Το σύστηµα ενεργού ιλύος είναι το πλέον διαδεδοµένο και αποτελεσµατικό σύστηµα βιολογικής επεξεργασίας αστικών λυµάτων. Η εκτεταµένη ανάπτυξη και εφαρµογή του συστήµατος αυτού οφείλεται στην οικονοµία του και στην εξασφάλιση εκροής υψηλής ποιότητας. Σηµαντικό βήµα στην ιστορική εξέλιξη του συστήµατος ενεργού ιλύος αποτέλεσε η χρήση ανοξικών και αναερόβιων αντιδραστήρων για τη βιολογική αποµάκρυνση των θρεπτικών αζώτου και φωσφόρου. Ταυτόχρονα όµως µε την ανάπτυξη των βακτηριδίων τα οποία είναι υπεύθυνα για τις διεργασίες που σχετίζονται µε την αποµάκρυνση της οργανικής ύλης, του αζώτου και του φωσφόρου, οι επιβαλλόµενες περιβαλλοντικές συνθήκες σε ένα σύστηµα ενεργού ιλύος είναι δυνατόν να ευνοήσουν και την ανάπτυξη νηµατοειδών µικροοργανισµών. Η υπερβολική ανάπτυξη των τελευταίων δηµιουργεί σοβαρά λειτουργικά προβλήµατα, αναφορικά µε την καθιζησιµότητα της ιλύος (διόγκωση ιλύος) και τη δηµιουργία βιολογικού αφρού. Η υπερβολική ανάπτυξη των νηµατοειδών µικροοργανισµών σε ένα σύστηµα ενεργού ιλύος είναι δυνατόν να προκαλείται από τις περιβαλλοντικές και λειτουργικές συνθήκες που επικρατούν σε αυτό, καθώς και από τη σύσταση των λυµάτων που εισέρχονται στην εγκατάσταση. Συγκεκριµένα, στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές εργασίες που αναφέρουν την εξάρτηση της ανάπτυξης νηµατοειδών βακτηριδίων (Microthrix parvicella, Nocardia sp.) που προκαλούν φαινόµενα αφρισµού και διόγκωσης της ιλύος, από την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων στα λύµατα λιπαρών υλών γενικότερα και ειδικότερα λιπαρών οξέων. Αντικείµενο της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη και η εφαρµογή µιας µεθόδου προσδιορισµού των λιπαρών οξέων µακριάς ανθρακικής αλυσίδας (LCFAs) σε πειράµατα πιλοτικής κλίµακας, αλλά και σε δείγµατα λυµάτων από Ε.Ε.Λ. πλήρους κλίµακας, µε στόχο τη διερεύνηση του µεταβολισµού τους στο δίκτυο αποχέτευσης αστικών λυµάτων. Ως εκ τούτου, η µέθοδος που αναπτύχθηκε αποτελεί ένα επιπλέον «εργαλείο» στην προσπάθεια για την περαιτέρω µελέτη της εξάρτησης του M. parvicella από την παρουσία των LCFAs στα αστικά λύµατα. i
Στο Κεφάλαιο 1 γίνεται µία εισαγωγή στο πρόβληµα της υπερβολικής ανάπτυξης των νηµατοειδών µικροοργανισµών σε συστήµατα ενεργού ιλύος και αναφορά στο αντικείµενο της παρούσας εργασίας. Στο Κεφάλαιο 2 πραγµατοποιείται µια βιβλιογραφική ανασκόπηση σχετικά µε τα φαινόµενα της νηµατοειδούς διόγκωσης και αφρισµού. Συγκεκριµένα, περιγράφονται τα σηµαντικότερα προβλήµατα διαχωρισµού των στερεών από τα επεξεργασµένα λύµατα και πως αυτά σχετίζονται µε την ανάπτυξη των νηµατοειδών βακτηριδίων και παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα ερευνών καταγραφής τους ανά τον κόσµο. Ιδιαίτερη έµφαση δίνεται στην περιγραφή των µορφολογικών και µεταβολικών χαρακτηριστικών του Microthrix parvicella, του επικρατέστερου