ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΑΕΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΚΑΙΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟΦΟΙΤΩΝ ΑΕΙ (ΠΕΓΑ) «Οι σύγχρονες τεχνικές βιο-ανάλυσης στην υγεία, τη γεωργία, το περιβάλλον και τη διατροφή»
Department of Biochemistry and Biotechnology University of Thessaly Laboratory of Molecular Biology and Genomics Τεχνικές ανάλυσης DNA Κώστας Ματθιόπουλος Τεχνικές ανάλυσης DNA 2
1. Ένζυμα περιορισμού 2. Χάρτες DNA 3. Φορείς κλωνοποίησης 4. Αρχές κλωνοποίησης 5. Βιβλιοθήκες γενετικού υλικού: cdna και γονιδιωματικού DNA 6. Αλληλούχηση DNA 7. Η αντίδραση PCR Τεχνικές ανάλυσης DNA 3
1. Ένζυμα περιορισμού Τεχνικές ανάλυσης DNA 4
Τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το DNA σε συγκεκριμένες αλληλουχίες Τεχνικές ανάλυσης DNA 5
Ορισμένα ένζυμα περιορισμού και οι αλληλουχίες που αναγνωρίζουν. Τεχνικές ανάλυσης DNA 6
Ηλεκτροφόρηση Τεχνικές ανάλυσης DNA 7
Διαχωρισμός μορίων DNA διαφορετικού μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα. Τεχνικές ανάλυσης DNA 8
Πέψη με ένζυμα περιορισμού Τεχνικές ανάλυσης DNA 9
2. Χάρτες DNA Τεχνικές ανάλυσης DNA 10
Τα ένζυμα περιορισμού χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία χαρτών DNA Τεχνικές ανάλυσης DNA 11
Τεχνικές ανάλυσης DNA 12
Η DNA λιγάση ενώνει τα άκρα τμημάτων DNA που παράγονται από τα ένζυμα περιορισμού Τεχνικές ανάλυσης DNA 13
Τεχνικές ανάλυσης DNA 14 Τα ένζυμα περιορισμού παράγουν είτε λεία (τυφλά) άκρα είτε κολλώδη άκρα.
3. Φορείς κλωνοποίησης Τεχνικές ανάλυσης DNA 15
Πλασμίδια και ιοί χρησιμοποιούνται ως φορείς αλληλουχιών DNA Στόχος της κλωνοποίησης: απομόνωση γονιδίου παραγωγή σε μεγάλες ποσότητες Προφανώς: βακτήρια Τεχνικές ανάλυσης DNA 16
Βακτήρια ξενιστές Τεχνικές ανάλυσης DNA 17
E. coli K-12 Gram (-) βακτήριο Γονιδίωμα 4.639.221 bp που κωδικοποιεί ~4000 γονίδια Πρωτοαπομονώθηκε το 1921 από τα κόπρανα ασθενούς ελονοσίας (ή το 1922 από κόπρανα ασθενούς διφθερίτιδας*) Το #1 βακτηριακό μοντέλο Τεχνικές ανάλυσης DNA 18 * Bachmann, B., pp. 2460-2488 in Neidhardt et al.1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, ASM Press
Γενετικές αλλαγές της E. coli K-12 1. Αφαίρεση συστημάτων περιοριστικών μετατροπών (restriction modification) 2. Τροποποίηση συστημάτων ανασυνδυασμού του DNA 3. Μετάλλαξη ενδονουκλεολυτικής δράσης για αύξηση πλασμιδιακής απόδοσης Τεχνικές ανάλυσης DNA 19
