QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA 708785 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite TM Actin IgG είναι μία ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των αντισωμάτων IgG στο συστατικό ακτίνη των λείων μυών στον ανθρώπινο ορό. Η παρουσία αντισωμάτων ακτίνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές δοκιμασίες στη διάγνωση αυτοάνοσων ηπατικών νόσων όπως αυτοάνοσος ηπατίτιδα (autoimmune hepatitis - AIH) και κύρια χολική κίρρωση (primary biliary cirrhosis - PBC). Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Αντισώματα αντι-ακτίνης είναι το κύριο συστατικό των αποκαλούμενων αντισωμάτων λείου μυός (ASMA). Αυτά τα αντισώματα εμφανίζουν ειδικότητα προς το συστατικό ακτίνη του κυτταροσκελετού 1,2 και ανιχνεύονται παραδοσιακά μέσω έμμεσου ανοσοφθορισμού με χρήση λεπτών τμημάτων ήπατος, νεφρού ή στομάχου ποντικού ως υπόστρωμα. 2,3 Αντισώματα αντι-ακτίνης απαντώνται στο 52-85% των ασθενών με AIH ή χρόνια ενεργό ηπατίτιδα (chronic active hepatitis - CAH) και στο 22% των ασθενών με κύρια χολική κίρρωση (primary biliary cirrhosis - PBC). 3,4,5 Αντισώματα αντι-ακτίνης έχουν αναφερθεί, συνήθως σε χαμηλούς τίτλους, στο 3-18% των ορών από το γενικό υγιή πληθυσμό. 6 Οι διαδικασίες ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση αντισωμάτων ακτίνης ή λείου μυός είναι υποκειμενικές, με την απόδοση της ανάλυσης να εξαρτάται από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου ιστού, την ειδικότητα του συζεύγματος, την ισχύ του συστήματος μικροσκοπίου που χρησιμοποιείται για την ανάγνωση του αποτελέσματος καθώς επίσης και από την εμπειρία του χρήστη. Οι νεότερες μέθοδοι ELISA που παρουσιάστηκαν για πρώτη φορά στα μέσα της δεκαετίας 1980 ως τα πρώτα χρόνια της δεκαετίας 1990 4,5,7,8 δίνουν τη δυνατότητα για ανώτερη και περισσότερο τυποποιημένη και αυτοματοποιημένη απόδοση. Έχει αναφερθεί ότι η ειδικότητα αντι-λείου μυός για ακτίνη απαντάται κυρίως σε ασθενείς με CAH, ενώ, σε ιογενείς λοιμώξεις, όπως λοιμώδης μονοπυρήνωση, ιογενής ηπατίτιδα, ιλαρά και παρωτίτιδα, αυτή η αντιδραστιότητα αντι-λείου μυός οφείλεται στην αντιδραστικότητα σε κυτοπλασματικά αντιγόνα μη ακτίνης. 1,2,3,9,10 Τα αντισώματα λείου μυός και τα αντι-πυρηνικά αντισώματα είναι οι ανοσοοροδιαγνωστικές χαρακρητιστικές ενδείξεις της αυτοάνοσου ηπατίτιδας τύπου 1. 11 Τα αντισώματα λείου μυός στρέφονται έναντι διαφόρων συστατικών, το σπουδαιότερο από τα οποία είναι η ακτίνη, αλλά ο ανοσοφθορισμός μπορεί επίσης να ανιχνεύσει αντισώματα σε τουβουλίνη και ενδιάμεσα νημάτια. 12 Πρόσφατες μελέτες προτείνουν ότι είναι τα αντισώματα αντι-ακτίνης εκείνα τα οποία έχουν ειδικότητα για αυτοάνοσο ηπατική νόσο και θεωρούνται ως καλύτεροι δείκτες για αυτοάνοσο ηπατίτιδα από τα αντισώματα αντι-λείου μυός. 12,13,14 Στην πραγματικότητα, ο όρος ηπατίτιδα αντι-ακτίνης χρησιμοποιείται για να περιγράψει αυτήν την κατάσταση. 