Κεφάλαιο 18. Προσδιορισμός των πρωτεϊνικών δομών

Κεφάλαιο 18 Προσδιορισμός των πρωτεϊνικών δομών

Κεφάλαιο 18 Προσδιορισμός των Πρωτεϊνικών Δομών Κρυσταλλογραφία Ακτίνων-Χ & Φασματοσκοπία ΝΜR Πλεονεκτήματα - Μόρια, Μοριακά Σύμπλοκα ΜΒ>>100kDa!!! - Δεν απαιτείται κρυστάλλωση -Tαχύτητα όταν υπάρχουν κρύσταλλοι - Διαλύματα. Υδατικά ή μη - Εξέλιξη τεχνικής - Μεγάλη κλίμακα πειραματικών συνθηκών (θερμοκρασία, ph, ιονική ισχύς κ.λπ.) - Δυναμική συμπεριφορά βιομορίων (κινητικότητα, χημική ισορροπία, unfolding) - Σύγκριση μεταξύ δομών NMR και X-ray Δομικές διαφορές σε Στερεά Κατάσταση & Διάλυμα Μειονεκτήματα - Υψηλή συγκέντρωση αλάτων - Μέγεθος μορίων Τώρα : 35-50kDa - Κρυστάλλωση Βιομορίου *** Μέλλον : 100-150kDa - Εμπλουτισμός Βιομορίου σε 13 C, 15 N & 2 Η (για βιομόρια > 10-12 kda)

Κεφάλαιο 18 Προσδιορισμός των Πρωτεϊνικών Δομών μέσω NMR Τεχνολογία Χρονική Διάρκεια Μελέτης - Πρωτεΐνες ~ 100 AA (12kDa) - 1 H 2D NMR 12-36 months - ~ 120-260 AA (15-35kDa) - 15 N, 13 C, 2 H 3D, 4D NMR > 36 months - Πεπτίδια ~ 40-50 AA (5-6kDa) - 1 H, 1 H- 13 C/ 15 N 2D NMR 2-3 months - ~ 10-15 AA (1-2kDa) - 1 H, 1 H- 13 C/ 15 N 2D NMR 2-3 weeks

Κεφάλαιο 18 Προσδιορισμός των Πρωτεϊνικών Δομών μέσω NMR Iστορία & Mεθοδολογία Αποτίμηση Δομικές Πληροφορίες Υπολογισμοί Δομής Βελτιστοποίηση Από 2D NMR φάσματα σε...3d δομές σε διάλυμα Complete Sequence-Specific Resonance assignments σε βιομόρια (K. Wüthrich In NMR of Proteins and Nucleic Acids, 1986) Prof Richard Ernst ETH, Zűrich Prof Kurt Wűthrich ETH, Zűrich & Scripps, California Nobel Prize 1991 Nobel Prize 2002

Κεφάλαιο 18 Ανατομία ενός πειράματος NMR μιας διάστασης * 1D Experiment - Pulse Sequence Ανατομία ενός 1D πειράματος NMR FT n FID : Ελεύθερη Επαγωγική απόσβεση Η περιστροφή το διάνυσμα της μαγνήτισης περιστρέφεται γύρω από τον άξονα z με συχνότητα Larmor και δημιουργεί σήμα ραδιοσυχνότητας το οποίο ανιχνεύεται στην κατά την διεύθυνση του άξονα x. Όσο η αποδιέγερση προχωρεί, το σήμα ελαττώνεται εκθετικά σε συνάρτηση με τον χρόνο και αποδίδει την ελεύθερη επαγωγική απόσβεση (free induction decay, FID). **Επανάληψη της εφαρμογή παλμών για βελτίωση του λόγου σήματος-προς-θόρυβο** Preparation : spinsystem is set to a state FT : Μετασχηματισμός Fourier Μαθηματική επεξεργασία του σήματος - μετατρέπει το σήμα από το πεδίο του χρόνου 90 : magnetization Mz (or M 0) onto xy plane(mxy) στο πεδίο των συχνοτήτων ώστε να ειναι πιο εύκολη η ψηφιακή επεξεργασία του. FT της FID Signal αποδίδει decays το κλασσικό due to T2 μονοδιάστατο relaxation (Free φάσμα Induction NMR Decay) Detection : signal is recorded

