ΑΛΕΞΑΝΔΡΕΙΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΛΙΕΙΑΣ ΚΑΙ ΥΔΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ. Παράρτημα Νέων Μουδανιών

ΑΛΕΞΑΝΔΡΕΙΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΛΙΕΙΑΣ ΚΑΙ ΥΔΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Παράρτημα Νέων Μουδανιών Μορφομετρική ανάλυση της ωρίμανσης των ωοκυττάρων σε εκτρεφόμενους γεννήτορες του φαγκριού, Pagrus pagrus (Linnaeus, 1758) ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Κιάκη Αικατερίνη Νέα Μουδανιά 2009

ΑΛΕΞΑΝΔΡΕΙΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΛΙΕΙΑΣ ΚΑΙ ΥΔΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Παράρτημα Νέων Μουδανιών Μορφομετρική ανάλυση της ωρίμανσης των ωοκυττάρων σε εκτρεφόμενους γεννήτορες του φαγκριού, Pagrus pagrus (Linnaeus, 1758) Πτυχιακή εργασία: Κιάκη Αικατερίνη Επίβλεψη: Δρ. Λάμπρος Κοκοκύρης Νέα Μουδανιά 2009

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1.1. Γεννητική ωρίμανση στα ψάρια 1 1.2. Η Ωογένεση 1 1.3. Η επιλογή του μελετούμενου είδος 2 1.4. Σκοπός της εργασίας 3 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4 2.1. Προέλευση των ψαριών 4 2.2. Προέλευση των ιστολογικών παρασκευασμάτων 5 2.3. Παρατήρηση των ιστολογικών παρασκευασμάτων 5 2.4. Προσδιορισμός του σταδίου ωρίμανσης 6 2.5. Μέτρηση του μεγέθους (μέση διάμετρος) των ωοκυττάρων 6 2.6. Συχνότητες κατανομής των ωοκυττάρων κατά τάξεις μεγέθους και 6 διάμετρος διαχωρισμού 2.7. Στατιστική ανάλυση 6 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8 3.1. Μορφομετρικά στοιχεία των θηλυκών ατόμων 8 3.2. Στάδιο ωρίμανσης των θηλυκών ατόμων 9 3.3. Μορφολογική ανάλυση ωοκυττάρων 9 3.4. Μορφομετρική ανάλυση 18 3.4.1. Διάμετρος των ωοκυττάρων 18 3.4.2. Συχνότητα εμφάνισης των ωοκυττάρων κατά στάδιο ανάπτυξης 19 και κλάση μεγέθους των θηλυκών 3.4.3. Κατανομή του μεγέθους των ωοκυττάρων κάθε στάδιο ανάλογα 20 με το μέγεθος των θηλυκών 3.4.4. Διάμετρος διαχωρισμού των ωοκυττάρων κατά στάδιο ανάπτυξης 23 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 25 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 31 6. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 33 7. ABSTRACT 34 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 35

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η συγκεκριμένη πτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών του Τμήματος Τεχνολογίας Αλιείας και Υδατοκαλλιεργειών του Α.Τ.Ε.Ι. Θεσσαλονίκης, υπό την επίβλεψη του Δρ. Λάμπρου Κοκοκύρη, Καθηγητή Εφαρμογών του Τμήματος. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επιβλέποντα Καθηγητή μου, Δρ. Λάμπρο Κοκοκύρη, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντας μου το συγκεκριμένο θέμα, για την παραχώρηση των δειγμάτων, τη στήριξη και την καθοδήγηση του στη συγγραφή της πτυχιακής και τέλος την υπομονή του όλον αυτό το καιρό. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ. Γ. Σκούφα, Καθηγητή Εφαρμογών του Τμήματος, για την παραχώρηση του γραφείου του και την βοήθεια του στη χρήση του προγράμματος μετρήσεων στο οπτικό μικροσκόπιο και τον Δρ. Ν. Μονοκρούσο, Επιστημονικό Συνεργάτη του Τμήματος, για τη βοήθεια του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου, για την υπομονή τους και την βοήθεια που μου πρόσφεραν όλον αυτό το καιρό.

