«Αξιοποίηση Τυρογάλακτος με Παραγωγή Μέσω Ζυμώσεως Ξανθάνης Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας» Αρ. Κουπονιού: 18533131 01 000096 ΧΩΤΟΣ Α.Β.Ε.Ε. Υπεύθυνος έργου Δρ. Γούλας Παναγιώτης Εργαστήριο Προϊόντων Ζωικής Παραγωγής Τμήμα Ζωικής Παραγωγής Λάρισα, 2011
Τίτλος έργου: Αξιοποίηση Τυρογάλακτος με Παραγωγή Μέσω Ζυμώσεως Ξανθάνης Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας. 1. Εισαγωγή Η εταιρεία ΧΩΤΟΣ Α.Β.Ε.Ε. δραστηριοποιείται στην παραγωγή φέτας και άλλων τυριών ποιότητας στην περιοχή της Φαλάνης της Λάρισας. Όπως και άλλες επιχειρήσεις του κλάδου αντιμετωπίζει πρόβλημα με την διαχείριση του τυρογάλακτος που παράγεται σαν υποπροϊόν της τυροκόμησης. Στα πλαίσια της παρούσας ερευνητικής πρότασης η εταιρεία με την βοήθεια του εργαστηρίου προϊόντων ζωικής παραγωγής του Τμήματος Ζωικής Παραγωγής του ΤΕΙ Λάρισας δοκίμασε μία καινοτόμο ιδέα παραγωγής ξανθάνης με απευθείας ζύμωση της λακτόζης του τυρογάλακτος σε βιοαντιδραστήρα πλήρους ανάδευσης τύπου STR. Mε τον παραπάνω τρόπο θεωρείται ότι θα μπορέσει η επιχείρηση να αντιμετωπίσει το πρόβλημα του αποβλήτου της. Επιπρόσθετα, μεταφέροντας την εφαρμογή σε βιομηχανική κλίμακα σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης πιστεύεται ότι η επιχείρηση θα λύσει με ορθολογιστικό τρόπο το πρόβλημα του τυρογάλακτος κερδίζοντας προστιθέμενη αξία από την πώληση της παραγόμενης ξανθάνης και από την διακοπή λειτουργίας του βιολογικού καθαρισμού της που επί του παρόντος επιβαρύνει την επιχείρηση με μεγάλα λειτουργικά κόστη. 1.1 Παρουσίαση της επιχείρησης. Η ιστορία της εταιρίας Χώτος ΑΒΕΕ ξεκινά εδώ και 75 χρόνια περίπου, όταν ο παππούς Γιώργος άρχισε τη συλλογή γάλακτος και την παρασκευή τυριών στη φημισμένη ορεινή περιοχή της Σαμαρίνας. Από τότε μέχρι σήμερα επενδύοντας συνεχώς στον σύγχρονο τεχνικό εξοπλισμό και στα τελειότερα εργαστήρια ποιοτικού ελέγχου. το όνομα Χώτος έγινε σε όλη την Ελλάδα συνώνυμο της σταθερής ποιότητας των προϊόντων και της εξυπηρέτησης των πελατών της. Χρησιμοποιώντας μόνο φρέσκο παστεριωμένο πρόβειο και γίδινο γάλα παράγει παραδοσιακά Ελληνικά τυριά ανώτερης ποιότητας όπως είναι η ΦΕΤΑ το ΜΑΝΟΥΡΙ η ΜΥΖΗΘΡΑ το ΑΝΘΟΤΥΡΟ το ΒΟΥΤΥΡΟ κ.λ.π. Τελευταία η εταιρία Χώτος εξάγει τα προϊόντα της στις μεγαλύτερες και απαιτητικότερες αγορές του κόσμου όπως είναι η ΑΜΕΡΙΚΗ, η ΓΕΡΜΑΝΙΑ, η ΕΛΒΕΤΙΑ, η ΓΑΛΛΙΑ κ.λ.π. 1
1.2 Εισαγωγή. Ένας από τους κοινοτικούς στόχους είναι η ανάπτυξη της Γεωργίας και Βιομηχανίας χωρίς επιβάρυνση του περιβάλλοντος για το γενικό σύνολο. Δυστυχώς σε πολλές ευρωπαϊκές χώρες όπως και στην Ελλάδα γεωργικά παραπροϊόντα και υπολείμματα γεωργικών βιομηχανιών και δραστηριοτήτων συνήθως απορρίπτονται σαν άχρηστα και πολλές φορές αποτελούν σοβαρά προβλήματα ρυπάνσεως και μόλυνσης του περιβάλλοντος. Θα μπορούσαν όμως πολλά από αυτά μετά από κατάλληλη επεξεργασία να αποτελέσουν νέο οικονομικό πόρο υπακούοντας ταυτόχρονα στους κανόνες περιβαλλοντικής προστασίας. Η αξιοποίηση αυτών των πρώτων υλών, αποβλήτων ή παραπροϊόντων που συνήθως είναι χαμηλού ή και αρνητικού κόστους μπορεί να μειώσει το κόστος παραγωγής ανά μονάδα και ταυτόχρονα να δημιουργήσει νέες θέσεις εργασίας που θα προκύψουν από την αξιοποίηση αυτή. Μεταξύ των οργανικών στερεών ή ημι-στερεών οργανικών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων που παρουσιάζουν ενδιαφέρον από πλευράς ποσοτήτων για τον Ελλαδικό χώρο μπορούμε να αναφέρουμε τα εξής: Άχυρα δημητριακών, στελέχη καλαμποκιού και βάμβακος, υποπροϊόντα ελαιουργείων και τυροκομέίων, υπολείμματα βιομηχανιών χυμών εσπεριδοειδών και τέλος στέμφυλα οινοποιίας.τέλος η αξιοποίηση και η διαχείριση τέτοιων αγροτοβιομηχανικών υπολειμμάτων και παραπροϊόντων αποβλέπει και στην έκδοση οικολογικού σήματος (Eco-label) των προϊόντων το οποίο σήμα θα δίνεται σε εκείνα τα οποία προέρχονται από διαδικασίες με μικρή ή καθόλου περιβαλλοντική επίπτωση. 1.3 Οργάνωση και στόχοι της έρευνας και βιομηχανικής εφαρμογής Η ένταση της βιομηχανικής παραγωγής τροφίμων ως ανάγκη της αύξηση του πληθυσμού της γης και η ταυτόχρονη αύξηση της κατανάλωσης ενέργειας από τη γενικότερη παγκόσμια οικονομική ανάπτυξη έχουν δημιουργήσει προβλήματα απόρριψης και διάθεσης των οργανικών-γεωργικών αποβλήτων στο περιβάλλον, καθώς έντονη ανάγκη για ανανεώσιμες πηγές ενέργειας. Από τις αρχές του 1980 η σχέση μεταξύ της ενεργειακής χρήσης και περιβαλλοντικών επιπτώσεων έχει τραβήξει το παγκόσμιο ενδιαφέρον και ένας μεγάλος αριθμός διεθνών δράσεων έχει επικεντρωθεί προς αυτήν την κατεύθυνση. 2
Τα τυροκομεία παράγουν απόβλητα των οποίων το τυρόγαλο (cheese whey) είναι το κύριο απόβλητο με υψηλό οργανικό φορτίο (μέχρι και 70 g COD/L) το οποίο ωστόσο είναι βιοαποκοδομήσιμο, πλούσιο σε πρωτεΐνη, λακτόζη, άλατα, κλπ. Γι αυτό το λόγο η χρήση ή η διάθεση του είναι σημαντική. Αν διατεθεί ακατέργαστο σε υδροφόρους ορίζοντες μπορεί να προκαλέσει σοβαρές περιβαλλοντικές επιπτώσεις (φαινόμενα υπερτροφισμού, εξάντληση οξυγόνου σε λίμνες, ποτάμια, εξόντωση της υδρόβιας ζωής). Επίσης διαθέτει σημαντική φυτοξικότητα (μείωση της σοδειάς αν χρησιμοποιηθεί ως υγρό λίπασμα), ενώ αλλοιώνει και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του εδάφους. Ωστόσο, το τυρόγαλο μπορεί να επεξεργασθεί και να αξιοποηιθεί κατάλληλα, ώστε να μειωθούν αφενός τα προβλήματα αποικοδόμησης του αποβλήτου (σε βιολογικούς καθαρισμούς) και διάθεσης στο περιβάλλον, και αφετέρου να παραχθούν αρκετά προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας που μπορούν να αποβούν εις όφελος των γαλακτοπαραγωγικών μονάδων. Τα κύρια αυτά προϊόντα είναι τα εξής: - Πρωτείνη ορού γάλακτος (τυρογάλακτος), έπειτα από θέρμανση (μετουσίωση-καθίζηση πρωτείνης, μαζί με ελάχιστο λίπος και άλατα) - Καθαρή πρωτείνη τυρογάλακτος έπειτα από υπερδιήθιση - Γαλακτικό οξύ ως προϊόν ζύμωσης τους τυρογάλακτος - Μονοκυτταρική πρωτείνη (μικροβιακή βιομάζα) ως προϊόν ζύμωσης τους τυρογάλακτος - Αιθανόλη ως προϊόν ζύμωσης τους τυρογάλακτος - Αρκετά ακόμη προιόντα μικροβιακής ζύμωσης του τυρογάλακτος Σήμερα σε βιομηχανική κλίμακα το πλήρες τυρόγαλα χρησιμοποιείται για την παραγωγή τυριών τυρογάλακτος όπως μυζύθρα, ανθότυρο, μανούρι, τυρί τύπου cottage/philadelphia, κλπ, ή για παραγωγή οροπρωτείνης έπειτα από υπερδιήθιση, η οποία χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε διάφορα τρόφιμα (ικανότητα γαλακτωματοποίσης-σταθεροποίησης γαλακτωμάτων, αύξησης συγκράτησης νερού σε γαλακτώματα-διαλύματα, αύξηση συγκέντρωσης σε πρωτείνη, κλπ). Επίσης, το 3