Κεφάλαιο 18 Φάσματα NMR μιας διάστασης Εικόνα 18.16 Μονοδιάστατα φάσματα NMR. (a) Φάσμα 1H-NMR της αιθανόλης. Σ αυτό το μικρό μόριο, τα σήματα NMR (χημικές μετατοπίσεις, chemical shifts) είναι με σαφήνεια διαχωρισμένα για όλα τα άτομα υδρογόνου. Σ αυτό το φάσμα, το σήμα από τα πρωτόνια του CH3 διαχωρίζονται σε τρεις κορυφές, ενώ το σήμα από τα πρωτόνια του CH2 σε τέσσερις, οι οποίες βρίσκονται κοντά η μία στην άλλη εξαιτίας των πειραματικών συνθηκών. (b) Φάσμα 1H-NMR μιας μικρής πρωτεΐνης, της C-τελικής επικράτειας μιας κυτταρινάσης, η οποία αποτελείται από 36 αμινοξέα. Τα σήματα NMR από πολλά διαφορετικά υδρογόνα επικαλύπτονται και προκύπτουν κορυφές που περιέχουν σήματα από πολλά άτομα υδρογόνου. (Ευγενική προσφορά του Per Kraulis, Uppsala, από δεδομένα που δημοσιεύτηκαν από τους Kraulis et al., Biochemistry 28: 7241-7257, 1989.)

Κεφάλαιο 18 Ανατομία ενός πειράματος NMR δύο διαστάσεων * 2D Homonuclear Experiment - Pulse Sequence Ανατομία ενός 2D πειράματος NMR FT Preparation : spinsystem is set to a state Εικόνα 18.17 Δισδιάστατο φάσμα NMR της C-τελικής επικράτειας μιας κυτταρινάσης. Οι κορυφές κατά μήκος της διαγωνίου αντιστοιχούν στο φάσμα της Εικόνας 18.16b. Οι κορυφές εκτός διαγωνίου σ αυτό το φάσμα ΝΟΕ αντιπροσωπεύουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ ατόμων υδρογόνου που βρίσκονται σε απόσταση μικρότερη των 5 Å το ένα από το άλλο. Από ένα τέτοιο φάσμα μπορεί κανείς να εξαγάγει συμπεράσματα τόσο για τη δευτεροταγή όσο και για την τριτοταγή δομή της πρωτεΐνης. (Ευγενική προσφορά του Per Kraulis, Uppsala.) 90 : magnetization Mz (or M 0) onto xy plane(mxy) Evolution : During t1 spins are labelled according to the chemical shift of the first nucleus Mixing Time: Magnetization is transferred from the 1st nucleus to a 2nd Different mechanisms ( scalar/dipolar) - Different Experiments Detection : Acquisition of data. Spins are labelled according to the chemical shift of the second nucleus & Signal decays due to T 2 relaxation (Free Induction Decay)

Κεφάλαιο 18 Κλασικά NMR πειράματα δύο διαστάσεων Mixing Τα πειράματα Time: Magnetization όμο- ή έτερο- πυρηνικής is transferred συσχέτισης from χαρακτηρίζονται the 1st nucleus μεταξύ to a 2nd άλλων από τον μηχανισμό Different της mechanisms αλληλεπίδρασης ( scalar/dipolar των πυρήνων )(της - Different μαγνήτισής Experiments τους). Αυτή μπορεί αν συμβαίνει είτε μέσω δεσμών είτε μέσωχώρου καταγράφονται ** COSY ( scalar Μέσω Δεσμών ), TOCSY ( Μέσω scalar Δεσμών ) & NOESY ( dipolar) Μέσω Χώρου aliph.-hn aliph.-hα Aliphatic Hα HN Hα Hα Hα aliph. aromatic HO 2 HN HN Hα HN HN aliph.

