ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Β.

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Διπλωματική εργασία του μεταπτυχιακού φοιτητή ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Β. ΝΙΚΗΦΟΡΙΔΗ ΜΕ ΤΙΤΛΟ ΘΕΡΜΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΚΡΟΚΟΥ ΤΟΥ ΑΥΓΟΥ ΚΑΙ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΤΑΣΕΝΕΡΓΟΥ TWEEN 40 Τριμελής εξεταστική επιτροπή Β. ΚΙΟΣΕΟΓΛΟΥ (Αναπλ.καθ.) (Επιβλέπων) Γ. ΜΠΛΕΚΑΣ (Επικ.καθ.) Α. ΠΑΡΑΣΚΕΥΟΠΟΥΛΟΥ (Λεκτ.) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Αντικείμενο της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη του μηχανισμού της θερμικής αποσταθεροποίησης, γαλακτωμάτων που παρασκευάζονται με χρήση κρόκου αυγού, η διερεύνηση της δυνατότητας παρεμπόδισης της θερμικής αποσταθεροποίησής τους με τη βοήθεια του τασενεργού Tween 40 και η μελέτη του μηχανισμού δράσης του τασενεργού αυτού. Η εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείας του ΑΠΘ στα πλαίσια του προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κ. Β. Κιοσέογλου, τον οποίο και ευχαριστώ θερμά για την επιστημονική, αλλά και την ηθική συμπαράστασή του. Ευχαριστώ επίσης την κα Α. Παρασκευοπούλου για τις πολύτιμες υποδείξεις της και τον κ. Γ. Μπλέκα για τις διορθώσεις του κειμένου. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όσους εργάστηκαν στον ίδιο χώρο για τη βοήθεια και την άψογη συνεργασία τους, όπως επίσης και σε όσους βρέθηκαν εκεί κοντά και μου συμπαραστάθηκαν. i

Στον πατέρα μου, Βασίλη ii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ...1 Β. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...2 1. ΔΟΜΗ, ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΚΡΟΚΟΥ ΤΟΥ ΑΥΓΟΥ 2 2. ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ 5 2.1. Ο ρόλος των πρωτεϊνών στα γαλακτώματα 9 2.1.1 Προσρόφηση των πρωτεϊνών σε διεπιφάνειες ελαίου-νερού 9 2.1.2 Ο ρόλος των προσροφημένων πρωτεϊνών στη σταθεροποίηση του γαλακτώματος 12 2.1.3. Ανταγωνιστική προσρόφηση τασενεργών και πρωτεϊνών σε διεπιφάνειες 13 3. ΘΕΡΜΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ 17 Γ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...20 Δ.ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...21 1.ΥΛΙΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ. 21 2. ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΌΡΓΑΝΑ. 21 3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ. 23 3.1. Παρασκευή γαλακτώματος ελαίου σε νερό. 23 3.2. Μέτρηση του μεγέθους των σταγονιδίων του γαλακτώματος και εκτίμηση του μεγέθους της συγχώνευσης και της συσσωμάτωσης. 23 3.3. Πειράματα θερμικής αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων. 24 3.4. Πειράματα αποκορύφωσης. 24 3.5. Παρατήρηση των γαλακτωμάτων στο μικροσκόπιο. 25 3.6. Μέτρηση της επιφανειακής πίεσης διαλυμάτων του κρόκου. 25 3.7. Προσδιορισμός της προσροφημένης πρωτεΐνης στα γαλακτώματα. 26 3.8. Στατιστική ανάλυση των πειραματικών αποτελεσμάτων. 27 Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ...28 1.ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ ΘΕΡΜΑΝΣΗΣ ΣΤΗΝ ΑΠΟΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΘΗΚΕ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΚΡΟΚΟΥ ΑΥΓΟΥ. 28 iii

2.ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣ ΤΟΥ ΤΑΣΕΝΕΡΓΟΥ TWEEN 40 ΣΤΗ ΘΕΡΜΙΚΗ ΑΠΟΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ 33 3.ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΠΟΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΟΥ ΤΑΣΕΝΕΡΓΟΥ TWEEN 40. 40 ΣΤ. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...45 Ζ. ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ...46 Η. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...47 iv

Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μελετήθηκε ο μηχανισμός της θερμικής αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων που παρασκευάζονται με τη βοήθεια κρόκου αυγού. Επίσης, διερευνήθηκε η δυνατότητα παρεμπόδισης της θερμικής αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων αυτών με την προσθήκη του τασενεργού Tween 40. Για το σκοπό αυτό παρασκευάσθηκαν γαλακτώματα τα οποία θερμάνθηκαν προκειμένου να μελετηθεί η μεταβολή του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων και να παρατηρηθούν στο μικροσκόπιο. Διαπιστώθηκε ότι η θέρμανση του γαλακτώματος σε θερμοκρασίες υψηλότερες από 80-85 ο C προκάλεσε αποσταθεροποίηση του συστήματος, δηλαδή αύξηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων, που ήταν το αποτέλεσμα της ταυτόχρονης συσσωμάτωσης και συγχώνευσης των σταγονιδίων. Διαπιστώθηκε επίσης ότι σημαντική επίδραση στη θερμική αποσταθεροποίηση των γαλακτωμάτων είχαν οι μη προσροφημένες στην επιφάνεια των σταγονιδίων πρωτεΐνες που είχαν παραμείνει στη συνεχή φάση, Παρατηρήθηκε, επίσης, ότι η προσθήκη του τασενεργού είχε ως αποτέλεσμα την προστασία των γαλακτωμάτων κατά τη θερμική επεξεργασία αποτρέποντας τη συσσωμάτωση αλλά και τη συγχώνευση των σταγονιδίων τους. Τα αποτελέσματα αυτά βοήθησαν στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της θερμικής αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων που παρασκευάζονται με τη βοήθεια κρόκου αυγού και στην αποσαφήνιση του ρόλου τόσο των πρωτεϊνικών μορίων που προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων όσο και αυτών που παραμένουν στη συνεχή φάση του συστήματος. Επίσης, προέκυψαν χρήσιμα συμπεράσματα σχετικά με την ανταγωνιστική προσρόφηση των μορίων του τασενεργού και της πρωτεΐνης του κρόκου αυγού στη διεπιφάνεια των σταγονιδίων και τη σημασία της στην σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων κατά τη θέρμανση. 1

Β. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Δομή, σύσταση και λειτουργικές ιδιότητες του κρόκου του αυγού Το αυγό είναι μία από τις σημαντικότερες τροφές του ανθρώπου. Αποτελεί σπουδαία πηγή πρωτεϊνών υψηλής βιολογικής αξίας και περιέχει σημαντικό αριθμό άλλων θρεπτικών συστατικών που βοηθούν στην ανάπτυξη και διατήρηση του ανθρώπινου οργανισμού. Επιπλέον, οι λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνικών συστατικών του, όπως είναι η γαλακτωματοποιητική ικανότητα, η ικανότητα σχηματισμού πηκτής και η αφριστική τους δράση, καθιστούν το αυγό απαραίτητο για την παρασκευή πολλών εδώδιμων προϊόντων, όπως είναι τα εμβάμματα σαλάτας, τα κέικ, τα προϊόντα ζαχαροπλαστικής, οι κρέμες κ.α. Το αυγό περιβάλλεται από ένα πλούσιο σε ασβέστιο λεπτό κέλυφος, το οποίο φέρει πόρους. Στην εσωτερική πλευρά του κελύφους υπάρχουν δύο μεμβράνες, η εσωτερική και η εξωτερική, που διαχωρίζονται στο μεγάλο άκρο του αυγού και σχηματίζουν ένα κενό χώρο που περιέχει αέρα, με διάμετρο περίπου 5 mm στα φρέσκα αυγά. Το άσπρο του αυγού (56-61%) είναι ένα παχύρευστο υγρό που αποτελείται από τρία διακριτά κλάσματα με διαφορετικό ιξώδες. Είναι κατά βάση ένα πρωτεϊνικό διάλυμα (αλβουμίνη) που περιέχει ίχνη υδατανθράκων. Στο κεντρικό τμήμα του αυγού βρίσκεται ο κρόκος (27-32%), ο οποίος περιβάλλεται από ένα λεπτό στρώμα αλβουμίνης που σχηματίζει στα άκρα του αυγού δύο σπιράλ, τα οποία συμβάλουν στη σταθεροποίηση του κρόκου στο κέντρο του αυγού. Ο κρόκος διαχωρίζεται από το άσπρο με μία πρωτεϊνική μεμβράνη που ονομάζεται βιτελλινική και αποτελείται από αλβουμίνη (Belitz, 1999). Η περιεκτικότητα του κρόκου σε στερεά συστατικά τα οποία, κυρίως λιπίδια και πρωτεΐνες, ανέρχεται σε 50%. Το ποσοστό αυτό εξαρτάται από τον χρόνο αποθήκευσης, επειδή το νερό τείνει να μεταναστεύει από το άσπρο στον κρόκο. Οι πρωτεΐνες, που αποτελούν περίπου 16,6% της μάζας του κρόκου, απαντούν κυρίως με τη μορφή λιποπρωτεϊνών. Τα λιπίδια αποτελούν περίπου 32,6% της μάζας του κρόκου. Αυτά είναι σε ποσοστό 65,5% τριγλυκερίδια, 28,3% φωσφολιπίδια και 5,2% χοληστερόλη. Εκτός από της πρωτεΐνες και τα λιπίδια, ο κρόκος περιέχει περίπου1% υδατάνθρακες καθώς και διάφορα ανόργανα στοιχεία, όπως φωσφόρο, ασβέστιο και κάλιο (Powrie, 1973). 2

Ο κρόκος αποτελείται από εναλλασσόμενα ομόκεντρα στρώματα ανοικτού και σκούρου κίτρινου χρώματος, με αυτά που έχουν σκούρο χρώμα να υπερισχύουν. Μεταξύ των στρωμάτων υπάρχει μία εύθραυστη μεμβράνη. Η μελέτη της μικροδομής του κρόκου με τη βοήθεια του μικροσκοπίου έδειξε ότι πρόκειται για ένα πολύπλοκο σύστημα που περιέχει πολλά σφαιρίδια και ένα μεγάλο αριθμό σωματιδίων μικρότερου μεγέθους, τους κόκκους (granules), οι οποίοι αιωρούνται σε ένα διαυγές κίτρινο υγρό, το πλάσμα. Σύμφωνα με τους Fujii et al. (1973), ο κρόκος του αυγού έχει κυψελώδη δομή και αποτελείται από παρακείμενους πολυεδρικούς κόκκους (grains). Κατά την ήπια ανάδευση, η κυψελώδης δομή διασπάται με αποτέλεσμα να ελευθερώνονται το πλάσμα (συνεχής φάση) και οι κόκκοι, οι οποίοι είναι τμήμα της εν διασπορά φάσης (Woodward and Cotterill 1987α; β). Το πλάσμα, αποτελείται από ένα πολύ μεγάλο αριθμό μικρών σφαιρικών σωματιδίων διαμέτρου περίπου 25nm, τα οποία καλούνται χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνικά (LDL) μικκύλια, καθώς και από ένα αριθμό υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών, τις λιβετίνες (livetins) (Σχήμα 1). Κρόκος 100% Νερό 50% Στερεά 50% Υψηλής Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνες (HDL) ή κόκκοι (granules) 26% Πλάσμα 70% Χαμηλής Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνη (LDL) 12% Λιποβιτελλίνη 70% + Φωσβιτίνη 16% Χαμηλής Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνη (LDL) 85% Λιβετίνες 15% Σχήμα 1. Σύσταση του κρόκου του αυγού (Burley και Cook, 1961, Powrie, 1973, Belitz, 1999) 3

Οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες αποτελούν περισσότερο από 60% της μάζας των ολικών στερεών του κρόκου και περιέχουν περίπου 85% λιπίδια και 15% πρωτεΐνες. Tα λιπίδια αποτελούνται κατά 74% από ουδέτερα λιπίδια, στα οποία συμπεριλαμβάνεται η ελεύθερη χοληστερόλη (4%) και η εστεροποιημένη με λιπαρά οξέα χοληστερόλη (0,2%) και κατά 26% από φωσφολιπίδια. Tα LDL μικκύλια αποτελούνται από ένα πυρήνα ουδέτερων λιπιδίων ο οποίος περιβάλλεται από φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες. To πρωτεϊνικό κλάσμα του μορίου των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (apoldl, ή απολιποβιτελλενίνη), εμφανίζει μία ετερογενή δομή και αποτελείται από διαφορετικά πρωτεϊνικά συστατικά. Εξαιτίας της υψηλής τους συγκέντρωσης στον κρόκο, οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες παίζουν καθοριστικό ρόλο στις φυσικοχημικές του ιδιότητες. H ικανότητα του κρόκου να συμβάλει στην ελάττωση της διεπιφανειακής τάσης σε διεπιφάνειες ελαίου/νερού αποδίδεται τόσο στην παρουσία των LDL όσο και ορισμένων άλλων συστατικών του κρόκου, όπως είναι τα φωσφολιπίδια, οι λιβετίνες και η χοληστερόλη. Ακόμη, οι λιποπρωτεΐνες συμμετέχουν σε μεγάλο βαθμό στο σχηματισμό γαλακτωμάτων με μικρό μέγεθος σταγονιδίων και υψηλή σταθερότητα, εξαιτίας της ικανότητας τους να προσροφώνται ταχύτατα στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου και να παρεμποδίζουν τη συγχώνευση τους (Mizutani and Nakamura, 1985). Οι HDL (κόκκοι) αντιπροσωπεύουν 13% της μάζας των στερεών του κρόκου του αυγού και αποτελούνται από λιποβιτελλίνη κατά 70%, από φωσβιτίνη (φωσφοπρωτεΐνη ελεύθερη λιπιδίων) κατά 16% και από LDL κατά 12% (Burley και Cook, 1961). Τα συστατικά του κρόκου μπορούν να προκαλέσουν μία σημαντική μείωση της διεπιφανειακής τάσης όταν προσροφώνται σε διεπιφάνειες ελαίου/νερού. H μεγάλη επιφανειοδραστικότητα του κρόκου συνδέεται κυρίως με LDL, τις λιβετίνες, τα φωσφολιπίδια και τη χοληστερόλη. H επιφανειοδραστικότητα επηρεάζεται από τη συγκέντρωση του κρόκου, την τιμή pη, την περιεκτικότητα σε χλωριούχο νάτριο, τη θερμοκρασία και την παρουσία διαλυτών (Kiosseoglou, 2004). H επίδραση των παραγόντων αυτών συνδέεται κυρίως με τη διάσπαση των σωματιδίων του κρόκου κατά την προσρόφηση τους στη διεπιφάνεια, καθώς και με το 'ξεδίπλωμα' και την αναδιάταξη των συστατικών που απελευθερώνονται (λιποπρωτεΐνες, χοληστερόλη και φωσφολιπίδια). Η διάσπαση των μικκυλίων των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών, όταν αυτά έλθουν σε επαφή με τις διεπιφάνειες ελαίου/νερού, 4