Φορείς κλωνοποίησης είναι μόρια DNA που χρησιμοποιούνται για να "μεταφέρουν" κλωνοποιημένες αλληλου-χίες μεταξύ βιολογικών δεικτών και του δοκιμαστικού σωλήνα (πχ. από βακτηριακά κύτταρα στο δοκιμαστικό σωλήνα σε φυτικό κύτταρο) Οι φορείς κλωνοποίησης έχουν 4 κοινές ιδιότητες: 1. Ικανότητα αυτόνομης αντιγραφής 2. Περιέχουν ένα γενετικό δείκτη (συνήθως επικρατή) προς επιλογή 3. Μοναδικές θέσεις αναγνώρισης ενζύμων περιορισμού για να διευκολύνουν την πέψη του DNA 4. Ελάχιστη ποσότητα μη-απαραίτητου DNA για τη βελτιστοποίηση της κλωνοποίησης Τεχνικές ανάλυσης DNA Φορείς κλωνοποίησης 20
Αντιπροσωπευτικοί φορείς κλωνοποίησης Τεχνικές ανάλυσης DNA 21
Τεχνικές ανάλυσης DNA 22
Τεχνικές ανάλυσης DNA 23
Φωτογραφία του πλασμιδίου psc101 στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τεχνικές ανάλυσης DNA 24
Διάκριση μπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισμό ανασυνδυασμένων φορέων. Τεχνικές ανάλυσης DNA 25
Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης. Τεχνικές ανάλυσης DNA 26
Τεχνικές ανάλυσης DNA 27
4. Αρχές κλωνοποίησης 5. Βιβλιοθήκες γενετικού υλικού: cdna και γονιδιωματικού DNA Τεχνικές ανάλυσης DNA 28
Τα πέντε βασικά βήματα της κλωνοποίησης Τεχνικές ανάλυσης DNA 29
Τεχνικές ανάλυσης DNA 30 Τα πέντε βασικά βήματα της κλωνοποίησης DNA σε πλασμίδιο
Κλωνοποίηση: Βήμα πρώτο Επιλογή νουκλεϊκού οξέος Χρωμοσωμικό DNA ή cdna? Καθαρότητα Επιλογή του κατάλληλου δείγματος Τεχνικές ανάλυσης DNA 31
Κλωνοποίηση Βήμα πρώτο: Α. Κατασκευή cdna βιβλιοθήκης Aπομόνωση mrna Τεχνικές ανάλυσης DNA 32
Κλωνοποίηση Βήμα πρώτο: Α. Κατασκευή cdna βιβλιοθήκης Σύνθεση cdna Τεχνικές ανάλυσης DNA 33
Κλωνοποίηση Βήμα πρώτο: Β. Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Τεχνικές ανάλυσης DNA 34
Κλωνοποίηση Βήμα δεύτερο: Πέψη πλασμιδιακού φορέα με ένζυμα περιορισμού Τεχνικές ανάλυσης DNA 35
Κλωνοποίηση Βήμα τρίτο: Σύνδεση προϊόντων πέψης DNA με πλασμιδιακό φορέα Τεχνικές ανάλυσης DNA 36
Κλωνοποίηση Βήμα τέταρτο: Μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων με τα προϊόντα σύνδεσης Τεχνικές ανάλυσης DNA 37 Χημικός μετασχηματισμός με CaCl 2
Τεχνικές ανάλυσης DNA 38 Μετασχηματισμός με ηλεκτροδιάτρηση
Ανάπτυξη σε θρεπτικό μέσο με αντιβιοτικό Τεχνικές ανάλυσης DNA 39
Κλωνοποίηση Βήμα πέμπτο: Διάκριση ανασυνδυασμένων κλώνων Τεχνικές ανάλυσης DNA 40
Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA από Escherichia coli Τεχνικές ανάλυσης DNA 41
Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA από Escherichia coli Τεχνικές ανάλυσης DNA 42
Σάρωση βιβλιοθήκης για τον εντοπισμό του επιθυμητού κλώνου Τεχνικές ανάλυσης DNA 43
Σάρωση βιβλιοθήκης για τον εντοπισμό του επιθυμητού κλώνου Τεχνικές ανάλυσης DNA 44
Ραδιενεργή σήμανση Τεχνικές ανάλυσης DNA 45
Αυτοραδιογραφία Τεχνικές ανάλυσης DNA 46
6. Αλληλούχηση DNA Τεχνικές ανάλυσης DNA 47
Διαδικασία αλληλούχησης με τη μέθοδο Sanger Η πιο χρησιμοποιούμενη σήμερα (ή τροποποιήσεις της) Βασίζεται στη διαδικασία της αντιγραφής Τεχνικές ανάλυσης DNA 48