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Γεννητική ωρίμανση Με τον όρο γεννητική ωρίμανση, περιγράφουμε τη διαδικασία της ωρίμανσης των γεννητικών κυττάρων (γαμέτες) στα αναπαραγωγικά όργανα των ψαριών (γονάδων). Στα θηλυκά άτομα, η γαμετογένεση πραγματοποιείται στις ωοθήκες, περιλαμβάνει την παραγωγή των ωαρίων και ονομάζεται ωογένεση. Στην πλειονότητα των ψαριών, η διαδικασία της γαμετογένεσης είναι κυκλική, με ετήσια συχνότητα. Η γεννητική ωρίμανση, βρίσκεται υπό τον έλεγχο των περιβαλλοντικών παραγόντων. Οι κυριότερoι παράγοντες που επηρεάζουν τη γεννητική ωρίμανση των ψαριών, είναι η φωτοπερίοδος και η θερμοκρασία (Κοκοκύρης & Μίνος, 2002). 1.2. Ωογένεση Η μελέτη της γαμετογένεσης είναι σημαντική για την κατανόηση της αναπαραγωγικής δραστηριότητας των τελεόστεων, αφού είναι μια διαδικασία αναφοράς για τον προσδιορισμό της περιόδου ωοτοκίας, δεδομένου ότι περιγράφει το πρότυπο ανάπτυξης των γεννητικών κυττάρων (γαμετών). Η διαδικασία της ωογένεσης μπορεί να διαχωρισθεί σε τέσσερις φάσης: (1) φάση ηρεμίας ή ωογονίων, (2) προλεκιθογένεση (3) πρωτογενής αύξηση, (3) δευτερογενής αύξηση. Τα ωογόνια είναι τα πρώτα θηλυκά γεννητικά κύτταρα και εντοπίζονται στις γονάδες καθόλη της διάρκεια της ζωής των θηλυκών ψαριών, σε όλα τα είδη των ψαριών (Tyler & Sumpter, 1996). Εξαιτίας αυτού, η προέλευση τους, η διαφοροποίηση τους αλλά και η λειτουργία τους είναι θεμελιώδους σημασίας για τη βιολογική ανάπτυξη. Τα ωογόνια βρίσκονται στο βλαστικό επιθήλιο των ωοθηκών. Διαιρούνται μιτωτικά για να πολλαπλασιαστούν ή μειωτικά για να μετατραπούν σε νεαρά ωοκύτταρα, τα οποία με τη σειρά τους μετακινούνται μέσα στα ωοφόρα ελάσματα (Grier, 2000). Τα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά την ανάπτυξη των ωοκυττάρων (ωογένεση) είναι κοινά, δηλαδή παρόμοια στο σύνολο των ψαριών (Wallace & Selman, 1981). Στα ψάρια όπως και στα άλλα σπονδυλωτά, τα πρώτα σημάδια της ωρίμανσης των ωοκυττάρων, παρατηρούνται αρχικά στα ωοφόρα ελάσματα των ωοθηκών και αργότερα στα ωοθυλάκια, τα οποία σχηματίζονται περιβάλλοντας τα ωοκύτταρα, από τα κύτταρα της κοκκιώδους στιβάδας, τα κύτταρα της θήκης αλλά και την ακτινωτή ζώνη (το ακυτταρικό χόριο), (Tyler & Sumpter, 1996). Τα ωοθυλάκια υφίστανται πολλές αλλαγές κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των ωοκυττάρων. Οι αλλαγές αυτές μας βοηθούν να κατηγοριοποιήσουμε τη διαδικασία της ωογένεσης σε βήματα. Το κύριο χαρακτηριστικό αυτών των βημάτων (ή και σταδίων) είναι η αύξηση του μεγέθους των ωοκυττάρων και των ωοθυλακίων ως αποτέλεσμα της λεκιθογένεσης αλλά και της ανάπτυξης του κυτοπλάσματος (Wallace & Selman, 1981). 1. Εισαγωγή 1