οφείλεται πιθανότατα στις ασθενείς δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ των πρωτεϊνών και συγκρατούν τα συστατικά των μικκυλίων. Οι απολιποπρωτεΐνες έχουν γενικά πολύ μεγάλη διεισδυτική ικανότητα, η οποία αποδίδεται στην απουσία δισουλφιδικών δεσμών (γεφυρών), γεγονός που προσδίδει στα μόρια μία πιο ευέλικτη δομή σε σύγκριση με τις υδατοδιαλυτές σφαιροπρωτεΐνες, όπως οι λιβετίνες και η φωσβιτίνη. Κατά την προσρόφηση τους στη διεπιφάνεια, τα συστατικά του κρόκου τείνουν να σχηματίζουν ισχυρά ιξωδοελαστικά υμένια στη δομή των οποίων συμμετέχουν και τριγλυκερίδια αποτελούμενα κυρίως από κορεσμένα λιπαρά οξέα που προέρχονται από τη φάση του ελαίου. H ισχύς και η ελαστικότητα των υμενίων αυτών αποδίδεται στη δομή των απολιποπρωτεϊνικών μορίων τα οποία περιέχουν τόσο πολικές όσο και μη-πολικές ομάδες και μπορούν να αλληλεπιδρούν τόσο με μη πολικά όσο και με πολικά λιπίδια (Kiosseoglou and Sherman, 1983). H δημιουργία των υμενίων είναι υπεύθυνη για τη σταθερότητα των γαλακτωμάτων ελαίου/νερού. Μελετώντας τη συμβολή των επιμέρους συστατικών του κρόκου (λιποβιτελλίνες, χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες, λιβετίνες) στη σταθερότητα των γαλακτωμάτων, διαπιστώθηκε ότι κανένα από αυτά, είτε μόνο του, είτε σε διάφορους συνδυασμούς, δεν είναι τόσο αποτελεσματικό στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων ελαίου σε νερό, όσο όλα τα συστατικά του κρόκου μαζί. Οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες, εξαιτίας της ικανότητας τους να προσεγγίζουν πολύ γρήγορα την επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου κατά τη διάρκεια της γαλακτωματοποίησης, προστατεύουν τα σταγονίδια από τη μεταξύ τους συγχώνευση. Παρόμοια γαλακτωματοποιητική δράση παρουσιάζουν, σύμφωνα με τους Anton et al. (1997) και οι κόκκοι. Οι κόκκοι, όταν διασπώνται, εμφανίζουν μεγάλη ικανότητα σταθεροποίησης των γαλακτωμάτων, η οποία αποδίδεται στη δυνατότητα των απολιποπρωτεϊνών τους να σχηματίζουν πολλαπλές στιβάδες γύρω από τα σταγονίδια του ελαίου με μεγαλύτερο πάχος σε σχέση με τις LDL του πλάσματος. 5

2. Σχηματισμός και σταθερότητα γαλακτωμάτων Ως γαλάκτωμα ορίζεται η κολλοειδής διασπορά ελαίου σε νερό (ή αντίστροφα), με τη μορφή σταγονιδίων μεγέθους 0,1-100 μm. Ανάλογα με τη φύση της συνεχούς φάσης, τα γαλακτώματα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: α) γαλάκτωμα ελαίου σε νερό (o/w), όπως τα εμβάμματα σαλάτας (salad dressings), η μαγιονέζα και οι κρέμες, και β) γαλάκτωμα νερού σε έλαιο (w/o), όπως η μαργαρίνη και το βούτυρο. Τα γαλακτώματα είναι ετερογενή θερμοδυναμικώς ασταθή φυσικοχημικά συστήματα,, διότι ενεργειακά δεν ευνοείται η ανάμιξη του ελαίου με το νερό. Με την προσθήκη των γαλακτωματοποιητών στο μίγμα, οι οποίοι προσροφώνται στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού, ελαττώνεται η ελεύθερη ενέργεια του συστήματος και επιτυγχάνεται κινητική σταθερότητα για χρονικό διάστημα ημερών, εβδομάδων ή μηνών (μετασταθής κατάσταση). Εκτός από τον σχηματισμό των απλών γαλακτωμάτων, είναι δυνατός και ο σχηματισμός γαλακτωμάτων πολλαπλής φάσης του είδους o/w/o ή w/o/w (Dickinson & McClements, 1995), όπου συνυπάρχουν οι δύο κατηγορίες γαλακτώματος ελαίου σε νερό (o/w) και νερού σε έλαιο (w/o). Ανάλογα με τη μορφολογία των σταγονιδίων, τα πολλαπλά γαλακτώματα κατηγοριοποιούνται σε τρεις τύπους, που αναφέρονται ως Α, Β και C (Florence και Whitehill, 1981) (Σχήμα 2). A B C Σχήμα 2. Οι τρεις κατηγορίες των πολλαπλών γαλακτωμάτων (Florence και Whitehill, 1981) Ο τύπος του γαλακτώματος που σχηματίζεται εξαρτάται από τον τρόπο παρασκευής, αλλά και από το γαλακτωματοποιητή που χρησιμοποιείται. Πολλαπλά γαλακτώματα είναι δυνατό να εμφανιστούν όταν προκύπτει αναστροφή των φάσεων, η οποία λαμβάνει χώρα όταν αλλάζουν οι συνθήκες του γαλακτώματος, όπως για παράδειγμα όταν αυξάνεται η θερμοκρασία. Αναστροφή των φάσεων σημαίνει ότι η συνεχής φάση μετατρέπεται στην εν διασπορά φάση και αντίστροφα. Η αύξηση της 6

θερμοκρασίας μεταβάλει τη διαλυτότητα του γαλακτωματοποιητή στην υδατική φάση ή στο έλαιο. Σε ένα γαλάκτωμα ελαίου σε νερό που σταθεροποιείται με ένα μη ιοντικό τασενεργό το οποίο είναι διαλυμένο στην υδατική συνεχή φάση, η αύξηση της θερμοκρασίας είναι δυνατό να προκαλέσει αύξηση της διαλυτότητας του τασενεργού στη φάση του ελαίου, με αποτέλεσμα τη μετακίνηση ορισμένων μορίων του τασενεργού στη φάση που ήταν αρχικά σε διασπορά. Η διαδικασία αυτή, αν και δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, έχει ως αποτέλεσμα την αναστροφή των φάσεων, και σε ορισμένες περιπτώσεις τον σχηματισμό πολλαπλού γαλακτώματος. Η αναστροφή των φάσεων εξαρτάται από παράγοντες, όπως είναι ο τύπος του ελαίου, ο τύπος του τασενεργού, η θερμοκρασία του συστήματος, η αναλογία νερού και ελαίου, η παρουσία προσθέτων υλών στην υδατική φάση και στο έλαιο, οι συνθήκες ανάμιξης και η σειρά με την οποία προστίθενται τα διάφορα συστατικά κατά την παρασκευή του γαλακτώματος (Brooks et al., 1998). Τα γαλακτώματα είναι ασταθή από θερμοδυναμική άποψη, συστήματα, εξαιτίας της μεγάλης ποσότητας ελεύθερης ενέργειας στη διεπιφάνεια των δύο υγρών (Halling, 1981). Υπάρχουν τρεις μηχανισμοί αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι η αποκορύφωση (creaming), η συσσωμάτωση (aggregation) και η συγχώνευση (coalescence). Σχήμα 3. Σχηματική αναπαράσταση των τριών κύριων φαινομένων αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων, της αποκορύφωσης, της συσσωμάτωσης και της συγχώνευσης. Αποκορύφωση είναι η ανοδική κίνηση των σταγονιδίων του ελαίου, λόγω διαφοράς πυκνότητας με την υδατική φάση, χωρίς να παρατηρείται κάποια μεταβολή 7

στο μέγεθος τους. Στα γαλακτώματα ελαίου σε νερό παρατηρείται αρχικά μία μεταβολή της συγκέντρωσης του ελαίου με το ύψος, γεγονός που δεν γίνεται αντιληπτό οπτικά, ενώ αργότερα διακρίνονται δύο ξεχωριστές στοιβάδες, μία εμπλουτισμένη σε σταγονίδια ελαίου και μία υδατική στοιβάδα. To φαινόμενο αυτό είναι αντιστρεπτό με τη έννοια ότι με απλή ανακίνηση επιτυγχάνεται μία ομοιόμορφη ανακατανομή των σταγονιδίων. Σημαντικό ρόλο στην ταχύτητα αποκορύφωσης ενός γαλακτώματος παίζει ο βαθμός συσσωμάτωσης και η πολυδιασπορά του μεγέθους των σταγονιδίων του ελαίου. Τα συσσωματώματα που είναι μη ομοιογενείς σφαίρες, συμπεριφέρονται ως σταγονίδια μεγάλης διαμέτρου και κινούνται ταχύτερα από τα μεμονωμένα σταγονίδια με μικρότερο μέγεθος. Επίσης, τα μεγάλου μεγέθους σταγονίδια ελαίου που κινούνται με μεγαλύτερη ταχύτητα συναντούν τα μικρότερα και τα συμπαρασύρουν προς τα πάνω, επιταχύνοντας το φαινόμενο της αποκορύφωσης (Melik & Fogler, 1988; Dukhin & Sjoblom, 1996). Η συσσωμάτωση είναι επίσης μία αντιστρεπτή διαδικασία κατά την οποία τα σταγονίδια πλησιάζουν και δημιουργούν ένα τρισδιάστατο πλέγμα. Μέσα στα τρισδιάστατα αυτά πλέγματα τα σταγονίδια συνδέονται χαλαρά με τη βοήθεια ελκτικών δυνάμεων. Τα σταγονίδια σε ένα υγρό σύστημα ακολουθούν την κίνηση Brown με αποτέλεσμα να συγκρούονται συχνά κάτι που είναι πιθανό να οδηγήσει στη συσσωμάτωσή τους. Σε αυτή την αλληλεπίδραση των σταγονιδίων, κυριότερο ρόλο παίζουν οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις, οι δυνάμεις van der Waals και οι πολυμερικές δυνάμεις (steric forces) που οφείλονται στα προσροφημένα μόρια των γαλακτωματοποιητών. Επίσης σε ορισμένες περιπτώσεις σημαντικό ρόλο παίζουν και οι δυνάμεις επιδιαλύτωσης, οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και οι δυνάμεις που οφείλονται στην παρουσία στη συνεχή φάση βιοπολυμερών που δεν προσροφώνται στη διεπιφάνεια (depletion forces). Η συγχώνευση, περιλαμβάνει τη διάσπαση του διεπιφανειακού υμενίου και τη συνένωση στη συνέχεια δύο ή περισσοτέρων σταγονιδίων, προς σταγονίδια μεγαλύτερου μεγέθους. Είναι μία μη αντιστρεπτή διαδικασία η οποία καταλήγει στην ολική κατάρρευση του γαλακτώματος και στο διαχωρισμό των δύο φάσεων, με αποτέλεσμα να παρατηρείται μακροσκοπικά η δημιουργία ελαιώδους στοιβάδας στο πάνω μέρος του γαλακτώματος. To φαινόμενο της συγχώνευσης εμφανίζεται κυρίως σε γαλακτώματα με σταγονίδια ελαίου που έχουν παραμείνει συσσωματωμένα για μεγάλο χρονικό διάστημα. Αρχικά, ανάμεσα στα σταγονίδια 8

υπάρχει μία στοιβάδα συνεχούς φάσης και γαλακτωματοποιητών (lamella), η οποία λεπταίνει μέχρι ένα κρίσιμο σημείο και έπειτα διαρρηγνύεται με αποτέλεσμα την συγχώνευση των δύο σταγονιδίων (van den Tempel, 1957). 2.1. Ο ρόλος των πρωτεϊνών στα γαλακτώματα Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα συστατικά για κάθε ζωντανό οργανισμό και χρησιμεύουν στο σχηματισμό και την αναγέννηση των ιστών ή δρουν ως βιοκαταλύτες (ένζυμα, ορμόνες). Εκτός από την πολύ μεγάλη διατροφική τους αξία χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα γιατί προσδίδουν σε αυτά επιθυμητές φυσικοχημικές ιδιότητες (Μπόσκου, 1997). Το σύνολο αυτό των φυσικοχημικών ιδιοτήτων που μπορεί να παρουσιάζει ένα σύστημα, εξαιτίας της παρουσίας των πρωτεϊνών, αναφέρεται ως λειτουργικότητα των πρωτεϊνών. Σε αυτές ανήκουν η διαλυτότητα, το ιξώδες, η ικανότητα συγκράτησης νερού και σχηματισμού πηκτών και η ικανότητα των πρωτεϊνικών μορίων να προσροφώνται σε διεπιφάνειες, σχηματίζοντας ένα ιξωδοελαστικό υμένιο, γεγονός που οδηγεί στη δημιουργία σταθερών γαλακτωμάτων. Στη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών οφείλεται η χαρακτηριστική υφή και οι ρεολογικές ιδιότητες που παρουσιάζει ένας μεγάλος αριθμός προϊόντων όπως η μαγιονέζα, τα εμβάμματα σαλάτας (salad dressings), οι κρέμες κ.α. 2.1.1 Προσρόφηση των πρωτεϊνών σε διεπιφάνειες ελαίου-νερού Κατά τη δημιουργία ενός γαλακτώματος, οι πρωτεΐνες, οι οποίες όπως έχει ήδη αναφερθεί λειτουργούν ως γαλακτωματοποιητές, προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου με τα υδρόφοβα τμήματα τους. Καθώς τα πρωτεϊνικά μόρια προσροφώνται, ξεδιπλώνονται και αναδιατάσσονται σε μία κατάσταση ελάχιστης ελεύθερης ενέργειας με αποτέλεσμα την ελάττωση της διεπιφανειακής τάσης. Ως επιφανειακή τάση ορίζεται το έργο που απαιτείται για την αύξηση του εμβαδού της επιφάνειας ενός υγρού κατά μία μονάδα. Υπολογίζεται από την εξίσωση: 9

