PASTOREX TM MENINGITIS 25 εξετάσεις 61607 61608 61610 61611 61613 61614 61616 61617 61618 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ.ΙΑΛΥΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΗΝΙΓΓΙΤΙ.ΟΚΟΚΚΟΥ Α, C, Y/W135, B/E.COLI K1, ΑΙΜΟΦΥΛΟΥ ΤΗΣ ΓΡΙΠΗΣ, ΠΝΕΥΜΟΝΙΟΚΟΚΚΟΥ, ΣΤΡΕΠΤΟΚΟΚΚΟΥ ΟΜΑ.ΑΣ B 1- ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Η βακτηριδιακή μηνιγγίτιδα είναι μία μόλυνση των μηνίγγων και οι κύριοι οργανισμοί ευθύνονται για αυτήν είναι: ο μηνιγγιτιδόκοκκος, ο πνευμονιόκοκκος, ο αιμόφιλος της γρίπης τύ β και ο στρεπτόκοκκος της ομάδας Β Η μηνιγγίτιδα συνιστά μία σοβαρή περίπτωση και συνεπώς η ταχεία διάγνωση της μόλυνσης προκειμένου να αρχίσει η κατάλληλη θεραπεία είναι σημαντική. Η κλασσική τεχνική ταυτοποίησης μέσω καλλιέργειας, ακόμη και αν είναι απαραίτητη για το αντιβιόγραμμα και για την επιβεβαίωση της διάγνωσης, είναι αργή και ενδέχεται να δώσει λανθασμένα αρνητικά αποτελέσματα εάν το δείγμα έχει μεταφερθεί και αποθηκευθεί υπό μη ικανοποιητικές συνθήκες ή εάν η θεραπεία με αντιβιοτικά έχει αρχίσει πριν από τη λήψη του δείγματος. Ανοσολογικές τεχνικές ανίχνευσης διαλυτού αντιγόνου εκλύεται από τους αιτιολογικούς οργανισμούς στα βιολογικά υγρά π.χ. εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ούρα, ορός, κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, επιτρέν ταχύτερη διάγνωση. Τα διαλυτά αντιγόνα μπορούν να ανιχνευθούν με το συγκεκριμένο κιτ είναι πολυσακχαρίτες ειδικοί για ορισμένες οροομάδες και ορότυς: πνευμονιόκοκκος (83 τύς); αιμόφιλος της γρίπης τύ β, μηνιγγιτιδόκοκκος ομάδας A, ομάδας B/E.coli K1, ομάδας C, ομάδας Y/W135 και στρεπτόκοκκος ομάδας B. Το αντιγόνο πολυσακχαρίτη ειδικό για Μηνιγγιτιδόκοκκο οροομάδας B είναι λιγότερο αντιγονικό και ήταν πάντα δύσκολη η αναπαραγωγή αντισωμάτων κονίκλου με ειδικότερη κατεύθυνση κατά του συγκεκριμένου αντιγόνου. Η τεχνολογία των μονοκλωνικών αντισωμάτων εφαρμόζεται στην προετοιμασία των ειδικών βακτηριδιακών αντιγόνων πολυσακχαρίτη επιτρέπει την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού τα οποία είναι ικανά να αναπαράγονται και ειδικά για την ταυτοποίηση του αντιγόνου πολυσακχαρίτη του Μηνιγγιτιδόκοκκου της οροομάδας Β. Το συγκεκριμένο αντιγόνο πολυσακχαρίτης, ειδικό για Μηνιγγιτιδόκοκκο οροομάδας B, είναι ίδιο με το αντιγόνο πολυσακχαρίτη υπάρχει στο E.coli K1. Αυτή η αντιγονική ομολογία μεταξύ του Μηνιγγιτιδόκοκκου B και του E.coli K1 επιτρέπει τη διάγνωση της μηνιγγίτιδας E.coli στα νεογνά, εκ των οποίων το 80% περί με στέλεχος K1. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το E.coli και ο Στρεπτόκοκκος B είναι τα κυριότερα βακτήρια ευθύνονται για την μηνιγγίτιδα στα νεογνά και τα πρόωρα βρέφη και ότι η μόλυνση από μηνιγγιτιδόκοκκο είναι άκρως σπάνια σε αυτή την ηλικιακή ομάδα.
