιολογικό. 7.5.3. Το LightCycler Adapt Software ελέγχει εάν το όνοµα δείγµατος σε µια στήλη είναι ίδιο, ώστε να διασφαλιστεί ότι οι τιµές Ct ανάλυσης µετάλλαξης και ορού ελέγχου που χρησιµοποιούνται για τον υπολογισµό των τιµών Ct ανήκουν στο ίδιο δείγµα. Τα ονόµατα δειγµάτων προέρχονται από την οθόνη επεξεργασίας δειγµάτων του LightCycler 480 Instrument στο αρχείο ανάλυσης πειράµατος. Εάν υπάρχει εσφαλµένη αντιστοίχιση στη στήλη, το λογισµικό εµφανίζει την ένδειξη SAMPLE MISMATCH στη στήλη "Sample Name" στην περιοχή "Sample Result Table". Στη διάταξη πλάκας, το λογισµικό εµφανίζει το όνοµα δείγµατος το οποίο ακολουθείται από την ένδειξη (MISMATCH). Εάν πρόκειται για τυπογραφικό λάθος, το όνοµα µπορεί να διορθωθεί στο αρχείο ανάλυσης του LightCycler 480 Instrument και τα δεδοµένα µπορούν να υποβληθούν σε εκ νέου ανάλυση µε το LightCycler Adapt Software. Ρύθµιση πειράµατος στο ABI7500 Για κάθε δείγµα DNA, οι αναλύσεις ορού ελέγχου και µετάλλαξης πρέπει να πραγµατοποιηθούν στην ίδια ανάλυση PCR, ώστε να αποφευχθούν διακυµάνσεις µεταξύ αναλύσεων. Αριθµός 24 από 43

1. Αποψύξτε τα µείγµατα αντίδρασης και το αναµεµειγµένο πρότυπο από το Κιτ K-RAS σε θερµοκρασία δωµατίου. Αναµείξτε κάθε διάλυµα ανακινώντας κάθε σωληνάριο 10 φορές µετά την απόψυξη, ώστε να αποφευχθεί η δηµιουργία τοπικών συγκεντρώσεων αλάτων. Προετοιµάστε επαρκή µείγµατα για τα δείγµατα DNA, το αναµεµειγµένο πρότυπο και τους ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο, καθώς και 2 επιπλέον αντιδράσεις ανά µείγµα όπως αναφέρεται στον πίνακα 11. Πίνακας 11: Όγκοι κύριου µείγµατος K-RAS Ανάλυση Ανάλυση ορού ελέγχου Αναλύσεις µετάλλαξης Μείγµα αντίδρασης (µl)x1 Κύρια µείγµατα Μείγµα Taq (µl)x1 αντίδρασης (µl) ανά πλάκα (x14) Taq (µl) ανά πλάκα (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. ΜΗ στροβιλίζετε την Taq πολυµεράση ή τυχόν µείγµατα αντίδρασης που περιέχουν Taq πολυµεράση, καθώς µπορεί να προκληθεί αδρανοποίηση του ενζύµου. 3. Βεβαιωθείτε ότι η Taq πολυµεράση βρίσκεται σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη χρήση. Περιστρέψτε το φιαλίδιο, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλη η Taq πολυµεράση έχει συγκεντρωθεί στον πυθµένα του φιαλιδίου και, στη συνέχεια, διοχετεύστε την τοποθετώντας το άκρο της πιπέτας ακριβώς κάτω από την επιφάνεια της Taq πολυµεράσης, ώστε να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος επικάλυψης του άκρου µε υπερβολική ποσότητα Taq πολυµεράσης. 4. Αναµείξτε τα κύρια µείγµατα αναρροφώντας και διοχετεύοντας προσεκτικά µε πιπέτα. 5. Προσθέστε αµέσως 20 µl των κύριων µειγµάτων στα βυθίσµατα αντίδρασης. 6. Προσθέστε αµέσως 5 µl δείγµατος, αναµεµειγµένου προτύπου ή νερού (για τους ορούς ελέγχου χωρίς πρότυπο) στα βυθίσµατα αντίδρασης. Κάθε δείγµα DNA πρέπει να υποβληθεί σε εξέταση τόσο µε την ανάλυση ορού ελέγχου όσο και µε τις αναλύσεις µετάλλαξης. Η διάταξη της πλάκας αναφέρεται στον πίνακα 12. Αριθµός 25 από 43

Πίνακας 12: ιάταξη πλάκας K-RAS στο ABI7500 διάταξη 96 βυθισµάτων Ανάλυση 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Αναµεµειγµένο Ορός πρότυπο ελέγχου B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL Η 13ASP Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο Αναµεµειγµένο πρότυπο NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 NTC είγµα 1 είγµα 2 είγµα 3 είγµα 4 είγµα 5 είγµα 6 είγµα 7 είγµα 8 είγµα 9 είγµα 10 7. Σφραγίστε και περιστρέψτε για σύντοµο διάστηµα την πλάκα PCR, ώστε τα αντιδραστήρια να συγκεντρωθούν στον πυθµένα των βυθισµάτων. 8. Τοποθετήστε αµέσως την πλάκα στο ABI7500 instrument. Ρύθµιση ABI7500 Instrument 1. Επιλέξτε το εικονίδιο του 7500 System Software στην επιφάνεια εργασίας του σταθµού εργασίας που είναι συνδεδεµένος στο όργανο. Ανοίξτε ένα νέο αρχείο ανάλυσης από το µενού "file" χρησιµοποιώντας το 7500 Sequence Detection Software version 1.4. 2. Στην περιοχή Assay, επιλέξτε Standard Curve (Absolute Quantification). Στην περιοχή Run Mode, επιλέξτε Standard 7500. 3. Μεταβείτε στο παράθυρο ρύθµισης ανιχνευτή επιλέγοντας το κουµπί Next. Προσθέστε τους ανιχνευτές FAM και JOE στη λίστα ανιχνευτών, επιλέγοντας τη ρύθµιση none για τους παρεµποδιστές. Εάν οι ανιχνευτές αυτοί δεν υπάρχουν ήδη, επιλέξτε το κουµπί New Detectors και ρυθµίστε τους ανιχνευτές FAM και JOE, ορίζοντας τη ρύθµιση none για τον παρεµποδιστή. 4. Ρυθµίστε την παράµετρο Passive Reference σε None και επιλέξτε το κουµπί Next. 5. Επιλέξτε ολόκληρη την πλάκα και τα πλαίσια ελέγχου για τους ανιχνευτές FAM και JOE, ώστε να βεβαιωθείτε ότι παρακολουθούνται και οι δύο χρωστικές σε κάθε βύθισµα. Επιλέξτε το κουµπί Finish. 6. Στην καρτέλα Instrument, ρυθµίστε την κυκλοποίηση όπως αναφέρεται στον πίνακα 13. Αριθµός 26 από 43