γ = G A p, T, n όπου G η ελεύθερη ενέργεια Gibbs του συστήματος, A το εμβαδόν της επιφάνειας, p η πίεση, T η θερμοκρασία και n ο συνολικός αριθμός των μορίων της πρωτεΐνης στο σύστημα. Όσο μικρότερη είναι η διεπιφανειακή τάση, τόσο μικρότερη ενέργεια απαιτείται για την αύξηση της επιφάνειας, κάτι που συμβαίνει κατά τον σχηματισμό ενός γαλακτώματος. Από την εξίσωση προσρόφησης του Gibbs προκύπτει η επιφανειακή συγκέντρωση Γ s των τασενεργών συστατικών που προσροφώνται στη επιφάνεια των σταγονιδίων ελαίου: Γ s dγ = dμ όπου μ το χημικό δυναμικό του συστατικού που προσροφάται στη διεπιφάνεια (Dickinson, 1992). H σταθεροποίηση του γαλακτώματος συνδέεται με τη δημιουργία μίας στοιβάδας προσροφημένων μορίων πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού. Ένα τυπικό υμένιο σε ένα γαλάκτωμα, δεν περιέχει συνήθως μία μόνο συγκεκριμένη πρωτεΐνη, αλλά ένα μίγμα πρωτεϊνικών μορίων. Επίσης είναι δυνατόν να περιέχει χαμηλού μοριακού βάρους τασενεργά, όπως πολικά λιπίδια, τα οποία προέρχονται από το έλαιο και πιθανόν άλλους γαλακτωματοποιητές. Σε μία ακάλυπτη επιφάνεια ελαίου, οι πρωτεΐνες προσροφώνται αμέσως μέσω των υδρόφοβων τμημάτων τους με σκοπό την ελαχιστοποίηση της επαφής των τμημάτων αυτών με τα πολικά μόρια του νερού (Damodaran, 1989). To φαινόμενο συνοδεύεται από μεγάλη αύξηση της εντροπίας ΔS προς., ενώ η μεταβολή της ενθαλπίας ΔΗ προσ. είναι μικρότερης σημασίας. H αύξηση της εντροπίας δικαιολογείται αφενός από την εκδίωξη των διευθετημένων πολικών μορίων του διαλύτη από την υδρόφοβη διεπιφάνεια και, αφετέρου, από το "ξεδίπλωμα" του μορίου της πρωτεΐνης κατά την προσρόφηση, προκειμένου να εμφανισθούν και να προσροφηθούν περισσότερα υδρόφοβα τμήματα που απαντούν στο εσωτερικό της (Dickinson and Matsamura, 1991). To φαινόμενο συμβαίνει αυθόρμητα, σύμφωνα με την εξίσωση της ελεύθερης ενέργειας προσρόφησης Gibbs, ΔG προσ. = ΔΗ προσ. -ΤΔS προσ αφού ο παράγοντας TΔS υπερισχύει του παράγοντα ΔΗ. Στη σταθεροποίηση της δομής των πρωτεϊνών που είναι προσροφημένες στη διεπιφάνεια και στη 10

δημιουργία ενός ιξωδοελαστικού υμενίου, σημαντικό ρόλο παίζουν κυρίως οι δυνάμεις van der Waals, οι δεσμοί υδρογόνου, οι ηλεκτροστατικές δυνάμεις και οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Tα αναδιπλωμένα μόρια έχουν διαμόρφωση πολύ διαφορετική από αυτή που είχαν στο διάλυμα και πολύ δύσκολα εκτοπίζονται από τη διεπιφάνεια ελαίου-νερού, διότι είναι στατιστικά απίθανο όλα τα τμήματα μίας πρωτεΐνης να εκροφηθούν ταυτόχρονα ώστε να εκτοπιστεί όλο το μόριο. Για το λόγο αυτό θεωρείται ότι οι πρωτεΐνες προσροφώνται με μη αντιστρεπτό τρόπο και είναι δυνατό να εκροφηθούν μόνο αν αλλάξουν οι συνθήκες pη και ιονικής ισχύος, ή αν προστεθούν χαμηλού μοριακού βάρους γαλακτωματοποιητές, οι οποίοι μηδενίζουν την ελεύθερη ενέργεια προσρόφησης της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού. Οι πρωτεΐνες καλύπτουν μία διεπιφάνεια στο μέγιστο δυνατό βαθμό, λόγω του μεγάλου μεγέθους και της ακανόνιστης δομής τους ακόμη και όταν η συγκέντρωση τους στο διάλυμα είναι σχετικά χαμηλή. Σύμφωνα με την επικρατέστερη θεωρία για τη δομή των πρωτεϊνών στη διεπιφάνεια (Dickinson, 1992), μόνο ένα μέρος των τμημάτων του πρωτεϊνικού μορίου βρίσκεται σε άμεση επαφή με τη διεπιφάνεια. Τα υπόλοιπα τμήματα του μορίου εκτείνονται προς τη φάση του διαλύματος δημιουργώντας μία περιοχή κοντά στη διεπιφάνεια με πολλαπλάσιο πάχος σε σχέση με το πάχος της πρωτεϊνικής αλυσίδας. Σχήμα 4. Δομή προσροφημένων μορίων πρωτεϊνών στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού (Dickinson, 1992). Σύμφωνα με το παραπάνω μοντέλο (Σχήμα 4) υπάρχουν τρεις τρόποι διάταξης των τμημάτων μίας πρωτεΐνης: α) οι "συρμοί" (trains) που αποτελούν τα τμήματα που έρχονται σε άμεση επαφή με τη διεπιφάνεια, β) οι "βρόγχοι" (loops) και γ) οι "ουρές" ή ελεύθερα άκρα (tails) που εκτείνονται προς την υδατική φάση. Παράδειγμα που επιβεβαιώνει την παραπάνω θεωρία αποτελεί η β-καζεΐνη, ένα 11

σχετικά ευέλικτο πρωτεϊνικό μόριο. Όταν η διεπιφανειακή πίεση είναι χαμηλή το 1/3 περίπου των μορίων της καζεΐνης απαντούν στην επιφάνεια με τη μορφή συρμών ενώ τα υπόλοιπα τμήματα ως βρόγχοι και "ουρές" που εκτείνονται είτε προς την υδατική είτε προς τη λιπαρή φάση, ανάλογα με το πόσο υδρόφοβο ή υδρόφιλο είναι το τμήμα. Πάντως, είναι αδύνατο να υπάρχει βρόγχος που να βρίσκεται στην υδατική φάση χωρίς να περιέχει και κάποια υδρόφοβα τμήματα, όπως φυσικά και το αντίθετο (Dickinson, 1992). Παρόμοια συμπεριφορά στη διεπιφάνεια ελαίου/νερού παρουσιάζουν και οι λιποπρωτεΐνες του κρόκου του αυγού και κυρίως αυτές που προέρχονται από τα LDL μικκύλια. Τα μόρια των πρωτεϊνών αυτών είναι πολύ περισσότερο ευέλικτα σε σχέση με τα μόρια των υπόλοιπων πρωτεϊνών του κρόκου του αυγού, με αποτέλεσμα να παίζουν το σημαντικότερο ρόλο κατά την προσρόφηση και κατά τον σχηματισμό του επιφανειακού υμενίου (Martinet et al. 2002). To παραπάνω μοντέλο δεν ισχύει στην περίπτωση σφαιροπρωτεϊνών όπως η λυσοζύμη ή η β-γαλακτοσφαιρίνη, όπου η δευτεροταγής και ένα ποσοστό της τριτοταγούς διαμόρφωσης παραμένουν αμετάβλητες κατά την προσρόφηση. Είναι πιο ρεαλιστικό να θεωρηθεί ότι οι πρωτεΐνες σε αυτή την περίπτωση απαντούν στη διεπιφάνεια ως σφαιρικά σωματίδια που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, οπότε σχηματίζεται ένα υμένιο με συγκεκριμένο πάχος. Μετά την προσρόφηση, η δομή της λυσοζύμης αλλάζει ελάχιστα. Αντίθετα η β- γαλακτοσφαιρίνη διαθέτει ελεύθερες σουλφυδρυλικές ομάδες, με συνέπεια τα πρωτεϊνικά μόρια να πολυμερίζονται μετά την προσρόφηση. Για να επιτευχθεί η τελική μορφή της δομής του μορίου απαιτείται αρκετός χρόνος και σε αυτή την περίπτωση η διεπιφάνεια είναι δυνατό να περιέχει μόρια πρωτεΐνης που απαντούν σε διαφορετικές φάσεις αναδίπλωσης. 2.1.2. Ο ρόλος των προσροφημένων πρωτεϊνών στη σταθεροποίηση του γαλακτώματος Η προσρόφηση των πρωτεϊνών στην επιφάνεια των σταγονιδίων συνδέεται με τη δυνατότητά τους να παρεμποδίζουν τη συσσωμάτωση και τη συγχώνευση των σταγονιδίων. Η δράση τους αποδίδεται κυρίως στην ενίσχυση των ηλεκτροστατικών και πολυμερικών απώσεων που υφίστανται ανάμεσα στα σταγονίδια (Dickinson and Stainsby, 1982), αν και είναι πιθανό η σταθεροποίηση αυτή να οφείλεται και σε 12

δυνάμεις ενυδάτωσης (hydration forces). Με εξαίρεση ορισμένες πρωτεΐνες με πολύ υψηλό φορτίο, όπως για παράδειγμα η φωσβιτίνη, ο κύριος παράγοντας σταθεροποίησης ενός γαλακτώματος ως προς τη συγχώνευση, είναι η πολυμερική σταθεροποίηση (steric stabilization). Τα μόρια των πρωτεϊνών που σχηματίζουν μία ιξωδοελαστική στοιβάδα με δομή πηκτής στη διεπιφάνεια, η οποία αποδίδεται σε εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσροφημένων πρωτεϊνικών μορίων, συμβάλουν αποτελεσματικότερα στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων, σε σχέση με τις πρωτεΐνες που έχουν περισσότερο χαλαρές και ευκίνητες δομές. Η σταθερότερη αυτή ιξωδοελαστική στοιβάδα, εμποδίζει τη διάρρηξη της επιφάνειας των σταγονιδίων και κατά επέκταση τη συγχώνευση. Ένας γενικός κανόνας που ισχύει είναι ότι η συγχώνευση των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων μπορεί να αποφευχθεί όταν υπάρχουν περισσότερες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια (Walstra, 1996). 2.1.3. Ανταγωνιστική προσρόφηση τασενεργών και πρωτεϊνών σε διεπιφάνειες Στα συστήματα τροφίμων όπως τα γαλακτώματα, μία πρωτεΐνη συχνά ανταγωνίζεται για την κατάληψη χώρου στη διεπιφάνεια με άλλα επιφανειοδραστικά συστατικά του συστήματος, όπως άλλες πρωτεΐνες ή χαμηλού μοριακού βάρους γαλακτωματοποιητές. Σε γενικές γραμμές, η προσρόφηση μίας πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια ελαίου/νερού ευνοείται, από θερμοδυναμική άποψη, όσο μεγαλύτερη είναι η ικανότητά της να ελαττώνει την διεπιφανειακή τάση. Για το λόγο αυτό η προσρόφηση πρωτεϊνών με ευέλικτη δομή, όπως η β- καζεΐνη, ευνοείται έναντι αυτής των σφαιροπρωτεϊνών. Τα μόρια των σφαιροπρωτεϊνών όμως, όταν προσροφώνται πρώτα στη διεπιφάνεια, εκτοπίζονται πολύ δύσκολα από άλλες πρωτεΐνες, ιδιαίτερα όταν έχει παρέλθει αρκετό διάστημα ώστε να ολοκληρωθεί πλήρως η προσρόφησή τους. Με την πάροδο του χρόνου είναι δυνατή η δημιουργία δικτυωτής δομής ανάμεσα στα προσροφημένα μόρια των πρωτεϊνών στη διεπιφάνεια, στην οποία μπορεί να συμβάλλουν και δισουλφιδικοί δεσμοί, όπως ακριβώς συμβαίνει κατά τη δημιουργία μίας πηκτής (McClements et al., 1993). Πρωτεΐνες με ευέλικτη δομή, όπως η β-καζεΐνη, μπορούν να διεισδύουν στη διεπιφάνεια εκτοπίζοντας μερικώς τις προσροφημένες σφαιροπρωτεΐνες. Οι εκτοπισμένες σφαιροπρωτεΐνες είναι δυνατόν, 13

όμως, να παραμείνουν στην επιφάνεια του σταγονιδίου του ελαίου σε μία εξωτερική στοιβάδα προσρόφησης. Στα τρόφιμα, πέρα από τις πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται και μικρού μοριακού βάρους τασενεργά, τα οποία αναφέρονται συχνά στη βιβλιογραφία ως γαλακτωματοποιητές. Οι γαλακτωματοποιητές διακρίνονται, σε αυτούς που διευκολύνουν το σχηματισμό του γαλακτώματος και συμβάλουν στη σταθερότητά του, σε αυτούς που τροποποιούν τη δομή και τις ρεολογικές ιδιότητες των τροφίμων μέσω αλληλεπιδράσεων με πολυσακχαρίτες ή με πρωτεΐνες, και σε αυτούς που αλλάζουν τη μορφολογία των λιπιδικών κρυστάλλων μετά από αλληλεπίδραση με τα τριγλυκερίδια. Τα μόρια των τασενεργών διευθετούνται σε μία διεπιφάνεια, το ένα κοντά στο άλλο παρέχοντας αποτελεσματική κάλυψη της διεπιφάνειας. Αυτά είναι δυνατό, όταν απαντούν σε υψηλές συγκεντρώσεις, να εκτοπίζουν τις πρωτεΐνες (Walstra, 1996). Στο Σχήμα 5, φαίνεται ο τρόπος με τον οποίο προσροφώνται σε μία διεπιφάνεια ελαίου-νερού τα χαμηλού μοριακού βάρους τασενεργά, τα πολυμερή και οι σφαιροπρωτεΐνες. Σχήμα 5. Τύποι προσρόφησης διαφόρων τύπων επιφανειακώς ενεργών μορίων σε μία διεπιφάνεια ελαίου-νερού ή αέρα-νερού. Κατά σειρά από τα αριστερά προς τα δεξιά: Tween 40, πολυμερές μικρού μοριακού βάρους και σφαιροπρωτεΐνη. (Walstra, 1996) Οι γαλακτωματοποιητές αποτελούνται από μία λιπόφιλη και μία υδρόφιλη ομάδα. Το υδρόφοβο (λιπόφιλο) τμήμα αποτελείται συνήθως από μία ή δύο αλειφατικές αλυσίδες που μπορεί να είναι κορεσμένες ή όχι, ενώ στο υδρόφιλο τμήμα υπάρχει μεγαλύτερη ποικιλία. Ανάλογα με τη φύση της υδρόφιλης ομάδας, τα μικρού μοριακού βάρους τασενεργά διακρίνονται σε μη ιοντικά (π.χ Tween 40), σε ανιονικά και σε κατιονικά, (Dickinson et al., 1995). Ένας δεύτερος διαχωρισμός γίνεται μεταξύ φυσικών (μονοακυλογλυκερόλες, φωσφολιπίδια) και συνθετικών 14