15 Οι Czaja et al. 14 έδειξαν ότι αντισώματα αντι-ακτίνης ήταν παρόντα σε 73 από 99 (74%) ασθενείς με τύπου 1 αυτοάνοσο ηπατίτιδα, σε 0 από 83 υγιείς δότες και σε 3-15% των ασθενών με άλλους τύπους χρόνιας ηπατίτιδας. Από την ίδια αυτή μελέτη, καθορίστηκε ότι σχεδόν όλοι (99%) οι θετικοί για ακτίνη ασθενείς ήταν επίσης θετικοί για αντίσωμα λείου μυός, ενώ 46% της αρνητικής για ακτίνη ομάδας έδειξε αντιδραστικότητα λείου μυός. Οι θετικοί για ακτίνη ασθενείς είχαν μεγαλύτερη πιθανότητα να μην ανταποκρίνονται στη θεραπεία με κορτικοστεροειδή (16% έναντι 4%) και να υποστούν ηπατική ανεπάρκεια (20% έναντι 4%). 14 Αρχη Μεθοδου Καθαρό αντιγόνο F-ακτίνης έχει δεσμευτεί στα τοιχώματα μίας πλάκας μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου υπό συνθήκες που διατηρούν το αντιγόνο στην καθαρή του κατάσταση. Έτοιμοι μάρτυρες (control ) και αραιωμένος ορός ασθενούς προσθέτονται σε ξεχωριστά πηγαδάκια επιτρέποντας έτσι το όποιο αντι-actin αντίσωμα που υπάρχει να προσκολλήσει στο ακινητοποιημένο αντιγόνο κατά την πρώτη επώαση. Το υπόλοιπο του δείγματος ξεπλένεται και ένα ένζυμο από σεσημασμένο αντι-ανθρώπινο IgG (conjugate) αντίσωμα προστίθεται σε κάθε πηγαδάκι. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο να συνδεθεί με όποιο αντίσωμα του ασθενούς έχει προσκολληθεί στο υπόστρωμα του πηγαδιού. Με το δεύτερο ξέπλυμα των μη συνδεδεμένων συζυγών ενζύμων(conjugate), η υπόλοιπη ενζυματική δραστηριότητα μετράται με την πρόσθεση ενός χρωστικού διαλύματος (chromogen) μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται. Η επεξεργασία μπορεί να κριθεί με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια πρότυπων ορών ελέγχου (control). Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο Actin (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς IgG ανθρώπινα αντισώματα Actin) 3. Actin IgG ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο IgG ανθρώπινο Actin, προαραιωμένο, 1.2ml 4. Actin IgG ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο IgG ανθρώπινο Actin, προαραιωμένο, 1.2ml 1

5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0.344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 16 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 8 ο C. 2

Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Actin IgG ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2mL αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος Actin IgG ELISA Low Χαμηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2mL αραιωμένος Actin IgG ELISA High Υψηλός πρότυπου ορού ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 3

5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι Actin IgG ELISA θετικοί και ο Actin IgG ELISA αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι Actin IgG ELISA θετικοί και ο Actin IgG ELISA αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού Actin IgG ELISA θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού Actin IgG ELISA θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού Actin IgG ELISA θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο Actin IgG αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός Actin IgG θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του Actin IgG ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του Actin ELISA Low. Η τιμή του Actin IgG ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X Actin IgG oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. Actin IgG ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, μάρτυρες, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί μετά να ταξινομηθεί σαν αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον πίνακα παρακάτω. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενώς θετικό 20-30 Ενδιάμεσο ή Ισχυρώς θετικό >30 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την παρουσία αντισωμάτων ακτίνης και υποδηλώνει την πιθανότητα αυτοάνοσου ηπατίτιδας ή χρόνιας ενεργού ηπατίτιδας. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων Actin ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 4

3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA.Οι τιμές που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία άνοσων συμπλεγμάτων ή άλλων συσσωρεύσεων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενούς μπορεί να προκαλέσει αυξημένα επίπεδα μη ειδικής σύνδεσης και να παράγει ψευδή θετικά στη συγκεκριμένη ανάλυση. 2. Οι πάσχοντες από χρόνια ενεργό ηπατίτιδα ή κύρια χολική κίρρωση δεν είναι όλοι θετικοί για αντισώματα ακτίνης. 3. Τα θετικά δείγματα λείου μυός δεν περιέχουν όλα αντισώματα ακτίνης. 4. Τα αποτελέσματα της μεθόδου αυτής πρέπει να δίδονται σε συνδιασμό με τά κλινικά ευρήματα και τα ευρήματα από άλλες ορολογικές δοκιμασίες. 5. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. 6. Επί του παρόντος, τα αποτελέσματα της θεραπείας στα αυτοαντισώματα αντι-ακτίνης είναι άγνωστα. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα της μεθόδου QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA να ανιχνεύσει αντισώματα ακτίνης αξιολογήθηκε μέσω σύγκρισης με μία εμπορικά διαθέσιμη δοκιμασία ανοσοφθορισμού και μέσω αξιολόγησης κλινικά καθορισμένων δειγμάτων ασθενών. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας ανοσοφθορισμού προσδιορίστηκαν σύμφωνα με το ένθετο οδηγιών του παρασκευαστή. Φυσιολογικές τιμές Η μελέτη εύρους φυσιολογικών τιμών διενεργήθηκε στο ερευνητικό εργαστήριο της INOVA Diagnostics, Inc. Εκατόν πενήντα τυχαία φυσιολογικά δείγματα ορού επιλέχθηκαν και αναλύθηκαν με τη μέθοδο QUANTA Lite Actin IgG ELISA. Ο συγκεκριμένος πληθυσμός περιέλαβε 89 άνδρες με εύρος ηλικίας από 18 έως 70 ετών (μέση ηλικία 31 έτη) και 61 γυναίκες με εύρος ηλικίας από 17 έως 74 ετών (μέση ηλικία 36 έτη). Μόνο 3 από αυτά τα 150 δείγματα εμφανίστηκαν θετικά. Δύο δείγματα έδωσαν μέτριο έως ισχυρό αποτέλεσμα 75 και 31 μονάδων και το άλλο δείγμα ήταν μόνο ασθενώς θετικό στις 21 μονάδες. Η θετική τιμή αποκοπής για την ανάλυση αυτή είναι 20 μονάδες. Η τιμή μέσου όρου για τα 150 φυσιολογικά δείγματα ήταν 7.3 μονάδες. Τα 3 θετικά φυσιολογικά δείγματα αναλύθηκαν με το κιτ ανοσοφθορισμού NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach. Τα ισχυρά θετικά δείγματα (75 και 31 μονάδες) αντέδρασαν με ένα κλασικό σχήμα λείου μυός θετικό για ακτίνη. Αυτά τα δείγματα έδωσαν έντονα φθορίζουσες αντιδράσεις με το λείο μυ των αιμοφόρων αγγείων του νεφρού, τον μυικό χιτώνα του στομάχου καθώς και με τις συσταλτές πρωτεϊνικές χορδές που εκτείνονται μεταξύ των γαστρικών τοιχωματικών κυττάρων. Το ασθενέστερο θετικό δείγμα (21 μονάδες) εμφάνισε μία άτυπη, περισσότερο ομοιάζουσα με ρετικουλίνη χρώση