νηµατοειδούς σε συστήµατα ενεργού ιλύος. Γίνονται εκτενείς αναφορές στα αποτελέσµατα ερευνών της ανάπτυξης του M. parvicella µε κατανάλωση λιπαρών οξέων µακριάς ανθρακικής αλυσίδας (LCFAs) και των εστέρων τους, µιας και βάσει των περισσοτέρων ερευνών θεωρούνται ως οι πλέον προτιµώµενες πηγές άνθρακα για την ανάπτυξή του. Στη συνέχεια παρατίθενται ποσοτικά στοιχεία εµφάνισης διαφόρων νηµατοειδών µικροοργανισµών σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυµάτων στον ελληνικό χώρο κατά τη θερινή και χειµερινή περίοδο και αναφέρονται οι πιθανές αιτίες της εποχιακής διακύµανσης του M. parvicella. Στη συνέχεια του Κεφαλαίου 2 περιγράφεται το µικροβιακό σύστηµα και ο τρόπος µεταφοράς των λυµάτων στους αγωγούς αποχέτευσης που προηγούνται της εγκατάστασης επεξεργασίας. Επίσης περιγράφεται ο τρόπος µε τον οποίο µεταβάλλεται η ποιοτική και ποσοτική σύσταση των λυµάτων στο αποχετευτικό δίκτυο, µε ιδιαίτερη έµφαση στις διαδικασίες υδρόλυσης των τριγλυκεριδίων που έχουν ως αποτέλεσµα την παραγωγή των LCFAs. Με τον τρόπο αυτό γίνεται αντιληπτό ότι το αποχετευτικό δίκτυο και οι εγκαταστάσεις βιολογικής επεξεργασίας πρέπει να αντιµετωπίζονται ως ενιαίο σύστηµα και ότι οι συνθήκες που επικρατούν στους υπονόµους µπορούν να επιδρούν σηµαντικά στη λειτουργία και την αποδοτικότητα της εγκατάστασης επεξεργασίας λυµάτων. Στο Κεφάλαιο 3 γίνεται µια βιβλιογραφική ανασκόπηση γύρω από τις κατηγορίες και τα χαρακτηριστικά (φυσικά και χηµικά) των λιποειδών που απαντώνται στη φύση ii
γενικότερα και ειδικότερα των γλυκεριδίων, µιας και τα γλυκερίδια αποτελούν την κυριότερη τάξη λιπιδίων στα αστικά λύµατα. Επίσης, γίνεται εκτενής αναφορά στις κατηγορίες των λιπαρών οξέων που αποτελούν προϊόντα υδρόλυσης των γλυκεριδίων, ενώ ιδιαίτερη έµφαση δίνεται στα λιπαρά οξέα µακριάς ανθρακικής αλυσίδας (LCFAs), αφού αυτά βάσει της βιβλιογραφίας πιθανότατα αποτελούν µία από τις πλέον προτιµώµενες πηγές άνθρακα για την ανάπτυξή του M. parvicella. Τέλος, στο Κεφάλαιο 3 αναφέρονται οι διάφορες κατηγορίες φωσφολιπιδίων που απαντώνται στη φύση, καθώς και συνοπτικά στοιχεία για τα γλυκολιποειδή και τις λιποπρωτεϊνες, ενώσεις που αποτελούν δοµικά συστατικά των βιολογικών µεµβρανών των προκαρυωτικών και ευκαριωτικών οργανισµών. Για την ευκολότερη κατανόηση του τρόπου µε τον οποίο οι προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί βιοσυνθέτουν και αποικοδοµούν τις διάφορες κατηγορίες λιποειδών, κρίθηκε σκόπιµο στο Κεφάλαιο 4 να γίνει αρχικά µια περιορισµένη αναφορά στη µοριακή αρχιτεκτονική των µεµβρανών και των κυτταρικών τοιχωµάτων των βακτηριδίων. Στη συνέχεια του Κεφαλαίου 4 πραγµατοποιείται µία αναλυτικότατη βιβλιογραφική ανασκόπηση σχετικά µε τις κατηγορίες των λιποειδών που απαντώνται στα βακτηριακά κύτταρα. Στο δεύτερο µισό του Κεφαλαίου 4 παρουσιάζονται οι τρόποι µε τους οποίους οι προκαρυωτικοί