Κεφάλαιο 18 Βασικά στάδια στον Προσδιορισμό Δομών μέσω NMR Το πρώτο στάδιο μετά την καταγραφή των 2D NMR φασμάτων είναι η ταυτοποίηση ενδο-αμινοξικών συζεύξεων με την χρήση φασμάτων COSY/TOCSY, (spin pattern). Στη συνέχεια τα δεδομένα των φασμάτων COSY/TOCSY μεταφέρονται στα φάσματα NOESY, όπου οι συζεύξεις προκύπτουν από την αλληλεπίδραση πρωτονίων μέσω του χώρου όταν οι πυρήνες βρίσκονται σε απόσταση <5.0-5.5 Å. Το δεύτερο στάδιο είναι η εξαγωγή γεωμετρικών πληροφοριών μέσω: ακολουθιακών συζεύξεων (ΝΗ, Ηα, πρωτεϊνικός σκελετός), συζεύξεις μεταξύ πρωτονίων πλευρικών ομάδων, συζεύξεις μέσης απόστασης και μακρινής απόστασης. σταθερές σύζευξης, αντιπροσωπευτικές για δίεδρες γωνίες του σκελετού της πρωτεΐνης, φ & ψ και χαρακτηριστικές για την 2ταγή δομή της. Το τρίτο στάδιο είναι η μετατροπή της έντασης του σήματος ΝΟΕ σε περιοριστικούς όρους απόστασης (υπό μορφή ανώτατων ορίων διατομικών αποστάσεων) και η εισαγωγή των γεωμετρικών δεδομένων σε προγράμματα υπολογισμού της δομής. Το τέταρτο στάδιο είναι ο υπολογισμός της δομής με όλα τα NMR πειραματικά δεδομένα που εξήχθησαν, (αποστάσεις, J-συζεύξεις, δίεδρες γωνίες, κλπ.) μέσω υπολογιστικών προγραμμάτων (μοριακή δυναμική, προσομοίωση ανόπτησης κ.λ.π.). Υπολογίζονται τα τα πιθανά διαμορφομερή που ικανοποιούν τις συγκεκριμένες γεωμετρικές παραμέτρους. Το πέμπτο και τελικό στάδιο περιλαμβάνει τη βελτιστοποίηση των υπολογισμένων δομών μέσω Μοριακής Μηχανικής ή/και Δυναμικής (λογισμικό AMBER) και την ποιοτική τους αξιολόγηση (λογισμικό Procheck).

Κεφάλαιο 18 Κλασικά NMR πειράματα δύο διαστάσεων Εικόνα 18.18 (a) Πειράματα COSY NMR δίνουν σήματα που αντιστοιχούν σε άτομα υδρογόνου τα οποία είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένα μέσω ενός ή δύο άλλων ατόμων. Εφόσον τα άτομα υδρογόνου γειτονικών αμινοξέων είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένα τουλάχιστον μέσω τριών άλλων ατόμων (για παράδειγμα, HCα- C -NH), τα σήματα COSY αποκαλύπτουν αλληλεπιδράσεις μόνο μεταξύ ατόμων υδρογόνου του ιδίου αμινοξικού καταλοίπου. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις είναι διαφορετικές για διαφορετικές πλευρικές ομάδες. Συνεπώς, τα σήματα NMR δίνουν ένα αποτύπωμα κάθε αμινοξέος. Στο διάγραμμα φαίνονται τα αποτυπώματα (κόκκινο) των καταλοίπων Ala και Ser. (b) Tα πειράματα NOE NMR δίνουν σήματα που αντιστοιχούν σε άτομα υδρογόνου τα οποία βρίσκονται κοντά στο χώρο (λιγότερο από 5 Å), ακόμα και αν είναι απομακρυσμένα στην αμινοξική αλληλουχία. Τόσο οι δευτεροταγείς όσο και οι τριτοταγείς δομές μικρών πρωτεϊνών μπορούν να συναχθούν από μια συλλογή τέτοιων σημάτων, που καθορίζουν περιορισμούς στην απόσταση μεταξύ ενός αριθμού ατόμων υδρογόνου της πολυπεπτιδικής αλυσίδας.

Κεφάλαιο 18 Κλασικά NMR πειράματα δύο διαστάσεων TOCSY Αλληλεπίδρασης μέσω δεσμών (σε απόσταση έως 4/5 δεσμών) Αναγνώριση Χαρακτηριστικών ομάδων σημάτων, π.χ. Αμινοξέα Ταυτοποίηση αμινοξέων Χαρακτηριστικές ομάδες σημάτων για κάποια αμινοξέα Μεταφορά δεδομένων στα NOESY Φάσματα

Κεφάλαιο 18 Κλασικά NMR πειράματα δύο διαστάσεων NOESY Αναγνώριση NMR σημάτων που οφείλονται σε Η-Η «ακολουθιακές συζεύξεις», π.χ. ΝΗ ΝΗi+1 & Hα ΝΗi+1 i Αναγνώριση σημάτων που οφείλονται σε Η-Η συζεύξεις που βρίσκονται σε κοντινή μέση και μακρινή απόσταση (μέχρι 5.5 Å)... ανάμεσα σε πρωτόνια του ίδιου ή διαφορετικών αμινοξέων NOEij ~1/r 6 ij Μέτρηση της έντασης των σημάτων Ολοκλήρωση Έντασης Βαθμονόμηση Εξαγωγή Γεωμετρικών αποστάσεων (ανώτατα όρια αποστάσεων)