H ανάπτυξη των ωοκυττάρων των τελεόστεων έχει μελετηθεί από πολλούς ερευνητές, σε πολλές οικογένειες (Selman & Wallace, 1989, Τyler & Sumpter, 1996, Grier 2000) και μεταξύ αυτών και στην οικογένεια των Σπαροειδών, τα οποία συνιστούν μια οικογένεια με μεγάλη οικονομική αξία και εμπορικό ενδιαφέρον (Kokokiris et al., 1999, 2001, Ramos 2003). Ως αποτέλεσμα αυτών των ερευνών, η ανάπτυξη των ωοκυττάρων έχει διαχωριστεί σε στάδια με πολλούς διαφορετικούς τρόπους. Παρά τις έρευνες επί του αναπαραγωγικού κύκλου, των τελεόστεων όλου του κόσμου, οι έρευνες για την ανάπτυξη των ωοκυττάρων σε σχέση με το μέγεθος των θηλυκών είναι εξαιρετικά περιορισμένες. Σε μια σχετικά πρόσφατη έρευνα της ωογένεσης στο πρωτόγυνο ερμαφρόδιτο είδος Synbranchus marmoratus (mussum), oι Spadella et al. (2005), επισημαίνουν ότι η ποικιλότητα του μεγέθους των ωοκυττάρων των διαφόρων σταδίων ανάπτυξης, είναι τόσο μεγάλη μεταξύ των ατόμων ενός είδους αλλά και μεταξύ των ειδών, ώστε για την κατανόηση του προτύπου ανάπτυξης των ωοθυλακίων, είναι απαραίτητο να προηγηθεί η περιγραφή της σχέσης ανάμεσα στην ανάπτυξη των ωοκυττάρων και στην αύξηση των θηλυκών ατόμων. Ένα βασικό ερώτημα που τίθεται είναι: «μεταβάλλεται ή παραμένει αμετάβλητο, το μέγεθος των ωοκυττάρων κατά τη διάρκεια της αύξησης των θηλυκών τελεόστεων;». Στην εργασία τους, οι προαναφερόμενοι ερευνητές επισημαίνουν ότι για το είδος Synbranchus marmoratus, το μέγεθος των ωοκυττάρων αυξάνεται στα μεγαλόσωμα θηλυκά άτομα. Η διαπίστωση αυτή ανοίγει νέους ορίζοντες για την εξακρίβωση της σχέσης του μεγέθους του αβγού με το μέγεθος των θηλυκών ατόμων. 1.3. Η επιλογή του μελετούμενου είδους Το φαγκρί (Perciformes, Sparidae, Pagrus pagrus, L. 1758) είναι ένα είδος της οικογένειας των Σπαροειδών. Απαντά σε βραχώδεις, χαλικώδεις βυθούς με ακανόνιστη διαμόρφωση και λιγότερο σε αμμώδεις περιοχές (Κοκοκύρης, 1998). Το χειμώνα ζει σε βαθειά νερά ενώ την άνοιξη πλησιάζει τις ακτές. Είναι σαρκοφάγο είδος και τρέφεται κυρίως με ασπόνδυλα και σπανιότερα με φύκη (Μίνος, 2005). Απαντάται σε βάθη από 30-60m (13 C-26 C) αλλά μερικές φορές έχει βρεθεί και στα 180m (Manooch, 1975). Δεν μεταναστεύει σε μεγάλες αποστάσεις και οι τοπικές μετακινήσεις του δεν είναι εκτεταμένες (Kentouri et al., 1994). Το φαγκρί ωριμάζει για πρώτη φορά στην ηλικία των 3-4 χρόνων αλλά περισσότερα από το 50% των θηλυκών, ωριμάζουν στην ηλικία των 4-5 χρόνων. Η ωογένεση αρχίζει την περίοδο