ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ - ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΜΑΡΙΑ ΓΑΖΟΥΛΗ ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ Σταθερός: DNA ή RNA ακινητοποιούνται σε νιτροκυτταρίνη. Οι προσδεδεμένες αλληλουχίες είναι ελεύθερες στο υβριδισμό με ανιχνευτή Southern Blots Dot/Slot Blots Northern Blots -In-silica hybridization (glass slides) in situ hybridization (tissue) Chromosomal (FISH) Microarrays
Αποδιάταξη - Επαναδιάταξη Denaturation Renaturation Doublestranded DNA Singlestranded DNA Initial Base pairing Renatured DNA
Southern Blot Restriction enzyme DNA of various sizes Electrophorese on agarose gel gel Denature - transfer to filter paper blot
Denature- transfer to filter paper blot Hybridize to probe Visualize
Northern Blot
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR PCR είναι in vitro ενζυμική σύνθεση και πολλαπλασιασμός ειδικών αλληλουχιών DNA Μπορεί να πολλαπλασιάσει ένα μόριο DNA σε εκατομμύρια αντίγραφα σε λίγες ώρες
PCR
Στα πλεονεκτήματα του PCR προσμετρούνται η μεγάλη ευαισθησία, η μεγάλη ειδικότητα και η μεγάλη ταχύτητα. Η μεγάλη ειδικότητα απορρέει από το γεγονός ότι κάθε ξεχωριστό γονίδιο έχει ένα μοναδικό DNA. Έτσι λοιπόν μπορούμε να σχεδιάσομε primers συμπληρωματικούς σ αυτές τις ειδικές και μοναδικές αλληλουχίες DNA για την υπό αναζήτηση γενετική περιοχή. Στα προβλήματα του PCR καταγράφονται οι ψευδώς θετικές αντιδράσεις, οι οποίες κυρίως οφείλονται στις επιμολύνσεις, οι ψευδώς αρνητικές αντιδράσεις, με το συνηθέστερο αίτιο τους να είναι η ύπαρξη αναστολέων και τέλος το κόστος το οποίο, παρά την εξέλιξη, παραμένει υψηλό.
RT-PCR Measures relative expression of mrna 1. Isolate and purify mrna 2. reverse transcription RNA cdna Αντίστροφη μεταγραφάση 3. PCR amplification 4. run on gel and probe/hybridize
RT-PCR Why use RT? Can observe very low levels of expression Requires very small amounts of mrna No radioactivity Specific - rapid
Real-Time PCR Πρόκειται για PCR, στην οποία εκτός από τους εκκινητές διαθέτει και ειδικά φθοριωμένα probes μέσω των οποίων ανιχνεύεται, επιβεβαιώνεται και ποσοτικοποιείται το PCR-προϊόν σε πραγματικό χρόνο. Καθώς δεν χρειάζονται επιπλέον διαδικασίες για την ανίχνευση του προϊόντος της αντίδρασης (gel, ηλεκτροφορήσεις κλ.) ο συνολικός χρόνος της διαδικασίας μειώνεται σημαντικά. Υπάρχουν τρεις διαφορετικές τεχνολογίες ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται στο real time PCR.
Α) Υδρολυόμενα probes (TaqMan System, Perkin-Elmer AB) Πρόκειται για την πλέον ευρύτερα χρησιμοποιούμενη τεχνολογία. Tα probes αυτά έχουν στο 5 άκρο τους τη φθορίζουσα ουσία carboxy fluorosceine και στο 3 άκρο τους μια άλλη ουσία τη ροδαμίνη Τα probes υδρολύονται και αποσυντίθενται από την 5 3 exonuclease activity της DNA pol. Ενόσω είναι υβριδοποιημένα τα probes η ουσία δεν φθορίζει. Όταν όμως (κατά τη σύνθεση νέων αντιγράφων από την DNA pol) υδρολυθούν, η ουσία αυτή φθορίζει και εμείς μπορούμε να ανιχνεύσομε το σήμα.