πλήρες υγρό τυρόγαλα ή έπειτα από ξήρανση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή (κυρίως σε χοίρους). Στη χειρίστη περίπτωση, απορρίπτεται ως έχει παράνομα σε υδροφόρους ορίζοντες. Το αποπρωτεϊνομένο τυρόγαλα (μετά και την απομάκρυνση-αξιοποίηση των οροπρωτεϊνών του) είναι το κύριο απόβλητο που παραμένει συνήθως αδιάθετο, καιεξακολουθεί να περιέχει υψηλό ρυπαντικό φορτίο, λόγο της υψηλής συγκέντρωσης σακχάρων, και κυρίως λακτόζης που περιέχει (~ 4,7-5,0 %). Αυτό το σάκχαρο, μαζί με άλατα και χαμηλού μοριακού βάρους αζωτούχες ενώσεις που μπορεί να περιέχει το αποπρωτείνωμένο τυρόγαλο (πρωτεόζες-πεπτόνες-αμινοξέα) είναι ένα αρκετά καλό υπόστρωμα ζύμωσης για μικροοργανισμούς που μπορούν να μεταβολίσουν τη λακτόζη και να παράγουν με βιοτεχνολογικό τρόπο ουσίες υψηλής προστιθέμενης αξίας, μειώνωντας παράλληλα σημαντικά το COD-BOD του απομένοντος υγρού αποβλήτου μετά το τέλος της ζύμωσης. Η βιομάζα άλλωστε που καλλιεργείται για μια ζύμωση μπορεί έπειτα από αποστείρωση-ξήρανση να χρησιμοποιηθεί ως μονοκυτταρική πρωτείνη για την ανθρώπινη διατροφή και διατροφικό συμπλήρωμα για ζωοτροφές, ενώ οι μικροβιακές καλλιέργειες μπορούν να παράγουν ουσίες υψηλής προστιθέμενης αξία όπως η ξανθάνη από υπόστρωμα λακτόζης. Η παραγωγή αυτή, δηλαδή η μετατροπή της λακτόζης με απευθείας ζύμωση σε ξανθάνη είναι και ο βασικός στόχος της παρούσας εφαρμοσμένης έρευνας και μελέτης. 1.4 Βιβλιογραφική Ανασκόπηση. 1.4.1 Το τυρόγαλα. Τυρόγαλα είναι το προϊόν το οποίο λαμβάνεται με τη χρήση οξέων, πυτιάς ή/ και φυσικοχημικών μεθόδων, κατά την παραγωγή τυριών και καζεΐνης (Κανονισμός 625/30-3-1978 ΕΕ). Κατά την τυροκόμηση αγελαδινού γάλακτος, το 10-20% (β/β) των συνολικών συστατικών του γάλακτος μεταφέρεται στο τυρί και το υπόλοιπο στο τυρόγαλα. Τα ποσοστά αυτά ποικίλουν ανάλογα με το είδος του τυριού που παρασκευάζεται και την τεχνολογία που εφαρμόζεται. Ως γενική προσέγγιση μπορούμε να πούμε ότι το τυρόγαλα είναι ιδιαίτερα πλούσιο σε λακτόζη, η οποία συνιστά το κύριο ρυπαντικό συστατικό του αποβλήτου, ενώ περιέχει μεγάλη ποικιλία ανόργανων και οργανικών ουσιών. Στις αζωτούχες ενώσεις του 4
τυρογάλακτος κυριαρχούν οι αλβουμίνες και γλοβουλίνες του γάλακτος που δεν πήζουν με την πυτιά ή με την οξίνιση του. Πέρα αυτών υπάρχουν πρωτεόζεςπεπτόνες και πλήθος άλλων υδατοδιαλυτών αζωτούχων ουσιών. Θα πρέπει να τονιστεί επίσης, ότι το τυρόγαλα έχει πλήθος αλάτων και βιταμινών. Κατά την τυροκόμιση του τυρογάλακτος μεταφέρεται περίπου το 40%-50% (β/β) των στερεών συστατικών του γάλακτος και προκαλεί σημαντική ρύπανση όταν απορρίπτεται στο περιβάλλον. Σε πολλές χώρες απαγορεύεται η απόρριψη του στο αποχετευτικό δίκτυο των πόλεων εάν πριν δεν έχει προηγηθεί κάποια επεξεργασία μείωσης της οργανικής του ουσίας. Σήμερα παράγονται περίπου 120 εκατομμύρια τόνοι τυρογάλακτος σε όλο τον κόσμο (Peters 2006). Από την παραγωγή αυτή αξιοποιείται μόνο το 55% περίπου. Το υπόλοιπο απορρίπτεται ως απόβλητο. 1.4.2 Σύσταση Τυρογάλακτος. Το τυρόγαλα περιέχει μεγάλη ποικιλία στερεών συστατικών, η αναλογία των οποίων προσδιορίζεται, κατά κύριο λόγο, από τη σύσταση του γάλακτος, από το οποίο προέρχεται αλλά και από τις τεχνολογικές επεμβάσεις που γίνονται κατά την διάρκεια της επεξεργασίας του. Όλοι οι παράγοντες, που επηρεάζουν τη σύσταση του γάλακτος, επηρεάζουν και αυτή του τυρογάλακτος που λαμβάνεται από αυτό. Επίσης, η θερμική μεταχείριση του γάλακτος πριν από την πήξη του, ο τρόπος πήξης του - ένζυμα, βιολογική οξίνιση, προσθήκη οξέων, ο βαθμός διαίρεσης του πήγματος, καθώς και ο τρόπος και η θερμοκρασία αναθέρμανσης επηρεάζουν τη σύσταση του τυρογάλακτος. Από τα συστατικά του τυρογάλακτος το λίπος είναι δυνατόν να απομακρυνθεί εύκολα με φυγοκέντρηση και να χρησιμοποιηθεί με διαφόρους τρόπους ενώ τα άλλα, για να παραληφθούν και να αξιοποιηθούν, θα πρέπει αυτό να υποβληθεί σε ειδική, κατά περίπτωση, επεξεργασία. Κατά τη φυγοκέντρηση του τυρογάλακτος, πέραν του λίπους, απομακρύνονται και μικρά τεμαχίδια πήγματος που περιέχει. Παραπλήσια σύσταση με αυτήν του αγελαδινού τυρογάλακτος έχει και το αποκορυφωμένο τυρόγαλα από την παρασκευή διάφορων τύπων τυριών του εξωτερικού, με εξαίρεση το λίπος που αφαιρείται. 5
Χαρακτηριστικό των αζωτούχων ουσιών του τυρογάλακτος είναι ότι σε αυτές η καζεΐνη υπάρχει σε ίχνη. Δεσπόζουν στην περίπτωση αυτή οι αλβουμίνες και γλοβουλίνες του γάλακτος που δεν πήζουν με την πυτιά ή με την οξίνισή του. Πέραν αυτών υπάρχουν πρωτεόζες-πεπτόνες και πλήθος άλλων υδατοδιαλυτών αζωτούχων ουσιών. Δε μεταφέρονται, όμως, στο τυρόγαλα μόνον κύρια συστατικά του γάλακτος αλλά και άλατα και βιταμίνες και μάλιστα σε σημαντικές ποσότητες. Ιδιαίτερα σημαντικό για το τυρόγαλα είναι ότι στη δομή των πρωτεϊνών του συμμετέχουν όλα τα απαραίτητα αμινοξέα, στην ενδεδειγμένη αναλογία και μεταξύ τους σχέσεις για τη διατροφή του ανθρώπου, γεγονός που τους προσδίδει εξαιρετική βιολογική αξία. Πίνακας 1: Θρεπτική αξία και Σύσταση Τυρογάλακτος.( Venetsaneas et al., 2009; e s, 1996) Συστατικό Τιμή Βιβλιογραφία Διαλύτες 0,6-0,8% w/v Venetsaneas et al., 2009; e s, 1996 Πρωτεΐνες 8-10% w/v Λιπίδια 0,4-0,5% w/v Venetsaneas et al., 2009; e s, 1996 Μεταλλικά άλατα 8-10% του ξηρού Venetsaneas et al., 2009; εκχυλίσματος e s, 1996 BOD5 30000-50000 ppm e s, 1996 COD 60000-80000 ppm e so, 1996 1.4.3 Η λακτόζη. Η λακτόζη ή γαλακτοσάκχαρο είναι χαρακτηριστικός υδατάνθρακας του γάλακτος, ο μόνος που υπάρχει ελεύθερος και σε σημαντικές ποσότητες. To κανονικό γάλα περιέχει συνήθως 4,4 έως 5,2% και κατά μέσο όρο 4,8% λακτόζη, που αντιπροσωπεύει το 50-52% των στερεών συστατικών του άπαχου γάλακτος. Στο γάλα της γυναίκας η λακτόζη απαντά σε μεγαλύτερη αναλογία, περίπου 7%. Τα διάφορα είδη γάλακτος παρουσιάζουν πολλές φορές σημαντικές διαφορές μεταξύ τους στην περιεκτικότητά τους σε λακτόζη. Αν εξετάσουμε όμως τη σύσταση του γάλακτος των περισσοτέρων θηλαστικών διαπιστώνουμε ότι η λακτόζη 6
