Η επίδραση του Ρυθμού Ανάδευσης κατά την Παρασκευή Βιοϋάλων Κολλοειδούς Γέλης στην Κρυσταλλική δομή και τη Βιοενεργότητα τους.

Πτυχιακή Εργασία της Περίσση Μαρίας 12221 Η επίδραση του Ρυθμού Ανάδευσης κατά την Παρασκευή Βιοϋάλων Κολλοειδούς Γέλης στην Κρυσταλλική δομή και τη Βιοενεργότητα τους. Επιβλέπων Καθηγητής : Κ.Μ. Παρασκευόπουλος 1/10/2011

2

Περιεχόμενα Περίληψη 5 Abstract 7 Πρόλογος 9 Σκοπός 11 Κεφάλαιο 1- Εισαγωγή 13 1.1. Βιοϋλικά 14 1.1.1. Βιοΰαλοι που παράγονται με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης 16 1.2. Έλεγχος βιοενεργότητας 21 1.2.1. Ανάπτυξη απατίτη in vitro 22 1.2.2 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη απατίτη 23 Κεφάλαιο 2- Τεχνικές Χαρακτηρισμού 25 2.1 Φασματοσκοπία υπερύθρου (FTIR) 26 2.1.1 Διαπερατότητας (Transmittance) 28 2.1.2 Ανακλαστικότητας (Specular Reflectance) 28 2.1.3 Περιγραφή της πειραματικής διάταξης 28 2.2 Περίθλαση Ακτίνων-Χ (XRD) 29 2.3 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM-EDS) 31 Κεφάλαιο 3- Πειραματικό Μέρος (Υλικά και Μεθοδολογία) 33 3.1 Μέθοδος παρασκευή βιοϋάλου κολλοειδούς γέλης (58S) 34 3.2 Παρασκευή υγρού προσομοίωσης σωματικών υγρών (c-sbf) 36 3.3 Εμβάπτιση 58S στο c-sbf 37 3.4 Επεξεργασία δειγμάτων και μεθοδολογία 38 Κεφάλαιο 4- Αποτελέσματα 40 4.1 Μελέτη της ομοιογένειας των παραγόμενων υλικών με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης για διάφορους ρυθμούς ανάδευσης. 41 4.2 Χαρακτηρισμός των παραγόμενων υλικών για τους διάφορους ρυθμούς ανάδευσης. 44 4.3 Μελέτη της βιοενεργής συμπεριφοράς των παραγόμενων υλικών για τους διάφορους ρυθμούς ανάδευσης. 47 Κεφάλαιο 5- Συμπεράσματα 50 Βιβλιογραφία 53 Παράρτημα 56 3

4

Περίληψη Για τις βιοϋάλους που παρασκευάζονται με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης έχουν γίνει πολλές μελέτες σύμφωνα με τις οποίες παρουσιάζουν ομοιογένεια και είναι βιοενεργές. Ο έλεγχος της βιοενεργότητας έχει μελετηθεί σε υγρό προσομοίωσης του πλάσματος του αίματος, που είναι το συμβατικό υγρό προσομοίωσης c-sbf. Σκοπός της παρούσας πτυχιακής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης του ρυθμού ανάδευσης στην κρυστάλλωση και στη βιοενεργή συμπεριφορά μιας ευρέως μελετημένης βιοενεργής υάλου που παρασκευάζεται με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης -58S- καθώς και η επιβεβαίωση της παρασκευής ομοιογενών υλικών με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης. Ο χαρακτηρισμός της βιουάλου πραγματοποιήθηκε λαμβάνοντας φάσματα από κάθε μία παρασκευή με διαφορετικό ρυθμό ανάδευσης (0rpm, 200rpm, 400rpm, 600rpm και 800rpm). Η ομοιογένεια του υλικού μας εξετάζεται με την παρασκευή τριών διαφορετικών δειγμάτων για κάθε ρυθμό ανάδευσης και στη συνέχεια γίνεται σύγκριση των φασμάτων τους. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό συνθήκες ανανέωσης του διαλύματος c- SBF, αφού έχει αναφερθεί πως η μέθοδος αυτή προσομοιώνει καλύτερα τις in vitro συνθήκες διατηρώντας σταθερή τη συγκέντρωση ιόντων και του ph του διαλύματος. Η βιοΰαλος κολλοειδούς γέλης (SiO 2 60, CaO 36, P 2 O 5 4 in wt %) παρήχθηκε όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία, ενώ τα προϊόντα των παρασκευών κονιορτοποιήθηκαν σε σκόνη κοκκομετρίας <40μm. Η in vitro βιοενεργότητα όλων των δειγμάτων, σε σκόνη, μελετήθηκε με εμβάπτιση τους στο c-sbf για διάφορους χρόνους με ταυτόχρονη ανανέωση του διαλύματος μετά από 6h, 24h και μετέπειτα κάθε 2 ημέρες. Για το χαρακτηρισμό των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές Φασματοσκοπίας Υπερύθρου (FTIR), η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) και η Περίθλαση ακτίνων Χ (XRD). Από τα φάσματα FTIR επιβεβαιώθηκε η ομοιογένεια του υλικού καθώς παρουσιάζονται οι χαρακτηριστικές κορυφές του σε κάθε παρασκευή με διαφορετικό ρυθμό ανάδευσης. Οι 5 βιοΰαλοι με διαφορετικό ρυθμό ανάδευσης χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες που προέκυψαν από τη μελέτη των φασμάτων FTIR και XRD ανάλογα με το ποσοστό κρυσταλλικής φάσης που εμφάνισαν. Στην πρώτη κατηγορία είναι το 0rpm, 200rpm και 800rpm και στη δεύτερη τα 400rpm και 600rpm. Έτσι μελετήθηκε η βιοενεργότητα μιας υάλου από κάθε κατηγορία, το 0rpm και το 400rpm. Tα δείγματα αυτά εμβαπτίσθηκαν στο διάλυμα c-sbf και η έναρξη του σχηματισμού απατίτη στην επιφάνεια των κόκκων του 58S παρατηρήθηκε μετά τις 6 ώρες και για τα δύο γυαλιά -0rpm και 5

400rpm- ενώ το στρώμα του απατίτη έγινε πιο παχύ μετά από την παραμονή τους 12 ώρες στο υγρό προσομοίωσης. Επιπλέον η κρυστάλλωση στρώματος απατίτη στις βιοϋάλους της πρώτης κατηγορίας ήταν πιο παχύ μετά από 6 μέρες στο c-sbf. 6

Abstract Sol-gel glasses typically are used in the manufacture of composite bioceramics materials. Sol-gel has also the advantage of forming composite materials as the matrix phase, the reinforcement phase or both. In most composite systems, the bioactive glass is extensively stirred in order to prevent the precipitation of the grains of the second system. Consequently, the aim of this work is to confirm the homogeneity of a sol-gel glass, to investigate the impact of various stirring rates on the crystallinity and bioactivity of a commonly used bioactive glass. Sol-gel-derived bioactive glass (SiO 2 60, CaO 36, P 2 O 5 4 in wt %) was produced as described in literature. The products were sieved to powder of <40μm. Fourier Transform Infrared Spectroscopy FTIR was used to confirm the homogeneity of the bioactive glasses. The in vitro bioactivity of all samples -as powders- was tested in SBF solutions for various immersion times, while the solution was renewed after 6h, 24h and then every 2 days. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-ray Diffractometry (XRD) were used to characterize all materials before and after immersion in c-sbf solution. The FTIR spectra showed peaks which confirm the homogeneity. FTIR and XRD measurements of all powders revealed the formation of a mainly amorphous glass, while the formation of a small amount of a crystalline phase was also detected. The crystalline phase was evaluated to be Ca 2 SiO 4, while the samples stirred at 400 and 600 rpm revealed the further crystallization of the same phase. For the samples immersed in c-sbf solution, SEM microphotographs revealed the onset of apatite formation on the surface of all samples, while FTIR and XRD confirmed the aforementioned findings. Furthermore, after 6 days of immersion all samples besides those stirred at 400 rpm revealed the formation of a thick apatite layer, since EDS analysis proved a mean molar Ca/P ratio of about 1.8 for all samples. However, the Si from the substrate was only eliminated for the sample produced without any stirring (0 rpm), while the sample stirred at 400 rpm revealed a mean molar Ca/P ratio of about 2 and a large amount of Si form the substrate revealing the formation of a quite thin apatite layer. 7

8

Πρόλογος H παρούσα πτυχιακή εργασία με τίτλο Η επίδραση του ρυθμού ανάδευσης κατά την παρασκευή βιοϋάλων κολλοειδούς γέλης στην κρυσταλλική δομή και τη βιοενεργότητα τους, πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φασματοσκοπίας Υπερύθρου του τομέα Φυσικής Στερεάς Κατάστασης στο τμήμα Φυσικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Σκοπός της είναι η αποτίμηση της βιοενεργής συμπεριφοράς ενός υλικού που προκύπτει με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης (sol-gel), το 58S μετά από εμβάπτισή τους σε υγρό προσομοίωσης του πλάσματος αίματος, το c-sbf υπό συνθήκες ανανέωσης των διαλυμάτων καθώς και ο χαρακτηρισμός και η επιβεβαίωση της ομοιογένειας του 58S. Η παρούσα εργασία χωρίζεται σε πέντε κεφάλαια. Στο πρώτο παρατίθενται πληροφορίες για τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν, τα βιοϋλικά, καθώς και πληροφορίες για τον έλεγχο της βιοενεργότητας στα συγκεκριμένα υλικά. Ακόμη αναφέρονται πληροφορίες για την ανάπτυξη απατίτη και παράγοντες που την επηρεάζουν. Στο δεύτερο κεφάλαιο γίνεται αναφορά στις τεχνικές χαρακτηρισμού που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των παρασκευασθέντων υλικών. Στο τρίτο κεφάλαιο, αναφέρεται η διαδικασία παρασκευής των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και τα βήματα που ακολουθήθηκαν για την επεξεργασία τους προτού εμβαπτιστούν στα διαλύματα. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της πειραματικής διαδικασίας ενώ τέλος στο πέμπτο κεφάλαιο γίνεται αποτίμηση αυτών των αποτελεσμάτων. Η εργασία αυτή διεκπεραιώθηκε με τη συνολική καθοδήγηση και υποστήριξη του καθηγητή μου Κ.Μ. Παρασκευόπουλο, καθηγητή του τμήματος Φυσικής, καθώς και τη σημαντική βοήθεια της κ. Ο. Μ. Γουδούρη η οποία με την αμέριστη κατανόησή της και συμπαράσταση όπως και την πολύτιμη βοήθειά της συνέβαλε στην πραγματοποίησή της. Για το λόγο αυτό θα ήθελα να την ευχαριστήσω, όπως και τον Γ. Θεοδώρου για την βοήθεια του στην επιμέλεια της εργασίας. Οκτώβριος 2011 9

10

Σκοπός Η χρήση τεχνητών εμφυτευμάτων για την αντικατάσταση ιστών ή οργάνων και υποστήριξη των ζωτικών λειτουργιών είναι απόρροια της αύξησης του προσδόκιμου διαβίωσης και του σύγχρονου τρόπου ζωής. Προκειμένου να κατασκευαστεί ένα εμφύτευμα προηγείται έρευνα σε διεπιστημονικό επίπεδο, αρχής γενομένης από τη μελέτη του παθολογικού προβλήματος και ακολουθεί ο σχεδιασμός της διάταξης, η σύνθεση των υλικών και οι έλεγχοι τους ως προς τις μηχανικές ιδιότητες, την τοξικότητα, τη βιολογική απόκριση και την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες, κύτταρα και ιστούς. Μετά την κατασκευή του εμφυτεύματος, γίνεται αποστείρωση και τυποποίηση, έλεγχος της συσκευής με in vitro βιοαντιδράσεις και εφαρμογή σε πειραματόζωα, λαμβάνεται η απαιτούμενη προέγκριση για την αγορά και ακολουθούν κλινικές μελέτες και δοκιμές με τις οποίες παρακολουθείται η χρήση του για μεγάλο χρονικό διάστημα πριν τεθεί ευρέως στην αγορά [1]. Βασικές εφαρμογές των υλικών αυτών εντοπίζονται στους τομείς της Ορθοπεδικής, της Αγγειοχειρουργικής, της Καρδιολογίας, της Ουρολογίας, της Πλαστικής Χειρουργικής και της Οδοντιατρικής. Ως εκ τούτου, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μελέτη των υλικών που δύνανται να χρησιμοποιηθούν στα τεχνητά εμφυτεύματα. Βιοϋλικά καλούνται τα υλικά εκείνα που πληρούν τις απαιτούμενες προϋποθέσεις, ώστε να τίθενται εντός των οργάνων ή ιστών του οργανισμού και να αντικαθιστούν ή να υποστηρίζουν τις λειτουργίες τους [1]. Τέτοια υλικά είναι όλες οι συνθέσεις γυαλιών, μετάλλων, κεραμικών και υαλοκεραμικών που μέσω πολύπλοκων βιολογικών αντιδράσεων που εκδηλώνονται στην διεπιφάνεια επαφής με τους ιστούς, έχουν τη δυνατότητα δημιουργίας σύνδεσης με το οστό ή και τους μαλακούς ιστούς [2]. Μια αντίδραση ανταλλαγής ιόντων μεταξύ του βιοενεργού ενθέματος και των υγρών του σώματος έχει σαν αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός στρώματος καρβονικού υδροξυαπατίτη (HCAp) πάνω στο μόσχευμα η οποία είναι χημικά ισοδύναμη και παρόμοια κρυσταλλογραφικά με την ανόργανη φάση των ιστών. Η ύπαρξη αυτού του στρώματος απατίτη δικαιολογεί τη σύνδεση μεταξύ των ιστών και των οστών σε ένα ανθρώπινο σώμα [3]. Μια κατηγορία βιοϋλικών είναι τα μικτά υαλοκεραμικά τα οποία παρασκευάζονται κυρίως με δύο τρόπους, με ταχεία ψύξη τήγματος (melt-derived) ή με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης (sol-gel). Σε πολλές περιπτώσεις η σύνθεση των sol-gel μικτών υαλοκεραμικών συστημάτων περιλαμβάνει ένα πρώτο σύστημα, το οποίο συνήθως είναι ένα βιοενεργό γυαλί, και ένα δεύτερο σύστημα σε μορφή σκόνης το οποίο προστίθεται ως 11