Κεφάλαιο 18 Αποτίμηση NMR σημάτων και συσχέτιση με την δομή βιομορίων Εικόνα 18.19 (a) Γειτονικά κατάλοιπα στην αμινοξική αλληλουχία μιας πρωτεΐνης μπορούν να ταυτοποιηθούν από τα φάσματα ΝΟΕ. Το άτομο υδρογόνου που βρίσκεται στο κατάλοιπο i+1 (πορτοκαλί) βρίσκεται κοντά και αλληλεπιδρά (μοβ βέλη) με τα άτομα υδρογόνου των Ν, Cα, Cβ του καταλοίπου i(ανοιχτό πράσινο). Αυτές οι αλληλεπιδράσεις δίνουν κορυφές στο φάσμα ΝΟΕ οι οποίες ταυτοποιούν γειτονικά κατάλοιπα και χρησιμοποιούνται για την εύρεση της ακριβούς θέσης στην αλληλουχία της πρωτεΐνης των αμινοξικών αποτυπωμάτων που παράγονται από ένα φάσμα COSY. (b) Οι περιοχές δευτεροταγούς δομής σε μια πρωτεΐνη χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ατόμων υδρογόνου που δε βρίσκονται σε γειτονικά κατάλοιπα. Το αποτέλεσμα είναι να προκύπτουν χαρακτηριστικά μοτίβα κορυφών σε ένα φάσμα ΝΟΕ. Σε περιοχές αντιπαράλληλων β-πτυχωτών επιφανειών αναπτύσσονται αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ατόμων Cα-Η παρακείμενων κλώνων (ροζ βέλη), μεταξύ των ατόμων Ν-Η και Cα-H (σκούρο μοβ βέλος) και μεταξύ των ατόμων Ν-Η γειτονικών κλώνων (ανοιχτό μοβ βέλος). Το αντίστοιχο μοτίβο των κορυφών σε ένα φάσμα ΝΟΕ ταυτοποιεί τα κατάλοιπα που σχηματίζουν την αντιπαράλληλη β-πτυχωτή επιφάνεια. Οι παράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες και οι α-έλικες ταυτοποιούνται με παρόμοιο τρόπο.

Κεφάλαιο 18 Σταθερές σύζευξης (J-couplings) 3 JHaΗΝ σταθερές σύζευξης. Οι σταθερές σύζευξης παρέχουν πληροφορίες για την σχετική διαμόρφωση των δίεδρων γωνιών, π.χ. 3 J συζεύξεις μεταξύ Hα και ΗΝ της πεπτιδικής αλυσίδας. Απλές μαθηματικές σχέσεις συνδέουν τις J και τις δίεδρες γωνίες φ και ψ ( εξίσωση Karplus): 3 JHαΗΝ = 6,4 cos2 θ 1,4 cosθ + 1,9, όπου θ = φ 60 ενώ η φ λαμβάνει τιμές για όλα τα αμινοξέα εκτός της γλυκίνης (Gly) από -30 έως 180. Η σχέση ανάμεσα στην 2ταγή δομή, της γωνίας φ και της 3JHαΗΝ έχει ως εξής: α-έλικα (φ = -57 ), 3 JHαΗΝ = 3,9 Hz 310-έλικα (φ = -60 ), 3 JHαΗΝ = 4,2 Hz Αντιπαράλληλη β-επιφάνεια (φ = -139 ), 3 JHαΗΝ = 8,9 Hz Παράλληλη β-επιφάνεια (φ = -119 ), 3 JHαΗΝ = 9,7 Hz

Κεφάλαιο 18 Χημικές μετατοπίσεις και 2ταγής Δομή Ανάλυση των χημικών μετατοπίσεων πρωτονίων H και ΗΝ (Chemical Shift Index). Βασίζεται στην ανάλυση των χημικών μετατοπίσεων των πυρήνων πρωτονίων Ηα και ΗΝ, καθώς και των πυρήνων άνθρακα Cα, CO και Cβ των αμινοξέων. Η συσχέτιση των πρωτεϊνικών δομών οι οποίες υπολογίστηκαν μέσω NMR και των χημικών μετατοπίσεων των πυρήνων τους έχει αποδείξει ότι οι χημικές μετατοπίσεις των Hα και ΗΝ πρωτονίων συνδέονται άμεσα με τα στοιχεία της 2ταγούς δομής της πρωτεΐνης, όπου βρίσκονται οι συγκεκριμένοι πυρήνες Θέση Πρωτονίου NH Hα α-έλικα βπτύχωση - Τυχαίο Σπείραμα δ (ppm) 9 8 5 4 3 Σχηματική απεικόνιση της σχέσης δευτεροταγούς δομής και της στατιστικής κατανομής τιμών χημικής μετατόπισης των Hα και ΗΝ πρωτονίων του πεπτιδικού σκελετού.