παρουσιάζει πάντοτε πολύ μικρότερη διακύμανση από ότι το λίπος και τα λευκώματα, πράγμα που οδηγεί στην άποψη ότι η ενζυματική διεργασία που αφορά τη σύνθεση της λακτόζης είναι παρόμοια σε τελείως διαφορετικά είδη. Από βιολογική άποψη η λακτόζη χρησιμεύει στον οργανισμό ως πηγή ενέργειας πλην όμως για να απορροφηθεί πρέπει πρώτα να διασπαστεί σε γλυκόζη και γαλακτόζη, Σ' αυτό βοηθά το ένζυμο λακτάση που αφθονεί στο πεπτικό σύστημα των βρεφών, Σήμερα έχει διαπιστωθεί ότι η δράση της λακτάσης παρουσιάζεται αυξημένη κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση πλην όμως ελαττώνεται με την πάροδο του χρόνου. Ο βαθμός ανοχής της λακτόζης του σιτηρεσίου από τα διάφορα είδη θηλαστικών μπορεί να λεχθεί ότι είναι ανάλογος της περιεκτικότητας του γάλακτός τους στο σάκχαρο αυτό. Η παρουσία της λακτόζης στο γάλα και στα προϊόντα του παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί: α) Είναι πρωταρχικός παράγοντας στον έλεγχο των ζυμώσεων σε διάφορα γαλακτοκομικά προϊόντα. β) Προσδίδει θρεπτική αξία στο γάλα και στα γαλακτοκομικά προϊόντα. γ) Η γεύση και η διαλυτότητα αποθηκευμένων γαλακτοκομικών προϊόντων επηρεάζονται out' αυτή. δ) Παίζει βασικό ρόλο στην εμφάνιση του χρώματος και της γεύσεως στα υπερθερμασμένα γαλακτοκομικά προϊόντα. ε) Για τον άνθρωπο και αρκετά ζώα δεν αποτελεί μόνο πηγή ενέργειας αλλά και πηγή γαλακτόζης, που αποτελεί συστατικό των νευρικών ιστών. 1.4.3.1 Δομή της Λακτόζης. Η λακτόζη είναι δισακχαρίτης που σχηματίζεται από την ένωση ενός μορίου d-γλυκόζης και ενός μορίου d-γαλακτόζης κατά τρόπο ώστε να μένει ελεύθερη μια αλδεϋδική ομάδα. Σχηματίζεται από τη γλυκόζη του αίματος και γι' αυτό η περιεκτικότητα του τελευταίου στο σάκχαρο αυτό κατά τη διάρκεια της γαλακτικής περιόδου είναι μικρότερη εκείνης της ξηράς περιόδου. Κατά το άρμεγμα παρατηρείται επίσης πτώση της γλυκόζης του αίματος που επανέρχεται όμως σε κανονικό επίπεδο λίγο μετά το άρμεγμα. Η λακτόζη υπάρχει σε δύο ισομερείς μορφές την α και β, που διακρίνονται μεταξύ τους από τη θέση του υδροξυλίου της γλυκόζης (σχήμα 1) 7
Σχήμα 1. Χημική δομή της λακτόζης Η λακτόζη απαντά στη φύση και στα γαλακτοκομικά προϊόντα είτε στις δύο κρυσταλλικές μορφές, α-ένυδρη και β-άνυδρη, ή σαν άμορφη υιλώδης μάζα, που είναι μίγμα α και β λακτόζης. Κάτω από ειδικές συνθήκες λαμβάνονται και άλλες μορφές που διαφέρουν μεταξύ τους κυρίως σε ότι αφορά τις φυσικές τους ιδιότητες, α-ένυδρη λακτάζη Η μορφή α-λακτόζης που απαντά σε συνήθεις θερμοκρασίες είναι η ενυδατωμένη με ένα μόριο νερού C 12 H 22 O M 'H 2 O-H λακτόζη του εμπορίου είναι η μορφή αυτή και λαμβάνεται από υπερκορεσμένα υδατικά διαλύματα λακτόζης με βραδεία κρυστάλλωση σε θερμοκρασίες μικρότερες των 93,5 C. Έχει σημείο τήξεως 201,6 C. Η α-άνυδρη λακτόζη σχηματίζει κρυστάλλους διαφόρων μορφών που καθορίζονται από τις συνθήκες κρυσταλλώσεως. Ο παράγοντας που κατά κύριο λόγο ρυθμίζει τη μορφή των κρυστάλλων είναι ο λόγος μεταξύ της πραγματικής συγκεντρώσεως προς τη διαλυτότητα. Όταν είναι μεγάλος, η κρυστάλλωση προχωρεί γρήγορα και σχηματίζονται μόνο πρίσματα. Όσο ο λόγος αυτός μειώνεται τόσο η κρυστάλλωση γίνεται με βραδύτερο ρυθμό, ενώ η μορφή των κρυστάλλων αλλάζει. Στη συνέχεια δίδονται οι διάφορες μορφές κρυστάλλων της α-ένυδρης λακτόζης. Οι Α, Β και C λαμβάνονται όταν ο ρυθμός κρυσταλλώσεως είναι γρήγορος ενώ οι Ε, F και G όταν είναι βραδύς. Ο κρύσταλλος Η δίδει την άλλη όψη του G ενώ η μορφή D έχει σχήμα πυραμίδας που προκύπτει από την εξέλιξη του κρυστάλλου C. Η κρυστάλλωση στα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι συχνά πιο πολύπλοκοo φαινόμενο. Τα άλλα συστατικά του επηρεάζουν την κρυστάλλωση της λακτόζης με αποτέλεσμα να δημιουργούνται ακανόνιστοι κρύσταλλοι που διαφέρουν εκείνων που λαμβάνονται από καθαρά διαλύματά της, σε ορισμένες περιπτώσεις μάλιστα είναι δυνατό να παρεμποδίσουν το σχηματισμό πυρήνων κρυσταλλώσεως και να καθυστερήσουν την κρυστάλλωση. Οι κρύσταλλοι της α- ένυδρης λακτόζης είναι σκληροί και δυσκολοδιάλυτοι (σχήμα 2). 8
Σχήμα 2. Κρυσταλλικές μορφές λακτόζης 1.4.3.2 Βιοσύνθεση της Λακτόζης. Κατά την υδρόλυσή της η λακτόζη δίδει ένα μόριο γλυκόζης και ένα μόριο γαλακτόζης. Ο τρόπος συνθέσεως της λακτόζης στο μαστό των ζώων έχει κατά καιρούς απασχολήσει ερευνητές διαφόρων χωρών, Σήμερα είναι γνωστό ότι η κατ' εξοχήν πρόδρομη ουσία για τη σύνθεση της είναι η D-γλυκόζη του αίματος. Σε πρώτη φάση μετατρέπεται στο μαστό ένα μέρος της D- γλυκόζης σε D-γαλακτόζη, Στη συνέχεια ένα μόριο D-γλυκόζης ενώνεται με ένα μόριο D-γαλοκτόζης και δημιουργείται η λακτόζη. Αναλυτικότερα ο σχηματισμός της λακτόζης στο μαστό περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 9
Από τα ένζυμα που συμμετέχουν στο σχηματισμό της λακτόζης, η συνθετάση της λακτόζης (UDP γαλακτόζη d γλυκόζη I γαλακτοζυλοτρανφεράση) απαντά μόνο στο μαστό, ενώ τα άλλα ανευρίσκονται και σε άλλα σημεία του σώματος των ζώων, όπου λαμβάνουν μέρος σε διάφορους μεταβολικούς κύκλους, Διαπιστώθηκε ότι η συνθετάση της λακτόζης αποτελείται από δύο πρωτεΐνες που ονομάστηκαν Α και Β. To τμήμα Β του ενζύμου βρέθηκε ότι είναι ταυτόσημο με την α-γαλακταλβουμίνη που είναι προϊόν της συνθετικής δραστηριότητας των γαλακτικών κυττάρων και απαντά μόνο στο μαστό, ενώ το Α υπάρχει σε διάφορους ιστούς και μόνο του καταλύει διαφορετική αντίδραση. 1.4.3.3 Ισορροπία λακτόζης σε διάλυμα. Ο ρυθμός μετατροπής της α-λακτόζης προς β και αντίστροφα μέχρι να επιτευχθεί η ισορροπία μεταξύ τους επηρεάζεται σημαντικά από τη θερμοκρασία του διαλύματος. Είναι μικρή σε χαμηλές θερμοκρασίες και αυξάνει με την αύξησή της, Στους 70 C η ισορροπία επιτυγχάνεται αμέσως. To ph επηρεάζει επίσης το φαινόμενο αυτό. Σε τιμές ρη γύρω από 5,0 ο ρυθμός μετατροπής της μιας μορφής προς την άλλη είναι πολύ μικρός πλην όμως αυξάνει με τη μεταβολή του. Σε ρη 9,0 η ισορροπία επιτυγχάνεται σε λίγα λεπτά. Η παρουσία αλάτων μπορεί να επηρεάσει την ταχύτητα μετατροπής της α-λακτόζης προς β και αντίστροφα. Η επίδραση είναι περιορισμένη σε αραιά διαλύματα αλάτων πλην όμως σε συγκεντρώσεις παραπλήσιες με αυτές του γάλακτος η ταχύτητα σχεδόν διπλασιάζεται. Παρόμοια επίδραση με τα άλατα έχει και η παρουσία σακχάρων σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Αντίθετα οι υψηλές συγκεντρώσεις μειώνουν την ταχύτητα μετατροπής της μιας μορφής λακτόζης προς την άλλη (σχήμα 3). 10
Σχήμα 3. Σχέση μεταξύ των διαφόρων μορφών λακτόζης (Τ=C) 1.4.4 Πλεονεκτήματα του Τυρογάλακτος Μερικά από τα πιο σημαντικά πλεονεκτήματα του τυρογάλακτος ως υπόστρωμα ζύμωσης είναι τα εξής: Υψηλό ποσοστό πρωτεϊνών (χαμηλό στο αποπρωτεϊνομένο τυρόγαλα) Υψηλό ποσοστό σακχάρων Χαμηλό κόστος 11