τελικό αντιδραστήριο κατά τη διάρκεια της ανάμειξης [4]. Στα περισσότερα διφασικά σύνθετα συστήματα που αποτελούνται από βιοενεργά γυαλιά που παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του sol-gel και ενισχύονται από ένα δεύτερο σύστημα, η καθίζηση των κόκκων του δεύτερου συστήματος αποφεύγεται με τη χρήση ανάδευσης μέχρι τη δημιουργία γέλης [5]. Έχουν παρουσιαστεί πολλές ερευνητικές εργασίες [6,7,8,9] σχετικά με την επίδραση της ανάδευσης στη δομή διαφόρων υλικών, η οποία μπορεί να προκαλέσει την κρυστάλλωση μιας πολύμορφης φάσης ή να επιδράσει στη μορφολογία των παραγόμενων φάσεων. Ειδικότερα ο Yan et al. [10] αξιολόγησε την επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης στην κρυστάλλωση CaCO 3 από υδατικά διαλύματα Na 2 CO 3 και CaCl 2 και απέδειξε ότι οι μεταβολές του ρυθμού ανάδευσης μπορούν να επιδράσουν στην κρυστάλλωση CaCO 3 στο σύστημα. Επιπλέον ο Cheney et al. [11] ανακάλυψε ότι η μηχανική ανάδευση επιδρά στη μορφολογία των νανοσωματιδίων και όταν γίνεται κατά την αρχική φάση της σύνθεσης του διαλύματος παράγονται μαύρα μεταλλικά οξείδια με νανοίνες ενώ χωρίς ανάδευση παράγονται καφέ μεταλλικά οξείδια. Σκοπός της παρούσας πτυχιακής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης του ρυθμού ανάδευσης στην κρυστάλλωση και στη βιοενεργή συμπεριφορά μιας ευρέως μελετημένης βιοενεργής υάλου που παρασκευάζεται με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης (58S), καθώς και η επιβεβαίωση της παρασκευής ομοιογενών υλικών με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης. Ο χαρακτηρισμός της βιουάλου πραγματοποιήθηκε λαμβάνοντας φάσματα από κάθε μία παρασκευή με διαφορετικό ρυθμό ανάδευσης. Η ομοιογένεια του υλικού μας εξετάζεται με την παρασκευή τριών διαφορετικών δειγμάτων για κάθε ρυθμό ανάδευσης και στη συνέχεια γίνεται σύγκριση των φασμάτων τους. Ο έλεγχος της βιολογικής συμπεριφοράς ενός υλικού συνίσταται από διάφορα στάδια in vitro και in vivo [3]. Ο in vitro έλεγχος, μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε στην εργασία μας, πραγματοποιείται με εμβάπτιση των δειγμάτων σε διαλύματα που με αρκετά μεγάλη ακρίβεια μπορούν να προσομοιώνουν την ανόργανη φάση του αίματος. Το πιο διαδεδομένο υγρό προσομοίωσης είναι το csbf (simulated body fluids) [12]. Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τον χαρακτηρισμό και τον έλεγχο της βιοενεργότητας των υλικών είναι: η Φασματοσκοπία Υπερύθρου (FT-IR), η Περίθλαση Ακτίνων-Χ (XRD) και η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) [13]. Ο επιστημονικός κλάδος των βιοϋλικών έχει ένα μικρό σχετικά χρόνο ζωής και πάρα πολλά ερωτήματα που χρήζουν απαντήσεις. Αποτελεί όμως, ένα σημαντικότατο επιστημονικό κομμάτι μέσω του οποίου καθίσταται δυνατή η αντιμετώπιση πολλών παθήσεων που ταλαιπωρούν ένα μεγάλο ποσοστό ανθρώπων σε κάθε γωνιά της υφηλίου. 12

13

1.1 Βιοϋλικά Η παρασκευή των πρώτων βιοενεργών υλικών με σύσταση πυριτίου, ασβεστίου, φωσφόρου και νατρίου πραγματοποιήθηκε από τον Hench το 1971. Από τότε, οι διαφοροποιήσεις που έγιναν στις συστάσεις και στους τρόπους παρασκευής τους έχει οδηγήσει σε μία μεγάλη ποικιλία βιοϋλικών, που χρησιμοποιούνται ήδη σε πληθώρα ιατρικών εφαρμογών [13]. Εδώ και χρόνια ο βασικός τρόπος παρασκευής των γυαλιών και κεραμικών είναι η απότομη ψύξη κατόπιν τήξεως των αντιδραστηρίων, καθώς και η θερμοκρασιακή κατεργασία σκονών σε καλούπια κοντά στο σημείο τήξης αυτών. Άλλες γνωστές τεχνικές είναι η ακτινοβόληση κρυστάλλων με υψηλής ενέργειας ακτίνες, και η συμπύκνωση ατμών. Πολλές από τις συστάσεις, οι οποίες δεν ήταν δυνατόν να γίνουν με τις προαναφερθείσες παραδοσιακές μεθόδους, κατέστησαν δυνατές με τη μέθοδο κολλοειδούς γέλης (sol gel). Τα κυριότερα πλεονεκτήματα της συγκεκριμένης μεθόδου είναι η χαμηλές θερμοκρασιακές συνθήκες παραγωγής των προϊόντων, τα υψηλά επίπεδα καθαρότητας αυτών, ο έλεγχος των προσμίξεων και η δυνατότητα παραγωγής πολυσύνθετων συνθέσεων σε διαφορετικές φόρμες. Η εφαρμογή βιοϋλικών για την αποκατάσταση οστικών ή οδοντικών αλλοιώσεων έχει σημειώσει ραγδαία ανάπτυξη τα τελευταία χρόνια, εστιάζοντας το ενδιαφέρον επιστημόνων από πολλούς κλάδους, όπως Χημείας, Φυσικής, Βιολογίας, Ιατρικής, Επιστήμης Υλικών. Ουσιαστικά η όλη φιλοσοφία συνίσταται στη χρησιμοποίηση ενός υλικού, είτε για να επάγει τη δημιουργία οστού από τον περιβάλλοντα ιστό, είτε για να δράσει ως φορέας ή υπόστρωμα οστικών κυττάρων ή άλλων παραγόντων. Επειδή πρόκειται για ένα ξένο σώμα για τον οργανισμό καθοριστικής σημασίας είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ αυτού και του ιστού. Είναι δεδομένο ότι κάθε εμφυτευμένο υλικό προκαλεί μια συγκεκριμένη απόκριση από τον περιβάλλοντα ιστό ενώ ανάλογα με τον τρόπο με τον οποίο προσκολλώνται τα δύο σώματα μεταξύ τους, τα βιοϋλικά και τα οστά χωρίζονται σε τέσσερις βασικές κατηγορίες [22]: α) Σχεδόν αδρανή. Δεν δημιουργείται χημικός ή βιολογικός σύνδεσμος μεταξύ εμφυτεύματος και ιστού, με αποτέλεσμα η λειτουργικότητα του υλικού να φθίνει με το πέρασμα του χρόνου (μέταλλα, αλουμίνα, ζιρκονία, πολυαιθυλένιο (ΡΕ)). β) Πορώδη. Ο ιστός αναπτύσσεται στην επιφάνεια των πόρων και εισχωρεί στη μάζα του υλικού (υδροξυαπατίτης (ΗΑ), πορώδη μέταλλα με επίστρωση ΗΑ). 14

γ) Βιοενεργά. Προκαλούν τέτοια απόκριση από το βιολογικό περιβάλλον, ώστε να δημιουργείται δεσμός μεταξύ εμφυτεύματος και οστού ( βιογυαλιά, ΗΑ, βιοενεργά υαλοκεραμικά). δ) Βιοαποικοδομήσιμα. Λαμβάνει χώρα σταδιακή αποσύνθεσή τους και ταυτόχρονη αντικατάστασή τους από οστό (πολυλακτικό οξύ (PLA)) [22, 14]. Επιπλέον, η χημεία των υλικών αυτών θα πρέπει να είναι προσαρμοσμένη στις ανάγκες γερασμένων και καταπονημένων ιστών. Το 1982 οι Hench και Ethridge κατέστρωσαν τη γενική θεωρία των βιοϋλικών που συνοψίζεται στις παρακάτω προτάσεις: Το ιδανικό εμφύτευμα συμπεριφέρεται σαν να είναι ισοδύναμο με τον ιστό. Αξίωμα 1: Το τμήμα του ιστού που βρίσκεται στη διεπιφάνεια μεταξύ του υλικού και του οστού δεν θα πρέπει να διαφέρει από τον υπόλοιπο ιστό. Αξίωμα 2: Η απόκριση του υλικού στα διάφορα φυσικά ερεθίσματα θα πρέπει να θυμίζει αυτήν του υγιούς ιστού. Τα παραπάνω αξιώματα είναι μεταξύ τους αλληλένδετα και αλληλοεξαρτώμενα. Ένας σταθερός διεπιφανειακός δεσμός μεταξύ ιστού και εμφυτεύματος είναι απαραίτητος για την επίτευξη της ιδανικής απόκρισης στα φυσιολογικά ερεθίσματα. Από την άλλη, ένα ελεγχόμενο ερέθισμα απαιτείται για τη δημιουργία μιας σταθερής διεπιφάνειας. Δηλαδή, ένα οστικό εμφύτευμα θα πρέπει να περικλείει ιδιότητες όπως Βιοχημική συμβατότητα, Μηχανική συμβατότητα και Βιοενεργότητα. Η απαίτηση για Βιοχημική συμβατότητα ικανοποιείται όταν η χημική σύσταση του υλικού περιλαμβάνει στοιχεία μη τοξικά (non toxic) ή λίγο τοξικά (low toxic) για τον ανθρώπινο οργανισμό, ούτως ώστε να μην αναγνωρίζεται σαν ξένο σώμα και προκαλεί ανοσοχημικές αντιδράσεις. Στην περίπτωση των βιοαπορροφούμενων υλικών, τα προϊόντα αποικοδόμησης αυτών θα πρέπει να κυμαίνονται σε συγκεντρώσεις μεταβολικά αποδεκτές. Απαραίτητη προϋπόθεση για να υπάρχει Μηχανική συμβατότητα είναι οι μηχανικές ιδιότητες του υλικού να προσομοιάζουν όσο το δυνατό περισσότερο αυτές του οστού. Οι κυριότερες ομάδες υλικών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοϋλικά είναι οι ακόλουθες [15]: Μέταλλα: Αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σκοπό αυτό λόγω της υψηλής τους μηχανικής αντοχής και ανθεκτικότητας. Ως εμφυτεύματα, τα πιο γνωστά μέταλλα είναι το ανοξείδωτο ατσάλι, το τιτάνιο και τα κράματα αλουμινίου. Το κυριότερο πρόβλημα της χρήσης μετάλλων ως εμφυτεύματα είναι η εμφάνιση αλλεργικών αντιδράσεων λόγω των εμφυτευμάτων. Ακόμη η διάβρωση, όσο μικρή και αν είναι, μπορεί 15

να οδηγήσει σε καταστροφή του εμφυτεύματος ή και πιθανά συμπτώματα δηλητηρίασης από βαρέα μέταλλα. Κεραμικά ή Ύαλοι: Αυτή η κατηγορία υλικών αποτελείται από μη μεταλλικά ανόργανα υλικά τα οποία είναι γενικά σκληρά, δύσκαμπτα και χημικά σταθερά. Ανθίστανται στη διάβρωση καλύτερα από τα μέταλλα. Αντίθετα όμως είναι ψαθυρά και η επεξεργασία τους είναι αρκετά δύσκολη. Πολυμερή: Μπορούν να παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με αυτές ενός οργανισμού. Η απορρόφησή τους από τον οργανισμό γίνεται αρκετά αργά, ενώ μπορούν να προκληθούν αλλεργικές αντιδράσεις από τη διάσπαση και απορρόφησή τους. 1.1.1 Βιοΰαλοι που παράγονται με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης(sol-gel) Το ενδιαφέρον για την επεξεργασία sol-gel ξεκίνησε στα μέσα της δεκαετίας του 1980 με την παρατήρηση ότι η υδρόλυση του tetraethyl orthosilicate (TEOS), σε όξινες συνθήκες, οδήγησε στον σχηματισμό του SiO 2, με τη μορφή ινών και μονολίθων. Η έρευνα της sol-gel είχε γίνει τόσο σημαντικό γεγονός ώστε στη δεκαετία του 1990 πάνω από 35.000 εργασίες είχαν δημοσιευτεί σε παγκόσμιο επίπεδο σχετικά με τη διαδικασία αυτή [16,17,18]. Στο διάλυμα (sol ή solution) εκτελούνται χημικές διεργασίες οι οποίες εξελίσσονται σταδιακά για το σχηματισμό μιας μορφής διφασικού συστήματος που περιέχει μια υγρή και μια στερεά φάση, δηλαδή η μορφολογία του είναι ανάμεσα σε διακριτά σωματίδια και συνεχή δίκτυα πολυμερών [19, 20]. Πρωτογενής ουσίες είναι τα μεταλλικά αλκοξίδια και τα μεταλλικά χλωριούχα άλατα, τα οποία υφίστανται υδρόλυση και αντιδράσεις πολυσυμπύκνωσης για να σχηματίσουν το κολλοειδές. Ο όρος «κολλοειδής» χρησιμοποιείται κυρίως για να περιγράψει το ευρύ φάσμα των υγρών-στερεών (ή και στερεών-υγρών) μειγμάτων, τα οποία περιέχουν διακριτά σωματίδια τα οποία είναι διάσπαρτα σε διάφορες βαθμίδες στο υγρό μέσο. Ο όρος είναι ειδικός για το μέγεθος των μεμονωμένων σωματιδίων, τα οποία έχουν διαστάσεις μεγαλύτερες από αυτές του ατόμου και πολύ μικρές ώστε να παρουσιάζουν την κίνηση Brown. Αν τα σωματίδια είναι αρκετά μεγάλα, τότε η δυναμική συμπεριφορά τους σε οποιαδήποτε δεδομένη χρονική στιγμή που βρίσκονται σε αναστολή θα διέπεται από τις δυνάμεις βαρύτητας και την καθίζηση. Αν, όμως, τα σωματίδια είναι αρκετά μικρά τότε η ακανόνιστη κίνησή τους 16