τασενεργών. Τα τασενεργά Tween 40 (πολυ-οξυ-αιθυλιωμένοι εστέρες της σορβιτάνης) είναι εστέρες της σορβιτάνης που φέρουν τρεις ή τέσσερις πολυοξυαιθυλενικές αλυσίδες οι οποίες αποτελούνται από πέντε περίπου μονομερή. Το Tween 40, για παράδειγμα, είναι ο μονοπαλμιτικός πολυ-οξυ-αιθυλιωμένος εστέρας της σορβιτάνης. Όταν η συγκέντρωση του τασενεργού σε ένα γαλάκτωμα ξεπεράσει μία ορισμένη κρίσιμη συγκέντρωση, εκτός των μονομερών που υπάρχουν, σχηματίζονται και μικκύλια. Η συγκέντρωση αυτή είναι γνωστή ως κρίσιμη συγκέντρωση σχηματισμού μικυλλίου, CMC (critical micelle concentration). Σε συγκέντρωση μικρότερη της CMC, τα τασενεργά απαντούν στο γαλάκτωμα αποκλειστικά ως μονομερή. Όση ποσότητα τασενεργού και να προστεθεί πέραν της CMC η συγκέντρωση των μονομερών παραμένει ίδια, ενώ η δραστικότητά τους μεταβάλεται ελάχιστα. Στο σημείο δηλαδή αυτό η τιμή της επιφανειακής τάσης είναι ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του τασενεργού. Η συγκέντρωση στην οποία σχηματίζονται τα μικκύλια εξαρτάται από το μήκος της αλυσίδας των τασενεργών. Τα τασενεργά μικρού μοριακού βάρους έχουν μεγάλη ικανότητα σχηματισμού δεσμών σε διεπιφάνειες υγρού/υγρού, όχι μόνο μεταξύ τους, αλλά και με άλλα διαλυμένα συστατικά, όπως ιόντα, πολυμερή ή μόρια άλλων τασενεργών. Την Επιστήμη των Τροφίμων, ενδιαφέρουν ιδιαίτερα οι αλληλεπιδράσεις των τασενεργών με τις πρωτεΐνες σε διεπιφάνειες. Τα χαρακτηριστικά που κάνουν μία πρωτεΐνη επιφανειακώς δραστική, δηλαδή η παρουσία στο μόριο υδρόφοβων και υδρόφιλων τμημάτων, είναι υπεύθυνα και για την εμφάνιση αλληλεπιδράσεων με μικρομοριακά συστατικά. Εκτός της ικανότητας που έχουν τα τασενεργά να σχηματίζουν δεσμούς με τις πρωτεΐνες, λόγω του μικρού μεγέθους τους και της επιφανειοδραστικότητάς τους, μπορούν να απομακρύνουν από τις διεπιφάνειες τα μόρια της πρωτεΐνης και να προσροφηθούν αυτά στη θέση τους, με αποτέλεσμα να προκύπτουν χαμηλότερες τιμές επιφανειακής τάσης Η ανταγωνιστική αυτή προσρόφηση εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση των αλληλεπιδράσεων του τασενεργού με τη πρωτεΐνη, τόσο στην υδατική φάση, όσο και στη διεπιφάνεια με το έλαιο (Dickinson et al., 1995). Σύμφωνα τους Feijter et al. (1987), σε σύστημα που περιείχε μίγμα SDS (δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο) και β-καζεΐνης, διαπιστώθηκε ότι η επιφανειακή τάση παρέμενε αμετάβλητη σε υψηλές συγκεντρώσεις του τασενεργού με τιμές παρόμοιες με αυτές, όταν στο σύστημα υπήρχε μόνο SDS. Αυτό αποτελεί ένδειξη ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις, το SDS εκτόπισε πλήρως τα μόρια της β-καζεΐνης από 15

την διεπιφάνεια. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις του τασενεργού το σύστημα ήταν περισσότερο πολύπλοκο εφόσον, σύμφωνα με τους ερευνητές, το διεπιφανειακό υμένιο περιείχε και μόρια της πρωτεΐνης σε αλληλεπίδραση με τα μόρια του SDS. Στο Σχήμα 6 δίνεται η γενική μορφή ενός διαγράμματος που αναπαριστά τη μεταβολή της διεπιφανειακής τάσης, σε σχέση με το λογάριθμο της συγκέντρωσης του τασενεργού, σε ένα μικτό σύστημα ιοντικού τασενεργού - πρωτεΐνης. Αρχικά, όταν η συγκέντρωση του τασενεργού είναι πολύ μικρή δεν παρατηρείται καμία μεταβολή στην επιφανειακή τάση, ενώ στη συνέχεια παρατηρείται ισχυρή αλληλεπίδραση του τασενεργού με τις πρωτεΐνες. Όταν η συγκέντρωση του τασενεργού αυξάνεται πολύ οι τιμές της επιφανειακής τάσης καθορίζονται μόνο από το τασενεργό. Log 10 C s Σχήμα 6. Η μεταβολή της διεπιφανειακής τάσης, σε σχέση με το λογάριθμο της συγκέντρωσης του τασενεργού, σε ένα σύστημα ιοντικού τασενεργού/ πρωτεΐνης (Feijter et al. 1987). Όταν στο σύστημα υπάρχει ένα μη ιοντικό τασενεργό, όπως το Tween 40, το διάγραμμα της μεταβολής της επιφανειακής τάσης σε σχέση με την συγκέντρωση του τασενεργού, παρουσιάζεται διαφοροποιημένο. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα προϊόντα της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στο τασενεργό και την πρωτεΐνη δεν είναι ιδιαίτερα επιφανειακώς ενεργά, γιατί το μη ιοντικό τασενεργό τείνει να αλληλεπιδρά με το υδρόφοβο τμήμα της πρωτεΐνης (Dickinson & Woskett, 1989). Οι Mackie et al. (2001), μελέτησαν την αλληλεπίδραση του Tween 40 20 με την β-καζεΐνη σε μία διεπιφάνεια αέρα-νερού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, όταν η τιμή της επιφανειακής πίεσης που ασκείται είναι σχετικά χαμηλή, το διεπιφανειακό υμένιο αποτελείται κυρίως από πρωτεΐνη (α). Στο αρχικό αυτό στάδιο, η πρωτεΐνη καταλαμβάνει το 97,4% της επιφάνειας, ενώ παράλληλα εμφανίζονται στο πρωτεϊνικό υμένιο ορισμένα κενά (μαύρα στίγματα), τα οποία είναι οι περιοχές στις οποίες απαντά το Tween 40 20. Όταν στη συνέχεια συμπιεσθεί το υμένιο (β), 16

παρατηρείται ότι το ποσοστό της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια μειώνεται, λόγω της ανταγωνιστικής προσρόφησης του Tween 40, και τα κενά αυτά μεγαλώνουν. Το φαινόμενο αυτό συνεχίζεται όταν συμπιέζεται και άλλο το υμένιο, με αποτέλεσμα η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια να γίνει ακόμα μικρότερη. Ανάλογα πειράματα έγιναν με άλλα συστήματα πρωτεϊνών/τασενεργών και παρατηρήθηκε περίπου παρόμοια συμπεριφορά. Όπως προκύπτει σε γενικές γραμμές, τα μόρια των τασενεργών δεν απομακρύνουν πλήρως τα μόρια των πρωτεινών από τη διεπιφάνεια κατά την ανταγωνιστική προσρόφηση, αλλά καταλαμβάνουν ορισμένες περιοχές της, ενώ οι πρωτεΐνες περιορίζονται στις υπόλοιπες (Mackie et al., 2001). Σχήμα 7. Φωτογραφίες από ειδικό μικροσκόπιο μικτού προσροφημένου υμενίου β- καζεΐνης/ Tween 40 20 σε διάφορες φάσεις συμπίεσης του υμενίου (Mackie et al., 2001). 3. Θερμική αποσταθεροποίηση γαλακτωμάτων O ρόλος των πρωτεϊνών σε ένα γαλάκτωμα μετά τον σχηματισμό του, είναι κυρίως η παρεμπόδιση των φαινόμενων αποσταθεροποίησης. Η επίδραση των πρωτεϊνών στη σταθερότητα των γαλακτωμάτων εξαρτάται από πολλούς 17

παράγοντες, όπως είναι η τιμή ph, η παρουσία τασενεργών ή αλάτων και η θερμοκρασία. Η επίδραση της θερμοκρασίας στη συμπεριφορά του γαλακτώματος είναι ιδιαίτερα σημαντική, εφόσον ένα γαλάκτωμα μπορεί να υποστεί θερμική επεξεργασία σε πολλές πρακτικές εφαρμογές, όπως το μαγείρεμα, η παστερίωση ή η αποστείρωση (Srinivasan et al., 2003, McSweeney et al., 2004). Η θερμοκρασία στην οποία επέρχονται μεταβολές σε ένα γαλάκτωμα, εξαρτάται από τη θερμοκρασία στην οποία μετουσιώνεται η πρωτεΐνη που το σταθεροποιεί. Τα γαλακτώματα, για παράδειγμα, που σταθεροποιούνται με σφαιροπρωτεΐνες, όπως η β-γαλακτοσφαιρίνη, είναι ιδιαίτερα ασταθή κατά τη θερμική επεξεργασία. Όταν η θερμοκρασία φτάσει σε μία ορισμένη τιμή, οι σφαιροπρωτεΐνες μετουσιώνονται, με αποτέλεσμα να εκτίθενται στην επιφάνεια του μορίου οι ενεργές ομάδες της πρωτεΐνης, όπως είναι οι μη πολικές και οι σουλφυδρυλικές ομάδες. Η αποκάλυψη των ομάδων αυτών στην επιφάνεια των σταγονιδίων έχει ως αποτέλεσμα την ενίσχυση των ελκτικών δυνάμεων αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών που είναι προσροφημένες στην επιφάνεια του ίδιου ή γειτονικών σταγονιδίων. Οι ελκτικές δυνάμεις μεταξύ των προσροφημένων, σε διαφορετικά σταγονίδια, που είναι σε γειτνίαση, πρωτεϊνών, συμβάλουν ώστε να έρθουν πιο κοντά τα σταγονίδια και τελικά να συσσωματωθούν. Όταν τα σταγονίδια δεν μπορούν να προσεγγίσουν το ένα το άλλο λόγω έντονων απωστικών δυνάμεων (π.χ. ηλεκτροστατικών απώσεων σε τιμή ph που απέχει από το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης), ευνοούνται οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσροφημένων πρωτεϊνών στην επιφάνεια του ίδιου σταγονιδίου και δε λαμβάνει χώρα συσσωμάτωση. Η συσσωμάτωση των σταγονιδίων μετά από θέρμανση, είναι δυνατό να επηρεαστεί και από την παρουσία τασενεργών. Σύμφωνα με τους Parkinson και Dickinson (2004), η προσθήκη μικρής ποσότητας Tween 40 20 σε γαλάκτωμα που σταθεροποιείται με β-γαλακτοσφαιρίνη και η θέρμανσή του, οδήγησαν στην αύξηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων. Η συμπεριφορά αυτή του γαλακτώματος, είναι σύμφωνη και με τα αποτελέσματα της έρευνας των Kim et al., 2002. Σύμφωνα με τους Parkinson και Dickinson, τα αποτελέσματα αυτά είναι διαφορετικά από το αναμενόμενο, μίας και τα μόρια του τασενεργού είναι δυνατό να προσροφηθούν στην επιφάνεια των σταγονιδίων, αντικαθιστώντας έτσι ορισμένα ευέλικτα μόρια των προσροφημένων πρωτεϊνών. Με το μηχανισμό αυτό της απομάκρυνσης των μορίων πρωτεΐνης από τη διεπιφάνεια, είναι δυνατό να 18

ελαττωθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των γειτονικών σταγονιδίων, οι οποίες οφείλονται κυρίως σε αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών (Dickinson, 1992). Αν και η θέρμανση σε γαλακτώματα που παρασκευάζονται με χρήση πρωτεΐνης του ορού του γάλακτος μπορεί να προκαλέσει εκτεταμένη συσσωμάτωση, μετά την αφαίρεση του κλάσματος των μη προσροφημένων πρωτεϊνών από τη συνεχή φάση του γαλακτώματος, η έκταση της συσσωμάτωσης μειώνεται αρκετά. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν τη θεωρία ότι κατά τη συσσωμάτωση γειτονικών σταγονιδίων, είναι δυνατό μη προσροφημένες πρωτεΐνες να αλληλεπιδρούν με προσροφημένες πρωτεΐνες και στα δύο σταγονίδια και να τα φέρνουν με αυτό τον τρόπο πιο κοντά, λειτουργώντας ως συγκλητικό υλικό μεταξύ των σταγονιδίων (Σχήμα 8). Η μελέτη της κινητικής της θερμικής συσσωμάτωσης γαλακτωμάτων που σταθεροποιούνται με τη βοήθεια πρωτεϊνών του ορού του γάλακτος οδήγησε στο συμπέρασμα ότι με τη θέρμανση σχηματίζονται μεγάλα και ασταθή πρωτεϊνικά συσσωματώματα, στα οποία κύριο ρόλο διαδραματίζουν τα μη προσροφημένα πρωτεϊνικά μόρια (Euston, 2000). Σχήμα 8. Σχηματική αναπαράσταση της πιθανής δομής των συσσωματωμάτων σε γαλακτώματα που παρασκευάσθηκαν με πρωτεΐνες ορού του γάλακτος, τα οποία σχηματίζονται κατά τη θέρμανση με αλληλεπίδραση των μη προσροφημένων πρωτεϊνών με προσροφημένες στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων πρωτεΐνες (Euston, 2000). 19