1.4.5 Μειονεκτήματα του Τυρογάλακτος. Για την αξιοποίηση του τυρογάλακτος αντιμετωπίζονται διάφορες δυσκολίες από τις οποίες οι πιο σημαντικές είναι: Το μεγάλο μικροβιακό φορτίο που το καθιστά ευπαθές. Αν δεν παστεριωθεί αμέσως μετά την παραγωγή του, αλλοιώνεται σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η σύστασή του δεν είναι σταθερή. Κυμαίνεται ανάλογα με τον τύπο του τυριού και το είδος του γάλακτος από τα οποία προέρχεται. Περιέχει χαμηλό σχετικά ποσοστό στερεών συστατικών, πράγμα που επιβραδύνει το κόστος επεξεργασίας του. Θεωρείται σαν προϊόν ευτελούς αξίας, για αυτό και συχνά δεν αξιοποιείται. Η άποψη αυτή αναθεωρήθηκε τελευταία. 1.4.6 Αξιοποίηση τυρογάλακτος. Το τυρόγαλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή τυριών (Ricotta, μανούρι, μυζήθρα), για παραγωγή σκόνης τυρογάλακτος και καθαρής πρωτεΐνης ορού μετά από υπερδιήθιση, σαν ζωοτροφή ως έχει για χοίρους ή πτηνά, σαν προσθήκη στο ψωμί για αύξηση της θρεπτικής του αξίας. Επίσης, χρησιμοποιείται για την παρασκευή αεριούχων ποτών, αλβουμίνης και σφαιρίνης για προσθετικά τροφίμων, λακτόζης, σιροπιών γαλακτόζης και γλυκόζης και για την παρασκευή ριβοφλαμίνης. 1.4.7 Χρήση των αποβλήτων τυροκομείου ως υπόστρωμα ζύμωσης. Μια από τις κύριες οδούς αξιοποίησης του τυρογάλακτος σχετίζεται με τη ζύμωση αυτού προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (γαλακτικό οξύ, αιθυλική αλκοόλη, βιταμίνες, β- γαλακτοσιδάση, ξύδι, βιομάζα, μικροβιακό λίπος) (Αγγελής 2007). Ειδικότερα το τυρόγαλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη μικροοργανισμών, (π.χ. γένη Kluyveromyces, Candida, Trichosporum, Torula), που δίδουν βιομάζα υψηλής βιολογικής αξίας. Μια ακόμα σημαντική χρήση του τυρογάλακτος είναι για την παραγωγή μικροβιακών πολυσακχαριτών όπως η ξανθάνη και η ξανθάνη. Σε σύγκριση με τα φυτά οι μικροοργανισμοί εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερους ειδικούς ρυθμούς ανάπτυξης και υψηλότερη συγκέντρωση πρωτεΐνης στην 12
παραγόμενη βιομάζα που σε πολλές περιπτώσεις φτάνει το 80% (β/β) επί ξηρής μάζας (Αγγελής 2007). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον εστιάζεται στο γ-λινολενικό οξύ ( LA, Δ6,9,12C18:3), ένα λιπαρό οξύ το οποίο παράγεται κατά κύριο λόγο ως μεταβολικό προϊόν από τους ελαιογόνους ζυγομύκητες (Agge s κ.λπ. 1987, 1988, 1990, Rat edge 1994, 2002, Fakas κ.λπ. 2006, 2007, 2008α, 2008β, Αγγελής 2007) και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω των αντικαρκινικών και αντιφλεγμονωδών ιδιοτήτων που έχει βρεθεί ότι περιέχει (Cert k a d h m u 1999, Ke y κ.λπ. 2000). Παρά το γεγονός ότι έχει αναφερθεί χρησιμοποίηση πληθώρας ανανεώσιμων υποστρωμάτων ή υποστρωμάτων τύπου «αποβλήτων» ως πηγών άνθρακα από ελαιογόνους ζυγομύκητες προκειμένου να παραχθεί λίπος και γ-λινολενικό οξύ (Certik and Shimizu 1999, Fakas κ.λπ. 2006, 2007, 2008α, 2008β, Αγγελής 2007), το τυρόγαλα μέχρι στιγμής δεν έχει χρησιμοποιηθεί από μικροοργανισμούς αυτής της κατηγορίας, πιθανώς λόγω της μη-ικανοποιητικής ανάπτυξης αυτών στη λακτόζη (Cert k a d h m u 1999). Αντίθετα, ήδη από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 είχε παραχθεί μικροβιακό λίπος που προσομοίαζε με αυτό του λίπους του κακάο (c c a- butter subst tute) σε βιομηχανική κλίμακα χρησιμοποιώντας ελαιοπαραγωγούς ζύμες του είδους Apiotrichum curvatum κατά την καλλιέργεια τους στο τυρόγαλα. (Ykema κλπ. 1988, 1990, Davies κλπ. 1990, Davies and Holdsworth 1992, Ratledge, 1994, Αγγελής 2007). 1.4.8 Ξανθάνη. Η ξανθάνη είναι βιοχημικό προϊόν υψηλής προστιθέμενης αξίας με πολυάριθμες βιομηχανικές εφαρμογές εξαιτίας των ιδιαιτέρων φυσικοχημικών ιδιοτήτων που παρουσιάζει. Χρησιμοποιείται ως γαλακτωματοποιητής, ως σταθεροποιητής ή απλά ως βελτιωτικό πρόσθετο στην βιομηχανία τροφίμων και ζαχαροπλαστικής. Επίσης χρησιμοποιείται στην φαρμακευτική βιομηχανία και στην πετροχημική βιομηχανία για εξόρυξη πετρελαίου. Η ξανθάνη ανήκει στην κατηγορία των ανιονικών ετεροπολυσακχαριτών και συντίθεται από τον αυστηρά αερόβιο μικροοργανισμό Xanthomonas campestris, βακτήριο της οικογενείας ψευδομονάδων. Η ξανθάνη εκκρίνεται εξωτερικά και περιβάλλει τα βακτήρια. Το βακτήριο Xanthomonas παρά το ότι δεν δημιουργεί σπόρια είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό στην ξηρασία. Αυτή η δημιουργία του εξωπεριβλήματος από ξανθάνη αυξάνει τη 13
βιωσιμότητα των βακτηρίων καθιστώντας τα ανθεκτικά στη ξηρασία και την υπεριώδη ακτινοβολία. Για την σύνθεσή της χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα γλυκόζη, μαννόζη και μελάσα. Έχει επίσης επιτευχθεί η σύνθεσή της από χυμό ροδάκινων και εκχύλισμα καστανάλευρου. Αναλυτικότερα η ξανθάνη (ή κόμεο ξανθάνης) είναι ένας ανιονικός εξωκυττάριος, υψηλού μοριακού βάρους πολυσακχαρίτης, και παράγεται από τον μικροοργανισμό Xanthomonas campestris με αερόβια ζύμωση. Ανακαλύφθηκε στις αρχές του 1960 στα πλαίσια προγράμματος για ανίχνευση μικροβιακά παραγόμενων πολυσακχαριτών με βιομηχανικό ενδιαφέρον και μελετήθηκε εκτεταμένα εξαιτίας των ιδιαίτερα φυσικοχημικών της ιδιοτήτων (Baird J.K. 1994). Σήμερα η ξανθάνη είναι μικροβιακός πολυσακχαρίτης που παρουσιάζει το μεγαλύτερο ερευνητικό ενδιαφέρον και αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους πολυσακχαρίτες για τη βιομηχανία, έχοντας αντικαταστήσει ως τώρα πολλά γνωστά φυσικά ή συνθετικά υδατοδιαλυτά κόμεα. Τόσο η σύστασή όσο και η δομή της εμπορικά παραγόμενης ξανθάνης είναι η ίδια με τον πολυσακχαρίτη που ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στο φυσικό του περιβάλλον (Kelco N.C. 1996). Η ξανθάνη πριν γίνει αποδεκτή ως συστατικό των τροφίμων μελετήθηκε εκτετεμένα και δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στις πιθανές τοξικές επιδράσεις που θα μπορούσε να έχει η χρήση της από τον άνθρωπο (Hagiwara A. et al., 2004). Το 1969 το FDA ενέκρινε τη χρήση της ως πρόσθετο τροφίμων, ως σταθεροποιητή και ως μέσο διόγκωσης. Το 1980 επίσης επιτράπηκε από την Ε.Ε. η χρήση της ως σταθεροποιητή, γαλακτωματοποιητή και μέσο διόγκωσης και της αποδόθηκε η κωδική ονομασία Ε-415. Τέλος το 1988 η ημερήσια αποδεκτή καθημερινή ποσότητα της ξανθάνης χαρακτηρίστηκε ως «μη καθορισμένη» γεγονός που επιβεβαιώνει την ασφάλεια στη χρήση της για τα τρόφιμα. Από την εμπορικά παραγόμενη ξανθάνη το 60% περίπου της ποσότητας χρησιμοποιείται στη βιομηχανία των τροφίμων. Η πιο συνηθισμένη μορφή πώλησης της είναι αυτή σε σκόνη αλλά στις βιομηχανικές της μορφές μπορεί να χρησιμοποιηθεί και με τη μορφή συμπυκνωμένου διαλύματος καλλιέργειας αφού στις εφαρμογές αυτές οι απαιτήσεις για καθαρότητα δεν είναι τόσο αυξημένες (Baird J.K., 1989). Τα τελευταία χρόνια έχουν παραχθεί διάφοροι τύποι ξανθάνης με εξειδικευμένες ιδιότητες για να εξυπηρετείται περισσότερο η χρήση της στις εφαρμογές. Έτσι π.χ. ξανθάνη με μεγαλύτερη καθαρότητα προορίζεται για τρόφιμα, ξανθάνη με βελτιωμένη ικανότητα 14