µικροοργανισµοί βιοσυνθέτουν και βιοαποικοδοµούν τις διάφορες κατηγορίες λιποειδών, µέσω της µελέτης του βακτηριδίου Echerichia coli. Συγκεκριµένα όσον αφορά στη βιοαποικοδόµηση, περιγράφεται αναλυτικά η διαδικασία υδρόλυσης των τριγλυκεριδίων, αλλά και οι διάφορες πορείες οξείδωσης των λιπαρών οξέων (βοξείδωση, α-οξείδωση, ω-οξείδωση), όπως επίσης και ο τρόπος αποικοδόµησης των φωσφολιπιδίων. Τέλος, στο Κεφάλαιο 4 αναφέρονται αναλυτικά οι τρόποι βιοσύνθεσης των κορεσµένων και ακόρεστων λιπαρών οξέων, καθώς και των φωσφολιπιδίων. Στο Κεφάλαιο 5 περιγράφονται οι δύο χρωµατογραφικές τεχνικές που χρησιµοποιήθηκαν για την επίτευξη του ποιοτικού και ποσοτικού προσδιορισµού των LCFAs. Συγκεκριµένα, περιγράφονται αναλυτικά οι αρχές και τα είδη της αέριας χρωµατογραφίας (GC) και της χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας (TLC), η iii
οργανολογία της GC, καθώς και η χρησιµότητα αυτών των δύο τεχνικών στη λιπιδική έρευνα. Στο Κεφάλαιο 6 γίνεται η περιγραφή της πιλοτικής µονάδας που χρησιµοποιήθηκε για την µελέτη του µεταβολισµού των λιπαρών οξέων µακριάς ανθρακικής αλυσίδας. Συγκεκριµένα, µελετήθηκαν τέσσερα λιπαρά οξέα, εκ των οποίων τα τρία µε άρτιο αριθµό ατόµων άνθρακα (παλµιτικό, στεατικό, ελαϊκό/ελαϊδικό οξύ) και ένα µε περιττό αριθµό ατόµων άνθρακα (µαργαρικό οξύ). Η επιλογή των τριών πρώτων λιπαρών οξέων έγινε µε βάση βιβλιογραφικές αναφορές, σύµφωνα µε τις οποίες ο M. Parvicella εµφανίζει ιδιαίτερη προτίµηση στην κατανάλωση αυτών των λιπαρών οξέων και των εστέρων τους (Slijkhuis, 1983, Andreasen et al., 1998, Andreasen et al., 2000, Νουτσόπουλος, 2002). Όσον αφορά στο µαργαρικό οξύ, αν και ανήκει στα οξέα µε περιορισµένη παρουσία στη φύση, αποτελεί χαρακτηριστικό εκπρόσωπο των LCFAs περιττού αριθµού ατόµων άνθρακα και αυτός ήταν ο λόγος που επιλέχθηκε να µελετηθεί. Στη συνέχεια του Κεφαλαίου 6 γίνεται µια συνοπτική παρουσίαση των πειραµάτων που πραγµατοποιήθηκαν και παρατίθενται οι µέθοδοι ανάλυσης που εφαρµόστηκαν. Συγκεκριµένα, για την ίδια συγκέντρωση αιωρούµενων στερεών κάθε φορά έγιναν διπλά πειράµατα. Στο πρώτο πείραµα χρησιµοποιήθηκε σαν οργανικό υπόστρωµα το polyoxyetylene sorbitan monoolate (Tween 80) το οποίο δεν είχε υποστεί καµία χηµική µεταβολή, ενώ στο δεύτερο πείραµα έγινε προσθήκη Tween 80 το οποίο είχε υποστεί προηγουµένως αλκαλική υδρόλυση (σαπωνοποίηση). Οι συγκεντρώσεις των αιωρούµενων στερεών σε κάθε ένα από τα παραπάνω πειράµατα κυµάνθηκαν από 30 έως 150 ppm περίπου. Τα πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν µε προσθήκη Tween 80 που δεν είχε υποστεί καµία χηµική µεταβολή αποσκοπούσαν στη µελέτη του µεταβολισµού από τους µικροοργανισµούς µιας χηµικής ουσίας µεγάλου µοριακού βάρους όπως είναι το Tween 80, η οποία φέρει στο µόριό της εστερικό δεσµό όπως και τα γλυκερίδια στα λύµατα. Από την άλλη, η σειρά πειραµάτων που πραγµατοποιήθηκαν µε προσθήκη Tween 80 το οποίο είχε υποστεί προηγουµένως σαπωνοποίηση, αποσκοπούσε στη µελέτη του µεταβολισµού των προϊόντων υδρόλυσης του εστερικού δεσµού του iv