Όσο λοιπόν φτιάχνονται καινούργια αντίγραφα τόσο το σήμα μας θα γίνεται πιο έντονο. Στην αρχή το σήμα είναι μη ανιχνεύσιμο. Από ένα σημείο όμως και μετά ξεπερνάει το κατώφλι ανίχνευσής. Με βάση τον κύκλο στον οποίο βρισκόμαστε εκείνη τη στιγμή και με τη βοήθεια ειδικού λογισμικού μπορεί να προσδιοριστεί ο αρχικός αριθμός αντιγράφων που υπήρχε στο δείγμα μας
Β) Hairpin probes (Molecular Beacons, Strategene) Τα probes αυτά έχουν στα δύο τους άκρα IΤR (inverted terminal repeats) συνδεδεμένα με δύο φθορίζουσες ουσίες Όταν δεν είναι υβριδοποιημένα τα probes παίρνουν τη μορφή φουρκέτας και καθώς οι δύο ουσίες βρίσκονται η μία δίπλα στην άλλη δεν φθορίζουν. Όταν όμως υβριδοποιηθεί το probe «ανοίγει» και οι ουσίες εκπέμπουν με αποτέλεσμα να ανιχνεύονται. Έτσι με βάση το ένταση του φθορισμού μπορεί κανείς κάθε στιγμή να προσδιορίσει τον ακριβή αριθμό των αντιγράφων, τα οποία υπάρχουν σε σχέση με τον εκάστοτε κύκλο.
Γ) Ανιχνευτές Υβριδισμού (Hybridization probes - Roche). Εδώ υπάρχουν δύο ειδικά σημασμένα (με τα κατάλληλα φθοριοφόρα) ολιγονουκλεοτιδικά probes, τα οποία είναι σχεδιασμένα να υβριδοποιούν σε γειτονικές περιοχές του γονιδίου (απόσταση 1 4 βάσεις) Όταν τα probes είναι υβριδοποιημένα, τα φθοριοφόρα βρίσκονται πολύ κοντά μεταξύ τους και εκπέμπεται σήμα, το οποίο και ανιχνεύεται.
Τεχνολογία Micro-chip chip Πρόκειται για τεχνολογία που εξελίσσεται τα τελευταία χρόνια. Βασίζεται στην δυνατότητα να ενσωματώνομε μεγάλους αριθμούς από ειδικά DNA probes πάνω σε σταθερό μέσο (πχ. γυαλί). Έτσι το υπό μελέτη DNA, αφού αρχικώς δεχτεί με κάποια επεξεργασία μια φθορίζουσα ουσία, αφήνεται να διατρέξει το σύνολο των probes και να υβριδοποιηθεί με τα συμπληρωματικά του.
DNA chip microarrays Put a large number (~100K) of cdna sequences or synthetic DNA oligomers onto a glass slide (or other subtrate) ) in known locations on a grid. Label an RNA sample and hybridize Measure amounts of RNA bound to each square in the grid Make comparisons Cancerous vs. normal tissue Treated vs. untreated Time course Many applications in both basic and clinical research
Ιεραρχική Ομαδοποίηση της Γονιδιακής Εκφρασης
Η ΕΝΝΟΙΑΤΗΣ ΙΕΡΑΡΧΙΚΗΣ ΟΜΑΔΟΠΟΙΗΣΗΣ Α Β Ιεραρχική Ομαδοποίηση Υψηλή Χαμηλή Γονιδιακή έκφραση Δείγματα βιοψίας όγκου Δείγματα βιοψίας όγκου
Potential Microarray Applications Drug discovery / toxicology studies Mutation/polymorphism detection Differing expression of genes over: Time Tissues Disease States Sub-typing complex genetic diseases
Deletion Duplication Reciprocal translocation Ring Chromosome Terminal Deletion Insertion Inversion Robertsonian Translocation Isochromosomes http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/cai-e.htm
Ανίχνευση μεταλλαγών
Mutation detection Sequence DNA Hybridization Methods Blotting Chips Restriction enzyme polymorphisms: GAATTC versus GATTTC SNPs (single nucleotide polymorphisms)
More About SNPs SNPs SNPs in exons are called coding SNPs SNPs SNPs in introns or regulatory regions may affect transcription, translation, RNA stability, RNA splicing
SNP markers Neutral SNPs can be found that are linked to disease alleles. Linked SNPs can be used as markers for the disease in diagnostic tests. Closely linked markers rarely separate, a pair of flanking markers almost never do.
