ρ. Κ. Γιαννακοπούλου

Transcript

1 ρ. Κ. Γιαννακοπούλου 1

2 Iστορικό 1945: Bloch, Hansen, Packard (Stanford U.), H 2 O 1945: Purcell, Torrey, Pound (Harvard U.), H 2 O, παραφίνη 1991: Richard Ernst παλµικό FT/MRI 2002: Fenn, Tanaka (MS), Wuthrich οµή βιολογικών µακροµορίων στο διάλυµα 2

3 Βασικές αρχές O Πυρηνικός Μαγνητικός συντονισµός (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) είναι ένα φαινόµενο που παρατηρείται όταν οι πυρήνες µερικών ατόµων, ευρισκόµενοι εντός στατικού οµογενούς µαγνητικού πεδίου, ταυτοχρόνως υφίστανται ένα δεύτερο παλλόµενο µαγνητικό πεδίο. Το φαινόµενο του Συντονισµού παρατηρείται σε όσους πυρήνες διαθέτουν πυρηνικό spin. 3

4 Το πυρηνικό Spin Ηλεκτρόνια, νετρόνια και πρωτόνια έχουν το καθένα spin Ι = 1/2. Όταν το συνολικό spin τουπυρήναενόςατόµου είναι 0, µπορεί να παρατηρηθεί σήµα στονμr µ Άτοµο Yδρογόνου: 1 e, 1 πρωτόνιο Συνολικό πυρηνικό spin Ι = ½ µ = µαγνητική ροπή µ = γ P (στροφορµή), P =(h/2π) Ι γ = γυροµαγνητικός λόγος 4

5 Πυρήνες σε µαγνητικό πεδίο a B 0 b Σε µαγνητικό πεδίο εντάσεως B 0, πυρήνας µε συνολικό spin I 0, (στροφορµή 0), καταλαµβάνει m I = 2Ι +1 επιτρεπτές καταστάσεις (επίπεδα) ενέργειας. Επιτρεπτές µεταβάσεις: m I =±1 Για Ι = ½, υπάρχουν δύο επιτρεπτές καταστάσεις 5

6 Ενεργειακά επίπεδα I = ½ m I = - ½ Β 0 E m I = + ½ E = h ν, ν = Συχνότητα Larmor (ω/2π) 6

7 Πυρήνες (στοιχείων) που δίνουν σήµα NMR Οι πυρήνες πρέπει να έχουν περιττό µαζικό αριθµό ή περιττό ατοµικό αριθµό Nuclei Unpaired Protons Unpaired Neutrons Net Spin γ (MHz/T) 1 H 1 0 1/ H P 0 1 1/ Na 2 1 3/ N C 0 1 1/ F 0 1 1/

8 Το µοντέλο του διανύσµατος της µαγνήτισης Κάθε µ εκτελεί µεταπτωτική κίνηση γύρω από τον άξονα z συχνότητα ω Β 0 µ Το σύνολο των µ Β 0 µ Συχνότητα Larmor : ω = - γ Β 0 Συνολική µαγνήτιση Μ (bulk magnetization) σε κατάσταση ισορροπίας Μ 0 6 8

9 Πώς παρατηρείται το σήµα NMR Συνολική µαγνήτιση (bulk magnetization) Μ (M z ) σε ισορροπία Μ z Συνολική µαγνήτιση εκτός ισορροπίας x Μ z z Β 0 Mx,y Μ y Β 0 Παλµός! (Ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία rf διάρκειας µs) Η αποδιέγερση επάγει ρεύµα στο εξωτερικό κάθετο πηνίο ΝΜR Signal! Μ z Larmor : ω = - γβ 0 ή ν = - (γ/2π )Β 0 Συνθήκη συντονισµού 9

10 Παλµοί Η βασική ακολουθία: n 10

11 Εκτροπή της Μαγνήτισης µέσω παλµού (κατά τον άξονα χ) B 0 -παλµός -ανίχνευση B 1 Περιστρεφόµενο πεδίο αναφοράς (rotating frame) 11

12 Εξέλιξη της Μαγνήτισης κατά τον άξονα z µετά από παλµό Free Induction Decay Fourier Transformation 12

13 Εξέλιξη της Μαγνήτισης κατά τους άξονες χ και y µετά από παλµό β ο (ανιχνεύσιµο σήµα) 13

14 Free Induction decay (FID) Σήµα Πραγµατικό y Φανταστικό χ 14

15 Aποδιέγερση (επαναφορά στην ισορροπία):δύο διαδικασίες 1. R z = 1/T 1 Αποδιέγερση spin-πλέγµατος (longitudinal) 2. R= 1/T 2 *, Αποδιέγερση spin-spin (transverse) M xy T 1 T 2 z Mz t x Mx,y y 15