2- ΑΡΧΗ Το αντιγόνο περιέχεται στο υπό δοκιμή δείγμα ταυτοποιείται χρησιμοποιώντας σωματίδια λάτεξ με επίστρωση ειδικών ομόλογων αντισωμάτων. Παρουσία του ομόλογου αντιγόνου, τα σωματίδια λάτεξ συγκολλούνται. Ασία αντιγόνου, παραμένουν σε ομοιογενές εναιώρημα. 3- ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ 1. Το κιτ 25 εξετάσεων PASTOREX TM MENINGITIS, κωδικός 61607, περιλαμβάνει τα εξής: Αντιδραστήριο 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1 1 φιάλη με 0,40 ml κόκκινο λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με μονόκλωνο αντίσωμα ποντικιού ειδικά για N. meningitidis ομάδας B/E.coli K1. Αντιδραστήριο 2 (R2): αρνητικός ορός ελέγχου N. meningitidis B/E.coli K1 1 φιάλη με 0,40 ml κόκκινο λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με μονόκλωνο αντίσωμα ποντικιού ειδικό για τοξοειδές τετάνου. Αντιδραστήριο 3 (R3): H. influenzae τύ b 1 φιάλη με 0,40 ml λευκό λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με αντισώματα κουνελιού ειδικά για H. influenzae τύ b. Αντιδραστήριο 4 (R4): S. pneumoniae 1 φιάλη με 0,40 ml πράσινο λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με αντισώματα κουνελιού ειδικά για S. pneumoniae. Αντιδραστήριο 5 (R5): Streptococcus B 1 φιάλη με 0,40 ml κίτρινο λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με αντισώματα κουνελιού ειδικά για Streptococcus B. Αντιδραστήριο 6 (R6): N. meningitidis A 1 φιάλη με 0,40 ml μπλε λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με αντισώματα κουνελιού ειδικά για N. meningitidis ομάδας A. Αντιδραστήριο 7 (R7): N. meningitidis C 1 φιάλη με 0,40 ml κόκκινο λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με αντισώματα κουνελιού ειδικά για N. meningitidis ομάδας C. Αντιδραστήριο 8 (R8): N. meningitidis Y/W 135 1 φιάλη με 0,40 ml ροζ λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με αντισώματα κουνελιού ειδικά για N.meningitidis Y/W 135 Αντιδραστήριο 9 (R9): Πολυδύναμο αρνητικός ορός ελέγχου 1 φιάλη με 0,40 ml βαθύ κόκκινο λάτεξ ευαισθητοποιήθηκε με ανοσοσφαιρίνες IgG μη ανοσοποιημένου κουνελιού. Αντιδραστήριο 10 (R10): Πολυδύναμο θετικός ορός ελέγχου Θετικός ορός ελέγχου: αφυδατωμένο υπό ψύξη αντιγονικό εκχύλισμα προς ανασύσταση με 1 ml αποστειρωμένου νερού. Περιέχει τα πολυσακχαριδικά αντιγόνα των N.meningitidis A, C, B, Y/W135, H.influenzae b, Streptococcus B και S.pneumoniae. Επαρκής όγκος για 20 αντιδράσεις. Όλα τα αντιδραστήρια περιέχουν 0,02 % thimerosal. Τα αντιδραστήρια R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 περιέχουν λιγότερο από 0,1% αζίδιο του νατρίου. Πλακίδια συγκόλλησης μίας χρήσης. Ράβδοι ανάμιξης μίας χρήσης.
2. ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΕ ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΑ ΛΑΤΕΞ PASTOREX TM MENINGITIS (25 εξετάσεις το καθένα): Εξέταση με μεμονωμένο λάτεξ (χωρίς ορό ελέγχου) - N.meningitidis A (R6) κωδικός 61608 - N.meningitidis C (R7) κωδικός 61610 - N.meningitidis B/E.coli K1(R1) κωδικός 61611 - Streptococcus B (R5) κωδικός 61613 - Streptococcus pneumoniae (R4) κωδικός 61614 - Haemophilus influenzae b (R3) κωδικός 61616 Ορός ελέγχου PASTOREX TM Meningitis Κιτ αντιδραστηρίων ορού ελέγχου για εξέταση μεμονωμένου λάτεξ (για 2 x 25 εξετάσεις) κωδικός 61618-2 φιάλες με σταγονόμετρο περιέχουν 0,40 ml πολυδύναμου αρνητικού ορού ελέγχου (R9) - 2 φιάλες πολυδύναμου αφυδατωμένου θετικού ορού ελέγχου (R10) υπό ψύξη προς ανασύσταση με 1 ml αποστειρωμένου νερού. - 2 φιάλες με σταγονόμετρο περιέχουν 0,40 ml αρνητικού ορού ελέγχου για N.m.B / E.coli K1 (R2) - πλακίδια μίας χρήσης. - ράβδοι ανάμιξης μίας χρήσης. 