του λείου μυϊκού ιστού. Σχετική συμφωνία μεταξύ ELISA και ανοσοφθορισμού Για να προσδιοριστεί η σχετική ευαισθησία και ειδικότητα της ανάλυσης, 83 δείγματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση για αντίσωμα λείου μυός από τον παραπάνω πίνακα συν άλλα 150 δείγματα αναλύθηκαν τόσο με τη μέθοδο QUANTA Lite Actin IgG ELISA όσο και με μία άλλη εμπορικά διαθέσιμη μέθοδο IFA. Από τα 233 δείγματα, 65 ήταν θετικά και 136 αρνητικά και με τις δύο μεθόδους. Τριάντα δύο δείγματα ήταν θετικά με τη μέθοδο IFA αλλά όχι με τη μέθοδο ELISA. Από αυτά τα 32 δείγματα που βρέθηκαν IFA θετικά ενώ ELISA αρνητικά, 11 ήταν από τη φυσιολογική ομάδα και 17 από τα υπόλοιπα 21 δείγματα ήταν IFA θετικά αλλά μόνο σε αραίωση 1:40. QUANTA Lite Actin IgG ELISA + - + 65 32 Θετική συμφωνία 67.0% Μέθοδος IFA Αρνητική συμφωνία 100% - 0 136 Γενική συμφωνία 86.3% Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα Τα κλινικά δεδομένα που παρατίθενται παρακάτω ελήφθησαν από μελέτες που διενεργήθηκαν στα εργαστήρια της INOVA καθώς και από 1 εξωτερική μελέτη. Ομάδα ασθενών Αριθμός Αριθμός θετικών % Θετικά Αυτοάνοσος ηπατίτιδα (AIH) 214 155 72.4 Κρυπτογενής ηπατίτιδα 9 3 33.0 Αυτοάνοσος χολαγγειίτιδα 8 5 62.5 Κύρια χολική κίρρωση (PBC) 10 3 30.0 Αλληλοεπικάλυψη AIH/PBC 9 7 77.8 Αλληλοεπικάλυψη AIH/PSC 3 2 66.0 Φαρμακογενής ηπατίτιδα 1 1 100.0 Αυτοάνοσος ηπατίτιδα τύπου 2 3 3 100.0 Ιογενής ηπατίτιδα 3 0 0.0 Κίρρωση 1 0 0.0 Κύρια σκληρωτική χολαγγειίτιδα (PSC) 1 0 0.0 Θετικοί οροί ελέγχου αυτοαντισωμάτων 108 11 10.0 Φυσιολογικοί 163 3 1.8 5

Η ευαισθησία για AIH μπορεί στην πραγματικότητα να είναι υψηλότερη από την υποδεικνυόμενη καθώς πολλοί από αυτούς τους ασθενείς υποβάλλονταν σε ανοσοκατασταλτική θεραπεία πριν από τη λήψη του δείγματος. Επιπρόσθετα, πολλοί ασθενείς είχαν πολλαπλές δειγματοληψίες. Η οροθετικότητα για τον παραπάνω πίνακα καθορίστηκε ως η θετικότητα της πρώτης δειγματοληψίας. Ένας πρόσθετος αριθμός 7 ασθενών AIH, 1 ασθενούς AIH/PBC και 1 ασθενούς AIH/PSC έγιναν θετικοί σε μετέπειτα δείγματα δίνοντας ευαισθησίες της τάξης του 75.7% για την ομάδα AIH. Διασταυρωμένη Αντιδραστικότητα Για την αξιολόγηση της πιθανής διασταυρούμενης αντιδραστικότητας άλλων αυτοαντισωμάτων με τη μέθοδο QUANTA Lite Actin IgG ELISA, αναλύθηκε ένα σύνολο 68 διαφορετικών ορών, καθένας από τους οποίους περιείχε υψηλά επίπεδα διαφόρων συνήθως εξεταζόμενων αυτοαντισωμάτων. Αυτό το σύνολο 68 δειγμάτων συμπεριέλαβε 6 δείγματα από ασθενείς με SLE, τα οποία περιείχαν υψηλά επίπεδα ANA και DNA διπλού έλικα, 2 ορούς ρευματοειδούς παράγοντα, 6 ορούς θετικούς για τρανσγλουταμινάση ενδομυΐου/ιστού, 7 ορούς θετικούς για υπεροξειδάση θυρεοειδούς (TPO). Υπήρχαν 8 ANCA θετικά, 4 P-ANCA και 4 C-ANCA. Αναλύθηκαν μία σπειραματική βασική μεμβράνη (GBM), 1 θετικό για λύκο αντιπηκτικό και 4 από καθένα από τα ακόλουθα: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70 και Jo-1. Οι υπόλοιποι οροί ήταν 4 αντικαρδιολιπίνης, 3 β 2 GPI, 2 προθρομβίνης θετικοί, 1 ιστόνης και 3 δείγματα από ασθενείς με διαβήτη τύπου I που ήταν ICA θετικοί. Μόνο 4 έδωσαν θετικό αποτέλεσμα. Δύο δείγματα ήταν ισχυρά θετικά στις 83 και 66 μονάδες. Όταν αναλύθηκαν με τη μέθοδο