διασποράς χρησιμοποιείται στις εφαρμογές πετρελαίου (Su. L. et al., 2003). Τέλος ξανθάνη με διαφορετική ρεολογική συμπεριφορά (περισσότερο Νευτωνική συμπεριφορά σε χαμηλούς ρυθμούς διάτμησης) χρησιμοποιείται σε αλκαλικά καθαριστικά (Vanderbilt C. 2000). Το ευρύτατο αυτό πεδίο εφαρμογής της δικαιολογεί και το αμείωτο ενδιαφέρον των ερευνητών για την όσο το δυνατόν καλύτερη κατανόηση της διεργασίας παραγωγής της. Η ξανθάνη αποτελείται από τρεις διαφορετικούς μονοσακχαρίτες, D-γλυκόζη, D- μαννόζη, και D-γλυκουρονικό οξύ σε αναλογία 2:2:1 με τη γραμμική κύρια αλυσίδα του πολυμερούς να συντίθεται αποκλειστικά από μόρια β-d-γλυκόζης ενωμένα με (1,4) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Σε κάθε δεύτερη γλυκόζη και στη θέση C-3, υπάρχει ενωμένη πλευρική αλυσίδα (τρισακχαρίτης) που αποτελείται (διαβάζοντας από το τέλος προς την αρχή) από β-dμαννόζη-(1,4)-β-d-γλυκουρονικό οξύ-(1,2)-α-d-μαννόζη. Ανάλογα με τις συνθήκες ζύμωσης, το τελικό τμήμα της μαννόζης μπορεί να έχει ενωμένο πυροσταφυλικό οξύ σε θέσεις 4- και 6-, ενώ και η μαννόζη στο εσωτερικό της ξανθάνης μπορεί είναι ακετυλιωμένη στη θέση -6. Τέλος, στην πλευρική της αλυσίδα μπορεί να είναι συνδεδεμένα άλατα, συνήθως καλίου, νατρίου και ασβεστίου (σχήμα 4). Εξαιτίας των σημαντικών φυσικοχημικών της ιδιοτήτων και της αξιόλογης ψευδοπλαστικής συμπεριφοράς που προσδίδει στα διαλύματα της, αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς πολυσακχαρίτες που χρησιμοποιούνται σήμερα στη βιομηχανία. Οι βασικές φυσικοχημικές ιδιότητες της ξανθάνης φαίνονται στον Πίνακα 2. 15
Σχήμα 4. Δομή (πρωτοταγής) της ξανθάνης Πίνακας 2. Τυπικές ιδιότητες εμπορικής ξανθάνης ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΙΜΗ Φυσική κατάσταση Ξηρή σκόνη, υποκίτρινη Υγρασία 8-15% Τέφρα 7-12% Άζωτο 0,3-1% Περιεκτικότητα σε οξικό 1,9-6% Περιεκτικότητα σε πυρουβικό 1-5,7% Μονοσθενή άλατα 3,6-13,4 g/l Δισθενή άλατα 0,085-017 g/l Ιξώδες (15,8 s -1, T=25C) 13-35 cp Σύμφωνα με τον Ψωμά Σ. (2005) εφαρμόστηκε η καλλιέργεια του άγριου στελέχους του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris με τη χρήση συνθετικού υποστρώματος και υποστρώματος από τυρόγαλα (σε βιοαντιδραστήρα), καθώς και με τη χρήση υποστρώματος (για πρώτη φορά) από παραπροϊόντα της επεξεργασίας καπνού. Επίσης μελετήθηκε η καλλιέργεια του άγριου (μη τροποποιημένου) 16
στελέχους του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris με τη χρήση υποστρωμάτων από αμυλούχα υλικά διαφορετικής προέλευσης. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η δυνατότητα χρήσης του καστανάλευρου ως υποστρώματος, για πρώτη φορά, (ενώ έγιναν και ξεχωριστές μελέτες απομονωμένων συστατικών του) και του αμύλου [τα πειράματα διεξήχθησαν σε κωνικές φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα]. Επίσης, μελετήθηκε κι η δυνατότητα χρήσης του καλαμποκάλευρου, της βρώμης (τόσο σε ακατέργαστη μορφή όσο και ως άλευρο), του ρυζιού (άλευρο) και της πατάτας (άλευρο) [τα πειράματα διεξήχθησαν σε κωνικές]. Από τα παραπάνω πειράματα προέκυψε ότι η παραγωγή της ξανθάνης με τη χρήση υποστρώματος από καστανάλευρο παρουσίασε το μεγαλύτερο ενδιαφέρον σε σχέση με τα υπόλοιπα αμυλούχα υλικά. Επίσης σημαντική παραγωγή παρατηρήθηκε και με τη χρήση των διαλυτών σακχάρων (από το καστανάλευρο) ως υπόστρωμα. Ακολούθως, μελετήθηκε η καλλιέργεια του άγριου στελέχους του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris με τη χρήση συνθετικού υποστρώματος (σε βιοαντιδραστήρα), για διάφορους ρυθμούς ανάδευσης. Από τα πειράματα αυτά προέκυψε ότι η αύξηση του ρυθμού ανάδευσης της καλλιέργειας συμβάλει θετικά στην παραγωγή της ξανθάνης, η οποία εμφανίζεται να είναι μερικώς συσχετιζόμενη με την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Επίσης, επηρεάζει θετικά και τις κινητικές παραμέτρους που περιγράφουν τη διεργασία της ζύμωσης, όπως ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων, καθώς και ο ρυθμός παραγωγής του πολυσακχαρίτη. Η περιεκτικότητα της παραγόμενης ξανθάνης σε πυροσταφυλικό οξύ αυξάνει με την αύξηση του ρυθμού ανάδευσης, σε αντίθεση με το μοριακό της βάρος, το οποίο ήταν σταθερό σε όλες τις περιπτώσεις. Από τα παραπάνω προέκυψαν μαθηματικά μοντέλα που περιγράφουν την παραγωγή ξανθάνης και βιομάζας ως συνάρτηση βασικών για τη διεργασία παραμέτρων και επιπλέον μελετήθηκαν ορισμένα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της παραγόμενης ξανθάνης, όπως το μοριακό της βάρος και η περιεκτικότητα της σε πυροσταφυλικό οξύ, η οποία φαίνεται να επηρεάζεται από τις πειραματικές συνθήκες που διερευνήθηκαν. Αν και η ξανθάνη είναι σταθερή στα περισσότερα ένζυμα η παρουσία μικροοργανισμών μπορεί να οδηγήσει σε αποικοδόμηση της (Nankai H. Et.al., 1999 και Ruijssenaars H.J et al., 1999). Κάτι τέτοιο όμως μπορεί εύκολα να εμποδιστεί με 17
μία κατάλληλη βιοκτόνο ουσία ή συντηρητικό το οποίο μπορεί να προστεθεί στα διαλύματα της όταν αυτά προορίζονται να χρησιμοποιηθούν για διάστημα περισσότερο από 24 ώρες. Η επιλογή των συγκεκριμένων κάθε φορά συντηρητικών εξαρτάται από παράγοντες όπως η σύσταση, ο τύπος του παρόντος μικροοργανισμού, το ph καθώς και η θερμοκρασία (Cargill FPS 2004). Τέλος η ξανθάνη όπως και αρκετά άλλα κόμεα δεν βιοαποδομούνται από τον άνθρωπο και χρησιμοποιούνται για να ελαττώσουν τη θερμιδική περιεκτικότητα των τροφίμων βελτιώνοντας ταυτόχρονα τη λειτουργία του εντέρου κατά διέλευση τους μέσω της γαστρεντερικής οδού. Η θερμιδική αξία της ξανθάνης είναι περίπου 0,6 Kcal/g (Katzhauer B., 1998). 1.4.9 Παραγωγική Διαδικασία Ξανθάνης. Δεν είναι παράξενο ότι οι μικροοργανισμοί έχουν χρησιμοποιηθεί ως συστατικά τροφών από τους αρχαίους χρόνους. Για παράδειγμα οι ζυμομύκητες χρησιμοποιούνται εδώ και πολλούς αιώνες για την παρασκευή του ψωμιού. Επίσης, τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος χρησιμοποιούνται γα την παρασκευή τυριού και αλλαντικών. Γύρω από το 1900 στην Αμερική η φυγοκέντρηση χρησιμοποιήθηκε για τον διαχωρισμό των κυττάρων της ζύμης από το μέσον καλλιέργειας. Για την καλύτερη κατανόηση της καλλιέργειας του μικροοργανισμού Xanthomonas campestris και την επίτευξη μεγαλύτερης απόδοσης στην παραγωγή της ξανθάνης έχουν γίνει πολλές προσπάθειες διερεύνησης των σταδίων της διεργασίας. Έχουν παρουσιαστεί λοιπόν μελέτες που αφορούν τον εντοπισμό των πιθανών μεταβολικών μονοπατιών που ακολουθεί ο μικροοργανισμός για τη μετατροπή των θρεπτικών μέσων (κυρίως της γλυκόζης) σε τελικό προϊόν (Letisse F et.al., 2002). Μελέτες με τροποποιημένα στελέχη του μικροοργανισμού εμφάνισαν σημαντικές διαφοροποιήσεις τόσο ως προς την παραγωγή όσο και ως προς τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της παραγόμενης ξανθάνης (ιξώδες, περιεκτικότητα σε πυροσταφυλικό και οξικό οξύ) (Rondriguez H et.,al. 1997) παρόλο που υπάρχει η άποψη ότι η πιθανότητα να εμφανιστεί σημαντική αύξηση της απόδοσης στην παραγωγή της ξανθάνης με νέα τροποποιημένα στελέχη είναι μικρή αφού (όπως και στη σύνθεση αρκετών άλλων βακτηριακών πολυσακχαριτών) η διαδικασία παραγωγής της ξανθάνης είναι πολύ αποδοτική παρουσιάζοντας μεγάλο βαθμό μετατροπής του υποστρώματος (Becker A et..al., 1998). Επίσης σημαντικά 18