3. Αραιωτικό PastorexTM Meningitis 1 φιάλη με 40 ml αραιωτικού για επεξεργασία ορών κωδικός 61717 4- ΦΥΛΑΞΗ Όλα τα αντιδραστήρια παραμένουν σταθερά έως την ημερομηνία λήξης αναγράφεται στην ετικέτα, εάν αποθηκεύονται στους 2 έως 8 C ασία μικροβιακής μόλυνσης (ακόμα και όταν ανοιχθούν). Ο πολυδύναμος θετικός μάρτυρας προκύπτει με ανασύσταση (R10) παραμένει σταθερός για 1 μήνα στους 2 έως 8 C (ασία μικροβιακής μόλυνσης) ή για περισσότερο εάν κλασματοποιηθεί και καταψυχθεί αμέσως στους -20 C. Αποθηκεύστε τις φιάλες αντιδραστηρίων λάτεξ σε όρθια στάση. ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΛΑΤΕΞ. 5- ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Πιπέτα για την κατανοµή µίας σταγόνας (40 έως 50µl) του δείγµατος. Σωλήνες αιµόλυσης ή Eppendorf Ξηρός επωαστήρας ή υδατόλουτρο 100 C. Φυγοκεντρητής για σωλήνες αιµόλυσης ή Eppendorf. Λουτρό απολύµανσης Αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό, αποστειρωμένος φυσιολογικός ορός ή αραιωτικό (κωδικός 61717)
6- ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η ποιότητα των αποτελεσμάτων εξαρτάται από την αυστηρή τήρηση της Ορθής Εργαστηριακής Πρακτικής. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε θερμοκρασία δωματίου από 18 έως 25 C. Μην αγγίζετε την επιφάνεια αντίδρασης των πλακιδίων συγκόλλησης. Αλλάζετε την πιπέτα ή το επιστόµιο µίας χρήσης σε κάθε δείγµα υποβάλλεται σε δοκιµή. Αναδεύετε τις φιάλες του λάτεξ πριν από τη χρήση. Σκουπίζετε το επιστόµιο της σταγονοµετρικής φιάλης περιέχει το αντιδραστήριο προκειµένου να λάβετε καλά βαθµονοµηµένες σταγόνες. Κρατάτε τη φιάλη αντιδραστηρίου κατακόρυφα για να αποθέσετε τις σταγόνες. Σε κάθε αντίδραση αλλάζετε τον αναδευτήρα. Απορρίπτετε όλα τα υλικά µίας χρήσης χρησιµοποιήσατε σε αυτόκλειστο κάδο απορριµµάτων ή σε λουτρό απολύµανσης. Ο πολυδύναµος θετικός µάρτυρας πρέπει να ανασυστήνεται µε αποστειρωµένο και απεσταγµένο νερό για την αποφυγή οιασδήποτε µόλυνσης. ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Ακολουθείτε πάντα τις ισχύουσες τεχνικές και προφυλάξεις σχετικά με την προστασία από μικροβιολογικούς κινδύνους. Όλα τα δείγματα λαμβάνονται πρέπει να θεωρούνται ως εν δυνάμει μολυσματικά. Όλα τα αντιδραστήρια λάτεξ περιέχουν αζίδιο νατρίου. Αποφεύγετε την επαφή με τα μάτια, το δέρμα και τον βλεννογόνο υμένα. Το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει με τις σωληνώσεις από μόλυβδο ή χαλκό και να σχηματίσει μεταλλικά αζίδια τα οποία είναι άκρως εκρηκτικά. Εάν τα αντιδραστήρια απορρίπτονται στον νιπτήρα, ξεπλένετε τις σωληνώσεις με άφθονο νερό. 7- ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ), ορός, ούρα Δείγματα Η επεξεργασία των δειγμάτων θα πρέπει να εκτελείται το συντομότερο δυνατό μετά τη συλλογή. Σε αντίθετη περίπτωση, μπορείτε να τα αποθηκεύσετε για μερικές ώρες σε θερμοκρασία από +2 έως +8 C ή για μεγαλύτερο διάστημα στους -20 C (στην περίπτωση αυτή, φυλάσσετε μόνο το υπερκείμενο υγρό στους 20 C μετά τη φυγοκέντριση). Αποφεύγετε την επανειλημμένη ψύξη/απόψυξη. Για την αποφυγή μόλυνσης του δείγματος, η εκτέλεση βακτηριολογικών εξετάσεων (καλλιέργεια) θα πρέπει να θεωρείται θέμα προτεραιότητας. Ο ελάχιστος όγκος δείγματος πρέπει να χρησιμοποιείται για εξέταση με το κιτ λάτεξ είναι 0,5 ml. A- Προετοιμασία κλινικών δειγμάτων. ΠΡΟΣΟΧΗ: κατά τη χρήση του υδατόλουτρου, χρησιμοποιείτε υδατοστεγείς σωλήνες για την αποφυγή εισχώρησης νερού στους σωλήνες. Εάν είναι δυνατό, χρησιμοποιείτε ξηρό επωαστήρα.