Νοέμβριου-Οκτωβρίου, η λεκιθογένεση τον Ιανουάριο ενώ η ωοτοκία αρχίζει τον Μάρτιο και διαρκεί μέχρι τον Μάιο, στην περιοχή της Μεσογείου (Κοκοκύρης, 1998, Kokokiris et al., 2001). Είναι πρωτόγυνο ερμαφρόδιτο είδος, με δυανδρική πρωτογυνία (Kokokiris et al., 1999). H πλειονότητα των ατόμων του είναι θηλυκά μέχρι την ηλικία της πρώτης γεννητικής ωρίμανσης ενώ μετά τα περισσότερα άτομα αλλάζουν φύλο και μετατρέπονται σε αρσενικά (δευτερογενή αρσενικά), (Kokokiris et al., 1999, 2006). 1. Εισαγωγή 2

Είναι είδος με υψηλή εμπορική αξία και ζήτηση, με μια ευρεία γεωγραφική εξάπλωση και κατά συνέπεια με μια μεγάλη αγορά όχι μόνο στην Ευρώπη αλλά και στην Αμερική. Έχει γρήγορο ρυθμό αύξησης σε συνθήκες εκτροφής, είναι ανθεκτικό σε ασθένειες, και προσαρμόζεται σε μεγάλες ιχθυοφορτίσεις (Kentouri et al., 1994). Σήμερα πλέον, ο έλεγχος της αναπαραγωγής του σε συνθήκες εκτροφής είναι εφικτός. Ο αναπαραγωγικός κύκλος και ο ορμονικός έλεγχος του κύκλου έχουν περιγραφεί (Kokokiris et al., 1999, 2000, 2001). Το είδος αυτό μπορεί να ωοτοκεί αυθόρμητα σε συνθήκες εκτροφής (Mylonas et al., 2003, 2004) ή και να ωοτοκεί με τεχνητή πρόκληση (Κokokiris et al., 2005) παράγοντας ένα σημαντικό αριθμό αβγών, ικανό να υποστηρίξει τη λειτουργία ενός εκκολαπτηρίου. Επιπλέον πολλές άλλες όψεις της βιολογίας του είδους σε συνθήκες εκτροφής είναι γνωστές (Fostier et al., 2000, Pavlidis et al., 2005, Kokokiris et al., 2006, Minos et al., 2007). Σήμερα πλέον το φαγκρί εκτρέφεται και παράγεται σε σημαντικές ποσότητες στη θάλασσα της Μεσογείου. Όμως, απομένουν πολλές όψεις της αναπαραγωγικής βιολογίας του φαγκριού που θα μπορούσαν να διερευνηθούν. Επιπρόσθετα, το είδος αυτό εξαιτίας του ερμαφροδιτισμού του, αποτελεί ένα αξιόλογο πειραματικό μοντέλο με πληροφορίες που μπορεί να φανούν εξαιρετικά χρήσιμες. 1.4. Σκοπός της εργασίας Ο σκοπός αυτής της εργασίας είναι: (1) να περιγράψει τα μορφολογικά χαρακτηριστικά (σε υποκυτταρικό επίπεδο) των ωοκυττάρων του φαγκριού στα διάφορα στάδια ανάπτυξης (ωογένεσης), με την παρατήρηση ιστολογικών παρασκευασμάτων των γονάδων, σε οπτικό μικροσκόπιο και (2) να περιγράψει το μέγεθος των ωοκυττάρων σε σχέση με την αύξηση (το μέγεθος) των θηλυκών ατόμων, ώστε να συγκεντρώσουμε πληροφορίες και να κατανοήσουμε καλύτερα το πρότυπο ανάπτυξης των ωοκυττάρων σ αυτό το ερμαφρόδιτο και εμπορικό είδος ψαριού. 1. Εισαγωγή 3