IFA στο κιτ NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach (νεφρό/στόμαχος ποντικού) και τα δύο δείγματα βρέθηκαν θετικά για αντίσωμα λείου μυός σε τίτλο 1:320 με ένα χαρακτηριστικό σχήμα ακτίνης. Δύο δείγματα ήταν ασθενή θετικά στις 26 μονάδες το καθένα. Κανένα από αυτά δεν έδειξε αντιδραστικότητα με λείο μυϊκό ιστό από τον ανοσοφθορισμό. Και τα δύο δείγματα ήταν ANA/DNA θετικά. Ανάλυση 83 γνωστών θετικών δειγμάτων λείου μυός Ο ακόλουθος πίνακας παραθέτει τη θετικότητα ακτίνης ELISA σύμφωνα με τον τίτλο IFA λείου μυός. Τίτλος IFA Αριθμός Αριθμός θετικών ακτίνης % Θετικά 2560 1 1 100% 1280 1 1 100% 640 8 8 100% 320 7 6 86% 160 12 12 100% 80 17 14 82% 40 37 20 54% Total 83 62 75% Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα της δοκιμασίας μετρήθηκε με την εξέταση έξι διπλών, ένα ισχυρώς θετικό, ασθενές θετικό και ένα αρνητικό δείγμα σε έξι ξεχωριστές αναλύσεις. Η μέση αντιδραστικότητα του ισχυρώς θετικού ήταν 110 μονάδες, του ασθενώς θετικού ήταν 25.0 μονάδες, ενώ η μέση τιμή για το αρνητικό ήταν 14. Η κανονική απόκλιση και ο συντελεστής της αποκλισης για κάθε δείγμα συνοψίζονται παρακάτω. Αρνητικό Ασθενώς Θετικό Ισχυρώς Θετικό SD CV SD CV SD CV Ολικό 1.3 9.7% 1.4 5.5% 4.5 4.1% Κατά την διάρκεια της ανάλυσης 1.1 8.0% 1.4 5.8% 3.8 3.5% Μεταξύ των αναλύσεων 1.2 8.6% 1.3 5.3% 5.3 4.2% Βιβλιογραφία 1. Anderson P, et al. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26:57-66, 1976. 2. Bottazzo GF, et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 129:403-410, 1976. 3. George, J and Shoenfeld Y. Actin Autoantibodies, p10-12 in Autoantibodies by JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, 1996. 4. Bretherton L, et al. Elisa assay for IgG autotantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51: 611-616, 1983. 5. Dighiero G, et al. Sera with high levels of antismooth muscle and anti mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeletal proteins. Clin Ept Immunol 82:52-56, 1990. 6. Fagraeus A and Norberg R. Antiactin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82:1-13, 1978. 7. DeScheerder I, et al. Post-Cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56:631-633, 1985. 8. Leibovitch L, et al. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Letters 48:129-132, 1995. 9. Kurki P, et al. Smooth muscle antibodies of actin and nonactin specificity. Clin Immuno Immunpathol 9:443-453, 1978. 10. Toh BH, et al. Viral infections and IgM autoantibody to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37:76-82, 1979. 6

11. Alvarez F, et al. International autoimmune hepatitis group report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J of Hepatology 31:929-938, 1999. 12. Toh BH. Smooth muscle atuoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38:621-628, 1979. 13. Fusconi M, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem? J Immunol Mehtods 130:1-8, 1990. 14. Czaja A, et al. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24:1068-1073, 1996. 15. Homberg J, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 7:1333-1339, 1987. 16. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628785GRC September 2009 Revision 4 7