α) ENY (εγκεφαλονωτιαίο υγρό) Αν το εγκεφαλονωτιαίο υγρό είναι πολύ θολό ή περιέχει ερυθροκύτταρα, εκτελέστε φυγοκέντριση για 5 λεπτά στα 350 g και συλλέξτε το υπερκείμενο υγρό. Θερμάνετε το δείγμα για 3 λεπτά στους 100 C (σε ξηρό επωαστήρα ή υδατόλουτρο). Αφήστε το δείγμα να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια εκτελέστε ξανά φυγοκέντριση για 5 λεπτά στα 3000 g ή διήθηση με φίλτρο 0,45 µm. β) ΟΡΟΣ Προσθέστε 3 όγκους (1,5 ml) αραιωτικού (κωδικός 61717) και έναν όγκο (0,5 ml) ορό. Θερμάνετε για 3 λεπτά στους 100 C σε υδατόλουτρο ή ξηρό επωαστήρα. Εκτελέστε φυγοκέντριση για 5 λεπτά στα 3000 g. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη χρησιμοποιείτε δείγματα πλάσματος. Δεν έχει εξεταστεί τυχόν αλληλεπιδράσεις λόγω υπερβολικής ποσότητας λευκωματίνης, λιπιδίων, αιμοσφαιρίνης και χολερυθρίνη. Βέλτιστα αποτελέσματα λαμβάνονται με χρήση φρέσκου ορού. γ) ΟΥΡΑ Για να αυξηθεί η συγκέντρωση αντιγόνου, μπορείτε να συμπυκνώσετε το δείγμα πριν από την εξέταση έως και 25 φορές σε μια μεμβράνη τύ Amicon B15 (Amicon France). Θερμάνετε τα ούρα για 3 λεπτά στους 100 C (σε ξηρό επωαστήρα ή υδατόλουτρο). Εκτελέστε φυγοκέντριση για 5 λεπτά στα 3000 g ή διήθηση με φίλτρο 0,45µm. B- Διαδικασία εξέτασης. Τοποθετήστε μία σταγόνα (40-50 µl) υπερκείμενου του προεπεξεργασμένου δείγματος σε κάθε κύκλο της κάρτας συγκόλλησης. Ήπια ανακινήστε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων λάτεξ. Κρατώντας το φιαλίδιο σε όρθια θέση, τοποθετήστε μία σταγόνα από κάθε αντιδραστήριο λάτεξ στην κάρτα μίας χρήσης, ακολουθώντας την ενδεικνυόμενη κατανομή: τα R9, R6, R7, R1 και R2 στους λευκούς κύκλους και τα R8, R3, R4 και R5 στους μαύρους κύκλους. Αναμείξτε τα αντιδραστήρια λάτεξ με το δείγμα με μία ράβδο. Αλλάζετε τη ράβδο για κάθε λάτεξ. Περιστρέψτε την κάρτα (~120 περιστροφές ανά λεπτό (ΠΑΛ)) με ήπιες κινήσεις για 10 λεπτά και παρακολουθήστε έως ότου εμφανιστεί οποιαδήποτε συγκόλληση, ορατή με γυμνό μάτι εντός 10 λεπτών (μπορεί να χρησιμοποιηθεί περιστροφικός αναδευτήρας σε ταχύτητα ~120RPM). 8- ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Για λόγους εικαζόμενου προσανατολισμού, ελέγξτε τη μορφολογία και τα αποτελέσματα χρώσης. Πάρτε 1-2 ml θετικού αποτελέσματος αιμοκαλλιέργειας. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 2.000g. Τοποθετήστε μία σταγόνα (40-50 µl) υπερκείμενου σε κάθε κύκλο της κάρτας μίας χρήσης, η οποία αντιστοιχεί στα προς έλεγχο αντιδραστήρια λάτεξ, σύμφωνα με το αποτέλεσμα χρώσης. Ήπια ανακινήστε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων λάτεξ έχετε επιλέξει για την εξέταση. Κρατώντας το φιαλίδιο σε όρθια θέση, τοποθετήστε μία σταγόνα από κάθε αντιδραστήριο λάτεξ στην περιφέρεια των υπερκείμενων σταγόνων.