Tween 80, που είναι το ελαϊκό οξύ και το υπόλοιπο τµήµα του µορίου του Tween 80. Με τον τρόπο αυτό η βιοµάζα τροφοδοτούνταν άµεσα µε τα προϊόντα της υδρόλυσης χωρίς να υπάρχει χρονική υστέρηση οφειλόµενη στην αναγκαιότητα βιοχηµικής υδρόλυσης του εστερικού δεσµού. Οι παράµετροι που παρακολουθήθηκαν κατά τη διάρκεια των πειράµατων ήταν: Θερµοκρασία ph ιαλυµένο οξυγόνο Ολικά αιωρούµενα στερεά και πτητικά αιωρούµενα στερεά Ολικό και διαλυτό χηµικώς απαιτούµενο οξυγόνο Πτητικά οξέα (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, βαλερικό οξύ) Λιπαρά οξέα µακριάς ανθρακικής αλυσίδας Όσον αφορά στην ανάπτυξη και εφαρµογή των αναλυτικών µεθόδων προσδιορισµού των πτητικών και µακριάς ανθρακικής αλυσίδας λιπαρών οξέων, γίνεται εκτενής αναφορά στον τρόπο προκατεργασίας των δειγµάτων, στις λειτουργικές συνθήκες κατά την εφαρµογή της αέριας χρωµατογραφίας και της χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας, καθώς και στις διαδικασίες επιλογής της µεθόδου προσδιορισµού των LCFAs. Σηµειώνεται ότι η µέθοδος που εφαρµόστηκε για τον προσδιορισµό των LCFAs στην παρούσα εργασία δίνει τη δυνατότητα υπολογισµού τόσο των ελεύθερων LCFAs που υπάρχουν σε κάποιο δείγµα λυµάτων (κατεργασία δείγµατος χωρίς σαπωνοποίηση), όσο και των συνολικών LCFAs που περιέχονται σε αυτό (αφού προηγηθεί σαπωνοποίηση του δείγµατος). Η αναλυτική παρουσίαση των πειραµάτων της εργαστηριακής κλίµακας και ο σχολιασµός των αποτελεσµάτων που προέκυψαν γίνεται στο Κεφάλαιο 7. Από την πραγµατοποίηση των πειραµάτων µε χρήση σαπωνοποιηµένου Tween 80 υπολογίζεται κάθε φορά ο ρυθµός κατανάλωσης του ελαϊκού οξέος, ο οποίος και βρίσκεται ότι ακολουθεί τη σχέση: r h = K h * [(X s /X β )/(K x + X s /X β )]* X β v
όπου: K h ο µέγιστος ειδικός ρυθµός υδρόλυσης (d -1 ) X s η συγκέντρωση της υδρολύσιµης ουσίας (mg/l) X β η συγκέντρωση της βιοµάζας (mg/l) K x σταθερά κορεσµού (gcod ουσίας /gcod βιοµάζας ) Από τα πειράµατα µε χρήση Tween 80 σαν οργανικό υπόστρωµα, υπολογίζεται η µέση τιµή του ρυθµού παραγωγής ελαϊκού οξέος, r p(oleic)average, καθώς και η µέση τιµή του ρυθµού κατανάλωσης του tcod (r (tcod)average ). Η τιµή του r (tcod)average συγκρινόµενη µε την αντίστοιχη τιµή που υπολογίσθηκε σε παλαιότερα πειράµατα µε χρήση σωµατιδιακού και διαλυτοποιηµένου αµύλου, καθώς και µε οξικό οξύ, βρίσκεται ότι είναι περίπου 1,5 φορές µικρότερη από εκείνη του σωµατιδιακού αµύλου, 3 φορές µικρότερη από εκείνη του διαλυτοποιηµένου αµύλου και 6 φορές µικρότερη από τον ρυθµό κατανάλωσης του COD, όταν σαν οργανικό υπόστρωµα χρησιµοποιείται το οξικό οξύ. Τέλος από την ίδια σειρά πειραµάτων, υπολογίζεται η µέση τιµή του συντελεστή µετατροπής