μπορεί να αποδοθεί στο συλλογικό βομβαρδισμό από μυριάδες θερμικά μόρια μέσα στο υγρό και άρα η κίνησή τους περιγράφεται από τη θεωρία κίνησης Brown. Στην περίπτωση του κολλοειδούς, το κλάσμα του όγκου των σωματιδίων (ή η πυκνότητα των σωματιδίων), μπορεί να είναι τόσο μικρό ώστε μια σημαντική ποσότητα του υγρού μπορεί να χρειαστεί να αφαιρεθεί για να εμφανιστούν οι ιδιότητες της γέλης. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με διάφορους τρόπους. Η απλούστερη μέθοδος είναι να περάσει κάποιο χρονικό διάστημα ώστε να συμβεί ιζηματοποίηση και στη συνέχεια να αδειάσουμε το υπόλοιπο υγρό. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί η φυγοκέντριση για την διαδικασία διαχωρισμού φάσης. Με τον όρο γέλη (gel) ορίζεται ένα τριών διαστάσεων δίκτυο στερεής φάσης, στενά συνδεδεμένης με μία ακίνητη συνεχή υγρή φάση, η οποία είναι εγκλωβισμένη μέσα στη στερεά. Το gel περιέχει πόρους, οι οποίοι έχουν διαστάσεις μικρότερες του μικρομέτρου καθώς και αλυσίδες πολυμερούς των οποίων το μέγεθος κατά μέσο όρο είναι λίγο μεγαλύτερο του μικρομέτρου. Ο όρος gel περιλαμβάνει μια μεγάλη ποικιλία υλικών διαφόρων συνδυασμών τα οποία μπορούν να ταξινομηθούν σε τέσσερις κατηγορίες: α) καλά οργανωμένα παχύρευστα υλικά, β) ομοιόμορφα δίκτυα πολυμερών, που βρίσκονται σε πλήρη αταξία, γ) δίκτυα πολυμερών τα οποία έχουν σχηματιστεί με φυσική συσσώρευση και στα οποία επικρατεί αταξία και δ) συγκεκριμένες δομές σε αταξία. Όταν η υγρή φάση απομακρυνθεί μέσω θερμικής εξάτμισης (η διαδικασία ονομάζεται ξήρανση και εφαρμόζεται στην πρώτη και στην τρίτη μέθοδο) εμφανίζεται μία συρρίκνωση του gel και ο μονόλιθος που σχηματίζεται χαρακτηρίζεται ως ξηρο γέλη (xerogel). Αν η αρχική υγρή φάση είναι κάποια αλκοόλη, ο μονόλιθος που προκύπτει ονομάζεται αλκο γέλη (alcogel). Ο γενικός όρος gel χρησιμοποιείται τόσο για τα xerogel, όσο και για τα alcogel καθώς και για τα aerogel. Ένα gel χαρακτηρίζεται ως ξηρό, όταν το φυσικώς προσροφημένο νερό απομακρυνθεί τελείως. Αυτό παρατηρείται σε θερμοκρασίες μεταξύ 100 180 ο C. Το ξηρό gel εξακολουθεί να περιέχει μεγάλες συγκεντρώσεις χημικώς προσροφημένων υδροξυλίων στην επιφάνεια των πόρων. Θερμική επεξεργασία των gel στους 500 800 ο C απελευθερώνει τα υδροξύλια, με αποτέλεσμα να μειώνεται η γωνία επαφής και η ευαισθησία των gel στις τάσεις ενυδάτωσής τους, δίνοντας έτσι ένα σταθεροποιημένο gel. Η θερμική επεξεργασία των gel σε υψηλές θερμοκρασίες ουσιαστικά μειώνει τον αριθμό των πόρων και την σύνδεση μεταξύ τους λόγω μιας ιξώδους φάσης που εμφανίζεται με την αύξηση της θερμοκρασίας. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται 17

συμπύκνωση. Η πυκνότητα του μονόλιθου αυξάνεται και το κλάσμα όγκου του πορώδους μειώνεται κατά την διάρκεια της θερμικής επεξεργασίας. Το πορώδες gel μετατρέπεται σε ένα πυκνό γυαλί όταν εξαλειφθούν όλοι οι πόροι του. Η πύκνωση ολοκληρώνεται στους 1250 1500 ο C για gel που παρασκευάστηκαν με την πρώτη μέθοδο και περίπου στους 1000 ο C για τα gel που έγιναν με βάση την τρίτη μέθοδο. Καθώς μειώνεται η θερμοκρασία πύκνωσης, μειώνεται και η ακτίνα των πόρων, ενώ το επιφανειακό εμβαδό αυξάνεται. Στο Σχήμα 1 παρουσιάζονται τα στάδια μετατροπής ενός κολλοειδούς διαλύματος σε gel πυριτίου και τελικά σε ύαλο. Σχήμα 1: Αλληλουχία διεργασιών για ύαλο από gel πυριτίου. Οι ύαλοι πυριτίου που παρασκευάζονται με πύκνωση από πορώδη gel πυριτίου είναι άμορφα υλικά και σχεδόν ισοδύναμα στην δομή και την πυκνότητα τους με τα γυαλιά πυριτίου που παράγονται με τήξη κρυστάλλων χαλαζία ή με πύρωση σκόνης SiO 2 που δημιουργήθηκε με χημική εναπόθεση ατμών SiCl 4. Οποιαδήποτε και από τις τρείς μεθόδους παρασκευής μονόλιθων με sol gel διεργασίες και αν εφαρμόσουμε τα κυριότερα στάδιά της είναι [13]: 1) Μηχανική ανάδευση (Mixing): Τα συστατικά αναμιγνύονται σε νερό και/ή αλκοόλη (προαιρετικά) με σκοπό την δημιουργία αιωρημάτων και μάλιστα σε τέτοιο ph, ώστε να εμποδίζεται η ανάπτυξη συσσωματωμάτων (πρώτη μέθοδος). Ακόμη, στο στάδιο αυτό είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν υγρές ενώσεις αλκοξειδίων, ως πρόδρομες ενώσεις των συστατικών του gel (δεύτερη και τρίτη μέθοδος). Για παράδειγμα μπορούν, να χρησιμοποιηθούν αλκοξείδια του τύπου M(OR) n, όπως το Si(OR) 4, με το R να είναι CH 3, 18

CH 3 CH 2 ή C 3 H 7. Τα αλκοξείδια κατά το στάδιο αυτό υδρολύονται με την ανάμιξή τους με το νερό σύμφωνα με την αντίδραση: Μ (OR) n + nh 2 O M (OH) n + nroh Η παραπάνω αντίδραση αποτελεί την πλήρη υδρόλυση του αλκοξειδίου κάτι που είναι δυνατόν να μη συμβαίνει πάντοτε. Η υδρόλυση του αλκοξειδίου είναι φαινόμενο που εξαρτάται από την ποσότητα του νερού και από το περιβάλλον στο οποίο πραγματοποιείται (όξινο βασικό). Συνήθως παρατηρείται μία μερική υδρόλυση, η οποία περιγράφεται από τη σχέση : M (OR) x + yh 2 O M (OH) y (OR) x y + yroh Αμέσως μετά λαμβάνουν χώρα αντιδράσεις συμπύκνωσης η οποίες περιγράφονται από τις σχέσεις : M OR + M OH M OH + M O M + R OH M OH + M OH M O M + H OH καθώς και αντιδράσεις πολυσυμπύκνωσης, όπως: M O M + M OH M O M O M + H OH Οι αντιδράσεις που περιγράφονται παραπάνω οδηγούν στο σχηματισμό ενός συνεχούς δικτύου με δεσμούς μετάλλου και οξυγόνου, ενώ η αλκοόλη ή το νερό που προκύπτει κατά τις αντιδράσεις παραμένει εγκλωβισμένο στους πόρους του δικτύου. Οι αντιδράσεις υδρόλυσης και πολυσυμπύκνωσης ξεκινούν σε διάφορα σημεία του μίγματος που προκύπτει κατά την ανάμιξη του αλκοξειδίου Μ(ΟR) n και του νερού. Όταν έχει δημιουργηθεί ικανοποιητικός αριθμός διασυνδέσεων των δεσμών Μ Ο Μ σε μία περιοχή, τα τμήματα αυτά συμπεριφέρονται ως κολλοειδή σωματίδια με διαστάσεις μικρότερες από μικρόμετρο. Το μέγεθος των κολλοειδών σωματιδίων και η μεταξύ τους σύνδεση επηρεάζεται από: α) τη θερμοκρασία η οποία σχετίζεται με τις σταθερές των αντιδράσεων υδρόλυσης (KH) και συμπύκνωσης (KC), β) το ph στο οποίο 19

πραγματοποιούνται αυτές οι αντιδράσεις, δηλαδή αν είναι όξινο ή βασικό το περιβάλλον. Με βάση πάντα πειραματικά δεδομένα κατέστη γνωστό πως η σταθερά υδρόλυσης παρουσιάζει μία γραμμική συμπεριφορά με την αύξηση των H + σε όξινο περιβάλλον ή των OH σε βασικό, γ) ο τύπος του διαλύτη που χρησιμοποιείται, δ) ο λόγος R = [H 2 O]/[M(OR) n ], που με την αύξησή του οδηγεί σε αύξηση της σταθεράς υδρόλυσης και ε) ο τύπος του αλκοξειδίου, όπου χαρακτηριστικά αναφέρεται πως όσο πιο συμπαγές και πολύπλοκο είναι το μόριο αυτού τόσο πιο αργή είναι η σταθερά της αντίδρασης. 2) Μορφοποίηση (Casting): Από τη στιγμή που έχουν ολοκληρωθεί οι αντιδράσεις των συστατικών, το sol που έχει ως κύριο χαρακτηριστικό το χαμηλό ιξώδες, μεταφέρεται σε συγκεκριμένα καλούπια. Το υλικό από το οποίο είναι κατασκευασμένα τα καλούπια πρέπει να είναι τέτοιο ώστε να αποφεύγεται η προσκόλληση του gel. 3) Σχηματισμός Gel (Gelation): Το sol βρισκόμενο μέσα στο καλούπι και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος αρχίζει και παρουσιάζει αύξηση του ιξώδους του και της πυκνότητάς του λαμβάνοντας το σχήμα του καλουπιού. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου σχηματίζεται ένα τρισδιάστατο δίκτυο, λόγω της σύνδεσης των κολλοειδών σωματιδίων. 4) Γήρανση (Ageing): Κατά το στάδιο της γήρανσης, το gel πρέπει να παραμείνει βυθισμένο στο υγρό, για μια περίοδο που μπορεί να κρατήσει από μερικές ώρες μέχρι μερικές μέρες. Κατά το στάδιο αυτό συνεχίζεται η πολυσυμπύκνωση, με αύξηση του μεγέθους των σωματιδίων, ενώ παρατηρείται μείωση του πορώδους και περαιτέρω μείωση του ιξώδους. Η γήρανση συμβάλλει στην αύξηση της ισχύος του gel, κάτι που είναι πολύ σημαντικό για να αποφευχθεί η διάσπασή του κατά την ξήρανση. 5) Ξήρανση (Drying): Είναι το στάδιο στο οποίο απομακρύνονται τα υγρά που έχουν παραμείνει στο δίκτυό του και είναι το πιο κρίσιμο στάδιο όσον αφορά το αν επιθυμείται να ληφθεί σκόνη ή συμπαγές υλικό. Χαρακτηριστικό του σταδίου αυτού είναι η ανάπτυξη μεγάλων τριχοειδών τάσεων κατά τη διάρκειά του, όταν το μέγεθος των πόρων είναι μικρό (< 20nm). Οι τάσεις αυτές μπορούν να οδηγήσουν σε διάσπαση του gel και για τον λόγο αυτό είναι σημαντικό το στάδιο της ξήρανσης να ελέγχεται μειώνοντας την επιφανειακή ενέργεια του υγρού, είτε με την χρησιμοποίηση απορρυπαντικών, είτε εφαρμόζοντας υπερκρίσιμη εξάτμιση. 6) Σταθεροποίηση (Chemical Stabilization): Πραγματοποιείται με τη θέρμανση του υλικού σε διάφορες θερμοκρασίες και έχει ως αποτέλεσμα την απομάκρυνση των δεσμών Μi OH από την επιφάνεια του υλικού, κάτι που οδηγεί σε ένα χημικά σταθερότερο υλικό. 20

7) Πύκνωση (Densification): Αποτελεί ένα στάδιο προαιρετικό ανάλογα με το επιθυμητό αποτέλεσμα. Κατά το στάδιο αυτό παρατηρείται εξάλειψη των πόρων του υλικού και αύξηση της πυκνότητας σε βαθμό τέτοιο που το υλικό που προκύπτει να είναι τόσο πυκνό όσο ο τηγμένος χαλαζίας. Η θερμοκρασία πύκνωσης εξαρτάται από το επιθυμητό μέγεθος του δικτύου των πόρων, τον βαθμό της μεταξύ τους σύνδεσης καθώς και από το επιφανειακό εμβαδό. 1.2 Έλεγχος βιοενεργότητας Η ιδιότητα που διακρίνει ένα υλικό για να θεωρηθεί βιοϋλικό είναι η βιοενεργότητα. Η ιδιότητα αυτή όπως έχουμε αναφέρει δίνει τη δυνατότητα στα βιοϋλικά να δημιουργούν κάτω από ορισμένες συνθήκες δεσμούς με τους ιστούς, αναπτύσσοντας στη διεπιφάνεια επαφής μεταξύ του ιστού και του εμφυτεύματος ένα στρώμα βιολογικού υδροξυαπατίτη (HCAp) [21]. Η ιδιότητα αυτή συμβάλλει στη δημιουργία ευνοϊκού περιβάλλοντος για οστεογένεση δηλαδή, ανάπτυξη οστού. Ο υδροξυαπατίτης προσομοιάζει το ανόργανο τμήμα του οστού και όταν αναπτύσσεται επάνω στο γυαλί, λαμβάνουν χώρα αντιδράσεις τις οποίες ο οργανισμός αντιλαμβάνεται ως μηνύματα για εκκίνηση οστεογένεσης. Μεταξύ των βιοενεργών υλικών υπάρχει διαφορά όχι μόνο ως προς το μηχανισμό και τη χρονική εξάρτηση της δημιουργίας δεσμού με το οστό, αλλά και ως προς την ισχύ και το πάχος του δεσμού αυτού. Οι διαφορές αυτές εξαρτώνται από τη σύσταση και τη μικροδομή του υλικού [22,23]. Ο ρυθμός ανάπτυξης του διεπιφανειακού δεσμού ορίζεται ως επίπεδο βιοενεργότητας, το οποίο αντανακλά το χρόνο που απαιτείται ώστε να γίνει η σύνδεση με τον ιστό σε βαθμό μεγαλύτερο από το ήμισυ της επιφάνειάς του. Έτσι, το επίπεδο βιοενεργότητας ενός συγκεκριμένου υλικού σχετίζεται με το χρόνο που απαιτείται για να συνδεθεί περισσότερο από το 50% της διεπιφάνειας του εμφυτεύματος με το οστό (t 0.5bb ), σύμφωνα με τη σχέση: I B 100 t 0.5bb Τα υλικά που παρουσιάζουν μια τιμή του I B μεγαλύτερη από 8, π.χ. το 45S5 Bioglass, μπορούν να συνδεθούν και με μαλακό και σκληρό ιστό. Τα υλικά με τιμή του I B μικρότερη από 8 αλλά μεγαλύτερη από 0, π.χ. ο συνθετικός υδροξυαπατίτης, συνδέεται μόνο με σκληρό ιστό [24]. 21