Αναμείξτε τα αντιδραστήρια λάτεξ με το δείγμα με μία ράβδο. Αλλάζετε τη ράβδο για κάθε λάτεξ. Περιστρέψτε την κάρτα στις ~120 rpm για 5 λεπτά. Κατά τη διάρκεια αυτών των 5 λεπτών, ελέγξτε για την εμφάνιση συγκόλλησης. Ορισμένα υλικά αιμοκαλλιέργειας μπορούν να παρουσιάσουν μη ειδικές αντιδράσεις ή προβλήματα αναγνωσιμότητας. Όσον αφορά τον αρνητικό έλεγχο, χρησιμοποιήστε αιμοκαλλιέργεια ενοφθαλμισμένη με αποστειρωμένο αίμα ή με κάποιον οργανισμό διαφορετικό από αυτούς εντοπίστηκαν με το PASTOREX TM Meningitis. 9- ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΘΕΤΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Η θετική αντίδραση υποδεικνύεται μέσω της ικανοποιητικής συγκόλλησης, ορατής με γυμνό μάτι, σε σύγκριση με τους αρνητικούς ελέγχους. Η ένταση της συγκόλλησης και η χρονική στιγμή εμφάνισης εξαρτώνται από τη συγκέντρωση αντιγόνων στο ελεγμένο δείγμα. Η ασυμφωνία μεταξύ της θετικής δοκιμασίας αντιγόνου και της αρνητικής καλλιέργειας μπορεί να αιτιολογηθεί λόγω της ασίας βιώσιμων βακτηρίων στο δείγμα έχει καλλιεργηθεί (έναρξη αντιβιοτικής θεραπείας πριν τη λήψη του δείγματος ή μη κατάλληλες συνθήκες μεταφοράς για την επιβίωση των ευαίσθητων βακτηρίων). Στις περισσότερες περιπτώσεις, η θετική αντίδραση με anti-n. meningitidis B/E.coli K1 λάτεξ σε νεογνά ή σε πρόωρα βρέφη υποδεικνύει λοίμωξη με E.coli K1. Σε μεγαλύτερους σε ηλικία ασθενείς, πιθανότερη αιτία είναι το Meningococcus B. Η διάγνωση πρέπει να επιβεβαιωθεί με καλλιέργεια του δείγματος. ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Ομοιογενές εναιώρημα, χωρίς συσσώματα. ΜΗ ΕΡΜΗΝΕΥΣΙΜΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η αντίδραση είναι μη ερμηνεύσιμη εάν το δείγμα συγκολλάται με τους αρνητικούς ελέγχους λάτεξ (R2 ή R9) και/ή με τουλάχιστον ένα αντιδραστήριο λάτεξ της συσκευασίας. Σε αυτήν την περίπτωση, συνίσταται η επανάληψη της εξέτασης με άλλο δείγμα και η αναμονή των αποτελεσμάτων της καλλιέργειας. (Σπανίως, μία λοίμωξη ενδέχεται να οφείλεται σε δύο διαφορετικά είδη βακτηρίων). 10- ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΣΕ ΑΓΑΡ (Αποικίες από πρόσφατη και καθαρή καλλιέργεια) Το Latex Y/W135 δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αυτήν την ομαδοποίηση βακτηριακών στελεχών. Για τον καθορισμό αυτών των ομάδων, συνίσταται η χρήση συμβατικών αντιορών (Συσκευασία Y,W135, 29E : Αναφ. # 58704, 3 x 1mL) Για λόγους εικαζόμενου προσανατολισμού πριν την εξέταση: Ελέγξτε τη μορφολογία και το αποτέλεσμα χρώσης. Για αρνητικά κατά Gram βακτηρίδια, ελέγξτε για οξυδάση (Θετικό για N. meningitidis, αρνητικό για E.coli K1). Για θετικούς κατά Gram κόκκους, πραγματοποιήστε εξέταση καταλάσης. (Μην ελέγξετε την καταλάση για θετικά στελέχη). Τα μη περιβλημένα στελέχη S.pneumonia και Haemophilus influenzae δεν μπορούν να προσδιοριστούν μέσω αυτής της τεχνικής.