Μεθοδολογία Βασίζεται στον βασεο - ειδικό τερματισμό μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης επέκτασης εκκινητή (χρήση διδεόξυ-νουκλεοτιδίων) Σήμανση εκκινητή ή νουκλεοτιδίου Αποδιάταξη DNA επαναδιάταξη με εκκινητή Χωρισμός δείγματος σε 4 τμήματα Προσθήκη σε κάθε τμήμα των τεσσάρων κανονικών νουκλεοτιδίων και σε κάθε ένα από αυτά μια ποσότητα ενός τροποποιημένου διδεόξυ νουκλεοτιδίου Αντίδραση επέκτασης τερματισμός σε διαφορετικά σημεία σε κάθε δείγμα όμως σε ίδια βάση (A ή G ή C ή T) Παράλληλη ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Τεχνικές ανάλυσης DNA 49
Τερματισμός με διδεόξυ - νουκλεοτίδιο Τεχνικές ανάλυσης DNA 50
Τερματισμός επέκτασης σε διαφορετικά σημεία της αλυσίδας Τεχνικές ανάλυσης DNA 51
Ηλεκτροφόρηση μίας αντίδρασης τερματισμού Τεχνικές ανάλυσης DNA 52
Η διαδικασία αλληλούχησης DNA με τη μέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων. Τεχνικές ανάλυσης DNA 53
Η διαδικασία αλληλούχησης DNA με τη μέθοδο του Sanger που βασίζεται στη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων. Τεχνικές ανάλυσης DNA 54
Τεχνικές βελτιώσεις Ανάπτυξη φθοριζουσών χρωστικών Τροποποιημένες DNA πολυμεράσες Χρήση ρομπότ Συσκευές αλληλούχησης με τριχοειδή Υπολογιστική δύναμη Τεχνικές ανάλυσης DNA 55
Δομές διδεοξυνουκλεοτιδίων (ddntp) σημασμένων με φθορίζουσες χημικές ομάδες. Τεχνικές ανάλυσης DNA 56 56
Αυτοματοποιημένη αλληλούχηση Τεχνικές ανάλυσης DNA 57 57
Τεχνικές ανάλυσης DNA 58
Το αρχείο γραφήματος εκπομπής περιέχει την απεικόνιση των αποτελεσμάτων μιας αντίδρασης αλληλούχησης όπως παράγονται από έναν αυτόματο αναλυτή. Τεχνικές ανάλυσης DNA 59 59
Ο αυτόματος αναλυτής ABI 310 DNA Sequencer τριχοειδής (capillary) ηλεκτροφόρηση Τριχοειδής κολόνα Τεχνικές ανάλυσης DNA 60
Macrogen - ABI 3730 capillary sequencers Κόστος: ~ 5 ευρώ / αντίδραση (και κατεβαίνει) Διάβασμα~ 700 bp (και ανεβαίνει) Τεχνικές ανάλυσης DNA 61
Η εισαγωγή ρομποτικών συσκευών αύξησε σημαντικά την παραγωγικότητα των προγραμμάτων αλληλούχησης γονιδιωμάτων. Τεχνικές ανάλυσης DNA 62
Πολυκυψελιδικά πιάτα. Τεχνικές ανάλυσης DNA 63
Πυρο-αλληλούχηση Τεχνικές ανάλυσης DNA 64
7. Η αντίδραση PCR Τεχνικές ανάλυσης DNA 65
Εκκινητές της DNA πολυμεράσης. Τεχνικές ανάλυσης DNA 66
Ο κύκλος της τεχνικής PCR. Τεχνικές ανάλυσης DNA 67
Τεχνικές ανάλυσης DNA 68 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων DNA κατά την PCR.
Τεχνικές ανάλυσης DNA 69 Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων DNA κατά την PCR.
Τεχνικές ανάλυσης DNA 70 Πολλαπλασιασμός μορίων κατά την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.