Γονιδιακή έκφραση Μεταγραφή της πληροφορίας που περιέχεται στο DNA σε μόρια mrna. - Πολύπλοκη και αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία που επιτρέπει σε ένα κύτταρο να απαντά δυναμικά στα περιβαλλοντικά ερεθίσματα και στις δικές του ανάγκες
Όλα τα κύτταρα στον οργανισμό μας έχουν το ίδιο γένωμα κωδικοποιημένο σε DNA. Όμως όλα τα κύτταρα του οργανισμού μας δεν είναι όμοια: ένα νευρικό κύτταρο, για παράδειγμα, είναι διαφορετικό από ένα κύτταρο του αίματος ή ένα μυϊκό κύτταρο. Η διαφορά εντοπίζεται στο γεγονός οτί κάθε τύπος κυττάρου έχει τη δυνατότητα να υιοθετήσει διαφορετικό γενετικό πρόγραμμα, ενεργοποιώντας ή καταστέλωντας συγκεκριμένα γονίδια στα διάφορα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και της ενηλικίωσης. κάθε κύτταρο «εκφράζει» διαφορετικά γονίδια.
Γιατί χρειαζόμαστε ένα χάρτη γονιδιακής έκφρασης; Η γνώση οτί ένα γονίδιο εκφράζεται σε ένα συγκεκριμένο αναπτυξιακό στάδιο, σε ένα συγκεκριμένο ιστό πιθανώς σημαίνει οτί αυτό το γονίδιο έχει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της ανάπτυξης ή στη λειτουργία αυτού του ιστού ή οργάνου. Το ίδιο ισχύει και για παθολογικές καταστάσεις: αν ένα γονίδιο εκφράζεται διαφορετικά σε ένα παθολογικό κύτταρο σε σχέση με ένα υγιές, αυτό σημαίνει ότι το ίδιο γονίδιο μπορεί να έχει συμμετοχή στην εκδήλωση της ασθένειας.
Ποιά είναι η διαφορά μεταξύ του άτλαντα έκφρασης και του χάρτη του ανθρώπινου γενώματος Ο χάρτης του γενώματος είναι η αλληλουχία των «γραμμάτων» του DNA που αποτελεί το γένωμα. Δηλαδή ποιά και πόσα γονίδια κάθε χρωμόσωμα περιέχει και το είδος της πρωτεϊνης που παράγουν. Όμως ο χάρτης του γενώματος δεν δίνει πληροφορίες για ποιό απο τα γονίδια δρα στους διαφορους ανθρώπινους ιστούς, στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια ή στις παθολογικές καταστάσεις.
Αυτού του είδους η πληροφορία υπάρχει στους χάρτες έκφρασης των γονιδίων: χάρη σε αυτούς αυτούς τους χάρτες γνωρίζουμε ποιά γονίδια είναι σημαντικά για τη διαμόρφωση ενός συγκεκριμένου ιστού ή οργάνου. Επιπλέον, μας βοηθάνε εκφράζονται διαφορετικά παθολογικούς ιστούς. στην αναγνώριση γονιδίων που στους υγιείς απο ότι στους Οι χάρτες γενώματος περιγράφουν τα χαρακτηριστικά του DNA, ενώ οι χάρτες έκφρασης περιγράφουν το RNA, ένα μόριο παρόμοιο με το DNA που παράγεται μόνο από ενεργά γονίδια. Κάθε ενεργό γονίδιο παράγει ένα διαφορετικό τύπο RNA: η ανάλυση της παρουσίας κάθε τύπου RNA μας λέει αν το συγκεκριμένο γονίδιο είναι ενεργό (= εκφράζεται) ή ανενεργό (= δεν εκφράζεται). Το ποσό του RNA που βρίσκεται σε κάθε ιστό δείχνει το βαθμό έκφρασης του συγκεκριμένου γονιδίου.