αποτελέσματα στην παραγωγή της ξανθάνης με αυξημένη περιεκτικότητα σε πυροσταφυλικό οξύ και χαμηλή σε οξικό πραγματοποιήθηκε με την επεξεργασία του μικροοργανισμού με υποχλωριώδες οξύ (ΗOCl) (Rao Y.M et., al 2001) τόσο με συμβατικούς τρόπους παραγωγής (κλασικός, αναδευόμενος αντιδραστήρας) όσο και με πιο σύγχρονους όπως η παραγωγή ξανθάνης με καθηλωμένα κύτταρα σε υδρόφιλες βαμβακερές ίνες (Hsu C.H et al., 2004). Άλλες πάλι έρευνες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη του μικροοργανισμού παρεμποδίζεται (κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες) παρουσία μικρού οριακού βάτους οργανικών οξέων (όπως οξικό, πεντανοικό και οκτανοικό οξύ) με την παρεμπόδιση να αυξάνεται όσο αυξάνεται ο αριθμός των ατόμων του άνθρακα στην αλυσίδα του οξέος. Κάτι τέτοιο έχει ως συνέπεια την αύξηση της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης του μικροοργανισμού εξαιτίας της προσπάθειας του να αντισταθεί στην τοξικότητα του οξέος (Esgalhado M.E et.al., 1996). Το πρόβλημα αυτό μπορεί να λυθεί με τον έλεγχο του ph. Ορισμένοι από τους βασικότερους παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή ξανθάνης όπως η αρχική προετοιμασία του μικροοργανισμού (ενοφθάλμισμα) η σύνθεση του υποστρώματος και οι συνθήκες της καλλιέργειας (θερμοκρασία, ph, παροχή αέρα κ.α.) περιγράφονται παρακάτω: Ενοφθάλμισμα (Εμβολιασμός): Με το ενοφθάλμισμα σκοπός μας είναι να αυξήσουμε τη συγκέντρωση των κυττάρων και να ελαχιστοποιήσουμε ταυτόχρονα την παραγωγή ξανθάνης η παρουσία της οποίας γύρω από τα κύτταρα εμποδίζει τη μεταφορά των θρεπτικών συστατικών στο εσωτερικό τους επιμηκύνοντας με αυτό τον τρόπο τη φάση ανάπτυξης των μικροοργανισμού. Στην προσπάθειά μας αυτή απαιτείται η εφαρμογή πολλαπλών διαδοχικών σταδίων ανάπτυξης. Αρχικά ο μικροοργανισμός μεταφέρεται από το στερεό μίγμα καλλιέργειας σε μικρό όγκο ενός συνθετικού υγρού μέσου (5-7 ml) για λιγότερο από 7 ώρες. Η σύνθεση του μέσου αυτού (π.χ. οργανικές πηγές αζώτου, μαγνησίου, φωσφόρου) καθώς και μικρή χρονική διάρκεια ανάπτυξης επιλέγονται ώστε να κατευθυνθεί το σύστημα προς την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και όχι την παραγωγή ξανθανης. Η καλλιέργεια αυτή με τη σειρά της μεταφέρεται σε 40-100 ml υγρού μέσου (το οποίο περιέχει και ανόργανα άλατα). Σε αυτή τη φάση τα κύτταρα προσαρμόζονται στις νέες 19
συνθήκες τις οποίες θα αντιμετωπίσουν στο κυρίως υπόστρωμα (στο στάδιο της παραγωγής). Ο όγκος του ενοφθαλμίσματος που εισέρχεται στον βιοαντιδραστήρα παραγωγής αποτελεί το 5-10% του συνολικού όγκου καλλιέργειας που υπάρχει στο δοχείο. Ο αριθμός των ενδιάμεσων σταδίων που χρειάζονται για να αναπτυχθεί το ενοφθάλμισμα (με την ταυτόχρονη παρεμπόδιση της παραγωγής ξανθάνης) εξαρτάται από τον όγκο παραγωγής του κυρίως θρεπτικού μέσου στον αντιδραστήρα (Garcia O.F. et.al., 2000). Υπόστρωμα: Σε αντίθεση με το προηγούμενο στάδιο η επιλογή του υποστρώματος στην κύρια ζύμωση είναι τέτοια ώστε ο μεταβολισμός των βακτηριακών κυττάρων να κατευθύνεται προς την παραγωγή ξανθάνης και όχι προς την ανάπτυξη τους. Η σύσταση ενός τέτοιου τυπικού υποστρώματος, περιέχει πηγές υδρογονάνθρακα και αζώτου αλλά και άλατα καλίου, σιδήρου και ασβεστίου (James R.D et.al., 1994). Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες πηγές υδρογονανθράκων είναι η γλυκόζη και η σακχαρόζη (Letisse F et.al., 2001 ενώ έχουν χρησιμοποιηθεί και φυσικές πηγές όπως το τυρόγαλα (Liakopoulou- Kyriakides M. Et.al., 1997), η μελάσσα (Kalogiannis S et.al., 2003), το καστανάλευρο (Liakopoulou-Kyriakides M. Et.al., 1999) ο χυμός ροδάκινου (Papi R.M et.al., 1999), λύματα ελαιοτριβείου (Lopez M.J et al., 2001), αγροτικά παραπροιόντα (Lopez M.J et.al., 2004) το άμυλο και οι μαλτοδεξτρίνες (Cote G.I 1995). Η συγκέντρωση των θρεπτικών πηγών επηρεάζει την απόδοση της παραγωγής ξανθάνης και ειδικότερα για την περίπτωση της γλυκόζης χρησιμοποιούνται συνήθως συγκεντρώσεις από 1-5% w/v, ενώ οι υψηλότερες συγκεντρώσεις της δεν δίνουν μεγαλύτερα επίπεδα παραγωγής παρεμποδίζοντας την ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Γενικά η ποσότητα του σακχάρου ρυθμίζεται έτσι ώστε να πέφτει το δυνατόν χαμηλότερα στο τέλος του κύκλου ζύμωσης χωρίς όμως να εξαφανίζεται για να αποφευχθεί το γεγονός να χρησιμοποιήσουν οι μικροοργανισμοί το σχηματιζόμενο πολυσακχαρίτη ως υπόστρωμα (James R.D et al., 1994). Το άζωτο επίσης είναι ένα σημαντικό θρεπτικό συστατικό το οποίο μπορεί να πάρει ο μικροοργανισμός από οργανικά συστατικά όσο και από ανόργανα μόρια. Βασική πηγή αζώτου στην κύρια φάση ζύμωσης είναι τα ανόργανα άλατα (π.χ. νιτρικό αμμώνιο) σε αντίθεση με τις οργανικές πηγές (π.χ. μερικά 20
υδρολυμένη πρωτεΐνη σόγιας) που επιλέγονται περισσότερο στο στάδιο ανάπτυξης του μικροοργανισμού (Becker A et al., 1998). Γενικά οι χαμηλές συγκεντρώσεις άνθρακα και αζώτου συμβάλουν στην παραγωγή του πολυμερούς της ξανθάνης καθώς και η σχετικά υψηλή C/N αναλογία τους η οποία όμως είναι μικρότερη από την αντίστοιχη αναλογία στη φάση ανάπτυξης των κυττάρων. Η παραγωγή ξανθάνης επίσης ευνοείται και στην περίπτωση που η πηγή του υδρογονάνθρακα είναι το περιοριστικό θρεπτικό υπόστρωμα της διεργασίας (Lo Y.M et al., 1998). Έχει παρατηρηθεί ότι στην αύξηση της παραγωγής της ξανθάνης συμβάλει και η ύπαρξη στο υπόστρωμα διαφόρων τύπων απορρυπαντικών (detergents) όπως το Tween 40 και 80 (Galindo E et al., 1996) το Triton X-100 (Janas P et a., 2003) καθώς και η ξανθάνη (Baird J.K 1989). Κάποιοι πάλι ερευνητές ισχυρίζονται ότι ο έλεγχος του ph δεν είναι απαραίτητη διαδικασία αφού η μελέτη της επίδρασης του έδειξε ότι συνέβαλε στην ανάπτυξη των κυττάρων αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην παραγωγή ξανθάνης. Υπάρχουν όμως και αυτοί οι ερευνητές που προτείνουν τον έλεγχο του με τη χρήση κατάλληλης βάσης (KOH, NaOH, NH4OH) στην τιμή γύρω στο 7 με σκοπό τη μεγιστοποίηση της απόδοσης. Όταν το ph ελέγχεται η παραγωγή της ξανθάνης σταματά μόλις επιτευχθεί η στατική φάση ενώ όταν το ph δεν ελέγχεται η παραγωγή ξανθάνης συνεχίζει ταυτόχρονα με τη στατική φάση ανάπτυξης του μικροοργανισμού (Garcia O.F et al., 2000). Οξυγόνο: Ο μικροοργανισμός Xanthomonas campestris είναι αυστηρά αερόβιος γεγονός που καθιστά την παροχή οξυγόνου έναν πολύ κρίσιμο παράγοντα για την παραγωγή ξανθάνης. Η μεταφορά οξυγόνου επηρεάζεται από τον σχεδιασμό του βιοαντιδραστήρα καθιστώντας τον πολλές φορές το περιοριστικό βήμα της διεργασίας. Διάφοροι τύποι αντιδραστήρων έχουν μέχρι σήμερα χρησιμοποιηθεί αλλά αυτός που χρησιμοποιείται περισσότερο είναι ο τύπος του αναδευόμενου δοχείου (η ανάδευση είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την ανάμιξη, μεταφορά θερμότητας και αερισμό της καλλιέργειας) (Garcia O.F et al., 1998). Παρόλη όμως την ευρεία αποδοχή του ανδευόμενου δοχείου ως μέσου για την καλλιέργεια του μικροοργανισμού τα προβλήματα της μεγάλης κατανάλωσης ενέργειας, της μη επιθυνμητής διασποράς του αέρα (οξυγόνου) και γενικότερα της όχι και τόσο καλής 21