Κεφάλαιο 18 Διαμορφωτική Μελέτη μέσω NMR Sequential NOEs 3 J Hα-ΗΝ α-helix 3 J Hα-HN couplings 3 JHα-ΗΝ (Hz) β-sheet α-helix β-sheet ΔΗα & CSI analysis ΔHα (ppm) α-helix

Κεφάλαιο 18 Οικογένεια Δομών υπολογισμένη με NMR δεδομένα Εικόνα 18.20 Το δισδιάστατο φάσμα NMR της Εικόνας 18.17 χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί ένας αριθμός περιορισμών στις αποστάσεις μεταξύ διαφορετικών ατόμων υδρογόνου κατά μήκος της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της C-τελικής επικράτειας της κυτταρινάσης. Στo διάγραμμα φαίνεται η υπέρθεση δέκα δομών οι οποίες ικανοποιούν εξίσου καλά τους περιορισμούς της απόστασης. Αυτές οι δομές είναι αρκετά όμοιες, εφόσον ένας μεγάλος αριθμός από τους περιορισμούς προσδιορίστηκαν πειραματικά. (Ευγενική προσφορά του P. Kraulis, Uppsala, από δεδομένα που δημοσιεύτηκαν στο άρθρο των P. Kraulis et al., Biochemistry 28: 7241-7257, 1989).

Κεφάλαιο 18 Οικογένεια Δομών υπολογισμένη με NMR δεδομένα Οικογένεια 40 NMR δομών του κυτοχρώματος c Μέση δομή του κυτοχρώματος c 1 Rmsd = Σ( r - r ) N N i i 2 i=1

Κεφάλαιο 18 Σχέσεις Δομής-Δραστικότητας και σχεδιασμού νέων μορίων Μεγάλα Μόρια Ένζυμα, Πρωτεΐνες, Υποδοχείς, DNA, RNA... Μικρά Μόρια Πεπτίδια, Οργανικά Μόρια Υβριδικά Ανάλογα Πεπτιδίων... ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΔΟΜΗ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ Σύμπλοκα Ένζυμα-Υποστρώματα/ Αναστολείς Υποδοχείς-Ορμόνες ΣΥΝΘΕΣΗ Μελέτη αλληλεπίδρασης μορίων μέσω NMR NMR ιδιότητες των βιομακρομορίων και των μικρών μορίων: Όταν ένα μικρό μόριο, προσδέτης (Π), δεσμεύεται σε ένα μακρομοριακό υποδοχέα (Υ), τότε οι ιδιότητες του Υ μεταφέρονται στο Π και συνεπώς αλλάζουν και οι NMR ιδιότητες του. Kd: σταθερά διάστασης του Υ-Π συμπλόκου, Kon :σταθερά σχηματισμού του Υ-Π συμπλόκου, [Π] : συγκέντρωση του Π, NOE:nuclear Overhauser effect, [Υ]: συγκέντρωση του Υ.

Κεφάλαιο 18 Σχέσεις Δομής-Δραστικότητας και σχεδιασμού νέων μορίων Μεγάλα Μόρια Ένζυμα, Πρωτεΐνες, Υποδοχείς, DNA, RNA... Μικρά Μόρια Πεπτίδια, Οργανικά Μόρια Υβριδικά Ανάλογα Πεπτιδίων... ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΔΟΜΗ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ Σύμπλοκα Ένζυμα-Υποστρώματα/ Αναστολείς Υποδοχείς-Ορμόνες ΣΥΝΘΕΣΗ Αναγνώριση 1 ου σημείου δεσμευσης Διαφοροποίηση 1 ου Μορίου Βελτιστοποίηση Δέσμευσης Σχεδιασμός Δραστικών Μορίων Συγγένεια & Δοκιμές Πρόσδεσης Αναγνώριση 2 ου σημείου δεσμευσης Διαφοροποίηση 2 ου Μορίου Βελτιστοποίηση Δέσμευσης Η αναγνώριση των σημείων δέσμευσης στο μεγάλο μόριο κατευθύνει την σύνθεση μορίων με ισχυρή συγγένεια πρόσδεσης Σύνδεση των μορίων, που παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια δέσμευσης, μεταξύ τους