Γ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Τα γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με χρησιμοποίηση κρόκου αυγού, όπως και αρκετά τρόφιμα, είναι δυνατό να υποστούν θερμική επεξεργασία είτε για την παστερίωση/αποστείρωση τους είτε για την παρασκευή προϊόντων, στα οποία τα γαλακτώματα αυτά συμμετέχουν ως συστατικά, όπως κρέμες, πίτες κτλ. Αν και η περιορισμένη και ελεγχόμενη ανάπτυξη δομής που αποδίδεται στη μετουσίωση των πρωτεϊνών του κρόκου κατά τη θέρμανση είναι επιθυμητή, σε ορισμένες περιπτώσεις η μετουσίωση είναι δυνατό να οδηγήσει σε ανεπιθύμητες μεταβολές, όπως είναι η συσσωμάτωση και κυρίως η συγχώνευση των σταγονιδίων. Οι μεταβολές αυτές στη δομή των γαλακτωμάτων, οδηγούν στο διαχωρισμό των δύο φάσεων και στη συγκέντρωση του ελαίου στην επιφάνεια του γαλακτώματος. Από τις πρωτεΐνες του κρόκου του αυγού που χρησιμοποιούνται ευρέως στην παρασκευή των γαλακτωμάτων, περισσότερο ευαίσθητες στη θερμική επεξεργασία είναι οι λιβετίνες και οι LDL απολιποπρωτεΐνες. Οι σφαιροπρωτεΐνες του κρόκου είναι περισσότερο ανθεκτικές στη θερμική επεξεργασία, με αποτέλεσμα τα γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με τις πρωτεΐνες αυτές, να απαιτούν υψηλότερες θερμοκρασίες για να αποσταθεροποιηθούν (Denmat et al., 1999). Αν και ο κρόκος του αυγού χρησιμοποιείται εκτεταμένα στα τρόφιμα, ο μηχανισμός με τον οποίο λαμβάνει χώρα η θερμική αποσταθεροποίηση των γαλακτωμάτων του, σε αντίθεση με τα γαλακτώματα άλλων πρωτεϊνών, δεν έχει μελετηθεί συστηματικά. Επίσης δεν έχει διερευνηθεί η δυνατότητα της παρεμπόδισης ή στη χειρότερη περίπτωση της επιβράδυνσης του φαινομένου με την προσθήκη τασενεργών τα οποία σε ορισμένες περιπτώσεις είναι δυνατό να συμβάλουν στη σταθεροποίηση κατά τη θέρμανση των γαλακτωμάτων που σταθεροποιούνται με πρωτεΐνες. Ο σκοπός της εργασίας αυτής ήταν κυρίως η μελέτη του μηχανισμού της θερμικής αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων που παρασκευάσθηκαν με χρήση κρόκου του αυγού και η διερεύνηση της δυνατότητας παρεμπόδισης αυτή της αποσταθεροποίησης, όταν προστίθεται στο γαλάκτωμα ένα επιτρεπόμενο τασενεργό όπως το Tween 40. 20

Δ.ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Υλικά Αντιδραστήρια Κατά την παρασκευή των γαλακτωμάτων χρησιμοποιήθηκε υγρός κρόκος που παραλήφθηκε από φρέσκα αυγά. To έλαιο που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των γαλακτωμάτων ήταν εξευγενισμένο αραβοσιτέλαιο (εμπορικό δείγμα). Για την εκτίμηση της έκτασης της συγχώνευσης και της συσσωμάτωσης των σταγονιδίων και για τη μελέτη του μηχανισμού της θερμικής αποσταθεροποίησης του γαλακτώματος, χρησιμοποιήθηκε διθειοθρεϊτόλη (DTT, Sigma Chemical Co.) και χλωριούχο νάτριο (Sigma Chemical Co.). Για τα πειράματα μελέτης της επίδρασης ενός τασενεργού στο μηχανισμό της θερμικής αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων κρόκου, χρησιμοποιήθηκε Tween 40 (Fluka AG, Buchs, Switzerland). Η τιμή ph ρυθμίστηκε με διαλύματα που παρασκευάσθηκαν με χρήση πυκνού θειικού οξέος και καυστικού νατρίου (Riedelde-Haen, Seelze, Germany). Ο προσδιορισμός της ποσότητας της πρωτεΐνης που προσροφήθηκε στα γαλακτώματα, έγινε με εφαρμογή της μεθόδου Kjeldahl. Για την υγρή καύση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε θειικό κάλιο (Merck, Darmstadt, Germany), ένυδρος θειικός χαλκός (Merck, Darmstadt, Germany) και πυκνό θειικό οξύ (Riedel-de-Haen, Seelze, Germany). 2. Συσκευές Όργανα Για την παρασκευή των γαλακτωμάτων, χρησιμοποιήθηκε μηχανικός αναδευτήρας με προπέλα RW 14H (IKA Instruments, Germany) και ομογενοποιητής APV-2000 (Invensys APV products, Albertslund, Denmark). Για τη θέρμανση των γαλακτωμάτων χρησιμοποιήθηκε υδρόλουτρο, model WB 3015, (Bioline Scientific). Η παρατήρηση των γαλακτωμάτων έγινε με τη βοήθεια μικροσκοπίου εφοδιασμένου με φακούς Carl Zeiss, ενώ οι εικόνες αποτυπώθηκαν στο μικροσκόπιο με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Power Shot G2 (Canon). 21

Για τη μέτρηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων του γαλακτώματος χρησιμοποιήθηκε αναλυτής μεγέθους σωματιδίων Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, UK). Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών μετά από προσδιορισμό του οργανικού αζώτου, χρησιμοποιήθηκε συσκευή καύσης και απόσταξης Kjeldhal (Gerhardt, Bioline Scientific). H ξήρανση των γαλακτωμάτων έγινε σε συσκευή λυοφιλίωσης (Thermovac Industries Corp.UK). Οι φυγοκεντρήσεις, που ήταν απαραίτητες για την απομάκρυνση της μη προσροφημένης πρωτεΐνης από το γαλάκτωμα, πραγματοποιήθηκαν με φυγόκεντρο SV11 (Firlabo, France) και φυγόκεντρο Rotina 35 (Hettich, Germany). Οι ζυγίσεις έγιναν σε αναλυτικό ζυγό με ακρίβεια ±1mg EORV70 Explorer (Ohaus, Switzerland). Για την παρασκευή των διαλυμάτων και των αιωρημάτων χρησιμοποιήθηκε μαγνητικός αναδευτήρας (Bioline Scientific). Η ρύθμιση της τιμής του ph έγινε με χρήση ψηφιακού πεχαμέτρου MP 220 (Mettler Toledo, Germany). Για τη μέτρηση της επιφανειακής τάσης χρησιμοποιήθηκε δυναμόμετρο (Kruss GmbH K8 Germany), με δακτύλιο Du Nauy. 22

3. Μέθοδοι Πειραματικές διαδικασίες 3.1. Παρασκευή γαλακτώματος ελαίου σε νερό (o/w) Αρχικά παραλήφθηκε υγρός κρόκος από φρέσκα αυγά ως εξής: Μετά το σπάσιμο του κελύφους του αυγού διαχωρίστηκε ο κρόκος από το άσπρο με το χέρι και με τη βοήθεια απορροφητικού χαρτιού απομακρύνθηκε η αλβουμίνη από τη βιτελινική μεμβράνη. Μετά από διάτρηση της μεμβράνης συλλέχτηκε ο υγρός κρόκος. Ποσότητα του υγρού κρόκου προστέθηκε σε απιονισμένο νερό και παρασκευάσθηκε αιώρημα 6% (w/v) σε κρόκο, με την εφαρμογή μηχανικής ανάδευσης. Τα γαλακτώματα με περιεκτικότητα 30% (w/v) σε έλαιο παρασκευάσθηκαν με στάγδην προσθήκη και υπό συνεχή ανάδευση, αραβοσιτέλαιου στο αιώρημα του κρόκου. Το γαλάκτωμα ομογενοποιήθηκε σε συνθήκες πίεσης 900 bar για 5 λεπτά με τη βοήθεια ομογενοποιητή υψηλής πίεσης. Ορισμένη ποσότητα του γαλακτώματος, αραιώθηκε με απιονισμένο νερό σε αναλογία 1:2 για να προκύψει γαλάκτωμα με περιεκτικότητα σε υγρό κρόκο 2% (w/v) και σε αραβοσιτέλαιο 10% (w/v). 3.2. Μέτρηση του μεγέθους των σταγονιδίων στα γαλακτώματα Μικρή ποσότητα γαλακτώματος (1 ml) αραιώθηκε με απιονισμένο νερό και στη συνέχεια αναμίχθηκε με περίπου 700 ml αποσταγμένου νερού στο δοχείο της συσκευής μέτρησης σταγονιδίων. Ακολούθησε μέτρηση του μεγέθους των συσσωματωμάτων των σταγονιδίων κάτω από συνθήκες ήπιας ανάδευσης. Για τη μέτρηση του πραγματικού μεγέθους των σταγονιδίων, προστέθηκε στο γαλάκτωμα διάλυμα που περιείχε 1% (w/v) Tween 40 και 0.01 M DTT, προκειμένου να επέλθει πλήρης διάσπαση των συσσωματωμάτων των σταγονιδίων. Στη συνέχεια το αραιωμένο γαλάκτωμα αναμίχθηκε με περίπου 700 ml αποσταγμένου νερού στο δοχείο της συσκευής μέτρησης σταγονιδίων και μετρήθηκε η μέση διάμετρος των σταγονιδίων, d 4,3 κάτω από συνθήκες έντονης ανάδευσης. 23

3.3. Πειράματα θερμικής αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων Η εκτίμηση της θερμικής αποσταθεροποίησης του γαλακτώματος, έγινε με θέρμανση μικρής ποσότητάς του (1 ml) σε υδρόλουτρο στους 90 ο C για διάφορα χρονικά διαστήματα και τοποθέτησή του στη συνέχεια σε παγόλουτρο. Για την εκτίμηση του βαθμού αποσταθεροποίησης του γαλακτώματος κατά τη θερμική επεξεργασία, μετρήθηκε η μέση διάμετρος των σταγονιδίων με τη βοήθεια της συσκευής μέτρησης του μεγέθους των σταγονιδίων. Η επίδραση της θερμοκρασίας στην σταθερότητα των γαλακτωμάτων, μελετήθηκε με θέρμανση 1 ml του γαλακτώματος για 10 λεπτά σε υδρόλουτρο, σε θερμοκρασίες από 55 έως και 90 ο C και τοποθέτησή του στη συνέχεια σε παγόλουτρο. Ακολούθησε μέτρηση της κατανομής του μεγέθους στη συσκευή μέτρησης των σταγονιδίων. Για να μελετηθεί η επίδραση του μη προσροφημένου κλάσματος του κρόκου στη θερμική αποσταθεροποίηση του γαλακτώματος, απομακρύνθηκε μετά από φυγοκέντρηση (10000g για 20 λεπτά) το υποκείμενο υγρό. Στη συνέχεια προστέθηκε στην κρέμα η ίδια ποσότητα ακριβώς νερού με αυτή του υποκείμενου υγρού που απομακρύνθηκε. Ακολούθησε θέρμανση του γαλακτώματος στους 90 ο C για 10 λεπτά και μετρήθηκε η μέση διάμετρος των σταγονιδίων με τη βοήθεια της συσκευής μέτρησης του μεγέθους των σταγονιδίων. 3.4. Πειράματα αποκορύφωσης Η σταθερότητα των γαλακτωμάτων ως προς την αποκορύφωση μετά από θέρμανση, αξιολογήθηκε με μεταφορά 10 ml του θερμικά επεξεργασμένου γαλακτώματος σε ειδικά κυλινδρικά δοχεία με πώμα, διαστάσεων 1cm (διαμετρος) x 6cm (ύψος) που τοποθετήθηκαν σε υδρόλουτρο 90 ο C για 10 λεπτά, και καταγραφή του αρχικού ύψους Η 0. Αρχικά το γαλάκτωμα ήταν ομογενές (t = 0). Σημειώθηκε ο χρόνος εμφάνισης ορού στον πυθμένα του δοχείου και μετρήθηκε κατά διαστήματα το ύψος του ορού που διαχωρίστηκε. Η σταθερότητα του γαλακτώματος ως προς την αποκορύφωση υπολογίσθηκε από τη σχέση: H t H % = 100 H o 24

H o = το αρχικό ύψος του γαλακτώματος για t = 0 (45 mm) και H t = το ύψος του ορού που διαχωρίστηκε τη χρονική στιγμή t. 3.5. Παρατήρηση των γαλακτωμάτων στο μικροσκόπιο Τα γαλακτώματα τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρο πλάκα και παρατηρήθηκαν με τη βοήθεια μικροσκοπίου που έφερε φακό Carl Zeiss (10/0,22). Οι εικόνες στο μικροσκόπιο αποτυπώθηκαν με τη βοήθεια ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής. Τα γαλακτώματα παρατηρήθηκαν πριν και μετά τη θερμική επεξεργασία στους 90 ο C για 10 λεπτά, καθώς και μετά από προσθήκη 1% (w/v) Tween 40 στη θερμοκρασία περιβάλλοντος ή μετά από προσθήκη 1% (w/v) Tween 40 και θερμική επεξεργασία στους 90 ο C για 10 λεπτά 3.6. Μέτρηση της επιφανειακής τάσης αιωρημάτων του κρόκου Για τη μέτρηση της επιφανειακής τάσης παρασκευάσθηκε μία σειρά αιωρημάτων που περιείχαν κρόκο σε διάφορες συγκεντρώσεις, και στη συνέχεια προστέθηκε ορισμένη ποσότητα (20 ml) στο δυναμόμετρο Kruss, για να μετρηθεί η επιφανειακή τάση με την τεχνική του δακτυλίου. Η μέτρηση έγινε μετά από παραμονή των αιωρημάτων στη συσκευή για 24 ώρες. Μετρήθηκε επίσης η επιφανειακή τάση διαλυμάτων που περιείχαν μόνο Tween 40. Για τα πειράματα της ανταγωνιστικής προσρόφησης, ορισμένη ποσότητα (20 ml) αιωρήματος που περιείχε κρόκο σε συγκέντρωση 0.25% (w/v) τοποθετήθηκε στο δυναμόμετρο και αφέθηκε για 24 ώρες. Στα αιωρήματα, μεταφέρθηκε κάτω από την επιφάνεια, με τη βοήθεια σύριγγας, ορισμένη ποσότητα (0.5 ml) διαλύματος Tween 40 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Οι μετρήσεις της επιφανειακής τάσης έγιναν μετά από παραμονή του νέου αιωρήματος στο δυναμόμετρο για 24 ώρες. Όλες οι μετρήσεις στο δυναμόμετρο Kruss έγιναν στους 25 ο C. Από τις μετρήσεις της επιφανειακής τάσης υπολογίστηκαν οι τιμές της επιφανειακής πίεσης Π, με τη βοήθεια της σχέσης: Π = γ ο - γ t Όπου γ ο και γ t είναι οι επιφανειακές τάσεις του αποσταγμένου νερού (72 mn/m) και του αιωρήματος ή διαλύματος, αντίστοιχα. 25