ανάμιξης (ύπαρξη νεκρών ζωνών μακριά από τον αναδευτήρα) εξακολουθούν να παραμένουν (Suh S.I et al., 1992). Έτσι σε μία προσπάθεια να βρεθούν νέοι τρόποι παραγωγής αλλά και να ξεπεραστούν οι δυσκολίες της μέχρι τώρα παραγωγής, ερευνήθηκαν και άλλοι τύποι αντιδραστήρων κυρίως αντιδραστήρες κλίνης (Kawase Y et al., 1996 και Hsu CH et al., 2003). Σε μία καλλιέργεια του βακτηρίου η ολική απαίτηση για οξυγόνο αυξάνει όσο αυξάνει η βιομάζα και αλλάζουν οι συντελεστές μεταφοράς μάζας εξαιτίας των μεταβολικών προϊόντων. Εάν αυξήσουμε αρκετά τον αερισμό ή το ρυθμό ανάδευσης ώστε να ξεπεραστεί το πρόβλημα, εμφανίζονται έντονα φαινόμενα αφρισμού ενώ και η επιπλέον προσθήκη αντιαφριστικών ουσιών αλλάζει και πάλι τους συντελεστές μεταφοράς μάζας (Tsoneva R.G et al., 1998). Η επιλογή του υποστρώματος είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που συμβάλουν στην εμπορική παραγωγή της ξανθάνης αποτελώντας ένα σημαντικό κομμάτι (περίπου 25%) του κόστους της ολικής παραγωγής της (James R.D et al., 1994). Για αυτό τον λόγο συνεχίζονται και οι προσπάθειες για μεγαλύτερη απόδοση στην παραγωγή της ξανθάνης. Γενικά υπάρχει μεγάλη σχέση μεταξύ της μεταφοράς των θρεπτικών συστατικών αλλά κυρίως του οξυγόνου σε σχέση με το σύστημα ανάδευσης ενός αναδευόμενου αντιδραστήρα με αποτέλεσμα την ανάγκη ενδελεχούς διερεύνησης του φαινομένου. Στην πράξη πρέπει να πούμε πως όταν χρησιμοποιούνται αναδευόμενα δοχεία ο ρυθμός ροής αέρα είναι γενικά σταθεροποιημένος και συνήθως στην τιμή 1L/L/min σε αντίθεση με την ταχύτητα ανάδευσης που παίρνει μεγάλο εύρος τιμών. Αξίζει να αναφερθεί ότι η περιεκτικότητα σε πυροσταφυλικό οξύ δεν επηρεάζεται από το οξυγόνο που παρέχεται στην καλλιέργεια εκτός από την περίπτωση στην οποία το οξυγόνο είναι περιοριστικός παράγοντας, όπου είναι πιθανόν να οδηγήσει σε παραγωγή ξανθάνης με μικρότερη περιεκτικότητα σε πυροσταφυλικό οξύ (Peters H.U et al., 1993). Θερμοκρασία: Η θερμοκρασία είναι ένας από τους πιο σημαντικούς παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή ξανθάνης. Στο εύρος θερμοκρασιών από 22-35 C που έχει κατά καιρούς μελετηθεί παρατηρήθηκε ότι η περιοχή από 24-27 C είναι η βέλτιστη για την ανάπτυξη των κυττάρων του μικροοργανισμού ενώ η 22
περιοχή 30-33 C είναι η ιδανική για την παραγωγή της ξανθάνης. Επίσης στην περιοχή από 22-24 C παρουσιάστηκε αρχικά καθυστέρηση στην ανάπτυξη του μικροοοργανισμού (Shu C.H et al., 1990). Γενικά η επιλογή θερμοκρασίας ζυμώσεως εξαρτάται από το μέσο παραγωγής που χρησιμοποιείται αλλά και από τον τελικό σκοπό της διεργασίας. Η πιο συνηθισμένη θερμοκρασία ζύμωσης στις περισσότερες περιπτώσεις είναι αυτή των 28 C και των 33 C. Με βάση τις παραπάνω διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης του μικροοργανισμού και παραγωγής του πολυσακχαρίτη και με στόχο τη μέγιστη δυνατή παραγωγή της ξανθάνης έχει προταθεί μία διαδικασία ζύμωσης δύο σταδίων. Αρχικά η ζύμωση πραγματοποιείται σε χαμηλή θερμοκρασία και μετά από ένα ορισμένο χρονικό διάστημα όπου έχει αναπτυχθεί ο μικροοργανισμός η θερμοκρασία ρυθμίζεται σε υψηλότερες τιμές (Shu C.H et al., 1991). ph: Οι περισσότεροι ερευνητές συμφωνούν ότι το ουδέτερο ph είναι η καλύτερη τιμή για την ανάπτυξη του βακτηρίου. Κατά τη διάρκεια παραγωγής τη ξανθάνης το ph μειώνεται από ουδέτερο σε τιμές κοντά στο 5 εξαιτίας των ανιονικών ομάδων που φέρει η ξανθάνη (Baird J.K 1989). Συνοψίζοντας τα παραπάνω πρέπει να αναφέρουμε ότι γενικά η βιομηχανική παραγωγή της ξανθάνης πραγματοποιείται με τη μέθοδο της αερόβιας ζύμωσης με ανάδευση. Η συγκέντρωση του υποστρώματος καθώς και οι βασικές απαιτήσεις όπως ο αερισμός, η ανάδευση, το ph, και η θερμοκρασία είναι επακριβώς ελεγχόμενοι παράγοντες για να εξασφαλίσουν τα βέλτιστα αποτελέσματα για την αναπαραγωγή ενώ ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στο να εμποδιστεί η μόλυνση του υγρού της καλλιέργειας. Οι συσκευές ζύμωσης αποστειρώνονται πριν τη χρήση και εφαρμόζονται αυστηρές ασηπτικές τεχνικές για να εξασφαλιστεί η καθαρότητα της. Με τον τρόπο αυτό αποφεύγεται η μόλυνση ή η πιθανή μετάλλαξη του μικροοργανισμού. Αυτός είναι και ένας σημαντικός λόγος που επιλέγεται η παραγωγή ενός σταδίου (batch) από τη συνεχή παραγωγή (James R.D et al., 1994). Ενδεικτικά αναφέρονται οι συνθήκες καλλιέργειας του μικροοργανισμού στην οποία μελετήθηκε η χρήση υποστρώματος τυρογάλακτος σε βιοαντιδραστήρα 2L και σε κωνικές φιάλες (πίνακας 3). Κατά τη μελέτη αυτή προσδιορίστηκαν σε ένα σύνολο 23
περιπτώσεων η παραγωγή της ξανθάνης (g/100ml), η παραγωγή βιομάζας (g/100ml), η συγκέντρωση των αναγόντων σακχάρων (g/100ml), το ph της καλλιέργειας, το Μοριακό βάρος της παραγόμενης ξανθάνης και η περιεκτικότητα της σε πυροσταφυλικό οξύ. Πίνακας 3. Ενδεικτικές πειραματικές συνθήκες παραγωγής ξανθάνης Ψώμας Σ. (2005) Η ανάκτηση της ξανθάνης από το υγρό της καλλιέργειας είναι γενικά δύσκολη και δαπανηρή εργασία. Το τελικό υγρό της καλλιέργειας περιέχει εκτός από την ξανθάνη, κύτταρα, άλλους μεταβολίτες καθώς και τα εναπομείναντα θρεπτικά συστατικά. Εξαιτίας της συγκέντρωσης του πολυσακχαρίτη το υγρό είναι ισχυρά ιξώδες και δύσκολο να επεξεργαστεί. Επιπλέον η ανάμιξη του υγρού με τα αντιδραστήρια για την ανάκτηση είναι πολύ απαιτητική από πλευράς ενέργειας εξαιτίας του αυξημένου ιξώδους της καλλιέργειας. Για αυτό το λόγο το υγρό συνήθως αραιώνεται σε κάποιο σημείο της διεργασίας (Garcia O.F et al., 2000). 24