α) Ομαδοποίηση : N. meningitides(μόνο A, B, C), H. influenzae, E. coli, S. pneumoniae Τοποθετήστε μία σταγόνα 30 µl στείρου διαλύματος φυσιολογικού ορού σε έναν κύκλο στην κάρτα μίας χρήσης. Δείγμα: - Για τα Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzea και Escherichia coli, το ισοδύναμο με αγκύλη 1 µl, το οποίο είναι το ανώτερο 2-3 αποικίες. - Για το Streptococcus pneumoniae, το ισοδύναμο με αγκύλη 5 µl, το οποίο είναι τουλάχιστον 10-12 αποικίες. Προσεκτικά γαλακτωματοποιήστε τις αποικίες-δείγματα ώστε να επιτύχετε ένα ομοιογενές εναιώρημα. Ήπια ανακινήστε το φιαλίδιο αντιδραστηρίων λάτεξ έχετε επιλέξει για ταυτοποίηση. Κρατώντας το φιαλίδιο σε όρθια θέση, τοποθετήστε μία σταγόνα αυτού του λάτεξ στην περιφέρεια της σταγόνας του βακτηριακού εναιωρήματος. Αναμείξτε το λάτεξ με το εναιώρημα με μία ράβδο. Περιστρέψτε την κάρτα (~120 rpm). Παρατηρήστε την εμφάνιση καθαρής συγκόλλησης σε λιγότερο από 2 λεπτά. Επιβεβαιώστε την ταυτοποίηση των ειδών, χρησιμοποιώντας μία συμβατική βιοχημική εξέταση. β) Ομαδοποίηση : Steptococcus B (ß-αιμολυτικές αποικίες) Προκαλέστε εναιώρηση 5 αποικιών σε 2 ml ζωμού Todd Hewitt. Επωάστε σε θερμοκρασία 37 C σε υδρόλουτρο για 2-3 ώρες. Πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 3.000 g. Τοποθετήστε μία σταγόνα (40-50 µl) υπερκείμενου σε έναν κύκλο στην κάρτα μίας χρήσης. Ήπια ανακινήστε το φιαλίδιο αντιδραστηρίων λάτεξ. Κρατώντας το φιαλίδιο σε όρθια θέση, τοποθετήστε μία σταγόνα αυτού του λάτεξ στην περιφέρεια της σταγόνας του υπερκείμενου. Αναμείξτε το λάτεξ με το δείγμα με μία ράβδο. Περιστρέψτε την κάρτα (~120 rpm). Παρατηρήστε την εμφάνιση καθαρής συγκόλλησης σε λιγότερο από 1 λεπτό. Επιβεβαιώστε την ταυτοποίηση των ειδών, χρησιμοποιώντας συμβατικές βιοχημικές εξετάσεις. Για άμεση αφαίρεση από απομονωμένες αποικίες, χρησιμοποιήστε τη συσκευασία PASTOREX TM STREP (Κωδικός 61721) 11- ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Τα αντιδραστήρια λάτεξ πρέπει να είναι εντελώς ομοιογενή μετά την ανακίνηση. Ο θετικός πολυδύναμος έλεγχος R10 χρησιμοποιείται για την επαλήθευση της ανοσοαντιδραστικότητας κάθε λάτεξ. Για να πραγματοποιήσετε αυτόν τον ποιοτικό έλεγχο της εξέτασης, τοποθετήστε μία σταγόνα (40 µl) του θετικού ελέγχου (R10) σε κάθε κύκλο της κάρτας μίας χρήσης. Ήπια ανακινήστε τα φιαλίδια αντιδραστηρίων από λάτεξ. Κρατώντας το φιαλίδιο σε όρθια θέση, τοποθετήστε μία σταγόνα από κάθε αντιδραστήριο λάτεξ στην κάρτα μίας χρήσης, ακολουθώντας την ενδεικνυόμενη κατανομή: τα R9, R6, R7, R1 και R2 στους λευκούς κύκλους και τα R8, R3, R4 και R5 στους μαύρους κύκλους. Αναμείξτε τα αντιδραστήρια λάτεξ με το θετικό έλεγχο με μία ράβδο. Αλλάζετε τη ράβδο για κάθε λάτεξ.
Περιστρέψτε την κάρτα στις ~120 rpm για 10 λεπτά. Κατά τη διάρκεια αυτών των 10 λεπτών, ελέγξτε για την εμφάνιση συγκόλλησης με γυμνό μάτι (συγκρίνετε τις αντιδράσεις του λάτεξ εξέτασης με εκείνες των αρνητικών ελέγχων λάτεξ). Η ένταση της συγκόλλησης και η συχνότητα εμφάνισης εξαρτώνται από την ισχύ δεσμού αντιγόνου-αντισώματος. Κατά συνέπεια, οι αντιδράσεις παρατηρούνται με κάθε λάτεξ ποικίλλουν. Οι αντιδράσεις του λάτεξ NmB/Coli K1 είναι πιο ικανοποιητικές από των υπολοίπων. Ένα διάλυμα φυσιολογικού ορού ή ενός διαλύτη (κωδικός 61717) ελέγχει την ασία μη συγκεκριμένης συγκόλλησης από κάθε λάτεξ. Για να πραγματοποιήσετε αυτόν τον ποιοτικό έλεγχο της εξέτασης, χρησιμοποιήστε φυσιολογικό ορό ή διαλύτη R11 (κωδικός 61717), σύμφωνα με το πρωτόκολλο για τον πολυδύναμο θετικό έλεγχο (βλ. προηγούμενη διαδικασία). Δεν πρέπει να χρησιμοποιείτε τα αντιδραστήρια λάτεξ όταν δεν πραγματοποιούν συγκόλληση με τον πολυδύναμο θετικό έλεγχο (R10) ή όταν δεν πραγματοποιούν μη ειδική συγκόλληση με φυσιολογικό ορό ή διαλύτη (κωδικός 61717) (αυτό ενδέχεται να οφείλεται σε εσφαλμένες συνθήκες αποθήκευσης της συσκευασίας ή σε