3.7. Προσδιορισμός της προσροφημένης στα γαλακτώματα πρωτεΐνης Για τον προσδιορισμό της προσροφημένης πρωτεΐνης στην επιφάνεια των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων απομακρύνθηκε το μη προσροφημένο στο γαλάκτωμα πρωτεϊνικό κλάσμα με φυγοκέντρηση σε 10000g για 20 λεπτά. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στην κρέμα, προσδιορίστηκε στη συνέχεια με εφαρμογή της μεθόδου Kjeldahl (Pearson, 1973). Το ποσοστό της πρωτεΐνης που προσροφήθηκε στο γαλάκτωμα, μετατράπηκε σε ποσότητα πρωτεΐνης που προσροφήθηκε ανά μονάδα επιφάνειας του γαλακτώματος. Ο προσδιορισμός επαναλήφθηκε επίσης μετά από την προσθήκη στο γαλάκτωμα Tween 40 σε διάφορες συγκεντρώσεις. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που προσροφήθηκε ανά μονάδα διεπιφάνειας του γαλακτώματος (Γ S ) υπολογίσθηκε από τη σχέση (McClements, 1999): Γ s = Γ Τ S Τ ( mg / m 2 ) όπου Γ T είναι η ολική ποσότητα προσροφημένης πρωτεΐνης (σε mg) σε 100mL αιωρήματος και S T η συνολική επιφάνεια του γαλακτώματος ανά 100 ml αιωρήματος. S T = 10*S (m 2 ) όπου S η μέση επιφάνεια του γαλακτώματος ( σε m 2 /cm 3 ) που υπολογίζεται από την εξίσωση S = d 6 2 3 3,2 ( m / cm ) όπου d 3,2 η μέση διάμετρος των σταγονιδίων (σε μm). 26

3.8. Στατιστική ανάλυση των πειραματικών αποτελεσμάτων Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του προγράμματος One-Way ANOVA που εμπεριέχεται στο πρόγραμμα λογισμικού SPSS v.8.0. Το επίπεδο εμπιστοσύνης ήταν 95%. Οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων όρων διαπιστώθηκαν με τη μέθοδο LSD. 27

Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1.Επίδραση της θερμοκρασίας και του χρόνου θέρμανσης στην αποσταθεροποίηση του γαλακτώματος που παρασκευάσθηκε με χρήση κρόκου αυγού Η θέρμανση του γαλακτώματος στους 90 ο C είχε ως αποτέλεσμα την σχετικά ταχεία αποσταθεροποίηση του, αφού θέρμανση για χρονικό διάστημα 1 μόνο λεπτού επαρκούσε για να προκύψει μία αξιοσημείωτη αύξηση στο μέσο μεγέθος των σταγονιδίων του γαλακτώματος. Αντίθετα, η περαιτέρω αύξηση στο μέσο μέγεθος των σταγονιδίων, μετά από θέρμανση για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο των 3 λεπτών, ήταν μόνο οριακή (Σχήμα 9). Όγκος (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 Μέγεθος σωματιδίων (μm) μάρτυρας, 25ºC 1 min, 90ºC 3 min, 90ºC 10 min, 90ºC Σχήμα 9. Επίδραση του χρόνου θέρμανσης στους 90 ο C στην κατανομή του μεγέθους σταγονιδίων του γαλακτώματος που παρασκευάσθηκε με χρήση κρόκου αυγού. Όπως φαίνεται από το Σχήμα 10, τα σταγονίδια του γαλακτώματος ήταν ήδη συσσωματωμένα σε κάποιο βαθμό, στη θερμοκρασία περιβάλλοντος, αφού το μέσο μέγεθος, d 4,3, των σταγονιδίων του γαλακτώματος πριν τη θέρμανση στους 90 ο C, ήταν περίπου 5 μm, ενώ η πραγματική τιμή του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων, όπως αυτή μετρήθηκε μετά από προκατεργασία του δείγματος με Tween 40 και DTT, ήταν περίπου 0,7 μm. 28

30 25 d4,3(μm) 20 15 10 5 0 25 55 60 65 70 75 80 85 90 Θερμοκρασία ( o C) απουσία Tween 40 1% Tween 40 1%Tween 40 + 0,01M DTT d4,3(μm) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 25 55 60 65 70 75 80 85 90 Θερμοκρασία ( o C) 1%Tween 40 1% Tween 40 + 0.01M DTT Σχήμα 10. Επίδραση της θέρμανσης για 10 λεπτά σε επιλεγμένες θερμοκρασίες, στα γαλακτώματα απουσία Tween 40, παρουσία Tween 40 και παρουσία Tween 40 και DTT. Παρόμοια συμπεράσματα είναι δυνατό να εξαχθούν και μετά από παρατήρηση των γαλακτωμάτων, πριν και μετά τη θέρμανση, στο μικροσκόπιο. Όπως φαίνεται στις φωτογραφίες, στο δείγμα πριν τη θερμική επεξεργασία (Σχήμα 11.α.), υπάρχει ένας αριθμός σταγονιδίων που δεν είναι συσσωματωμένα, τα οποία συνυπάρχουν με συσσωματώματα σταγονιδίων που ποικίλουν σε σχήμα και μέγεθος. Στο Σχήμα 11.γ, φαίνεται ότι τα συσσωματώματα αυτά διασπώνται με την προσθήκη του Tween 40. Στο Σχήμα 11.β φαίνονται τα μεγάλα συσσωματώματα αλλά και τα μεγάλα σταγονίδια που προέκυψαν μετά τη θέρμανση στους 90 ο C. 29

α. β. γ. δ. Σχήμα 11. Φωτογραφίες του γαλακτώματος όπως φαίνεται στο μικροσκόπιο, πριν τη θέρμανση (α), μετά από θέρμανση στους 90 ο C για 10 λεπτά (β), μετά την προθήκη 1% Tween 40 και πριν τη θέρμανση (γ) και μετά την προσθήκη 1% Tween 40 και τη θέρμανση στους 90 ο C για 10 λεπτά (δ). Προφανώς, ο σχηματισμός των συσσωματωμάτων στο σύστημα, ήταν το αποτέλεσμα ελκτικών δυνάμεων μεταξύ των σταγονιδίων του ελαίου, των οποίων η ισχύς ήταν μεγαλύτερη αυτής των απωστικών δυνάμεων. Οι ελκτικές αυτές δυνάμεις συνδέονται και με την παρουσία των προσροφημένων πρωτεϊνικών μορίων στην επιφάνεια των σταγονιδίων του γαλακτώματος. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσροφημένων σε γειτονικά σταγονίδια πρωτεϊνικών μορίων, έχουν ως αποτέλεσμα την προσέγγιση των σταγονιδίων και τελικά το σχηματισμό συσσωματωμάτων. Όπως είναι γνωστό (Demetriades et al., 1997), η αλληλεπίδραση μεταξύ δύο σταγονιδίων 30

ελαίου σε ένα γαλάκτωμα, μπορεί να εξηγηθεί εάν ληφθούν υπόψη δυνάμεις αλληλεπίδρασης, όπως είναι οι δυνάμεις van der Waals και οι ηλεκτροστατικές, πολυμερικές και υδρόφοβες δυνάμεις. Στα γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με πρωτεΐνες, οι πολυμερικές δυνάμεις αλληλεπίδρασης ενεργούν μόνο όταν τα σταγονίδια πλησιάσουν σε πολύ μικρή απόσταση, ώστε να συμπιεσθούν τα μόρια της πρωτεΐνης που είναι προσροφημένα στη διεπιφάνεια δύο γειτονικών σταγονιδίων. Οι δυνάμεις αυτές εμποδίζουν τα σταγονίδια να πλησιάσουν ακόμα περισσότερο και να συγχωνευθούν, αλλά δεν προσφέρουν καμία προστασία ως προς τη συσσωμάτωση (Anton et al., 2002). Ο βαθμός συσσωμάτωσης και η σταθερότητα των συσσωματωμάτων που σχηματίζονται, καθορίζεται κυρίως από τις απωστικές ηλεκτροστατικές δυνάμεις που αναπτύσσονται μεταξύ σταγονιδίων με ομώνυμα φορτία. Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την σταθερότητα των γαλακτωμάτων είναι ο υδρόφοβος χαρακτήρας της επιφάνειας των σταγονιδίων. Σύμφωνα με τους Demetriades et al., (1997), όταν 5% της επιφάνειας ενός γαλακτώματος που σταθεροποιείται με πρωτεΐνη καταστεί μη πολικό, οι υδρόφοβες δυνάμεις γίνονται τόσο ισχυρές, ώστε το σύστημα οδηγείται σε συσσωμάτωση. Αυτό που επίσης πρέπει να ληφθεί υπόψη όταν παρατηρούνται φαινόμενα συσσωμάτωσης σε ένα γαλάκτωμα το οποίο περιέχει βιοπολυμερή, είναι οι οσμωτικές αλληλεπιδράσεις που οφείλονται σε μη προσροφημένα μόρια του πολυμερούς που είναι διαλυμένα στη συνεχή φάση ή σε μικύλλια, τα οποία σχηματίζονται από τα μη προσροφημένα μόρια πρωτεϊνών, όπως στην περίπτωση της καζεΐνης. Τα μικύλλια της καζεΐνης είναι δυνατό να ενισχύσουν τις ελκτικές δυνάμεις αλληλεπίδρασης μεταξύ των σταγονιδίων και να συμβάλλουν στην ενίσχυση του φαινόμενου της συσσωμάτωσης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί από τους Anton et al.(2002), οι δυνάμεις αλληλεπίδρασης που οφείλονται στα οσμωτικά φαινόμενα μπορούν να δράσουν στα γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με κρόκο του αυγού τόσο σε ουδέτερο όσο και σε όξινο περιβάλλον. Οι δυνάμεις αυτές, σε συνδυασμό με τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσροφημένων πρωτεϊνών στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων, είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση συσσωματωμάτων στα γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με κρόκο, στη θερμοκρασία δωματίου. Μετά από θέρμανση για 10 λεπτά σε επιλεγμένες θερμοκρασίες μεταξύ 30 και 90 ο C, παρατηρήθηκε ότι στο γαλάκτωμα δεν παρουσίασθηκε καμία αύξηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων του, μέχρι και τους 75 ο C. Στους 80 ο C παρατηρήθηκε μία μικρή αύξηση στο μέγεθος των σταγονιδίων του, ενώ σε θερμοκρασίες πάνω από τους 80 ο C, η αποσταθεροποίηση του γαλακτώματος ήταν ραγδαία (Σχήμα 10). Η αύξηση 31

αυτή στο μέγεθος των σταγονιδίων του γαλακτώματος οφείλεται προφανώς στη μετουσίωση των πρωτεϊνών του κρόκου του αυγού, η οποία έλαβε χώρα μετά από θέρμανση σε θερμοκρασίες υψηλότερες από 70 ο C. Όπως είναι γνωστό (Le Denmat et al., 1999), ορισμένες πρωτεΐνες του κρόκου του αυγού, όπως οι λιβετίνες και οι LDL απολιποπρωτεΐνες, είναι σχετικά ευαίσθητες και μετουσιώνονται όταν ο κρόκος του αυγού θερμανθεί σε θερμοκρασίες μεταξύ 69 και 76 ο C. Οι σφαιροπρωτεΐνες, όπως και ορισμένες πρωτεΐνες του κρόκου (π.χ οι HDL), είναι περισσότερο ανθεκτικές στη θέρμανση, με αποτέλεσμα να μετουσιώνονται σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Αυτό ίσως εξηγεί το λόγο που η συσσωμάτωση των σταγονιδίων του γαλακτώματος κατά τη θέρμανση έλαβε χώρα μόνο όταν η θερμοκρασία ξεπέρασε τους 80 ο C. Η μετουσίωση των πρωτεϊνών οδηγεί σε αύξηση του επιφανειακού υδρόφοβου χαρακτήρα και στην ενίσχυση των υδρόφοβων δυνάμεων αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών που είναι προσροφημένες στην διεπιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων ελαίου. Στο Σχήμα 10.β, φαίνεται ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσροφημένων σε γειτονικά σταγονίδια πρωτεϊνών που οφείλονται κυρίως σε υδρόφοβους δεσμούς, διακόπηκαν παρουσία του Tween 40. Στο σχηματισμό των συσσωματωμάτων είναι πιθανό να εμπλέκονται και δεσμοί, όπως είναι οι δισουλφιδικοί. Οι δεσμοί αυτοί εμπλέκονται είτε μέσω της οξείδωσης των σουλφυδρυλικών ομάδων είτε με δεσμούς ανταλλαγής σουλφυδρυλίου δισουλφυδικού δεσμού. Σύμφωνα όμως με πρόσφατη δημοσίευση (Kiosseoglou et al., 2005) οι ομοιοπολικοί δισουλφιδικοί δεσμοί σε αυτά τα συστήματα παίζουν δευτερεύοντα ρόλο σε σχέση με τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Μπορεί επομένως να υποστηριχθεί ότι ο σχηματισμός των συσσωματωμάτων των σταγονιδίων οφείλεται κυρίως στις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μετουσιωμένων πρωτεϊνών που είναι προσροφημένες στην διεπιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων, ενώ ο σχηματισμός των δισουλφιδικών δεσμών αρχίζει όταν τα στρώματα των προσροφημένων πρωτεϊνικών μορίων πλησιάσουν αρκετά μεταξύ τους, ώστε να εμπλακούν και τα θειούχα αμινοξέα. 32