16 Mηχανισµοί Aποδιέγερσης Μαγνητικά πεδία από διάφορες πηγές προκαλούν αποδιέγερση: 1.Παραµαγνητικά σωµατίδια 2. ιπολικές αλληλεπιδράσεις: γ 1, γ 2, οι δύο πυρήνες που αλληλεπιδρούν ΝΟΕ 3. Ανισοτροπία χηµικής µετατόπισης 16

17 Νuclear Overhauser Effect Aυξοµείωση σχετικών πυρηνικών πληθυσµών µέσω διπολικών αλληλεπιδράσεων (αποτέλεσµα απαγορευµένων µεταβάσεων W 0,W 2 ) Μaximum θεωρητικές τιµές NOE για διαφορετικά µεγέθη µορίων Μικρά µόρια τ c = correlation time Μεγάλα µόρια 17

18 Φάσµα NMR υδρογόνου ( 1 H NMR) µιας απλής ουσίας Ο αριθµός διαφορετικών σηµάτων αντιστοιχεί σε διαφορετικά είδη υδρογόνου στο µόριο Το εµβαδόν των σηµάτων αντιστοιχεί στον αριθµό ατόµων υδρογόνου δύο είδη πρωτονίων 18

19 Φάσµα 1 H NMR µιας απλής ουσίας τρία είδη πρωτονίων 19

20 Χηµική Μετατόπιση (Chemical Shift), δ (ppm) Τυπικές περιοχές 1 Η 20

21 Χηµική Μετατόπιση (Chemical Shift), δ (ppm) 13 C NMR 21

22 Χηµική Μετατόπιση (Chemical Shift), δ (ppm): Τυπικές περιοχές 13 C 22

23 Σύζευξη (Coupling) J (Hz): Σύστηµα δύοσπιναβ 4 συνδυασµοί αλληλεπιδράσεων = 4 ενεργειακά επίπεδα ν Β ν Α 23

24 Σύζευξη (Coupling) J (Hz): Σύστηµα τριώνσπιναβ 2 δ Β δ Α 24

25 Σύζευξη (Coupling) J (Hz): Πώς φαίνεται στη πράξη 25

26 Φασµατόµετρο: Μαγνήτης-κονσόλα 26

27 27

28 ΝΜR δύο διαστάσεων (2D ΝΜR) t 1 t 2 Relaxation (mixing) 28

29 2D ΝΜR ν Χ ν Α Α-Χ ν Χ, ν Α ν Α, ν Χ ν Α ν Χ 29

30 2D ΝΜR-βασικές ακολουθίες COSY- οµοπυρηνικός συσχετισµός χηµικών µετατοπίσεων ( 1 Η- 1 Η) ΝΟESY(ROESY) οµοπυρηνικός συσχετισµός διπολικών αλληλεπιδράσεων HSQC/HMQC (ΗΕTCORR)- ετεροπυρηνικός συσχετισµός χηµικών µετατοπίσεων ΤΟCSY- συσχετισµός χηµικών µετατοπίσεων στοίδιοσύστηµα σπιν INADEQUATE- συσχετισµός χηµικών µετατοπίσεων 13 C- 13 C (πολύ χαµηλή ευαισθησία) 30

31 2D ΝΜR-παραδείγµατα Πεπτιδική ορµόνη GnRH-βιβλιογραφία 31

32 2D ΝΜR-παραδείγµατα Πεπτιδική ορµόνη GnRH-βιβλιογραφία- 1 H 32

33 2D ΝΜR-COSY (DQF) Συσχετισµός γειτονικών πρωτονίων µέσω δεσµών 33

34 2D ΝΜR-TOCSY Συσχετισµός πρωτονίων στον ίδιο δακτύλιο (spin system) 34

35 2D ΝΜR-Συσχετισµός NOE Γειτονικών πρωτονίων µέσω χώρου 35

36 Αποτελέσµατα 2D ΝΜR- Τρισδιάστατη δοµή στο υδατικό διάλυµα 36

37 nd ΝΜR- οµή πρωτεϊνώνστο διάλυµα NMR structure of the human prion protein Zahn R., Liu A., Lührs T.,RiekR., von Schroetter C., Lopez Garcia F., Billeter M., Calzolai L., Wider G., Wüthrich K. (2000). NMR structure of the human prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(1),