Ουσιαστικά όλες οι in vitro και in vivo μελέτες οδηγούν στο συμπέρασμα ότι το μόνο κοινό χαρακτηριστικό μεταξύ των βιοενεργών υλικών είναι η ανάπτυξη στρώματος υδροξυαπατίτη στην επιφάνειά τους [22]. 1.2.1 Ανάπτυξη απατίτη in vitro Η βιοενεργότητα ενός βιοϋλικού μπορεί να ελεγχθεί είτε in vivo με τη βοήθεια πειραματόζωων, είτε in vitro με τη βοήθεια Διαλυμάτων Προσομοίωσης των Βιολογικών Υγρών (Simulated Body Fluids SBF), τα οποία έχουν συγκέντρωση ιόντων σχεδόν ίση με τη συγκέντρωση των ιόντων του πλάσματος του αίματος. Κατά καιρούς προτάθηκαν αρκετές διαφοροποιήσεις του αρχικού SBF, αλλά αυτό που κατοχυρώθηκε από την Τεχνική Επιτροπή ISO/TC150 της Διεθνούς Οργάνωσης Τυποποίησης το 2003 είναι το c- SBF (conventional SBF) [25]. Η τοποθέτηση ενός υλικού στο SBF ή/και κάθε υγρό προσομοίωσης γίνεται με σκοπό τη μελέτη της αλληλεπίδρασης της επιφάνειας του με τα ιόντα του υγρού. Στην περίπτωση των βιοϋάλων μελετάται η ανάπτυξη ή μη του απατίτη, ο χρόνος έναρξης δημιουργίας αυτού και ο ρυθμός ανάπτυξής του (βαθμός βιοενεργότητας). Ένα κοινό χαρακτηριστικό των βιοενεργών υλικών είναι η χρονικά εξαρτώμενη διαφοροποίηση της επιφάνειάς τους μετά την εμφύτευση. Καθώς γίνεται η πρόσδεση με το οστό μια αλληλουχία 11 αντιδράσεων λαμβάνουν χώρα στην επιφάνεια του βιογυαλιού. Τα πρώτα 5 στάδια (ανάπτυξη in vitro) συμβαίνουν στην πλευρά που βρίσκεται το υλικό και δεν εξαρτώνται από την παρουσία ιστού, ενώ καταλήγουν στην ανάπτυξη κρυσταλλικού υδροξυκαρβονικού απατίτη (HCAp) στην επιφάνεια του γυαλιού. Στην πραγματικότητα, η πλήρωση των 5 αυτών σταδίων αποτελεί ικανή και αναγκαία συνθήκη για να χαρακτηριστεί ένα γυαλί ως βιοΰαλος. [22]. Τα στάδια και οι μηχανισμοί για τη δημιουργία υδροξυαπατίτη στην επιφάνεια βιοενεργών υάλων sol-gel είναι τα παρακάτω: Στάδιο 1: Ταχεία ανταλλαγή Na - ή K + της επιφάνειας με H + ή H 3 O + από το διάλυμα. Στο στάδιο αυτό συμβαίνει διάχυση των ιόντων από το κυρίως διάλυμα στην επιφάνεια του υλικού, Si-O-Na + + H + + OH - Si-OH + Na + (διάλυμα) + OH - 22

Στάδιο 2: Η απώλεια ιόντων Na - ή K + της επιφάνειας προκαλεί τοπική χαλάρωση του δικτύου που δημιουργούν οι δεσμοί Si-O-Si με αποτέλεσμα τη δημιουργία μονάδων Si(OH) 4 που ονομάζονται σιλανόλες, στη διεπιφάνεια της υάλου με το βιολογικό υγρό. Η επιφάνεια αποκτά ζελατινώδη υφή (silica gel) και υψηλό πορώδες με ειδική επιφάνεια της τάξης των 100m 2 και διάμετρο πόρων της τάξης των 30 50A. Το στάδιο αυτό ελέγχεται από την αντίδραση, Si-O-Si + H 2 O Si-OH - + - OH-Si Στάδιο 3: Συμπύκνωση και πολυμερισμός των σιλανολών με αποτέλεσμα τη δημιουργία νέου στρώματος πλούσιου σε SiO 2, Στάδιο 4: Κίνηση ιόντων Ca 2+ 3- και ομάδων PO 4 προς την επιφάνεια μέσω του στρώματος SiO - 2 και δημιουργία στρώματος πλούσιου σε CaΟ-P 2 O 5 στην επιφάνεια της υάλου. Ακολουθεί δημιουργία άμορφου στρώματος CaΟ-P 2 O 5 με την ενσωμάτωση ιόντων ασβεστίου και φωσφορικών από το διάλυμα. Στάδιο 5: Εισαγωγή ιόντων OH -, CO 2- ή F στο στρώμα CaΟ-P 2 O 5 με αποτέλεσμα αυτό να περνάει από την άμορφη στην κρυσταλλική φάση σχηματίζοντας φθοροαπατίτη ή υδροξυαπατίτη. Παράλληλα, ινίδια κολλαγόνου προσκολλώνται στην επιφάνεια των βιοενεργών υάλων, οπότε η ανάπτυξη των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη ταυτόχρονα και την βιοενεργή ύαλο, προσφέρει μια σταθερή διεπιφάνεια σύνδεσης με τους ζωντανούς ιστούς. 1.2.2 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη απατίτη Mε βάση πειραματικά αποτελέσματα οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη απατίτη στα γυαλιά είναι [26]: 23

Το υγρό προσομοίωσης που χρησιμοποιείται για την τοποθέτηση των υλικών. Το c- SBF παρουσιάζει μια σταθερότητα της τάξης των 60 ημερών σε αντίθεση με άλλα υγρά προσομοίωσης του πλάσματος αίματος που δημιουργούν συσσωματώματα Το πορώδες και η επιφάνεια των υλικών. Για την επιφάνεια, σύμφωνα με έρευνες [27], υπάρχει το κατώτερο όριο των 80m 2 /gr. Όσον αφορά στο πορώδες, η σημαντικότητά του έγκειται στο γεγονός της ανάπτυξης του απατίτη και μέσα στους πόρους του εκάστοτε υλικού. Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα γυαλιών πυριτίου της ίδιας σύστασης με ή χωρίς πορώδες. Στα πρώτα κατέστη δυνατή η ανάπτυξη απατίτη ενώ στα μη πορώδη γυαλιά δεν υπήρξε ανάπτυξη απατίτη [24]. Οι μεταβολές που υφίσταται η επιφάνεια των γυαλιών μέσα στο SBF. Οι αντιδράσεις οι οποίες πραγματοποιούνται στην επιφάνεια γυαλιών πυριτίου ή τιτανίου οδηγούν στην ανάπτυξη αρνητικού φορτίου ενώ σε γυαλιά αλουμίνας στην ανάπτυξη θετικού φορτίου. Για τα δύο πρώτα γυαλιά έχει αποδειχθεί η βιοενεργότητά τους ενώ της αλουμίνας δεν έχει αποδειχθεί. Οι ομάδες OH - που υπάρχουν στο γυαλί και κυρίως οι ομάδες Si-OH. Πιστεύεται πως αποτελούν κέντρα πυρηνοποίησης και προσέλκυσης των ατόμων Ca/P. Ακόμη όμως δεν είναι ξεκάθαρο κατά πόσο η αύξηση ή μείωση του αριθμού τους στο γυαλί σχετίζεται με το ρυθμό ανάπτυξης του απατίτη. Τέλος, άλλες παράμετροι όπως πιθανές ατέλειες στο γυαλί, θεωρείται πως παίζουν ρόλο. Για την ανάπτυξη των στρωμάτων Si και Ca-P στην επιφάνεια των βιοενεργών υάλων, ιδιαίτερη σημασία έχει η σύνθεση της υάλου και ειδικότερα η περιεκτικότητα της σε συγκεκριμένες αναλογίες SiO 2 και P 2 O 5. Έχει βρεθεί ότι όσο λιγότερη η περιεκτικότητα του SiO 2 στη σύνθεση της υάλου, τόσο αυξάνεται ο ρυθμός ανάπτυξης υδροξυαπατίτη στην επιφάνεια της. Ταυτόχρονα όμως, αυξημένος ρυθμός σύνδεσης σημαίνει αυξανόμενη διαλυτότητα. Η διαλυτότητα ενός βιοϋλικού είναι επιθυμητή όταν αυτή περιορίζεται στην επιφάνεια και δεν εισέρχεται στην κυρίως μάζα του υλικού. Τα αποτελέσματα των μελετών έχουν δείξει ότι τα στρώματα Ca-P και SiO 2 σχηματίζονται με μεγαλύτερη ταχύτητα σε υάλους με τη λιγότερη περιεκτικότητα σε SiO 2 [28]. 24

25

Η απόδειξη της ανάπτυξης του απατίτη σε υλικά πραγματοποιείται με τη χρήση της μικροσκοπίας (διερχόμενης, TEM και σάρωσης, SEM δέσμης), με ακτινογραφήματα περίθλασης ακτίνων Χ (XRD), φάσματα υπερύθρου (FTIR) κ.λπ. Η ύπαρξη πληθώρας τεχνικών μελέτης επιφανείας και εσωτερικού των δειγμάτων έχει συνεισφέρει αποφασιστικά στην αποδοχή και απόρριψη, συστάσεων, υλικών και τεχνικών προετοιμασίας. 2.1 Φασματοσκοπία υπερύθρου (FTIR) Η απορρόφηση ακτινοβολίας στην περιοχή του υπερύθρου ( 15000-20cm -1 ) προκαλεί διεγέρσεις μεταξύ διάφορων ενεργειακών σταθμών δονήσεως και περιστροφής του μορίου, ενώ το μόριο παραμένει στη θεμελιώδη ηλεκτρονική κατάσταση. Ένα μόριο απορροφά υπέρυθρη ακτινοβολία, ωστόσο, μόνο στην περίπτωση όπου παρατηρείται μεταβολή στη διπολική ροπή του κατά τη διάρκεια της δόνησης, ειδάλλως η δόνηση χαρακτηρίζεται ως ανενεργή στο υπέρυθρο. Ο θεωρητικός αριθμός των δονήσεων εξαρτάται από τον αριθμό ατόμων και τη γεωμετρία του μορίου. Ένα μη γραμμικό μόριο Ν ατόμων έχει τη δυνατότητα 3Ν-6 δονήσεων, ενώ ένα γραμμικό Ν ατόμων έχει τη δυνατότητα 3Ν-5 δονήσεων. Στην πράξη, όμως, ο αριθμός των παρατηρούμενων ταινιών στο φάσμα υπερύθρου διαφέρει από το θεωρητικό λόγω μιας σειράς παραγόντων. Οι δονήσεις διακρίνονται σε δονήσεις τάσεως ή εκτατικές (stretching vibrations) και δονήσεις κάμψεως (bending vibrations). Στις δονήσεις τάσεως, ν, η δόνηση γίνεται κατά μήκος του χημικού δεσμού που συνδέει τα δονούμενα άτομα και αλλάζει η μεταξύ τους απόσταση. Η δόνηση μπορεί να είναι συμμετρική, όπου συμπίπτουν τα κέντρα θετικού και αρνητικού φορτίου σε κάθε δονητική θέση, ή ασύμμετρη. Στις δονήσεις κάμψεως, δ, μεταβάλλεται η γωνία μεταξύ δύο δεσμών και η δόνηση μπορεί να είναι ψαλιδοειδής, λικνιζόμενη, παλλόμενη ή συστρεφόμενη. Οι συχνότητες των δονήσεων εξαρτώνται από τις μάζες των δονούμενων ατόμων και την ισχύ του δεσμού, ενώ επηρεάζονται σε μικρό βαθμό από άλλα άτομα που συνδέονται μαζί τους. Η μελέτη της δομής μιας χημικής ένωσης γίνεται μέσω της μελέτης του φάσματός του. Το φάσμα υπερύθρου μπορεί να χωριστεί σε επιμέρους περιοχές βάσει των ατόμων ή των ομάδων των οποίων οι δονήσεις προκαλούν την απορρόφηση στις περιοχές αυτές. 26

Ανάλογα με τις κορυφές που εμφανίζονται στο φάσμα γίνεται η αντιστοίχιση των ομάδων των ατόμων που απαρτίζουν το μόριο. Η φασματοσκοπία IR μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για τη δομή και τη σύνθεση των βιολογικών υλικών βάσει των μεταβολών στις εντάσεις των δονήσεων των δεσμών των μορίων τους. Παρέχει τη δυνατότητα μελέτης μεγάλου εύρους δειγμάτων από πρωτεϊνικά διαλύματα και κρυστάλλους μέχρι ολόκληρα βακτήρια και από κυψελίδες (vesicles) λιπιδίων μέχρι περιοχές ιστών. Συνηθέστερες ταινίες απορρόφησης που εμφανίζονται στα βιολογικά υλικά είναι: η ταινία «αμιδίου Ι» στα 1650cm -1, που προκαλείται από τις δονήσεις τάσεως ν(c=o) των πρωτεϊνικών αμιδικών δεσμών, η ταινία «αμιδίου ΙΙ» στα 1549 cm-1, που είναι αποτέλεσμα των δονήσεων κάμψεως δ(n-h) και τάσεως ν(c-n) των αμιδικών δεσμών, η ν(c=o) των λιπιδίων στα 1740cm -1 και η ασύμμετρη ν as (PO - 2 ) των νουκλεϊκών οξέων και των φωσφολιπιδίων στα 1225cm -1. Μία πληθώρα ταινιών απορρόφησης, επίσης, παρατηρείται σε φάσματα που είναι χαρακτηριστικά κάποιου συγκεκριμένου υλικού ή ιστού. Για πιο πολύπλοκα συστήματα, όπως επί παραδείγματι περιοχές ιστών, η φασματική πληροφόρηση που αποκτάται είναι σε μεγάλο βαθμό μία χονδρική προσέγγιση του δείγματος, που ενδεχομένως περιλαμβάνει πολλές επιμέρους δομές και κυτταρικούς τύπους. Ωστόσο, επειδή -όπως έχει ήδη αναφερθεί και ανωτέρω- είναι πολύ σημαντική η μελέτη τέτοιων δειγμάτων για την κατανόηση της δομής και των λειτουργιών των οργανισμών, καταβάλλονται προσπάθειες για βελτιώσεις στην ακρίβεια προσέγγισης διακριτών μικρών περιοχών από τους ιστούς. Πρόσφατες εξελίξεις στα εργαστήρια εκπομπής σωματιδίων υψηλής ενέργειας έχουν δείξει ότι καθίσταται δυνατή η μελέτη βιολογικών δειγμάτων διαστάσεων λίγων μικρομέτρων με εστιασμένη δέσμη IR 100 φορές πιο έντονη και μικρότερο σήμα θορύβου απ ότι έδιναν οι συμβατικές πηγές [29]. Η φασματοσκοπία FTIR πλεονεκτεί έναντι άλλων μεθόδων στη μελέτη της ποιοτικής και την ποσοτικής μεταβολής στην ανόργανη φάση. Δύναται να ανιχνεύει και να ποσοτικοποιεί τις μεταβολές στη σύνθεση του απατίτη καθώς και τις μεταβολές στην κρυσταλλικότητα του, με την μελέτη της μορφής των κορυφών που αναδεικνύονται και αποδίδονται στις ανθρακικές (CO 3 ) και στις φωσφορικές (PO 4 ) ομάδες του μορίου. Το FTIR μπορεί να διακρίνει την ύπαρξη απατίτη, που προέρχεται ιδιαιτέρως από τη διάσπαση P-O, στην περιοχή του μεσαίου υπερύθρου (MIR), στα 1030cm -1 (ισχυρή), 1100cm -1 ( shoulder ) και από την κάμψη μιας διπλής κορυφής στα 610cm -1 και 566cm -1. 27