μόλυνση του αντιδραστηρίου λάτεξ) 12- ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα αντιδραστήρια παρασκευάζονται σύμφωνα με τις διαδικασίες του συστήματος ελέγχου ποιότητας εφαρμόζουμε, από την παραλαβή των πρώτων υλών έως την τελική εμπορευματοποίηση του προϊόντος. Κάθε παρτίδα υποβάλλεται σε διαδικασίες ελέγχου ποιότητας και διατίθεται στην αγορά, μόνο εφόσον ικανοποιεί τα προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία σχετίζονται με την παραγωγή και τον έλεγχο κάθε παρτίδας τηρούνται εντός της εταιρίας Bio-Rad. 13- απόδοση εξέτασης ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Η ευαισθησία κάθε αντιδραστηρίου του κιτ καθορίστηκε με ανάλυση των εξής: κεκαθαρμένων αντιγόνων, αραιωμένων σε φυσιολογικό ορό κλινικών δειγμάτων εγκεφαλονωτιαίου υγρού βάσει συμβατικών τεχνικών ανάλυσης (καλλιέργεια, μικροσκοπική εξέταση) στελεχών απομονώθηκαν από καλλιέργεια σε άγαρ Mueller Hinton, άγαρ chocolate + PVS, άγαρ Columbia + άγαρ αίματος προβάτου. Αντιγόνο ή βακτήρια βρέθηκαν στο δείγµα Αραιωµένο αντιγόνο (NaCl, 9 ) Όριο συγκέντρωσης ανιχνεύθηκε δειγµάτων CFS θετικών δοκιµών λάτεξ δειγµάτων Στελέχη θετικών δοκιµών λάτεξ N. meningitidis A 2,5 ng/ml 12 12 22 22 N. meningitidis B E. coli K1 62,5 ng/ml ND 101 101 N. meningitidis C 2,5 ng/ml 3 3 16 16 N. meningitidis Y 5 ng/ml ND - - N. meningitidis W 2,5 μg/ml ND - - S. pneumoniae 95 ng/ml 24 22 15 15 Streptococcus B 20 ng/ml 1 1 15 15 H. influenzae τύ B 0,1 ng/ml 34 33 17 17
ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Η ειδικότητα κάθε αντιδραστηρίου καθορίστηκε με ανάλυση των εξής: αποστειρωμένου εγκεφαλονωτιαίου υγρού (α) ή μολυσμένου εγκεφαλονωτιαίου υγρού με βακτήρια ευθύνονται για μηνιγγίτιδα και διαφέρουν από εκείνα ανιχνεύθηκαν με την εξέταση λάτεξ (β) στελεχών ανήκουν στα γένη Neisseria, Branhamella, Moraxella, Acinetobacter, Kingella, Klebsiella, Streptococcus, Haemophilus υποβλήθηκαν σε εξέταση με ετερόλογο λάτεξ. Latex test Αποστειρωµένο CSF (α) δειγµάτων αρνητικών δοκιµών λάτεξ δειγµάτων Μολυσµένο CSF (β) αρνητικών δοκιµών λάτεξ δειγµάτων ΣΤΕΛΕΧΗ (γ) αρνητικών δοκιµών λάτεξ N. meningitidis A 52 52 50 50 122 122 N. meningitidis B E. coli K1 25 25 ND 41 40* S. pneumoniae 52 52 56 56 127 127 Streptococcus B 49 49 58 58 17 17 H. influenzae Τύ B N. meningitidis Y/W 135 61 61 32 32 31 31 δειγµάτων αναλύθηκα Τυχαία επιλεγµένο CSF δειγµάτων 40 40 - - *1 στέλεχος Klebsiella pneumoniae έδωσε μη ειδική αντίδραση. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ Οι αποδόσεις του PASTOREX TM MENINGITIS έχουν εξεταστεί σε καλλιέργειες αίματος. Τα αποτελέσματα της αξιολόγησης αυτής είναι: Ευαισθησία: 100 % (4/4 συμπεριλαμβανομένων 2 στελεχών S. pneumoniae και 2 στελεχών Streptococcus B). Ειδικότητα : 100 % (37/37). Για τα αντιδραστήρια R3, R4, R5, R6, R7 και R8. Ειδικότητα : 98,2% (54*/55). Για το αντιδραστήριο R1. *Από τα 19 στελέχη των αρνητικών σταφυλόκοκκων στην πηκτάση εξετάστηκαν, 1 στέλεχος έδωσε μη ειδική αντίδραση, ένα αποτέλεσμα δεν επιβεβαιώθηκε στο στέλεχος εξετάστηκε από υποκαλλιέργεια άγαρ μετά τη διαδικασία ομαδοποίησης. 14. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ Σε πολλές περιπτώσεις, η ανοσολογική τεχνική με latex καθιστά δυνατή την πιθανή διάγνωση των οργανισμών. Ωστόσο, η συγκέντρωση του αντιγόνου στο δείγμα ενδέχεται να είναι μικρότερη από το κατώτερο όριο ανίχνευσης του λάτεξ με αποτέλεσμα να εμφανιστεί αρνητικό αποτέλεσμα. Σε αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να επαναληφθεί αργότερα η εξέταση του δείγματος. Η τεχνική αυτή δεν μπορεί να αντικαταστήσει την καλλιέργεια βακτηρίων, η οποία από μόνη της επιτρέπει τον καθορισμό αποτελεσμάτων αντιμικροβιακής ευαισθησίας. Λαμβάνοντας υπόψη την ευρεία ποικιλία μέσων καλλιέργειας αίματος, δεν μπορεί να διασφαλιστεί η απόδοση για όλα τα μέσα. (Βλ. 7-Α).