Τα βασικά στάδια της διαδικασίας ανάκτησης είναι (σχήμα 5): Η απενεργοποίηση και η απομάκρυνση των βακτηριακών κυττάρων Η κατακρήμνιση του βιοπολυμερούς με αλκοόλη Η απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού μετά από φυγοκέντρηση Η ξήρανση Η άλεση. Η όλη διαδικασία πρέπει να γίνει χωρίς να υποβαθμιστεί το βιοπολυμερές και το τελικό προϊόν είναι συνήθως ξηρή σκόνη ή συμπυκνωμένο διάλυμα (Baird J.K 1989). Σχήμα 5. Διάγραμμα ροής για την παραγωγή ξανθάνης 1.4.10 Χρήσεις της Ξανθάνης. Οι ιδιαίτερες φυσικοχημικές ιδιότητες της ξανθάνης έχουν ως αποτέλεσμα τη χρήση της σε ένα μεγάλο φάσμα βιομηχανικών εφαρμογών. Χρησιμοποιείται κυρίως στη βιομηχανία τροφίμων και καλλυντικών, σε εφαρμογές στον αγροτικό τομέα αλλά και στη διαδικασία εξόρυξης πετρελαίου. Στον παρακάτω πίνακα 4 παρουσιάζονται ενδεικτικά κάποιες από τις εφαρμογές της. 25
Πίνακας 4. Βιομηχανικές εφαρμογές ξανθάνης. Εξαιτίας των ξεχωριστών φυσικοχημικών ιδιοτήτων της η ξανθάνη βρίσκει ιδιαίτερο πεδίο εφαρμογής στη βιομηχανία των τροφίμων προσδίδοντας τους ένα μοναδικό συνδυασμό υφής, οργανοληπτικών ιδιοτήτων και σταθερότητας. Πιο συγκεκριμένα στα τρόφιμα η ξανθάνη παρέχει σταθερότητα και βελτιώνει ή και τροποποιεί τις ιδιότητες υφής, ροής, χαρακτηριστικών και ικανότητας προσκόλλησης (Καλογερόπουλος Ν., 2006). Στα ροφήματα δίνει μία ελαφρά αύξηση του ιξώδους και προσδίδει την αίσθηση του ενισχυμένου σώματος χωρίς να μειώνει την επίδραση της γεύσης αφού η ίδια δεν έχει γεύση. Επιπλέον, με μερική αντικατάσταση μεγάλων συγκεντρώσεων αμύλου από αρκετά συστήματα τροφίμων, η ξανθάνη συνεισφέρει σε μία περισσότερο ψευδοπλαστική ρεολογία με πλεονεκτήματα τη βελτίωση της απελευθέρωσης της γεύσης και περισσότερο ευχάριστη υφή (Jungbunzlauer A.G, 2003). Επίσης έχει σημαντική εφαρμογή σε τρόφιμα που περιέχουν ποσότητες αλκοόλης. Αν και κατακρημνίζεται από απόλυτη αιθανόλη, ωστόσο είναι ανθεκτική σε περιεκτικότητα μέχρι και 50% σε αλκοόλη, συνθήκες κάτω από τις οποίες άλλα κόμεα χάνουν την ικανότητα τους να βελτιώνουν το ιξώδες (Katzbauer B. 1998). Η 26
πιο αξιοσημείωτη όμως χρήση της εμφανίζεται στις σάλτσες. Εξαιτίας του τρισδιάστατου δικτύου που σχηματίζουν οι αλυσίδες της εμποδίζεται ο διαχωρισμός των αδιάλυτων συστατικών καθώς και η απομάκρυνση του ελαίου και με την ψευδοπλαστική της συμπεριφορά συμβάλει στην ικανότητα ανάμιξης, άντλησης και ροής τους. Τέλος οι δυνατότητες της ξανθάνης επεκτείνονται ακόμη περισσότερο με τη συνεργιστική της δράση με γαλακτομαννάνες σε εφαρμογές που απαιτούν χαμηλότερο κόστος ή χαμηλότερα επίπεδα σταθερότητας από αυτά που θα παρείχε η ξανθάνη από μόνη της. Εφαρμογές της ξανθάνης σε προϊόντα τροφίμων είναι οι ακόλουθες: Ζύμες Προϊόντα σε φούρνο. Γεμίσεις προϊόντων για φούρνο και για πίτες. Αρωματικά γαλακτώματα για προϊόντα φούρνου. Ροφήματα. Ζαχαροπλαστική. Γαλακτοκομικά προϊόντα. Επιδόρπια. Διαιτητικά τρόφιμα. Σάλτσες. Μίγματα σε μορφή σκόνης. Παγωμένα και κατεψυγμένα τρόφιμα. Ζαχαρώδες κρούστες. Ορεκτικά. Σάλτσες σώς και σάλτσες ζωμών κρέατος. Σιρόπια και γαρνιρίσματα. 1.5 Μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή ξανθάνης. Ο πιο γνωστός μικροοργανισμός που έχει μελετηθεί για την παραγωγή ξανθάνης από συνθετικά υποστρώματα ή υγρά απόβλητα τυροκομείου είναι ο εξής: 27
1.5.1 Xanthomonas campestris. Το γένος Xanthomonas ανήκει στην οικογένεια των ψευδομονάδων (Pseudomonaceae). Όλοι οι μικροοργανισμοί αυτού του γένους είναι παθογόνοι για τα φυτά, αρκετά μάλιστα από τα οποία παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη γεωργική βιομηχανία όπως στα λάχανα και τα κουνουπίδια, τα τριφύλλια, τις πιπεριές, τις τομάτες και τα όσπρια (Young J.M. et al., 1997) όπου δρουν ως φυτοπαθογόνα. Ο μικροοργανισμός είναι αυστηρά αερόβιος και τα κύτταρά του απαντώνται ως μονές ευθείες λωρίδες πλάτους 0,4-0,7 μm και μήκους 0,7-1,8 μm. Το κύτταρο είναι κινητό, Gram αρνητικό και φέρει ένα μονό πολικό μαστίγιο μήκους 1,7-3 μm (Scaad N.W. 2001). Η δομή του κυτταρικού φακέλου είναι παρόμοια με αυτή των άλλων αρνητικών κατά Gram κυττάρων. Σε όλα τα είδη των Xanthomonas υπάρχει κίτρινη χρωστική ενώ αρκετά απομονωμένα είδη του μικροοργανισμού έχουν περικάλλυμα (capsular) με καψιδικό πολυσακχαρίτη ο οποίος τις περισσότερες φορές είναι ελαφρά συνδεδεμένος με τα κύτταρα (Bradbury J.F. 1984) (βλ. εικόνα1) Εικόνα 1. Αποικίες X. campestris σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, όπου φαίνεται η σύνθεση λευκού καψιδίου πολυσακχαρίτη περιμετρικά των κίτρινων αποικιών. Γενικά όλα τα είδη των Xanthomonas μπορούν να παράγουν ξανθάνη η παρόμοιας μορφής πολυσακχαρίτη (Fortaniella B. Et al., 2002). Εκείνα όμως που ανήκουν στην οικογένεια Xanthomonas casmpestris (π.χ. X. campestris pv campestris NRRL B- 1459) είναι τα πιο αποδοτικά και αυτά που κυρίως χρησιμοποιούνται για την εμπορική παραγωγή της ξανθάνης (Moreira A.S. et al., 2001) σε καθορισμένες εργαστηριακές συνθήκες τόσο με συνεχή όσο και με ασυνεχή διαδικασία. Στον 28
ακόλουθο πίνακα 5 παρουσιάζεται η επι τοις εκατό κατά μέσο όρο σύσταση πολυσακχαρίτη που παράγεται από ορισμένα βακτήρια Xanthomonas (Garcia O.F. et al., 2000). Πίνακας 5. Σύσταση (%) των δoμικών μορίων ξανθάνης από διαφορετικά είδη του γένους Xanthomonas. Τρία είδη του Xanthomonas campestris έχουν περιγραφεί. Το είδος L (μεγάλο) δημιουργεί ιξώδης, λαμπερές αποικίες διαμέτρου 4-5 mm. Παρέχει την καλύτερη απόδοση σε ξανθάνη με μεγάλη περιεκτικότητα σε πυροσταφυλικό οξύ. Ο είδος Sm (μικρό) παράγει ιξώδης σκουροκίτρινες αποικίες διαμέτρου 2 mm με απόδοση σε ξανθάνη και περιεκτικότητα σε πυροσταφυλικό οξύ μικρότερη από το πρώτο. Τέλος το είδος Vs (πολύ μικρό) έχει μη ιξώδεις αποικίες απαλού κίτρινου χρώματος μέγιστης διαμέτρου 1 mm χωρίς όμως να παράγει ξανθάνη. Τα είδη Sm και Vs προκύπτουν από τον εκφυλισμό του είδους L εξαιτίας της παλαιότητας της καλλιέργειας ή ακόμα από τις κακές τεχνικές διατήρησης που είναι πιθανόν να εφαρμοστούν (Garcia O.F. et al., 2000). Γενικά παρατηρήθηκε ότι όσο μεγαλύτερη είναι η διάμετρος της αποικίας του μικροοργανισμού τόσο μεγαλύτερη είναι και η τελική παραγωγή της ξανθάνης στην καλλιέργεια (Romirez M.E. et al., 1988). Η παραγωγή της ξανθάνης πραγματοποιείται πάντα από το είδος L. του μικροοργανισμού. Για τη διατήρηση του έχουν επινοηθεί διάφορες τεχνικές τόσο για τη μικρή όσο και για τη μακροχρόνια διάρκεια (Galindo E. Et.al., 1994). Έτσι η συντήρηση για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι μία μη αναπαραγωγική τεχνική διατήρησης η οποία χρησιμοποιεί λυοφυλίωση και κατάψυξη με 10% v/v διάλυμα γλυκερίνης. Από την άλλη μεριά οι μέθοδοι διατήρησης μικρού χρόνου επιτρέπουν 29