2.1.1 Διαπερατότητας (Transmittance) Με αυτή τη μέθοδο μετράται η διερχόμενη από το δείγμα ακτινοβολία και τα αποτελέσματα εκφράζονται σαν Transmittance ή Absorbance (A= -log T ). Στην περίπτωση αυτή, προκειμένου να μετρηθεί η διερχόμενη ακτινοβολία ή το δείγμα πρέπει να είναι πολύ λεπτό ή ελάχιστη ποσότητα του υλικού να αναμιχθεί (σε πολύ μικρή αναλογία, ~1%) με κάποια μη απορροφούσα στη φασματική περιοχή που μας ενδιαφέρει ουσία πχ. KBr για την περιοχή 5000-400cm -1 ή CsΙ για την περιοχή 4000-200cm -1. 2.1.2 Ανακλαστικότητας (Specular Reflectance) Με αυτή την τεχνική μετράται η ανακλώμενη από την επιφάνεια του δοκιμίου ακτινοβολία και τα αποτελέσματα εκφράζονται σαν % ανακλαστικότητα (Reflectance). Στην περίπτωση αυτή, προκειμένου να μετρηθεί η ανακλώμενη ακτινοβολία, το δείγμα δεν χρειάζεται κάποια επεξεργασία, η ποιότητα όμως της επιφάνειας (roughness) επηρεάζει σημαντικά την ένταση της ανακλαστικότητας και το λόγο σήματος προς θόρυβο (S/N) του φάσματος. Η μέθοδος της ανακλαστικότητας πλεονεκτεί σε σχέση με αυτή της απορρόφησης, μια και επιτρέπει τον ακριβέστερο προσδιορισμό και ταυτοποίηση πολλών συνυπαρχόντων φάσεων. Επιπλέον ένα ακόμα πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι το γεγονός, πως πρόκειται για μια μη καταστροφική μέθοδο για το δείγμα [24]. 2.1.3 Περιγραφή της πειραματικής διάταξης Ένα φασματοσκόπιο υπερύθρου αποτελείται από μια πηγή υπέρυθρης ακτινοβολίας, ένα μονοχρωμάτορα για να διαχωρίζει τις διάφορες συχνότητες, το χώρο για την τοποθέτηση του δείγματος και τον ανιχνευτή. Με την εφαρμογή της τεχνολογίας και του μαθηματικού μοντέλου των μετασχηματισμών Fourier, ο μονοχρωμάτορας αντικαθίσταται. Τότε, με τη βοήθεια του κατάλληλου λογισμικού, η υπέρυθρη ακτινοβολία, αφού περάσει μέσα από το δείγμα, αναλύεται μέσω ενός ιντερφερομέτρου σάρωσης (scanning interferometer). Αυτό αποτελείται από ένα ακίνητο και ένα κινητό κάτοπτρο, 3 και 4, αντίστοιχα και ένα διαχωριστή ακτινοβολίας C. Όλα τα παραπάνω παρουσιάζονται στο παρακάτω σχήμα: 28

Σχήμα 2.1: Σχηματική εικόνα ενός τυπικού φασματοφωτομέτρου FT-IR με λειτουργία μετασχηματισμών Fourier και διάταξη των πηγών, κατόπτρων και ανιχνευτή. 2.2 Περίθλαση Ακτίνων-Χ (XRD) Η φασματοσκοπία ακτίνων Χ αποτελεί μια σύγχρονη αξιόπιστη τεχνική που βρίσκει σημαντικές επιστημονικές εφαρμογές στο χώρο της επιστήμης της συντήρησης έργων τέχνης και της αρχαιομετρίας. Οι φασματοσκοπικές τεχνικές που εκμεταλλεύονται τις αλληλεπιδράσεις των ακτίνων-χ με την ύλη, όπως την περίθλαση, την απορρόφηση και την εκπομπή χαρακτηριστικής ακτινοβολίας, αποτελούν κύριο εργαλείο για τους ερευνητές της δομής των υλικών. Η τεχνική της περίθλασης ακτίνων-χ προσφέρει τη δυνατότητα να γίνει χαρακτηρισμός των κρυσταλλικών υλικών, όπως μετάλλων, κεραμικών, ορυκτών, πολυμερών, πλαστικών, ανόργανων ή οργανικών ενώσεων. Πρόκειται για ένα ανεκτίμητο ερευνητικό εργαλείο για την μελέτη της κρυσταλλικής δομής των υλικών. Είναι δυνατή η επακριβής μέτρηση των αποστάσεων των ατόμων στο κρυσταλλικό πλέγμα, καθώς και ο προσδιορισμός της πλεγματικής δομής σύνθετων κρυστάλλων αυξημένης δομικής πολυπλοκότητα. Επιπλέον, δύναται να χρησιμοποιηθεί για προσδιορισμό των επιμέρους φάσεων του δείγματος, από τις πρώτες ύλες μέχρι το τελικό προϊόν, και να παρέχει πληροφορίες για τη φυσική κατάσταση του υλικού, όπως το μέγεθος κόκκων, την υφή κ.ά. 29

Καταλυτικό ρόλο για τη χρησιμοποίησή του στην επιστήμη της συντήρησης παίζει το γεγονός πως εντάσσεται στις μη καταστρεπτικές μεθόδους, δίνει γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί επιτόπου, in situ. Μετρήσεις μπορούν να ληφθούν από κρυστάλλους μερικών μικρομέτρων μέχρι σύνολα από κρυστάλλους, παρόλο που το μέγεθος της περιοχής του δείγματος που θα εξετασθεί σπάνια υπερβαίνει το 1cm 2 [30]. Οι κορυφές ενός φάσματος XRD χαρακτηρίζονται από καθορισμένη θέση σε αυτό, χαρακτηριστική ένταση ανάλογα το υλικό και διαφορετικό σχήμα. Οι εντάσεις των κορυφών σχετίζονται με τον τύπο των ατόμων, τη διευθέτηση τους στον κρύσταλλο και μπορούν επίσης να ποσοτικοποιηθούν και να δώσουν ακριβείς πληροφορίες για το υλικό. Το σχήμα των κορυφών στο φάσμα είναι μια ένδειξη της τελειότητας ενός κρυστάλλου. Σχήμα 2.2: Σχεδιάγραμμα μιας Coolidge συσκευή παραγωγής ακτίνων χ. Η πιο ευρέως διαδεδομένη τεχνική χαρακτηρισμού υλικών με περίθλαση ακτίνων- Χ είναι η Powder XRD. Όπως αντιλαμβανόμαστε από την ονομασία, το δείγμα είναι συνήθως σε μορφή σκόνης, αποτελούμενο από λεπτούς κόκκους ενός μονοκρυσταλλικού υλικού. Ο όρος σκόνη στην πραγματικότητα σημαίνει ότι οι κόκκοι είναι τυχαία προσανατολισμένοι στο δείγμα, με αποτέλεσμα τα περιθλώμενα κύματα να δημιουργούν ένα μέγιστο (κορυφή) συμβολής συμμετρικό της κατανομής των ατόμων. Οι θέσεις και οι εντάσεις των μεγίστων χρησιμοποιούνται στην αναγνώριση της δομής (ή φάσης) του υλικού. Για παράδειγμα, οι γραμμές περίθλασης του γραφίτη θα είναι διαφορετικές από αυτές του διαμαντιού, παρόλο που και τα δύο αποτελούνται από άτομα άνθρακα. Κάποια από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι η γρήγορη ταυτοποίηση των υλικών, η εύκολη προετοιμασία των δειγμάτων και η μεγάλη βιβλιοθήκη των γνωστών κρυσταλλικών υλικών. 30

Οι μετρήσεις XRD πραγματοποιήθηκαν στο τμήμα Γεωλογίας του ΑΠΘ με χρήση περιθλασίμετρου τύπου PHILIPS (PW1710), εξοπλισμένο με λυχνία Cu και φίλτρο Νi για τη λήψη CuKα ακτινοβολίας, ενώ η περιοχή σάρωσης γωνίας 2θ ήταν 5-85, το βήμα 0,05 ο και η ταχύτητα σάρωσης 0,01 o 2θ/sec. Τα δείγματα που μετρήθηκαν με την περίθλαση ακτίνων-χ μελετήθηκαν υπό μορφή σκόνης. Σχήμα 2.3: Περιθλασίμετρο τύπου PHILIPS (PW1710) 2.3. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM-EDS) Η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης είναι μία από τις σύγχρονες και ευέλικτες μεθόδους με πολλαπλές χρήσεις αφού προσφέρει τη δυνατότητα για τη τοπογραφική και μορφολογική μελέτη καθώς και τον προσδιορισμό της σύστασης της ύλης. Η αρχή λειτουργίας της μικροσκοπίας σάρωσης βασίζεται στη χρήση ενός διερευνητή αισθητήρα (probe), ο οποίος καλείται με κάποια φυσική διεργασία να διεγείρει την κατάλληλη πληροφορία από κάθε στοιχείο της επιφάνειας και ακολούθως ο αρμόδιος ανιχνευτής καταγραφέας να τη συλλέξει. Στην περίπτωση της Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM) ο διερευνητής αισθητήρας είναι μια δέσμη ηλεκτρονίων και ο ανιχνευτής συλλέγει τα προϊόντα της αλληλεπίδρασης της δέσμης με την επιφάνεια. Έτσι το SEM δίνει πληροφορίες που αφορούν τη μορφολογία της επιφάνειας, χρησιμοποιώντας τα δευτερεύοντα ηλεκτρόνια που απελευθερώνονται από την 31

επιφάνεια του δείγματος, και για τη σύσταση της επιφάνειας, χρησιμοποιώντας τα οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια, ηλεκτρόνια της προσπίπτουσας δέσμης που σκεδάζονται ελαστικά και διαφεύγουν από την επιφάνεια του δείγματος. Ακόμη, εφαρμόζοντας ένα σύστημα ανίχνευσης της διασποράς των ενεργειών των ακτίνων-χ (EDS) που προκύπτουν από την επίδραση της προσπίπτουσας δέσμης στην επιφάνεια του υλικού, μπορεί να γίνει στοιχειoμετρική ανάλυση του υπό μελέτη δείγματος. Στο μικροσκόπιο SEM υπάρχουν δυο διακριτά θεμελιώδη τμήματα: 1. Το τμήμα της ηλεκτρονικής στήλης και 2. Το τμήμα ελέγχου, επεξεργασίας και απεικόνισης των σημάτων. Ρυθμίζει τη σάρωση της επιφάνειας και την εμφάνιση της τελικής πληροφορίας. Η ηλεκτρονική Μικροσκοπία σαρωτικής δέσμης αποτελεί μια σπουδαία τεχνική για τη μελέτη της επιφάνειας της ύλης και χρησιμοποιείται ευρύτατα για τη μελέτη της μορφολογίας και της σύσταση ενός υλικού. Συνδυάζει μεγάλη μεγέθυνση και μεγάλο βάθος πεδίου, παράγοντες πολύ περιορισμένους στην οπτική μικροσκοπία. Η εικόνα σχηματίζεται από ηλεκτρικό σήμα χωρίς τη χρήση μεγεθυντικών φακών, και έτσι αποφεύγονται τα σφάλματα των φακών. Η μεγάλη δυνατότητα εστίασης, η ελάχιστη προετοιμασία του δείγματος και τα διαγράμματα σύστασης, όπως η χημική πληροφορία κατά μήκος μιας γραμμής (on-line analysis) και η χημική χαρτογράφηση (mapping), που μας προσφέρει το SEM, το καθιστούν ένα απαραίτητο όργανο έρευνας [31]. Το μειονέκτημα του SEM είναι η μικρή διακριτική ικανότητα λόγω μη σχηματισμού δέσμης πολύ μικρής διαμέτρου. Τα σύγχρονα όργανα διαθέτουν κατάλληλους ανιχνευτές και εκμεταλλεύονται όλους τους μηχανισμούς αλληλεπίδρασης προσπίπτουσας δέσμης και δείγματος για εξαγωγή ποιοτικών και ποσοτικών συμπερασμάτων. Σήμερα, το SEM χρησιμοποιείται για τη μελέτη μιας μεγάλης ποικιλίας υλικών όπως π.χ. βιολογικά, μεμβράνες, φίλτρα, ίνες, ρητίνες, χώματα, μεταλλικές επιφάνειες, αρχαιολογικά, ορυκτά και άλλα. 32

33

3.1 Μέθοδος παρασκευής βιοϋάλου κολλοειδούς γέλης (58S) Το σύστημα που επιλέχτηκε για τη μελέτη μας είναι η βιοΰαλος 58S (SiO 2 -CaO- P 2 O 5 ) είναι γνωστό για το υψηλό επίπεδο βιοδραστικότητας [32]. Η σύνθεση του είναι 60 mol%, SiO 2, 36 mol% CaO και 4 mol% P 2 O 5, η οποία γίνεται με τη μέθοδο sol-gel και παρασκευάζεται όπως παρουσιάζεται σχηματικά στο διάγραμμα 3.1 και συνεπάγεται την υδρόλυση των πρόδρομων αλκοξειδίων, ώστε να δημιουργήσει μια κολλοειδή γέλη. Sol: TEOS + H 2O + HNO 3, TEP, Ca(NO 3) 2 Μηχανική Ανάδευση Έκχυση σε δοχείο και γελοποίηση Γήρανση στους 60 C Ξήρανση στους 90-130 C Σταθεροποίηση στους 400 700 C Διάγραμμα 3.1: Σχηματικό Διάγραμμα της διαδικασίας παρασκευής ενός sol-gel γυαλιού Ως βάση των πυριτικών βιοενεργών υάλων μπορεί να είναι πυριτικό αλκοξείδιο, τετρααιθυλιούχα ορθοπυριτία (orthosilicate), TEOS ή/και παρόμοια. Όμως το TEOS, που χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία, είναι αδιάλυτο στο νερό και έτσι η αντίδραση υδρόλυσης απαιτεί καταλύτη, συνήθως όξινο. Τα υπόλοιπα συστατικά εκτός από διοξείδιο του πυριτίου που απαιτούνται για τη σύνθεση της υάλου 58S, προστίθενται στη γέλη είτε ως άλλα αλκοξείδια (TEP) είτε ως άλατα (Ca(NO 3 ) 2 ) [33]. Οι sol-gel ύαλοι θεωρούνται πυριτικά μείγματα που μπορούν να υποστούν πολυσυμπύκνωση. Η αντίδραση πολυσυμπύκνωσης δημιουργεί τη βάση του πυριτικού δικτύου. Το ιξώδες του sol αυξάνεται καθώς σχηματίζεται ο δεσμός Si-O-Si και τελικά (συνήθως μέσα σε 3 ώρες), δημιουργεί μια γέλη με νερό και αιθανόλη, υποπροϊόντα της αντίδρασης συμπύκνωσης [33]. 34