FEM1A and FEM1B: novel candidate genes for polycystic ovary syndrome. Goodarzi MO, Maher JF, Cui J, Guo X, Taylor KD, Azziz R. Hum Reprod. 2008 Dec;23(12):2842-9. Epub 2008 Aug 29. : Polymorphism in the insulin-like growth factor 1 gene is associated with age at menarche in caucasian females. Zhao J, Xiong DH, Guo Y, Yang TL, Recker RR, Deng HW. Hum Reprod. 2007 Jun;22(6):1789-94. Epub 2007 Mar 21. Single nucleotide polymorphisms of the gonadotrophin-regulated testicular helicase (GRTH) gene may be associated with the human spermatogenesis impairment. A Z, Zhang S, Yang Y, Ma Y, Lin L, Zhang W. Hum Reprod. 2006 Mar;21(3):755-9. Epub 2005 Nov 17
Some Diseases Involve Many Genes There are a number of classic genetic diseases caused by mutations of a single gene. There are also many diseases that are the result of the interactions of many genes: athsma,, heart disease, cancer Each of these genes may be considered to be a risk factor for the disease. Groups of SNP markers may be associated with a disease without determining mechanism
Clinical Applications DNA testing for genetic diseases and disease "risk" genes Issues of privacy and risk management counseling Every new disease-linked gene is a potential target for new drugs Pharmacogenomics - personalized drugs Gene therapy
Pharmacogenomics The use of DNA sequence information to measure and predict the reaction of individuals to drugs. Personalized drugs Faster clinical trials Less drug side effects
Cytochrome P450 ~10% of the Caucasian population is homozygous for alleles of the Cytochrome P450 gene CYP2D6 that do not metabolize the hypertension drug debrisoquine,, which can lead to dangerous vacular hypotension.
ACE Patients homozygous for an allele with a deletion in intron 16 of the gene for angiotensin-converting enzyme (ACE) showed no benefit from the hypertension drug enalapril while other patients did benefit.
Make Genetic Profiles Scan these populations with a large number of SNP markers. Find markers linked to drug response phenotypes. It is interesting, but not necessary, to identify the exact genes involved.
GWAS
Lots of Sequence Data How to extract useful knowledge from all of this data? Find the genes Maps, mutations, and markers (diagnostics) Function - Layers of information Protein product (homology) Expression (tissue specificity, inducible) Protein-protein and DNA-protein interactions Metabolic pathways
Long Term Implications A A "periodic table for biology" will lead to an explosion of research and discoveries - we will finally have the tools to start making systematic analyses of biological processes. Understanding the genome will lead to the ability to change it - to modify the characteristics of organisms and people in a wide variety of ways
Η μέθοδος εφαρμόζεται ευρέως για τον αποκλεισμό γονιδίων τα οποία είναι σίγουρο ότι θα προκαλέσουν κάποιο κληρονομικό νόσημα. Σε ορισμένες χώρες (Βέλγιο, Δανία, Ισπανία, Βρετανία, ΗΠΑ) επιτρέπεται να εφαρμοστεί και στην περίπτωση «γονιδίων προδιάθεσης», τα οποία είναι μόνο πιθανό, και όχι βέβαιο, ότι θα προκαλέσουν ανίατες ασθένειες. Προεμφυτευτικός έλεγχος για την αποφυγή του καρκίνου έχει εφαρμοστεί σε αρκετές περιπτώσεις στο Βέλγιο και τις ΗΠΑ. 9/1/09 Προληπτικός γενετικός έλεγχος Mωρό που ελέχθηκε για καρκινογόνο γονίδιο γεννήθηκε για πρώτη φορά στη Βρετανία
Eξόρυξη Γενωμικής Πληροφορίας για Aνακάλυψη Φαρμάκων Yπολογιστική Γενωμική Aνάλυση Συγκριτική γενωμική Φυλογενετικά πρότυπα Aνάλυση μοτίβων Mοριακές-μεταβολικές μελέτες Γονιδιακή σύντηξη Πειραματική Γενωμική Aνάλυση Mικροδιατάξεις DNA Πρωτεωμική Γενετική Tεχνολογίες αλληλεπίδρασης Γενωμική βάση πληροφοριών Aνίχνευση στόχων και ανάπτυξη νέων φαρμάκων