38 38

39 Φάρµακα Ταξόλη: φάσµα πρωτονίου και άνθρακα back to top 39

40 13 C ΝΜR της ασπιρίνης 40

41 Το NMR στην ανάλυση κρασιού (SNIF NMR) (Site-Specific Natural Isotope Fractionation-NMR) Μετράται η κατανοµή του δευτερίου (D) στην αιθανόλη, και ανιχνεύεται η νοθεία στα κρασιά 2 ΗΝΜR φάσµα του Βacardi rum 41

42 Μαγνητική Τοµογραφία (Magnetic Resonance Imaging, MRI) Απεικόνιση ιστών σε τοµή(ές) του ανθρώπινου σώµατος, βασιζόµενη στον διαφορετικών χρόνο αποδιέγερσης του 1 Η του νερού και του λίπους στους ιστούς, και στην χωρική ανίχνευση της φάσης και συχνότητος των σηµάτων που εκπέµπονται από τους απεικονιζόµενους ιστούς. Tissue T 1 (s) T 2 (ms) White Gray Meninges Muscle Adipose

43 Μαγνητική Τοµογραφία (Magnetic Resonance Imaging, MRI) 43

44 Μαγνητική Τοµογραφία (Magnetic Resonance Imaging, MRI) 44

45 Μικροσκοπία NMR Εφαρµογή των αρχών του MRI (magnetic resonance imaging, µαγνητική τοµογραφία) στην απεικόνιση µικρών αντικειµένων. Απαιτεί ειδικό harware (οστό κουνελιού:3d απεικόνιση) 45

46 ραστηριότητες του εργαστηρίου οµικής και Υπερµοριακής Χηµείας Υπερµοριακά συστήµατα κυκλοδεξτρινών µε µικρά και µεγάλα µόρια ιαµοριακές αλληλεπιδράσεις Συσχετισµός δοµής µε ιδιότητες Σύνθεση κυκλοδεξτρινικών παραγώγων 46

47 Οι Φυσικές κυκλοδεξτρίνες Structures of Natural Cyclodextrins Rigid shape of conical cylinder due to intramolecular H-bonding 6 H 4 5 HO 3 OH 2 H H H O OH 1 O H n α CD β CD γ CD 47

48 ηµιουργία υπερµοριακού συµπλόκου µε κυκλοδεξτρίνες 48

49 Εγκλεισµός λιπόφιλων φαρµάκων Lipophilic cavity OH OH OH + Lipophilic drug Lipophilic OH OH Hydrophilic OH 1:1 complex exterior Lipophilic drug 2:1 complex K 1:1 = [ Complex ] [CD] [drug] 49

50 Moριακή Αναγνώριση Εναντιοειδική σύνδεση της φεροµόνης φύλου του dacus oleae µε µεθυλιωµένες CDs: Τhe (R)-enantiomer/TMαCD The (S)-enantiomer/TMβCD O O (R)-(-) O O (S)-(+) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2480 Αcta Crystallogr. 2001, B57,

51 ιερεύνηση πολλαπλών συµπλόκων και ισορροπιών µεταξύ κυκλοδεξτρινών και αλειφατικών αµινοξέων- ΝΜR σε υδατικό διάλυµα Ισορροπίες σε υδατικά διαλύµατα X X Y X and Y + X or Y, Y X Y X Y Y X 51

52 Συνθετικές κυκλοδεξτρίνες-ανάλυση δοµής µε NMR TOCSY F G E A D B C 52

53 Συνθετικές κυκλοδεξτρίνες-ανάλυση δοµής µε NMR COSY F G E A D B C 53

54 Σύνθεση Νέων κυκλοδεξτρινών H 2 N Br n (NH(CH 2 ) m NH 2 ) n NH(CH 2 ) m NH NH n OH OH OH OHn n n n OH OH n n βcd: n=7 γ-cd: n=8 m=2,3,6 54

55 7 9 Ανάλυση Connectivity δοµής checks µε NMR through (ΗΜΒC)... HMBC H HN 8 NH H O H9 HO 3 H H 2 OH 1 O H H5 H3 H2 H4 H6 H7 H8 8 C8 C9 C7 C6 H7-C6 C2 C5 C3 55

56 ..που δραστικά αλλάζουν την δοµή τουdna, µελέτη αυτών των αλληλεπιδράσεων (Ηλεκτροφόρηση και AFM) marker bpen bpren marker βcd βpnh 2 bpen DNA 5 kbp DNA 5 kbp/bpen 56

57 και εύκολα διαπερνούν τις κυτταρικές µεµβράνες και εισέρχονται στο κυτταρόπλασµα Aminoalkylamino cyclodextrin labeled with FITC Inside HeLa cells Fluorescent image Aminoalkylamino cyclodextrin labeled with FITC Inside HeLa cells Nucleous stained with propidium Iodide Fluorescent image 57

58 Kαλό καλοκαίρι... 58