Για την παρασκευή 25gr βιοϋάλου κολλοειδούς γέλης (58S) αναμιγνύονται 13.2ml τετρααιθυλοξυσιλάνιο (tetraethyoxysilane - TEOS), 1.6ml νιτρικό οξύ, το οποίο προστίθεται για να επιταχύνει την αντίδραση της υδρόλυσης του TEOS, 0.7ml triethyl phosphate [TEP] και 5.8gr ένυδρο νιτρικό ασβέστιο [Ca(N0 3 ) 2 4H 2 0], σε 9.5ml δισαπεσταγμένου H 2 O. Μετά την προσθήκη του κάθε αντιδραστηρίου το διάλυμα αναδεύεται για 3 ώρες για κάθε παρασκευή βιοϋάλου. Η ανάδευση γίνεται με διαφορετικό ρυθμό (rpm), ο οποίος ορίστηκε ώστε να γίνει σύγκριση των δειγμάτων με διαφορετικούς ρυθμούς ανάδευσης. Στη συνέχεια πραγματοποιείται γήρανση της γέλης στους 60 C για 55 ώρες. Kατά τη διάρκεια της γελοποίησης, το μίγμα αναδεύεται συνεχώς για τις τρεις πρώτες ώρες. Ακολούθως γίνεται ξήρανση σε θερμοκρασία 60 C για 12 ώρες, 90 C για 15 ώρες και 130 C για 42 ώρες, για αφαίρεση του ύδατος και της αλκοόλης, χρησιμοποιώντας προσεκτικά ελεγχόμενη θέρμανση με χαμηλό ρυθμό αύξησης σε ατμόσφαιρα υδρατμών για την αποφυγή εμφάνισης συσσωματωμάτων Ca [34]. Το τελικό στάδιο είναι θέρμανση της αποξηραμένης γέλης στους 400 ο C για 18 ώρες, 600 ο C για 25 ώρες και 700 C για 23 ώρες, προκειμένου να αρθούν τα οργανικά υποπροϊόντα και ειδικά τα νιτρικά άλατα από το νιτρικό ασβέστιο, τα οποία αναφλέγονται περίπου στους 560 C [35] και να πραγματοποιηθεί ελεγχόμενη μείωση του πορώδους. Στη συνέχεια τα συσσωματώματα των υλικών θρυμματίζονται σε υδραυλική πρέσα σε περίπου 20 τόνους πίεση. Εάν χρειαστεί επαναλαμβάνεται ο θρυμματισμός του υλικού. Στη συνέχεια το υλικό τοποθετείται σε σφαιρόμυλο από αχάτη, όπου κονιορτοποιείται. Ο χρόνος παραμονής του υλικού στο σφαιρόμυλο για κάθε μια από τις παρασκευές της παρούσας εργασίας ήταν σαράντα λεπτά. Έπειτα η σκόνη εισέρχεται σε ιθμό 40μm και με τη βοήθεια αλκοόλης γίνεται κοσκίνηση της σκόνης του υλικού. Το υλικό, που χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία έχει κοκκομετρία <40μm, έτσι το υλικό που έχει μεγαλύτερη κοκκομετρία φυλάσσεται ώστε να επαναληφθεί το στάδιο της κονιορτοποίησης στο σφαιρόμυλο. Το συγκεκριμένο μέγεθος των κόκκων (<40μm) επιλέχτηκε διότι έρευνες [36] έχουν δείξει πως αυξανομένου του μεγέθους των κόκκων μέχρι και 80μm βελτιώνεται η βιοενεργή συμπεριφορά της υάλου, λόγω της μεγαλύτερης ενεργής επιφάνειας που εμφανίζουν οι κόκκοι μικρότερης διαμέτρου [37,38,39]. 35

3.2 Παρασκευή υγρού προσομοίωσης σωματικών υγρών (c-sbf) Το SBF (simulated body fluid) που χρησιμοποιήθηκε παρασκευάζεται ακολουθώντας την παρακάτω σειρά: 1. Τα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν, πλύθηκαν αρχικά με διάλυμα HCl, 1N, ακολούθως με ακετόνη και τελικά με δισαπεσταγμένο νερό και έπειτα αφέθηκαν να στεγνώσουν. 2. Υπολογίστηκαν 1000ml δισαπεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία δωματίου και τοποθετήθηκαν σε ογκομετρική φιάλη. Ο συνολικός όγκος του νερού χωρίστηκε σε 2 φιάλες. Στη μία πραγματοποιήθηκε η διάλυση των αλάτων και των στοιχείων του ρυθμιστικού διαλύματος. Το υπόλοιπο προστίθεται στο τέλος, έως ότου το συνολικό διάλυμα αποκτήσει όγκο 1000ml. 3. Η ογκομετρική φιάλη τοποθετείται σε μαγνητικό αναδευτήρα και ξεκινάει η συνεχής ανάδευση του διαλύματος. Στη συνέχεια προστίθενται στη φιάλη, με τη σειρά που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.1, τα αντιδραστήρια μέχρι να διαλυθούν πλήρως. Κατά διάρκεια της αναμείξεως το διάλυμα πρέπει να διατηρείται διαυγές. Πίνακας 3.1: Ποσότητα των αντιδραστηρίων για προετοιμασία του c-sbf Αντιδραστήρια a Καθαρότητα % Ποσότητα(gr) c-sbf d NaCl >99.5 8.036 gr NaHCO 3 >99.5 0.352 gr Na 2 CO 3 >99.5 KCl >99.5 0.225 gr K 2 HPO 4. 3H 2 O >99.0 0.230 gr MgCl 2. 6H 2 O >98.0 0.311 gr 1.0 M-HCl - 40 ml 0.2 M-NaOH - HEPES b >99.9 CaCl 2 >95.0 0.293 gr Na 2 SO 4 >99.0 0.072 gr TRIS c >99.9 6.063 gr 1.0 M-HCl 0.2 ml 1.0 M-NaOH a b Τοποθετημένα με τη σειρά ανάμειξης στo διάλυμα, HEPES: 2-(4-(2-Υδρόξυ-αίθυλο)-1-πιπεροζύνιλο)αιθάνο σουλφονικό οξύ, c TRIS: Τρίς-υδρόξυμέθυλο αμινομεθάνιο, d Ρυθμισμένο σε ph 7.40 στους 36.5 C με TRIS και διάλυμα 1.0 M-HCl 36

4. Το διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι τους 37 ο C και το PH του ρυθμίστηκε στο 7,4 με προσθήκη σταγόνων διαλύματος HCl, 1Ν εάν χρειαστεί. 5. Τέλος μόλις το διάλυμα βρεθεί στους 20 ο C προστίθεται το υπόλοιπο δισαπεσταγμένο νερό μέχρις ότου ο τελικός όγκος του γίνει 1L. 3.3 Εμβάπτιση 58S στο c-sbf Για να υπολογιστεί η βιοενεργότητα ενός υλικού χρειάζεται μετά την παρασκευή του τα δείγματα να εισέρθουν σε υγρό που προσομοιώνει τα σωματικά υγρά ώστε να υπάρξει ανάπτυξη HAp, η οποία θα μελετηθεί. Η εμβύθιση και παραμονή των δοκιμίων στο διάλυμα πραγματοποιούνται κάθε φορά έτσι ώστε να υπάρχει συγκεκριμένη αναλογία επιφάνειας δοκιμίου προς όγκο διαλύματος. Η πλέον ενδεδειγμένη αναλογία όπως αυτή αναφέρεται στη βιβλιογραφία είναι ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ/ΟΓΚΟΣ = 1/10 [40]. Για πορώδη υλικά, όπως το 58S, η ποσότητα του διαλύματος που πρέπει να χρησιμοποιηθεί χρειάζεται να είναι μεγαλύτερη. Τα δείγματα του 58S εμβαπτίσθηκαν στο c-sbf με αναλογία 50mg σκόνης από το υλικό σε 35ml υγρό προσομοίωσης. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ανανέωσης των ιόντων του υγρού προσομοίωσης για την εμβάπτιση του 58S στο c-sbf. Η χρήση της μεθόδου της ανανέωσης έγινε για το λόγο ότι προσφέροντας στα δείγματα επιπρόσθετη ποσότητα υγρού, προσφέρονται περισσότερα ιόντα που υποβοηθούν τις αντιδράσεις που συμβαίνουν πάνω στην επιφάνεια των κόκκων του υλικού [33]. Η ανανέωση του υγρού προσομοίωσης του πλάσματος αίματος (c-sbf) γίνεται με αναρρόφηση του υγρού, που ήδη βρίσκεται στο δοχείο με το δείγμα. Κατά τη διαδικασία αυτή χρειάζεται όμως προσοχή ώστε να μην γίνει αναρρόφηση μέρους της σκόνης του δείγματος. Η μέθοδος της ανανέωσης απαιτεί αναρρόφηση και αντικατάσταση του υγρού προσομοίωσης αρχικά μετά από 6 ώρες από την πρώτη εμβάπτιση των δειγμάτων στο υγρό, ακολούθως στις 24 ώρες και έπειτα κάθε δύο μέρες. Ο συνολικός χρόνος παραμονής των δειγμάτων στο υγρό προσομοίωσης ήταν μέχρι τις έξι μέρες και άρα ανανέωση του υγρού πραγματοποιήθηκε στις 6 ώρες, στις 24 ώρες, στις 72 και τέλος στις 5 μέρες. Δηλαδή ο χρόνος παραμονής των δειγμάτων στο c- SBF ήταν 6, 12, 24, 48, 72 ώρες και 6 μέρες. Κατά τη διάρκεια της ανανέωσης των υγρών προσομοίωσης απαιτείται αποστείρωση των σκευών που χρησιμοποιήθηκαν για την 37

αποφυγή της μόλυνσης των δειγμάτων. Επίσης τόσο τα αρχικά δείγματα των υλικών, όσο και τα δοχεία στα οποία εισήχθησαν αποστειρώθηκαν. Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε επωαστήρα για το προκαθορισμένο χρονικό διάστημα σε θερμοκρασία 37 ο C. Μετά το προκαθορισμένο διάστημα παραμονής στον επωαστήρα τα δείγματα αφαιρέθηκαν και έγινε διήθηση του διαλύματος ώστε να διαχωριστεί το υλικό από το διάλυμα. Στη συνέχεια ακολουθείται η διαδικασία επεξεργασίας των δειγμάτων για τη λήψη των φασμάτων τους. 3.4 Επεξεργασία δειγμάτων και μεθοδολογία Μετά από τη διήθηση του κάθε υλικού για να εξέλθει από το υγρό προσομοίωσης, και αφού αφεθεί να στεγνώσει, χωρίζεται ώστε να γίνει ο χαρακτηρισμός του. Μια ποσότητα της σκόνης χρησιμοποιείται για χαρακτηρισμό της με περίθλαση ακτίνων-χ (XRD), ένα άλλο μέρος της επανθρακώνεται για το SEM-EDS και τέλος η υπόλοιπη ποσότητα χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό FTIR. Για την λήψη των φασμάτων FTIR των υλικών χρειάζεται αρχικά να παρασκευαστούν δισκία διαμέτρου 13mm από το μέρος της σκόνης που χωρίστηκε μετά από τη διήθηση. Πρώτα όμως πρέπει να παρασκευαστεί ένα δισκίο καθαρά από βρωμιούχο κάλιο (KBr) το οποίο χρησιμοποιείται ως υπόβαθρο στο φασματοσκόπιο. Ακολούθως 2mg από τη σκόνη του υλικού αναμειγνύεται με 0,2gr KBr και αφού ομογενοποιηθούν σε ιγδίο από αχάτη, τοποθετούνται σε υδραυλική πρέσα σε πίεση έως 7 tons για τη δημιουργία δισκίου διαμέτρου 13mm. Το παρασκευασθέν δισκίο τοποθετείται στο φασματοσκόπιο και λαμβάνεται φάσμα διαπερατότητας του υλικού. Η διαδικασία γίνεται για όλα τα δείγματα και για τα δύο υλικά ξεχωριστά και λαμβάνονται τα φάσματα διαπερατότητας τους. Όλες οι φασματοσκοπικές μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο φασματοσκοπίας, που βρίσκεται στον τομέα Φυσικής Στερεάς Κατάστασης στο τμήμα Φυσικής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ), με το FTIR φασματοσκόπιο Spectrum 1000 της Perkin Elmer στην περιοχή του μεσαίου υπερύθρου (4000-400cm -1 ), με διακριτική ικανότητα (resolution) 4cm -1 και 32 σαρώσεις (scans). Οι μετρήσεις XRD πραγματοποιήθηκαν στο τμήμα Γεωλογίας του ΑΠΘ με χρήση περιθλασίμετρου τύπου PHILIPS (PW1710), εξοπλισμένο με λυχνία Cu και φίλτρο Νi για τη λήψη CuKα ακτινοβολίας, ενώ η περιοχή σάρωσης γωνίας 2θ ήταν 5-60, το βήμα 38

0,05 ο και η ταχύτητα σάρωσης 0,01 o 2θ/sec. Τα δείγματα που μετρήθηκαν με την περίθλαση ακτίνων-χ μελετήθηκαν υπό μορφή σκόνης. Τέλος η τοπογραφική αποτίμηση και η επιφανειακή στοιχειομετρική σύσταση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με SEM της εταιρείας JEOL J.S.M. 840A, Tokyo, Japan, το οποίο είναι εξοπλισμένο με αναλυτή EDS. Για τις ανάγκες της μικροανάλυσης τα δοκίμια επικαλύφθηκαν με άνθρακα (επανθράκωση) πάχους περίπου 200 A για να επιτευχθεί η αγωγιμότητα του υλικού. Η επανθράκωση έγινε με JEOL-4X εξαχνωτή κενού (vacuum evaporator). 39

40

4.1 Μελέτη της ομοιογένειας των παραγόμενων υλικών με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης για διαφορετικούς ρυθμούς ανάδευσης Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της παραγωγής της βιουάλου με τη μέθοδο sol-gel είναι ο σχηματισμός ομογενούς διαλύματος. Η βιοΰαλος 58S παρασκευάστηκε με διαφορετικό ρυθμό ανάδευσης κάθε φορά. Οι ρυθμοί στους οποίους αναδεύτηκε το υλικό ήταν 0rpm, 200rpm, 400rpm, 600rpm και 800rpm. Πραγματοποιήθηκαν 3 παρασκευές για κάθε έναν από τους παραπάνω ρυθμούς ανάδευσης και στη συνέχεια λήφθηκαν τα φάσματα FTIR ώστε να επιβεβαιωθεί η ομοιογένεια της βιοϋάλου 58S.Τα φάσματα που λήφθηκαν, παρουσιάζονται στα παρακάτω γραφήματα, το καθένα από τα οποία αντιστοιχεί σε διαφορετικό ρυθμό ανάδευσης (rpm) και διαφορετική παρασκευή για της σκόνης 58S. Σχήμα 4.1 : Το FTIR φάσμα δειγμάτων σκόνης 58S για ανάδευση με ρυθμό 0 rpm και 200rpm. Στο φάσμα του 0rpm έχουμε το σχηματισμό μιας ευρείας κορυφής στα 1050 cm -1 και μιας κορυφής στα 796cm -1 που οφείλονται στην ασύμμετρη και συμμετρική δονητική έκταση του δεσμού Si-O-Si αντίστοιχα. Παρατηρώντας την πρώτη κορυφή στα 1050cm -1 επισημαίνεται η μετακίνηση της κύριας κορυφής των δονήσεων του τετραεδρικού πυριτίου στα 1100cm -1 σε μικρότερο μήκος κύματος. Επιπλέον αυτή η κορυφή έχει συγχωνευτεί με την κορυφή του δεσμού Si-O-Ca της κρυσταλλικής φάσης Ca 2 SiO 4 στα 950cm -1. Στη συνέχεια υπάρχει μια κορυφή στα 450cm -1 η οποία αποδίδεται στην κάμψη του δεσμού Si- 41