2.Επίδραση της παρουσίας του τασενεργού Tween 40 στη θερμική αποσταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Η θέρμανση των γαλακτωμάτων στους 90 ο C για 10 λεπτά είχε ως αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση τους και την εμφάνιση συσσωματωμάτων μεγάλου μεγέθους. Το τελικό μέσο μέγεθος των συσσωματωμάτων, που μετρήθηκε μετά από διασπορά του θερμικά επεξεργασμένου γαλακτώματος στο νερό, εξαρτάται από την τιμή ph της συνεχούς φάσης και από την παρουσία ή απουσία χλωριούχου νατρίου. Σε ουδέτερο περιβάλλον η συσσωμάτωση των σταγονιδίων ήταν περισσότερο έντονη, σε σχέση με αυτήν σε όξινο περιβάλλον, αφού το μέσο μέγεθος των σταγονιδίων του γαλακτώματος μετά τη θέρμανση ήταν περίπου 30 και 5μm σε τιμές ph 7 και 3,8, αντίστοιχα. Η παρουσία χλωριούχου νατρίου σε συγκέντρωση 0,3 M στο γαλάκτωμα με τιμή ph 3,8 είχε ως αποτέλεσμα τη δραματική αύξηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων. Οι τιμές d 4,3 ήταν περίπου 10 μm, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 12. Οι διαφορές αυτές στο μέσο μέγεθος των σταγονιδίων μετά από θέρμανση των γαλακτωμάτων που είχαν διαφορετική τιμή ph ή περιείχαν χλωριούχο νάτριο οφείλονται πιθανότατα σε διαφορετικής έντασης αλληλεπιδράσεις μεταξύ των προσροφημένων στην διεπιφάνεια των σταγονιδίων πρωτεϊνικών μορίων. 25 20 d4.3(μm) 15 10 5 0 ph=7 ph=3,8 ph=3,8 + NaCl 0,3M 0%Tween 40 1%Tween 40 Σχήμα 12. Επίδραση της προσθήκης 1% Tween 40 στη μέση διάμετρο των συσσωματωμάτων του γαλακτώματος μετά τη θέρμανση στους 90 ο C για 10 λεπτά. Σε ουδέτερο περιβάλλον (ph 7), οι κύριοι σταθεροποιητές των γαλακτωμάτων που είναι οι απολιποπρωτεΐνες του κρόκου, οι οποίες έχουν ισοηλεκτρικό σημείο περίπου 6,0 6,5, φέρουν ασθενή αρνητικά φορτία (Anton et al., 1999), με αποτέλεσμα οι απωστικές δυνάμεις μεταξύ των γειτονικών σταγονιδίων να είναι 33

σχετικά ασθενείς. Για το λόγο αυτό μετά από τη θέρμανση στους 90 ο C και τη μετουσίωση των προσροφημένων στην επιφάνεια των σταγονιδίων πρωτεϊνικών μορίων αναμένεται η δημιουργία των συσσωματωμάτων. Σε όξινο περιβάλλον, τα σταγονίδια φέρουν στην επιφάνειά τους θετικό φορτίο, το οποίο όμως δεν επαρκεί, όπως φαίνεται, να παρεμποδίσει το σχηματισμό των συσσωματωμάτων κατά τη θέρμανση. Η μόνη διαφορά σε σχέση με το ουδέτερο περιβάλλον, είναι ότι λόγω του μεγαλύτερου φορτίου σχηματίζονται συσσωματώματα που έχουν μικρότερο μέσο μέγεθος. Η προσθήκη του χλωριούχου νατρίου έχει ως αποτέλεσμα την εξουδετέρωση των φορτίων αυτών λόγω της παρουσίας των ιόντων νατρίου και χλωρίου και συνεπώς την εξασθένιση των απωστικών δυνάμεων και την ενίσχυση των ελκτικών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα σταγονίδια που ευνοεί τον σχηματισμό συσσωματωμάτων με σχετικά μεγάλο μέγεθος. Η προσθήκη 1% Tween 40, ευνοεί τη συσσωμάτωση των σταγονιδίων σε κάποια έκταση, ανεξάρτητα από την τιμή ph της υδατικής φάσης ή την παρουσία του χλωριούχου νατρίου. Σύμφωνα με το Σχήμα 12, η παρουσία του Tween 40 είχε ως αποτέλεσμα, το μέσο μέγεθος των σταγονιδίων να έχει την ίδια σχετικά χαμηλή τιμή, ανεξάρτητα από την τιμή ph ή την παρουσία χλωριούχου νατρίου. Όπως είναι γνωστό, μία από τις ιδιότητες των τασενεργών είναι η παρεμπόδιση της ανάπτυξης υδρόφοβων δεσμών μεταξύ των προσροφημένων στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων πρωτεϊνικών μορίων και η παρεμπόδιση στη συνέχεια του σχηματισμού συσσωματωμάτων. Όπως φαίνεται και από Σχήμα 11, το γαλάκτωμα που περιέχει Tween 40 αποτελείται στη θερμοκρασία δωματίου σχεδόν αποκλειστικά από μεμονωμένα σταγονίδια, ενώ στην ίδια θερμοκρασία όταν δεν περιέχει Tween 40 αποτελείται από συσσωματώματα και μεμονωμένα σταγονίδια. Τα μόρια του τασενεργού εκτός του ότι παρεμποδίζουν το σχηματισμό μεγαλύτερων συσσωματωμάτων κατά τη θέρμανση, συμβάλλουν και στη διάσπαση ενός σημαντικού αριθμού συσσωματωμάτων που υπάρχουν στο γαλάκτωμα πριν τη θέρμανσή του. Ένας αριθμός συσσωματωμάτων παραμένει όμως στο γαλάκτωμα. Σε αυτόν οφείλεται η μικρή αύξηση στο μέσο μέγεθος των σταγονιδίων μετά τη θέρμανση (Σχήμα 11.δ). Η εμφάνιση των συσσωματωμάτων αυτών οφείλεται πιθανότατα στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ των μετουσιωμένων πρωτεϊνικών μορίων που είναι προσροφημένα στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων ελαίου. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε εκτεταμένη συγχώνευση, όπως κατά τη θέρμανση του γαλακτώματος που δεν περιείχε Tween 40. 34

Το θερμικά επεξεργασμένο γαλάκτωμα εμφανίζει διαφορετική συμπεριφορά ως προς την αποκορύφωση, η οποία εξαρτάται από την τιμή ph και από την παρουσία του χλωριούχου νατρίου και του Tween 40. Το γαλάκτωμα με τιμή ph 3,8 που περιείχε χλωριούχο νάτριο σε συγκέντρωση 0,3Μ ήταν ιδιαίτερα ασταθές, ενώ η προσθήκη Tween 40 σε συγκέντρωση 1% βελτίωσε σημαντικά τη σταθερότητά του στην αποκορύφωση που έλαβε χώρα με πολύ πιο βραδύ ρυθμό. Η προσθήκη Tween 40 οδήγησε σε βελτίωση της σταθερότητας και των υπόλοιπων γαλακτωμάτων (Σχήμα 13.α και 13.β). Είναι δύσκολο όμως να εξηγηθούν οι διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των γαλακτωμάτων που είχαν διαφορετική τιμή ph ή περιείχαν χλωριούχο νάτριο. Φαίνεται ότι η διαφορά στην ph ή η προσθήκη του χλωριούχου νατρίου επηρεάζει τη συγκέντρωση των λιποπρωτεϊνών ή των άλλων πρωτεϊνικών συστατικών του κρόκου στη διεπιφάνεια ελαίου/νερού. Σύμφωνα με τoυς Le Denmat et al. (2000), η συγκέντρωση αυτή είναι συνάρτηση του φορτίου των μορίων της πρωτεΐνης, το οποίο διαφοροποιείται ανάλογα με τις τιμές ph ή τη συγκέντρωση του χλωριούχου νατρίου. H% 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 t(h) ph=7 ph=7, 1% (w/v) Tween 40 ph=3,8 ph=3,8, 1% (w/v) Tween 40 ph=3,8, 0,3M NaCl ph=3.8, 0.3M NaCl, 1% (w/v) Tween 40 Σχήμα 13.α. Αποκορύφωση γαλακτωμάτων κρόκου μετά από θέρμανση στους 90 ο C για 10 λεπτά. 35

25 20 15 Χρόνος (h) 10 5 0 ph = 7 ph = 3.8 ph = 3.8 + NaCl 0.3M 0% Tween 40 1% Tween 40 Σχήμα 13.β. Επίδραση της προσθήκης Tween 40 στο χρόνο έναρξης της αποκορύφωσης των γαλακτωμάτων μετά τη θέρμανση τους για 10 λεπτά στους 90 o C. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 14, το μέσο μέγεθος των σταγονιδίων μετά τη θέρμανση του γαλακτώματος, φτάνει σε μία ελάχιστη τιμή για συγκέντρωση Tween 40 0,25% (w/v) ή μεγαλύτερη. Αυτό υποδηλώνει ότι όταν η συγκέντρωση του τασενεργού είναι σχετικά μικρή, δεν υπάρχει στο σύστημα επαρκής αριθμός μορίων ώστε να προστατευθεί το γαλάκτωμα από τη θερμική αποσταθεροποίηση. Σε όξινο περιβάλλον η μεταβολή στο μέσο μέγεθος των σταγονιδίων δεν είναι τόσο μεγάλη όσο είναι σε ουδέτερο, όπου παρατηρήθηκε μία αύξηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων από 1,5 μm (στα γαλακτώματα που περιείχαν 0,25% (w/v) σε Tween 40), σε 30 μm (στα ελεύθερα τασενεργού γαλακτώματα). Στα γαλακτώματα με τιμή ph 3,8, το μέσο μεγέθος των σταγονιδίων μεταβλήθηκε από 1,5 μm σε 3 μm. Η διαφορά αυτή πιθανότατα οφείλεται στη σταθεροποίηση που παρέχει το φορτίο της επιφάνειας των σταγονιδίων, το οποίο είναι υψηλότερο στο όξινο περιβάλλον. Το φορτίο αυτό δεν επιτρέπει να πλησιάσουν αρκετά οι επιφάνειες των σταγονιδίων και να σχηματισθούν υδρόφοβοι ή/και δισουλφιδικοί δεσμοί μεταξύ των προσροφημένων στην επιφάνειά τους πρωτεϊνικών μορίων. 36

d4.3(μm) 35 30 25 20 15 10 5 0 0 0,05 0,1 0,25 0,5 1 2 % w/v Tween 40 ph=7 ph=3.8 Σχήμα 14. Επίδραση της συγκέντρωσης του Tween 40 στη μέση διάμετρο των σταγονιδίων, d 4,3, των γαλακτωμάτων με τιμή ph 7 ή 3,8 μετά τη θέρμανσή τους στους 90 ο C για 10 λεπτά. H σταδιακή αύξηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων του γαλακτώματος που επέρχεται κατά τη θέρμανση σε σχέση με τη μείωση της συγκέντρωσης του τασενεργού, οφείλεται πιθανότατα στον διαφορετικό τρόπο με τον οποίο αλληλεπιδρούν τα μόρια του τασενεργού με τα πρωτεϊνικά μόρια που απαντούν στην εξωτερική πλευρά της προσροφημένης στην επιφάνεια των σταγονιδίων μεμβράνης. Η μεμβράνη που σχηματίζεται από τα προσροφημένα στην επιφάνεια των σταγονιδίων του γαλακτώματος πρωτεϊνικά μόρια, αποτελείται από έναν αριθμό πρωτεϊνών που διαφέρουν ως προς το μοριακό βάρος, τη δομή και τον υδρόφοβο χαρακτήρα. Εκτός από τις πρωτεΐνες, η στοιβάδα αυτή αποτελείται και από φωσφολιπίδια που προέρχονται από τον κρόκο του αυγού. Αν και σχεδόν όλες οι πρωτεΐνες του κρόκου είναι δυνατό να προσροφηθούν στη διεπιφάνεια των σταγονιδίων σε βαθμό που εξαρτάται από παραμέτρους, όπως η τιμή ph της υδατικής φάσης, η συγκέντρωση του χλωριούχου νατρίου και η δομή και σύσταση του κρόκου του αυγού, τα συστατικά του κρόκου που συμβάλλουν στο σχηματισμό της επιφανειακής στοιβάδας των σταγονιδίων είναι κυρίως οι απολιποπρωτεΐνες των LDL μικυλλίων, οι κόκκοι (granules) και τα φωσφολιπίδια τα οποία προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων του γαλακτώματος σε συγκέντρωση 1,0-1,2 mg/m 2 περίπου (Martinet et al., 2003). Οι απολιποπρωτεΐνες και τα φωσφολιπίδια που αποτελούν τη μεμβράνη η οποία σχηματίζεται λόγω της προσρόφησης των LDL μικκυλίων του κρόκου στη διεπιφάνεια αέρα/νερού έχουν ανεξάρτητη συμπεριφορά. Η επιφανειακή αυτή στοιβάδα, εμφανίζει μία σειρά από μεταβολές κατά τη συμπίεσή της. Αυτές που 37