βιοµάζας Y average, η οποία και βρίσκεται µεγαλύτερη από οποιαδήποτε τιµή που προσδιορίσθηκε από τους Wakelin και Forster (1997), οι οποίοι υπολόγισαν το συντελεστή µετατροπής βιοµάζας χρησιµοποιώντας ως οργανικό υπόστρωµα διάφορες λιπαρές ύλες. Στο Κεφάλαιο 8 παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα από την εφαρµογή της µεθόδου που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισµό των VFAs και LCFAs, σε δείγµατα των εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυµάτων της πόλης των Ιωαννίνων, του Κ.ΕΡ.ΕΦ.Υ.Τ. της ΕΥ ΑΠ στην Μεταµόρφωση Αττικής και της Θεσσσαλονίκης. Όσον αφορά στα LCFAs, σε ορισµένα δείγµατα προσδιορίσθηκαν τόσο αυτά που βρίσκονταν σε ελεύθερη µορφή, όσο και τα συνολικά (ελεύθερα και εστεροποιηµένα LCFAs) που περιέχονταν σε αυτά. Όσον αφορά στην Ε.Ε.Λ. των Ιωαννίνων, αναλύθηκαν δείγµατα που λήφθηκαν από φρεάτιο του κεντρικού αποχετευτικού αγωγού που απέχει 4 km από την είσοδο της Ε.Ε.Λ., από την είσοδο της Ε.Ε.Λ., κατάντη του εξαµµωτή-απολιπαντή και κατάντη της.π.κ. Τα δείγµατα από την Ε.Ε.Λ. της Θεσσαλονίκης λήφθηκαν από θέσεις ανάντη και κατάντη της.π.κ., ενώ το δείγµα από το Κ.ΕΡ.ΕΦ.Υ.Τ. λήφθηκε από το φρεάτιο εισόδου της εγκατάστασης. Συνοπτικά, οι σηµαντικότερες παρατηρήσεις που προκύπτουν από τις αναλύσεις στα παραπάνω δείγµατα είναι οι εξής: vi
Κατά τον προσδιορισµό των τεσσάρων VFAs σε κανένα από τα εξεταζόµενα δείγµατα δεν ανιχνεύτηκε ποσότητα βαλερικού οξέος. Σε όλα σχεδόν τα δείγµατα που αναλύθηκαν βρέθηκε ότι το παλµιτικό οξύ είναι εκείνο το οξύ που βρίσκεται σε κάθε θέση σε µεγαλύτερη ποσότητα. Αντίθετα, το λιπαρό οξύ µε τη µικρότερη συγκέντρωση από τα τέσσερα LCFAs που προσδιορίσθηκαν είναι το µαργαρικό οξύ. Κατά µήκος του τµήµατος των 4 km του κεντρικού αποχετευτικού αγωγού της πόλης των Ιωαννίνων η συγκέντρωση τόσο των συνολικών LCFAs, όσο και των ελεύθερων LCFAs που µελετήθηκαν, ελαττώνεται. Τόσο στα δείγµατα από τα Ιωάννινα, όσο και στα δείγµατα από τη Θεσσαλονίκη, παρατηρείται ελάττωση στη συγκέντρωση των συνολικών LCFAs και των ελεύθερων LCFAs µε την παρεµβολή της.π.κ. Τα τέσσερα λιπαρά οξέα που µελετήθηκαν βρίσκονται στα λύµατα κατά το µεγαλύτερο ποσοστό τους υπό την ελεύθερη µορφή τους. Εκτός από τα τέσσερα LCFAs που προσδιορίσθηκαν µε χρήση GC, στα χρωµατογραφήµατα εµφανίζονται κορυφές που αντιστοιχούν και σε άλλα λιπαρά οξέα η ποσότητα των οποίων, βάσει του εµβαδού των κορυφών, φαίνεται να µην επηρεάζει σηµαντικά τη συνολική συγκέντρωση των LCFAs που υπάρχουν στα δείγµατα των λυµάτων που αναλύθηκαν. Τέλος, στο Κεφάλαιο 9 γίνεται µια συνοπτική παρουσίαση των κυριώτερων συµπερασµάτων της παρούσας εργασίας βάσει των αποτελεσµάτων από τα πειράµατα εργαστηριακής κλίµακας και τις µετρήσεις των LCFAs σε δείγµατα των εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυµάτων πλήρους κλίµακας. vii