O [41]. Επίσης παρατηρείται μια διπλή κορυφή στα 568 και 602 cm -1, η οποία αποδίδεται στην κάμψη δόνησης του δεσμού P-O του υαλώδους πλέγματος και η οποία αποδεικνύει μια προϋπάρχουσα φάση Ca-P [42]. Η ενίσχυση της κορυφής στα 796cm -1 του δεσμού έκτασης Si-O-Si δείχνει την ενσωμάτωση ιόντων Ca που απελευθερώνονται από το δίκτυο διοξειδίου του πυριτίου στην υδροξυκαρβονική φάση. Ομοίως στα φάσματα των 200rpm, 400rpm, 600rpm και 800rpm παρατηρούνται οι ίδιες χαρακτηριστικές κορυφές με αυτές που αναφέρθηκαν εκτενώς για το 0rpm. Σχήμα 4.2 : Το FTIR φάσμα δειγμάτων σκόνης 58S για ανάδευση με ρυθμό 200 rpm, 400rpm, 600rpm και 800rpm Όπως περιγράφηκε κατά την παραπάνω ανάλυση όλα τα φάσματά παρουσιάζουν τις ίδιες χαρακτηριστικές κορυφές. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την παρασκευή υλικού με 42

τις ίδιες ιδιότητες και άρα μπορούμε να το χαρακτηρίσουμε ομοιογενές. Επιβεβαίωση της ομοιογένειάς του μπορεί να γίνει και από τις εικόνες που πήραμε από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και παρουσιάζονται στον πίνακα 4.1. Πίνακας 4.1 Φωτογραφίες SEM για όλους τους ρυθμούς ανάδευσης. 58S_0 58S_200 58S_400 58S_600 58S_800 Οι εικόνες από το SEΜ, παρουσιάζουν σε γενικές γραμμές ομοιογένεια του δείγματος, αν και μπορεί να παρατηρηθεί κατά τόπους μια μικρή χημική διαφοροποίηση 43

(λευκές κηλίδες), εμφανής σε όλα τα υλικά. Η ανάλυση EDS των κηλίδων αυτών δείχνει ότι είναι περιοχές υψηλής περιεκτικότητας σε ασβέστιο [24]. Τέτοιες περιοχές έχουν παρατηρηθεί ξάνα στο παρελθόν σε δείγματα Bioglass 58S, από τους Zhong et al [34], οι οποίοι τις απέδωσαν στις συνθήκες θέρμανσης. Παρατήρησαν ότι αν η πρώτη φάση θέρμανσης δεν γίνει σε συνθήκες υψηλής υγρασίας, ιόντα Ca 2+ μεταναστεύουν από τους πόρους στην επιφάνεια του υλικού στην επιφάνεια του, δημιουργώντας περιοχές υψηλής περιεκτικότητας σε ασβέστιο. Αντίστοιχα, η ανάδευση κατά την πρώτη φάση φαίνεται να βοηθάει αυτή τη μετανάστευση, ευτυχώς όχι σε μεγάλο βαθμό, αφού αυτό θα προκαλούσε ανομοιογένεια του υλικού και πιθανόν μείωση της βιοενεργότητας του. Άρα το αναδευμένο υλικό παρουσιάζει ικανοποιητική ομοιογένεια, παρά τις περιοχές ασβεστίου, οι οποίες είναι πολύ μικρές και εκτείνονται σε όλο το υλικό και όλους τους ρυθμούς ανάδευσης. Τέλος παρατηρείται ότι το μέγεθος των κόκκων της βιουάλου είναι το ίδιο για όλους τους ρυθμούς ανάδευσης. 4.2 Χαρακτηρισμός των παραγόμενων υλικών για τους διάφορους ρυθμούς ανάδευσης Λήφθηκαν τα φάσματα FTIR της σκόνης 58S για κάθε έναν ρυθμό ανάδευσης (0, 200, 400, 600, 800rpm) τα οποία παρουσιάζονται στο Σχήμα 4.3. Το FTIR φάσμα του υλικού χωρίς ανάδευση (0rpm) παρουσιάζει τις κορυφές που αναφέρθηκαν στην παράγραφο 4.1, δηλαδή μια ευρεία κορυφή στα 1050cm -1, η οποία αποδίδεται στη δόνηση του δεσμού έκτασης του Si-O-Si και μια κορυφή στα 450cm -1, η οποία αποδίδεται στο δεσμό κάμψης του Si-O-Si. Η κορυφή στα 1050cm -1 συγχωνεύεται με μια κορυφή δόνησης του Si-O-Ca της κρυσταλλικής φάσης Ca 2 SiO 4 στα 950cm -1 που οδηγεί στην διεύρυνσή της. Η ενίσχυση της κορυφής στα 796cm -1 του δεσμού έκτασης Si-O-Si δείχνει την ενσωμάτωση ιόντων Ca. Και τέλος παρατηρείται μια διπλή κορυφή στα 568 και 602 cm -1, η οποία αποδίδεται στην κάμψη δόνησης του δεσμού P-O του υαλώδους πλέγματος και η οποία αποδεικνύει μια προϋπάρχουσα Ca-P φάση. Ομοίως οι ίδιες χαρακτηριστικές κορυφές εμφανίζονται και στις υάλους που αναδεύτηκαν στους 200rpm και 800rpm. Παρατηρήθηκε από τα φάσματα FTIR των υάλων που παρήχθησαν με ρυθμό ανάδευσης 400rpm και 600rpm είναι η ύπαρξη των κορυφών στα 1050cm -1, στα 950cm -1 και στα 450cm -1 καθώς την κορυφή στα 796cm -1, όπως και στις υπόλοιπες βιοϋάλους, 44

διαφοροποιούνται όμως αυτοί οι δύο ύαλοι γιατί έχουμε την εξαφάνιση της διπλής κορυφής στα 602 και 568cm -1. Σχήμα 4.3: α) Το FTIR φάσμα των δειγμάτων και β) το XRD ακτινογράφημα των ίδιων δειγμάτων του 58S. Επίσης λήφθηκαν διαγράμματα από περίθλαση ακτίνων-χ στους κόκκους του 58S και διαπιστώθηκε (σχήμα 4.3) ότι σε όλα τα βιοενεργά γυαλιά που παρασκευάστηκαν χωρίς εκτεταμένη ανάδευση κατά τις τρεις πρώτες ώρες της γελοιοποίησης επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη μιας κρυσταλλικής φάσης του πυριτικού ασβεστίου (calcium silicate) και συγκεκριμένα την Ca 2 (SiO 4 ) ICDD card (86-0399), η οποία αποτελεί το 10wt% του υλικού ενώ το 90wt% εμφανίζεται σαν άμορφο. Αυτό επιβεβαιώνεται από την κορυφή που εμφανίζεται σε γωνίες 2θ μεταξύ 15-30 ο στα 0rpm, 200rpm και 800rpm η οποία έχει όλα τα χαρακτηριστικά ενός τυπικού άμορφου υλικού, δηλαδή ευρεία κορυφή, μεγάλη βάση (γωνία 2θ στην οποία αναπτύσσονται) και σχετικά μικρές γωνίες 2θ στις οποίες παρατηρούνται. Επίσης για τα προαναφερθέντα γυαλιά η κορυφή σε γωνίες μεταξύ 31-37 ο παρουσιάζεται πολύ οξύληκτη κάτι που συνεπάγεται την παρουσία κρυσταλλικής δομής. Αυτό όμως δεν ισχύει για τις υάλους που αναδεύτηκαν στους 400rpm και 600rpm. Στις δύο αυτές περιπτώσεις παρατηρήθηκε από τα διαγράμματα περίθλασης ακτίνων-χ, η μεγάλη κορυφή του άμορφου η οποία έχει όλα τα χαρακτηριστικά ενός τυπικού άμορφου υλικού, δηλαδή ευρεία κορυφή, πολύ μεγάλη βάση και μικρές γωνίες εμφάνισης. Όμως ο 45

σχηματισμός απότομων κορυφών μεταξύ 32-47 ο υποδεικνύει την περαιτέρω κρυστάλλωση Ca 2 SiO 4 στα 400rpm και 600rpm. Επίσης η παρουσία μιας πιο μικρής κορυφής στις 34 ο δείχνει το σχηματισμό μιας φάσης Ca-P. Η απουσία επιπλέον κορυφών της φάσης Ca-P στο φάσμα του XRD των υπόλοιπων γυαλιών (0, 200, 800rpm), πιθανώς αποδίδεται στο μεγάλο εύρος των κορυφών του Ca 2 SiO 4. Λαμβάνοντας υπόψη τα πειραματικά αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν η επίδραση της ανάδευσης στο σχηματισμό άμορφου βιοενεργού γυαλιού 58S μπορεί να εξηγηθεί γνωρίζοντας ότι η εσωτερική ενέργεια του διαλύματος στις συγκεκριμένες συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης μπορεί να θεωρηθεί σταθερή από μακροσκοπική άποψη. Η ενέργεια όμως σε όλη την έκταση του διαλύματος δεν είναι βέβαιο ότι είναι ίδια [43]. Μικρές αλλαγές στη θερμοκρασία και την πίεση μπορούν ενδεχομένως να επηρεάσουν την πυρήνωση και την ανάπτυξη κρυσταλλικού πλέγματος, παρέχοντας στο διάλυμα το κατάλληλο ποσό ενέργειας που χρειάζεται για την κρυστάλλωση ή τη δημιουργία άμορφου υλικού. Στις υπέρκορες περιοχές όπου η θερμοκρασία ή η πίεση είναι υψηλότερες, αυξάνονται προσωρινά τα ενεργειακά επίπεδα και συμβαίνει πυρηνοποίηση. Σε ένα σύστημα, η δημιουργία άμορφου ή κρυσταλλικού πλέγματος μπορεί να προκαλείται από περίσσεια ανάδευσης του διαλύματος ή ανάμιξη/κονιορτοποίηση σε σφαιρόμυλο [6, 7, 8, 9]. Σύμφωνα με τα παραπάνω, ο σχηματισμός κρυσταλλικής φάσης όξινου πυριτίου στο 58S χωρίς ανάδευση οφείλεται στις διακυμάνσεις της ενέργειας στο διάλυμα εξαιτίας των αλλαγών της πίεσης και της θερμοκρασίας. Παρ όλο που η εσωτερική ενέργεια αυξάνει με την ανάδευση του διαλύματος, εάν γίνεται ανάδευση σε χαμηλούς ρυθμούς (0rpm ή 200rpm) συμβαίνουν μικρές αλλαγές στην θερμοκρασία και την πίεση. Κατά συνέπεια δεν παρατηρούνται περιοχές υπερκορεσμού στο διάλυμα με αποτέλεσμα την παρασκευή ενός σχεδόν άμορφου τελικά προϊόντος. Καθώς αυξάνεται ο ρυθμός ανάδευσης η κινητική ενέργεια των σωματιδίων μεγαλώνει και ξεπερνάει το επίπεδο ενέργειας για να είναι άμορφο το υλικό. Ως εκ τούτου παρατηρείται ο σχηματισμός μιας κρυσταλλικής φάσης στα πειράματά μας. Παρ όλα αυτά πρέπει να συνεχιστεί η έρευνα για να μπορέσει να εξηγηθεί το ότι η ύαλος που αναδεύτηκε στους 800rpm εμφανίζει ένα τόσο μικρό ποσοστό κρυσταλλικής φάσης. 46

4.3 Μελέτη της βιοενεργής συμπεριφοράς των παραγόμενων υλικών για τους διάφορους ρυθμούς ανάδευσης Σύμφωνα με την FTIR και XRD ανάλυση που παρουσιάστηκε στην παράγραφο 4.2 η σύνθεση των υλικών μπορεί να χωριστεί σε δύο κατηγορίες, η μία κατηγορία περιλαμβάνει τα υλικά που παράχθηκαν με ρυθμό ανάδευσης 0rpm, 200rpm, 800rpm και η άλλη τα υλικά που παράχθηκαν με ρυθμό ανάδευσης 400rpm και 600rpm. Επομένως επιλέξαμε μια ύαλο από κάθε κατηγορία για να αναλύσουμε τα φάσματα μετά από 6, 12, 24, 48, 72 ώρες και 6 μέρες παραμονής στο c-sbf. Στο σχήμα 4.4 έχουμε τα FTIR φάσματα για χρόνους ανάδευσης 0rpm και 400rpm πριν και μετά την εμβάπτιση στο c-sbf για τους χρόνους που αναφέραμε. α β Σχήμα 4.4 To FTIR φάσμα των υάλων α) 0rpm και β) 400rrm μετά από την εμβάπτιση τους στο csbf. Αρχικά επισημαίνεται ότι στις υάλους 0rpm και 400rpm δεν υπάρχει αλλαγή στο χαρακτηριστικό τους φάσμα πριν από τις 6 ώρες από την ώρα που εμβαπτίστηκαν στο csbf. Όμως μετά από 6 ώρες παραμονή στο υγρό προσομοίωσης, το 0rpm και 400rpm παρουσιάζουν μια ευρεία κορυφή περίπου στα 570cm -1. Αυτή η κορυφή προέρχεται από το σχηματισμό μιας άμορφης φάσης Ca-P. Μετά από 12 ώρες έχουμε την εμφάνιση μιας διπλής κορυφής στην περιοχή 550-610cm -1 και μιας ακόμα κορυφής στα 960cm -1 η οποία αποδίδεται στην έκταση και την κάμψη του δεσμού Ρ-Ο αντίστοιχα και δείχνει την έναρξη κρυστάλλωσης απατίτη. Επιπλέον η ενίσχυση της κορυφής στα 796cm -1 από την έκταση του δεσμού Si-O-Si δείχνει την ενσωμάτωση των ιόντων Ca που απελευθερώνονται από το πυριτικό δίκτυο στην φάση δημιουργίας υδροξυκαρβονικού απατίτη. Στη συνέχεια μετά 47

από 6 μέρες εμβάπτισης έχουμε ενίσχυση της διπλής κορυφής στα 564cm -1 και 602cm -1 καθώς και όξυνση της ευρείας κορυφής στα 1100cm -1 που οφείλεται στο έκταση των δεσμών του PO 4 δικτύου. Ακόμα αναπτύσσεται και η κορυφή στα 1420cm -1 που προέρχεται από τη συμμετρική δόνηση του CΟ 3 και μια πιο μικρή κορυφή στα 876cm -1. Όλες αυτές οι μεταβολές κορυφών επιβεβαιώνουν την περαιτέρω κρυστάλλωση του απατίτη. Μπορεί να παρατηρηθεί ότι το φάσμα της υάλου χωρίς ανάδευση μετά από 6 μέρες στο SBF δεν είναι όμοιο με αυτό ενός πυριτικού γυαλιού δεδομένου ότι οι κορυφές στα 800cm -1 και 450cm -1 έχουν εξαφανιστεί υποδεικνύοντας τον σχηματισμό στρώματος απατίτη μεγάλου πάχους στην επιφάνεια των κόκκων, το οποίο υπερβαίνει το βάθος διείσδυσης του υπέρυθρου φωτός. Αυτό όμως δε συμβαίνει στα 400rpm και 600rpm, τα οποία για αυτό το λόγο διαφέρουν από την πρώτη ομάδα. Σχήμα 4.5 To XRD φάσμα των υάλων α) 0rpm και β) 400rrm μετά από την εμβάπτιση τους στο csbf. Η ανάλυση XRD που πήραμε και για τα δύο υλικά μετά την παραμονή τους στο csbf για 12 ώρες και 6 μέρες επιβεβαιώνει την κρυστάλλωση μιας φάσης HCAp παρατηρώντας τις χαρακτηριστικές κορυφές που σχηματίστηκαν περίπου στις 26 ο και 32 ο και αποδίδονται σε υδροξυαπατίτη (Ca 5 (PO 4 ) 3 (OH), 89-4405 ICDD card). Βλέπουμε μια ευρεία κορυφή στις 32 ο η οποία δηλώνει την ανάπτυξη μια μικροκρυσταλλικής φάσης του HCAp. 48