λαμβάνουν χώρα σε τιμές επιφανειακής πίεσης 41 και 54 mn/m σχετίζονται με την παρουσία των απολιποπρωτεϊνών και των φωσφολιπιδίων, αντίστοιχα (Martinet et al., 2003). Εφόσον η διεπιφανειακή μεμβράνη μπορεί να υποστεί περαιτέρω συμπίεση πριν καταρρεύσει, μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι οι στοιβάδες που σχηματίζονται λόγω της προσρόφησης των λιποπρωτεϊνών του κρόκου δεν είναι πλήρως κορεσμένες, αλλά υπάρχουν περιοχές οι οποίες είναι ελεύθερες από προσροφημένα μόρια. Στο Σχήμα 15 φαίνεται η επίδραση της συγκέντρωσης του κρόκου στην τιμή της επιφανειακής πίεσης διαλυμάτων κρόκου-αέρα, 24 ώρες μετά την έναρξη της προσρόφησης. Όταν η συγκέντρωση του κρόκου αυξήθηκε πάνω από 3x10-3 %, οι τιμές της επιφανειακής πίεσης παρέμειναν σταθερές, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συγκέντρωση των επιφανειακώς ενεργών συστατικών στο σύστημα επαρκούσε για το σχηματισμό τουλάχιστον μίας μονομοριακής στοιβάδας στην επιφάνεια αφού η τιμή της επιφανειακής τάσης καθορίζεται κυρίως από τη βασική στοιβάδα των προσροφημένων συστατικών που είναι σε άμεση επαφή με τον αέρα. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις κρόκου, η τιμή της επιφανειακής πίεσης μειώθηκε σταδιακά ενώ η στοιβάδα που σχηματίσθηκε ήταν πιθανόν λιγότερο οργανωμένη, εφόσον δεν υπήρχε η απαραίτητη ποσότητα επιφανειακώς ενεργών συστατικών για να καλυφθεί πλήρως όλη η έκταση της επιφάνειας. Η προσθήκη Tween 40 με σύριγγα σε διάλυμα κρόκου 0.25% (w/v) είχε ως αποτέλεσμα, οι τιμές της επιφανειακής πίεσης να παραμείνουν σταθερές και σχεδόν ταυτόσημες με τις τιμές της επιφανειακής πίεσης ενός διαλύματος το οποίο περιέχει μόνο Tween 40 (37 mn/m). Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα μόρια του τασενεργού διαπερνούν τα προσροφημένα στην διεπιφάνεια συστατικά του κρόκου και φθάνουν στο προσροφημένο στρώμα που είναι σε άμεση επαφή με τον αέρα. Στην περιοχή εκείνη τα μόρια του τασενεργού είτε διευθετούνται στα κενά που αφήνουν τα φωσφολιπίδια και τα προσροφημένα τμήματα των μορίων των απολιποπρωτεϊνών, είτε προκαλούν μία αλλαγή στον τρόπο διευθέτησης των προσροφημένων μορίων, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μία πιο συμπιεσμένη επιφανειακή στοιβάδα σε υψηλότερες τιμές επιφανειακής πίεσης. 38

Π (mn/m) 36 34 32 30 28 26 24 22 20 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 % (w/v) υγρός κρόκος ή Tween 40 Tween 40 υγρός κρόκος υγρός κρόκος (0.25% w/v) + Tween 40 Σχήμα 15. Επίδραση της συγκέντρωσης μετά την παρέλευση 24 ωρών στην επιφανειακή πίεση διαλύματος κρόκου ( ), διαλύματος Tween 40 ( ) και διαλύματος κρόκου 0,25% (w/v) που περιέχει Tween 40 στην υδατική φάση. Όταν η συγκέντρωση του Tween 40 ήταν μικρότερη από 10-2 %, οι τιμές της επιφανειακής τάσης ήταν παραπλήσιες με τις τιμές της επιφανειακής πίεσης όταν στη διεπιφάνεια αέρα-νερού υπήρχαν μόνο συστατικά του κρόκου. Φαίνεται δηλαδή, ότι δεν υπήρχε επαρκής αριθμός μορίων τασενεργού τα οποία θα μπορούσαν να διαπεράσουν τη μεμβράνη του κρόκου στην επιφάνεια για να επηρεάσουν την τιμή της επιφανειακής πίεσης. Από τα παραπάνω, εξάγεται το συμπέρασμα ότι όταν η συγκέντρωση του Tween 40 ήταν σχετικά χαμηλή, τα μόρια του τασενεργού δεν μπορούσαν να διεισδύσουν στη μεμβράνη που σχημάτιζαν τα προσροφημένα συστατικά του κρόκου. Στην περίπτωση αυτή ενδέχεται να διατηρούνται προσροφημένα στη μεμβράνη αλλά από την πλευρά του νερού, αλληλεπιδρώντας πιθανότατα με τα μόρια της πρωτεΐνης μέσω υδρόφοβων δεσμών. Σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις τα μόρια ενός τασενεργού ανταγωνίζονται τις πρωτεΐνες για μία θέση στη διεπιφάνεια και είναι δυνατό τα μόρια των βιοπολυμερών να εκροφηθούν ανταγωνιστικά από τη διεπιφάνεια. Η έκταση της εκρόφησης εξαρτάται από τα δομικά χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης και του τασενεργού. Είναι μάλιστα πιθανό σε ορισμένες περιπτώσεις να αντικατασταθεί πλήρως η προσροφημένη πρωτεΐνη από τα μόρια του τασενεργού. Σύμφωνα με το Σχήμα 16, η προσθήκη Tween 40 σε σχετικά χαμηλή συγκέντρωση (έως και 0,1%), οδήγησε στην απομάκρυνση μίας σημαντικής ποσότητας πρωτεΐνης από τη διεπιφάνεια. Περαιτέρω προσθήκη Tween 39

40 δεν είχε όμως κάποια άλλη επίδραση και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στη διεπιφάνεια διατηρήθηκε σταθερή. Συμπεραίνεται, επομένως, ότι τα μόρια του Tween 40 ωθούν σε εκρόφηση και αντικαθιστούν εκείνα τα μόρια των συστατικών του κρόκου που βρίσκονται προσροφημένα στην εξωτερική επιφάνεια της διεπιφανειακής στοιβάδας και είναι χαλαρά συνδεδεμένα με αυτήν. Επειδή τα ευέλικτα και υδρόφοβα μόρια των λιποπρωτεϊνών είναι ισχυρά προσροφημένα στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου, εξάγεται το συμπέρασμα ότι τα μόρια που εκροφώνται είναι είτε οι λιβετίνες, είτε άλλα συστατικά που είναι χαλαρά συνδεδεμένα στη διεπιφάνεια. 0,18 0,17 Γ (mg/m 2 ) 0,16 0,15 0,14 0,13 0,12 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 % (w/v) Tween 40 Σχήμα 16. Επίδραση της συγκέντρωσης του Tween 40 στην ποσότητα πρωτεΐνης κρόκου που προσροφαται ανά μονάδα διεπιφάνειας γαλακτώματος. 3. Προτεινόμενος μηχανισμός της αποσταθεροποίησης των γαλακτωμάτων και του προστατευτικού ρόλου του τασενεργού Tween 40. Όπως έχει υποστηριχθεί από αρκετούς ερευνητές (Demetriades et al., 1997, Le Denmat et al., 1999, Euston et al., 2000, Kim et al., 2002, Kelley et al., 2003, Sliwinsky et al., 2003, McSweeney et al., 2004, Parkinson et al., 2004), η θέρμανση των γαλακτωμάτων που σταθεροποιούνται με πρωτεΐνες του ορού του γάλακτος οδηγεί σε συσσωμάτωση των σταγονιδίων τους λόγω μετουσίωσης και αλληλεπίδρασης των προσροφημένων στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων ελαίου, πρωτεϊνών. Η παρουσία της καζεΐνης στη διεπιφάνεια των σταγονιδίων σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις μπορεί να παρεμποδίσει τα φαινόμενα που προκαλεί η θέρμανση σε γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με πρωτεΐνη του ορού. Η δράση της καζεΐνης 40

οφείλεται στην ενίσχυση των απωστικών πολυμερικών δυνάμεων που εμφανίζονται λόγω της αλληλεπικάλυψης των καζεϊνικών μακρομορίων κατά την προσέγγιση των σταγονιδίων του γαλακτώματος (Parkinson et al., 2004). Σύμφωνα με τους Euston et al. (2000) και τους Sliwinsky et al. (2003), η συσσωμάτωση των σταγονιδίων στα γαλακτώματα της πρωτεΐνης του ορού του γάλακτος επηρεάζεται και από την παρουσία μη προσροφημένων πρωτεϊνικών μορίων στη συνεχή φάση του γαλακτώματος. Τα μόρια αυτά πιστεύεται ότι κατά τη θέρμανση μετουσιώνονται και αλληλεπιδρούν σχηματίζοντας συσσωματώματα μεγάλου μεγέθους τα οποία είναι δυνατό να δράσουν ως συνδετικό υλικό μεταξύ των προσροφημένων σε γειτονικά σταγονίδια, πρωτεϊνών προκαλώντας τη συσσωμάτωσή τους. Για να διαπιστωθεί αν οι μη προσροφημένε πρωτεΐνες του κρόκου στα γαλακτώματα παίζουν κάποιο ρόλο στην αποσταθεροποίησή τους, απομακρύνθηκαν από την υδατική φάση μετά από συνεχείς πλύσεις με απιονισμένο νερό και το γαλάκτωμα θερμάνθηκε στους 90 ο C για 10 λεπτά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 17, η απομάκρυνση των μη προσροφημένων πρωτεϊνών του κρόκου από τη συνεχή φάση είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων του μη θερμασμένου γαλακτώματος και, επιπλέον, την προστασία του από τη συσσωμάτωση κατά τη θέρμανση. 10 8 Όγκος (%) 6 4 2 0 0,01 0,10 1,00 10,00 100,00 1000,00 Mέγεθος σωματιδίων (μm) 25ºC 90ºC 90ºC Σχήμα 17. Κατανομή μεγέθους σωματιδίων γαλακτώματος που θερμάνθηκε στους 90 ο C για 10 λεπτά ( ), που δε θερμάνθηκε ( ) που θερμάνθηκε μετά την απομάκρυνση του μη προσροφημένου πρωτεϊνικού κλάσματος στη συνεχή φάση ( ). Μπορεί συνεπώς να υποστηριχθεί ότι το μη προσροφημένο πρωτεϊνικό κλάσμα του κρόκου παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη θερμική αποσταθεροποίηση των γαλακτωμάτων. Το κλάσμα αυτό αποτελείται από σφαιροπρωτεΐνες όπως οι λιβετίνες και από απολιποπρωτεΐνες και φωσβιτίνη (Le Denmat et al., 2000). Η θέρμανση του 41

γαλακτώματος οδηγεί πιθανότατα στο σχηματισμό πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων, τα οποία στη συνέχεια λειτουργούν ως σύνδεσμος μεταξύ των γειτονικών σταγονιδίων επειδή προφανώς τείνουν να αλληλεπιδρούν με τα μετουσιωμένα προσροφημένα πρωτεΐνικά μόρια. Η αλληλεπίδραση αυτή γίνεται μέσω των εκτεθειμένων υδρόφοβων ομάδων, λόγω της μετουσίωσης των θειούχων και λοιπών αμινοξέων. Όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, κατά την αποσταθεροποίηση του γαλακτώματος λαμβάνει χώρα τόσο συσσωμάτωση όσο και συγχώνευση των σταγονιδίων. Στο Σχήμα 18 παρατηρείται ότι στα γαλακτώματα που έχουν θερμανθεί, εκτός από τα σταγονίδια του ελαίου και από τα συσσωματώματά τους, διακρίνονται και σταγονίδια πολλαπλής φάσης γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμφάνιση φαινομένων αναστροφής φάσεων κατά την θέρμανση των γαλακτωμάτων. Τα σταγονίδια αυτά παρατηρήθηκε ότι σχηματίστηκαν μετά τη θέρμανση του γαλακτώματος στους 90 ο για 5-6 λεπτά. Η αναστροφή κατά την θέρμανση είναι δυνατή εξαιτίας της αύξησης της διαλυτότητας των λιποπρωτεϊνών στο έλαιο. Όταν δηλαδή αυξηθεί η θερμοκρασία, ορισμένα πρωτεϊνικά μόρια είναι δυνατό να περάσουν στη φάση του ελαίου, να λάβει χώρα αναστροφή των φάσεων και ορισμένα συσσωματώματα του αρχικού γαλακτώματος να μετατραπούν σε σταγονίδια ελαίου μεγάλου μεγέθους τα οποία περικλείουν σταγονίδια νερού μικρότερου μεγέθους δηλαδή να σχηματισθεί ένα πολλαπλό γαλάκτωμα νερού/ελαίου/νερού. Το πολλαπλό γαλάκτωμα που σχηματίσθηκε στη συγκεκριμένη περίπτωση δεν ήταν ιδιαίτερα σταθερό και αποσταθεροποιήθηκε στη συνέχεια με την περαιτέρω θέρμανση σχηματίζοντας τελικά ένα απλό γαλάκτωμα ελαίου σε νερό, που είχε όμως μεγαλύτερου μεγέθους σταγονίδια σε σχέση με το αρχικό. Σχήμα 18. Επιλεγμένη φωτογραφία του γαλακτώματος στο μικροσκόπιο, όπου φαίνεται ο σχηματισμός συστήματος πολλαπλής φάσης (νερού σε έλαιο σε νερό, w/o/w) μετά από θέρμανση στους 90 ο C για 6 λεπτά. 42

Η προσθήκη Tween 40 στα γαλακτώματα που παρασκευάζονται με χρήση κρόκου αυγού οδηγεί σε παρεμπόδιση του φαινομένου της αποσταθεροποίησης κατά τη θέρμανση. Τα μόρια του τασενεργού παρεμποδίζουν τόσο τη διαδικασία της συσσωμάτωσης όσο και αυτή της συγχώνευσης των σταγονιδίων. Η πιθανότερη εξήγηση αυτής της συμπεριφοράς έχει να κάνει με την ελάττωση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των σταγονιδίων. Σύμφωνα με τα όσα έχουν προαναφερθεί, η δράση του Tween 40 στη σταθεροποίηση αυτών των γαλακτωμάτων κατά τη θέρμανση μπορεί να παρασταθεί με το Σχήμα 19. Μόριο Tween 40 Μόριο φωσφολιπιδίου Μόριο απολιποπρωτεϊνης με ευέλικτη δομή, σε άμεση επαφή με το έλαιο Μόριο χαλαρά προσροφημένης απολιποπρωτεΐνης ή σφαιροπρωτεΐνης Σχήμα 19. Σχηματική αναπαράσταση του μηχανισμού σχηματισμού συσσωματωμάτων στα γαλακτώματα που παρασκευάζονται με χρήση κρόκο αυγού μετά από τη θέρμανση και την παρεμποδιστική δραση του Tween 40. Όταν στην υδατική φάση των γαλακτωμάτων αυτών προστίθεται το τασενεργό Tween 40, τα μόρια του τελευταίου συμβάλλουν στην απομάκρυνση της προσροφημένης στα σταγονίδια πρωτεΐνης σε ποσοστό περίπου 20%. Πιθανότατα, τα πρωτεΐνικά μόρια που απομακρύνονται είναι αυτά που ήταν χαλαρά συνδεδεμένα με την επιφάνεια του σταγονιδίου. Η συσσωμάτωση των σταγονιδίων του γαλακτώματος, 43