Τα κλινικά και βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με την ανίχνευση αντιγόνων σε ορούς και ούρα με χρήση αντιδραστηρίων με λάτεξ είναι επί του παρόντος περιορισμένα. Έχουν αναφερθεί μερικά παραδείγματα μη σχετικών βακτηρίων έχουν παρόμοια αντιγόνα. Η πιθανότητα διασταυρούμενων αντιδράσεων θα πρέπει να λαμβάνεται πάντα υπόψη (1, 4, 5). Η τελική διάγνωση, όπως όλες οι εργαστηριακές διαγνώσεις, δεν μπορεί να βασίζεται στα αποτελέσματα μόνο μίας εξέτασης, αλλά σε μια επισκόπηση των κλινικών δεδομένων καθώς και των βιοχημικών, κυτταρολογικών και ανοσολογικών αποτελεσμάτων. Η ανίχνευση διαλυτών αντιγόνων σε καλλιέργεια αίματος καθώς και η ομαδοποίηση στελεχών απομονωμένων σε άγαρ θα πρέπει να ολοκληρώνεται με την ταυτοποίηση του είδους ενός στελέχους βακτηρίου 14- ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. BRADSHAW M.W., CHNEERSON R., PARKE J.C. Jr., ROBBINS J.B. Bacterial antigens cross-reactive with the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae, type b. Lancet, 1971, i (May 29), 1095-1097 2. DENIS F. et MOUNIER M. Le diagnostic rapide des méningites cérébrospinales: techniques, résultats, limites et perspectives. Méd. Mal. Infect.,1984, 14, 27-36 3. DENIS F., SAULNIER M. et CHIRON J.P. Diagnostic étiologique rapide des méningites purulentes par agglutination passive indirecte de particules de latex et par contre- immunoéléctrophorèse : expérience et perspectives. Bull. O.M.S., 1981, 59, 143-151 4. KASPER D.L., WINKELHAKE J.L., ZOLLINGER W.D., BRANDT B.L., and ARTENSTEIN M.S. Immunochemical similarity between polysaccharide antigens of Escherichia coli 07:K1 (L) : NM and group B Neisseria meningitidis. J. Immunol., 1973, 110, 262-268. 25 5. LEE P.C. and WETHERALL B.L. Cross-reaction between Streptococcus pneumoniae and group C streptococcal latex reagent. J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 152-153 6. LEINONEN M. and HERVA E. The latex agglutination test for the diagnosis of meningococcal and Haemophilus influenzae meningitis. Scand. J. Infect.,1977, 9,187-191 7. LUND E. and HENRICHSEN J. Laboratory diagnosis, serology and epidemiology of Streptococcus pneumoniae. In Methods in Microbiology, T. Bergan and J.R. Norris edit., 1978, 12, chap. XI, 241-262 (Academic press, London, New-York, San Francisco) 8. TESSIER F. Dépistage et identification des streptocoques du groupe B. Intérêt en périnatologie. Extrait de LABORAMA n 14, oct. 1982, Institut Pasteur Production edit. 9. NEWMAN R.B., STEVENS R.W. and GAAFAR H.A. Latex agglutination test for the diagnosis of Haemophilus influenzae meningitis. J. Lab. Clin. Med., 1970, 76, 107-113 10. ROBBINS J.B., Mc CRACKEN G.H. Jr., GOTSCHLICH G.C., ORSKOV F., ORSKOV I., HANSON L.A. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. New Engl. J. Med. 1974, 290, 1216-1220
11. P. GESLIN et coll., Centre National de Référence des Pneumocoques: Rapport d'activité 1997. 12. ASUNCIÓN FENOLL, ISABEL JADO, DOLORES VICIOSO, AMALIA PÉREZ, and JULIO CASAL. Evolution of Streptococcus pneumoniae Serotypes and Antibiotic Resistance in Spain : Update (1990 to 1996). J. Clin. Microbiol.,1998, 36, 3447-3454 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 06/2008 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881019