Πίνακας 4.2 Φωτογραφίες SEM για το 0 και 400rpm μετά από την εμβάπτισή τους στο csbf. 0rpm 400rpm 6 days 0 days Τα ευρήματα των FTIR και XRD φασμάτων είναι σε συμφωνία με τις μικροφωτογραφίες που λήφθηκαν από το SEM και παρουσιάζονται παρακάτω στον πίνακα 4.2. και αποδεικνύουν τον σχηματισμό στρώματος απατίτη που καλύπτει την επιφάνεια των κόκκων. Επιπλέον η EDS ανάλυση μας δείχνει τη μέση μοριακή αναλογία Ca/P να είναι περίπου στο 1,72 καθώς και η συμμετοχή του Si από το υπόστρωμα έχει εξαλειφθεί, γεγονός που υποδηλώνει ότι όλοι οι κόκκοι έχουν καλυφθεί εντελώς από το παχύ στρώμα απατίτη. Ωστόσο στην περίπτωση των 400rpm, μετά από 6 μέρες εμβάπτισης, αναπτύχθηκε ένα λεπτό στρώμα απατίτη, αποτελούμενο από μικροκρυσταλλικές νιφάδες, το οποίο δημιουργήθηκε στην επιφάνεια των κόκκων και η EDS ανάλυση έδειξε πως η αναλογία Ca/P είναι περίπου 1.7-1.9 και υπάρχει ένα σημαντικό ποσοστό Si από το υπόστρωμα. 49

50

Το 58S είναι μια βιούαλος που παρασκευάζεται με τη μέθοδο της κολλοειδούς γέλης (sol-gel). Η μέθοδος αυτή είναι γνωστή για τη παρασκευή ομοιογενών υλικών. Το πρώτο στάδιο της μεθόδου είναι η μηχανική ανάδευση όπου τα συστατικά αναμιγνύονται σε νερό και/ή αλκοόλη (προαιρετικά) με σκοπό την δημιουργία αιωρημάτων και μάλιστα σε τέτοιο ph, ώστε να εμποδίζεται η ανάπτυξη συσσωματωμάτων. Η διάρκεια της ανάδευσης είναι 3 ώρες και αλλάζει κάθε φορά ο ρυθμός ανάδευσης (0, 200, 400, 600, 800rpm). Παρασκευάστηκαν δύο ή τρεις σκόνες του 58S για κάθε έναν ρυθμό ανάδευσης. Μετρήθηκαν τα φάσματά τους και παρατηρήσαμε τις ίδιες χαρακτηριστικές κορυφές της βιουάλου σε όλες τις παρασκευές και επιβεβαιώνοντας την ομοιογένεια του υλικού. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση των φασμάτων των πέντε διαφορετικών ρυθμών ανάδευσης. Παρατηρήθηκε μια ευρεία κορυφή στα 1050cm -1, η οποία αποδίδεται στη δόνηση του δεσμού έκτασης του Si-O-Si και μια κορυφή στα 450cm -1, η οποία αποδίδεται στο δεσμό κάμψης του Si-O-Si. Σε δυο από τις υάλους (400 και 600rpm) έχουμε την εξαφάνιση της διπλής κορυφής στα 602 και 568cm -1 η οποία μπορεί να αποδοθεί στην κάμψη δόνησης του P-O από μια κρυσταλλική φάση του Ca-P. Ακόμα σε αυτά τα δύο γυαλιά υπήρξε ενίσχυση της κορυφής στα 796cm -1 του δεσμού έκτασης Si-O-Si. Τελικά παρήχθη ένα άμορφο κυρίως υλικό του οποίου η κρυσταλλική φάση ταυτοποιήθηκε με την Ca 2 (SiO 4 ). Στο σημείο αυτό σύμφωνα με τα πειραματικά μας αποτελεσμάτα και τη διεθνή βιβλιογραφία, μπορούμε να εξάγουμε συμπεράσματα όσον αφορά στην επίδραση της ανάδευσης στο υλικό. Αρχικά το υλικό που αναδεύεται με μεγαλύτερο ρυθμό (400 και 600rpm), λόγω της πρόσθετης ενέργειας που παρέχεται στο σύστημα με την παρατεταμένη ανάδευση, αποκτά μεγαλύτερο βαθμό κρυσταλλικότητας [34], γεγονός που επιβεβαιώνεται από τα πειραματικά αποτελέσματα τόσο με τη φασματοσκοπία υπερύθρου όσο και με την περίθλαση ακτίνων-χ. Για τους παραπάνω λόγους τα δείγματά μας μπορούν χωριστούν σε δύο κατηγορίες. Η πρώτη περιλαμβάνει το 0rpm, 200rpm, 800rpm και η δεύτερη το 400rpm και 600rpm. Τέλος, σύμφωνα με τον παραπάνω διαχωρισμό επιλέχτηκε μια ύαλος από κάθε κατηγορία για να μελετηθεί η βιοενεργότητά της, δηλαδή ο ρυθμός ανάπτυξης απατίτη στην επιφάνειά του. Η διαδικασία ξεκίνησε με την εμβάπτιση των δειγμάτων μέσα σε υγρό προσομοίωσης της ανόργανης φάσης του πλάσματος του αίματος, το csbf (Simulated Body Fluids), όπου έμειναν για 6, 12, 24, 48, 72 ώρες και 6 μέρες. Συγκρίνοντας τα φάσματα εξάγαμε τα παρακάτω συμπεράσματα. Για όλους τους ρυθμούς ανάδευσης (0, 200rpm, 400rpm, 600rpm, και 800rpm) του 58S υπήρξε ανάπτυξη υδροξυαπατίτη στην επιφάνεια των κόκκων της σκόνης μετά από τις 6 ώρες. Επιπλέον στις υάλους τις πρώτης 51

ομάδας σχηματίστηκε ένα παχύ στρώμα απατίτη μετά από 6 μέρες παραμονής στο SBF, γεγονός που δεν παρατηρήθηκε στα υλικά της δεύτερης ομάδας, πιθανόν λόγω της μεγαλύτερης συμμετοχής της κρυσταλλικής φάσης στην περίπτωση των δύο αυτών υλικών. 52

Βιβλιογραφία 1. Γεωργιλέ Μαρία, (2007), «Βιοϋλικά στα Τεχνητά Εμφυτεύματα και Μετρήσεις Ακριβείας των Εμφυτευμάτων», Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2. Χατζησταύρου Ξ. (2007), «Παρασκευη και Μελετη Τροποποιημενων Υλικων Καταλληλων για Ακινητες Προσθετικες Αποκαταστασεις, με Δυνατοτητες Αναπτυξης Συνθετων Βιολογικων Δομων», Διδακτορική Διατριβή, Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Φυσικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστημιο Θεσσαλονίκης. 3. J. R. Jones, P. Sepulveda, L. L. Hench: J. Biomed. Mater. Res. 58 (2001) p720-726 4. O.M. Goudouri, E. Kontonasaki, A. Theocharidou, L. Papadopoulou, N. Kantiranis, X. Chatzistavrou, P. Koidis, K.M. Paraskevopoulos, Modifying a dental ceramic by bioactive glass via the sol gel route: Characterization and bioactivity investigation, Materials Chemistry and Physics 125 (2011) 309-313. 5. Ourania Menti Goudouri (2011) The impact of stirring rate on the crystallinity and bioactivity of 58S bioactive glass 1 Physics Dept., Aristotle University of Thessaloniki, 54124 Thessaloniki, Greece. 6. FW Yan, SF Zhang, CY Guo, XH Zhang, GC Chen, F Yan, GQ Yuan, Influence of stirring speed on the crystallization of calcium carbonate. Cryst Res Technol 44 (2009) 725 728. 7. MA Cheney, PK Bhowmik, S Moriuchi, M Villalobos, S Qian, SW Joo, The Effect of Stirring on the Morphology of Birnessite Nanoparticles, J Nanomater 2008 (2008): Article ID 168716. 8. E Kondili, M Kontominas, M Kosmas, The effect of stirring on the diffusion of small molecules from a polymer matrix into a solution, Polymer 34 (1993) 2592-2596. 9. RC Reld, KR Sldman, AD Schwope, DE Till, Loss of Adjuvants from Polymer Films to Foods or Food Simulant. Effect of the External Phase, Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev 19 (1980) 580-587. 10. FW Yan, SF Zhang, CY Guo, XH Zhang, GC Chen, F Yan, GQ Yuan, Influence of stirring speed on the crystallization of calcium carbonate. Cryst Res Technol 44 (2009) 725 728. 11. MA Cheney, PK Bhowmik, S Moriuchi, M Villalobos, S Qian, SW Joo, The Effect of Stirring on the Morphology of Birnessite Nanoparticles, J Nanomater 2008 (2008): Article ID 168716 12. D. C. Clupper, J. E. Gough, M. M. Hall, A. G. Clare, W. C. LaCourse, L. L. Hench: J. Biomed. Mater.Res 67A (2003) p285 294 13. Χατζησταύρου Ευάγγελος (2008), «Μελέτη και Χαρακτηρισμός Εμφυτευματικών Υλικών και Μιγμάτων τους: Υδροξυαπατίτης και Βιοενεργή Ύαλος», Τμήμα Φυσικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. 14. Μ. Ηandke, M. Sitarz, M. Rokita, E.Galuskin, Journal of Molecular Structure, 651-653 (2003) 3 15. F.H. Silver, D. L. Christiansen, Biomaterials Science and Biocompatibility (1993) 53

16. Brinker, C.J.; G.W. Scherer (1990). Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing. Academic Press. ISBN 0121349705. 17. Hench, L.L.; J.K. West (1990). "The Sol-Gel Process". Chemical Reviews 90: 33. 18. Klein, L. (1994). Sol-Gel Optics: Processing and Applications. Springer Verlag. ISBN 0792394240. 19. Klein, L.C. and Garvey, G.J., "Kinetics of the Sol-Gel Transition" Journal of Non-Crystalline Solids, Vol.38, p.45 (1980) 20. Brinker, C.J., et al., "Sol-Gel Transition in Simple Silicates", J. Non-Crystalline Solids, Vol.48, p.47 (1982) 21. http://www.swri.edu/3pubs/ttoday/fall95/implant.htm 22. W. Cao, L. L. Hench, Ceramics International, 22 (1996) 493 23. L. L. Hench, Curr. Opin. Solid State Mater. Sci., 2 (1997) 604 24. Γουδούρη Ο.Μ. (2007), «Μελέτη και Χαρακτηρισμός Βιοενεργών Υλικών Τροποποιημένων με Νανοϋλικά», Διπλωματική Εργασία, Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Φυσικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστημιο Θεσσαλονίκης. 25. T. Jiang and K.Xu, FTIR Study of Ultradispersed Diamond Powder synthesized by Explosive Detonation, Carbon, 33, 12, 1995, pp.1663-1671 26. M.M. Pereira, L.L. Hench, J. Sol-gel Sci Technol 7, (1996) p59-6 27. M.M. Walker An Investigation into the Bonding Mechanics of Bioglass (M.S. thesis University of Florida) (1977) 28. Άννα Θεοχαρίδου (2009), «Μελέτη Κυτταρικής Αντίδρασης στην Τροποποιούμενη- με Βιοπολυμερή Ικριώματα- Επιφάνεια οδοντιατρικών κεραμικών υλικών», Οδοντοτριατική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 29. M.J. Tobin, M.A. Chesters, M. Pearson, FTIR Microspectroscopy Studies of Tumor Tissue, Scientific Reports Biological Spectroscopy- The Synchrotron radiation source 30. Χρυσάνθου Αντρέας (2010), «Εφαρμογή των τεχνικών της Φασματοσκοπίας Περίθλασης Ακτίνων-Χ (XRD) και του Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Σάρωσης (SEM) στη μελέτη τοιχογραφιών της Ύστερο Ρωμαϊκής περιόδου από το Κούριο, Κύπρος», Πολυτεχνική Σχολή Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης 31. http://mse.iastate.edu/microscopy/home.html 32. R Li, AE Clark, LL Hench, Effects of structure and surface area on bioactive powders by sol- gel process. In: Hench LL, West JK, editors. Chemical processing of advanced materials. New York: John Wiley & Sons, Inc.; 1992. 33. Θεοδώρου Γιώργος (2010), «Παρασκευή, Χαρακτηρισμός Βιοϋάλων και Μελέτη της Βιοενεργότητάς τους σε Διαφορετικά Υγρά που Προσομοιώνουν τα σωματικά (SBFs)» Πτυχιακή Εργασία, Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Φυσικής, Αριστοτέλειο Πανεπιστημιο Θεσσαλονίκης. 54

34. J. Zhong, D.C. Greenspan, Biomaterials (2000) 35. Saravanapavan, P., Hench, L. L. (2003a) Mesoporous calcium silicate glasses. I. Synthesis. J. Non-Cryst. Solids, 318, 1 13. 36. X. Chatzistavrou, T. Zorba, K. Chrissafis, G. Kaimakamis, E. Kontonasaki, P. Koidis, K. M. Paraskevopoulos J. of Th. An. and Calor, Vol. 85 (2006) 2, 253 259 37. M. Filgueiras, G. La Torre and L.L. Hench, J. Biomed. Mater. Res., 27 (1993) 445. 38. Ö. Andersson, K. V_h_talo, R. Happonen, A. Yli-Upro and K. Karlsson. In: Ö. Andersson, R. Happonen, A. Yli-Urpo, Eds Bioceramics Volume 7, Proceedings of the 7th International Symposium on Ceramics in Medicine. Turku, Finland: Butterworth-Heinemann Ltd., 1994, p. 67. 39. D. Greenspan, J. Zhong and G. La Torre, In: Ö. Andersson, R. Happonen, A. Yli-Urpo, Eds Bioceramics Volume 7, Proceedings of the 7th International Symposium on Ceramics in Medicine. Turku, Finland: Butterworth-Heinemann Ltd., 1994, p. 55. 40. Greenspan et al., 1994, Filgueiras et al., 1993 (a). 41. R.F.S. Lenza and W.L.Vasconcelos: Materials Research. Vol. 4 (2001), p. 189. 42. E. Kontonasaki, T. Zorba, L. Papadopoulou, E. Pavlidou, X. Chatzistavrou, Κ.Paraskevopoulos, P. Koidis: Cryst. Res. Technol. Vol. 37 (2002), p. 1165. 43. Mullin J. Crystallization. Woburn: Butterwoth-Heinemann; 2001 55

56