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. Προέλευση των ψαριών H εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε σε ιστολογικά παρασκευάσματα από γονάδες θηλυκών φαγκριών, που παραχωρήθηκαν από τον επιβλέποντα καθηγητή μου Δρ. Λάμπρο Κοκοκύρη, Καθηγητή Εφαρμογών του Τμήματος Τεχνολογίας Αλιείας και Υδατοκαλλιεργειών του ΑΤΕΙ Θεσσαλονίκης. Τα παρασκευάσματα προέρχονταν από 137 θηλυκά φαγκριά (Pagrus pagrus), ηλικίας 1 έως 5 ετών, που αλιεύθηκαν κατά τη διάρκεια της περιόδου ωοτοκίας του είδους (Φεβρουάριος-Μάιος), μετά από τυχαία επιλογή (Πίνακας 2.1). Πίνακας 2.1. Αριθμός θηλυκών που επιλέχθηκαν από κάθε μήνα της περιόδου ωοτοκίας του είδους και κάθε κλάση μεγέθους 1. Κλάση μεγέθους θηλυκών Μήνας Δειγματοληψίας 1 2 3 4 5 Σύνολο Φεβρουάριος 3 10 7 2 22 Μάρτιος 9 15 5 9 4 42 Απρίλιος 2 13 10 7 5 37 Μάιος 5 14 9 4 4 36 Σύνολο 19 42 34 27 15 137 Τα ψάρια εκτρέφονταν στις εγκαταστάσεις του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών, (ΕΛΚΕΘΕ, Τμήμα Υδατοκαλλιεργειών, Κρήτη) σε υπαίθριες τσιμεντένιες δεξαμενές, όγκου 10m 3, με πυκνότητα που κυμαίνονταν από 2 έως 12Kg/m 3. Το νερό διοχετεύονταν σε κάθε δεξαμενή μέσω ενός απλού συστήματος ροής, βασισμένου στην υψομετρική διαφορά μεταξύ μιας κεντρικής δεξαμενής συλλογής του αντλούμενου νερού από τη θάλασσα και των πειραματικών δεξαμενών εκτροφής. Τα ψάρια τρέφονταν με βιομηχανική τροφή υπό τη μορφή σύμπηκτων. Η τροφή παρέχονταν από ταΐστρες αυτοδιατροφής, ειδικά προσαρμοσμένες στις δυνατότητες χειρισμού κάθε 1 Για περισσότερες πληροφορίες ως προς τις κλάσεις μεγέθους των θηλυκών, ανατρέξτε στα Αποτελέσματα (παράγραφος 3.1.) 2. Υλικά και Μέθοδοι 4

κατηγορίας μεγέθους ψαριών (Kentouri et al., 1986). Τα ψάρια είχαν πρόσβαση στις ταΐστρες, καθόλη τη διάρκεια του εικοσιτετραώρου και τρέφονταν ad libidum. Κατά τη δειγματοληψία των γονάδων τα ψάρια ζυγίζονταν για τη μέτρηση του ολικού βάρους (ζυγός Ohaϊus, 0,01g) και μετρούνταν το σταθερό (SL), το μεσουραίο (FL) και το ολικό μήκος (TL) τους (ακρίβεια 0,1cm). Από κάθε ψάρι αφαιρέθηκαν οι γονάδες και ζυγίστηκαν για τον υπολογισμό του γοναδοσωματικού δείκτη (GSI, %) σύμφωνα με τη σχέση: Γοναδοσωματικός δείκτης (GSI, %)=100 x Βάρος γονάδων/ Σωματικό βάρος 2.2. Προέλευση των ιστολογικών παρασκευασμάτων Για τη δημιουργία των παρασκευασμάτων πάρθηκε δείγμα από το μεσαίο τμήμα της δεξιάς γονάδας κάθε θηλυκού αφού οι δυο γονάδες αναπτύσσονται ομοιόμορφα (Κοκοκύρης et al. 1995). Το δείγμα των γονάδων μονιμοποιήθηκε σε υγρό Bouin-Hollande και μετά την πάροδο 7-15 ημερών σε διάλυμα εξουδετερωμένης φορμόλης 10%. Η παρασκευή των ιστολογικών παρασκευασμάτων των γονάδων, έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο επεξεργασίας και χρώσης ιστών κατά Gabe (1986) στον Κοκοκύρης (1998). Η αφυδάτωση έγινε με εμβαπτίσεις συγκεκριμένης διάρκειας, σε διαλύματα αυξανόμενης συγκέντρωσης απόλυτης αιθανόλης και μίγματος απόλυτης αιθανόλης και βουτανόλης (50:50). Οι γονάδες διαποτίστηκαν με παραφίνη σημείου τήξης 56 0 C και ως διαλύτης σκήνωσης χρησιμοποιήθηκε ξυλόλη ή βουτανόλη. Οι τομές έγιναν σε χειροκίνητη μικροτόμο τύπου 2035 Biocut-Jung, (Leica),σε πάχος 4-7μm και ενυδατώθηκαν σε διάλυμα αιθανόλης φθίνουσας συγκέντρωσης. Οι τομές χρωματίστηκαν με χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης σύμφωνα με το πρωτόκολλο κατά Clark (1981). 2.3. Παρατήρηση των ιστολογικών παρασκευασμάτων Τα παρασκευάσματα παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο τύπου OLYMPUS Bx40, επάνω στο οποίο ήταν συνδεδεμένη ψηφιακή κάμερα τύπου SONY Digital-video Exwave HAD και σύστημα Η/Υ και ανάλυσης εικόνας. Το πρόγραμμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν CellˆΑ Soft Imagine System. Σε κάθε παρασκεύασμα επιλέχθηκαν πέντε πεδία παρατήρησης (ραχιαίο, κοιλιακό, πλευρικό 1, 2, κεντρικό). Τα πεδία φωτογραφήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στον υπολογιστή οι αντίστοιχες φωτογραφίες, από τις οποίες έγινε ο χαρακτηρισμός των ωοκυττάρων και η μέτρηση του μεγέθους τους. 2. Υλικά και Μέθοδοι 5

2.4. Προσδιορισμός του σταδίου ωρίμανσης Από τα παρασκευάσματα προσδιορίστηκε το στάδιο ωρίμανσης των γονάδων. Τα κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η σχετική αφθονία των διαφόρων τύπων ωοκυττάρων και η παρουσία του πιο ανεπτυγμένου τύπου ωοκυττάρων (σύμφωνα με τους Κokokiris et al., 1999, 2001). 2.5. Μέτρηση του μεγέθους (μέση διάμετρος) των ωοκυττάρων Για τον υπολογισμό του μεγέθους των ωοκυττάρων, σε κάθε πεδίο της κάθε τομής, τα ωοκύτταρα κατατάχθηκαν αρχικά σε στάδια ανάπτυξης (προλεκιθογόνα, λεκιθογόνα, λεκιθικά α, λεκιθικά β) σύμφωνα με την κλίμακα των Kokokiris et al., (1998). Ακολούθως στον πληθυσμό κάθε σταδίου ανάπτυξης, μετρήθηκε η μέση διάμετρος σε αριθμό ωοκυττάρων που διέφερε ανάλογα με το μέγεθος των ωοκυττάρων και τη μεγέθυνση της παρατήρησης (x4 ή x10). Το μέγεθος των ωοκυττάρων περιγράφηκε από τη μέση τιμή της μέγιστης και της ελάχιστης διαμέτρου. 2.6. Συχνότητες κατανομής των ωοκυττάρων κατά τάξεις μεγέθους και διάμετρος διαχωρισμού Τα ωοκύτταρα κάθε θηλυκού και τα ωοκύτταρα κάθε κλάσης ομαδοποιήθηκαν με κριτήριο το μέγεθος τους (μέση διάμετρος, μm) σε κλάσεις μεγέθους από 17 έως 340μm με εύρος κλάσης τα 10μm. Σε κάθε κλάση μεγέθους, υπολογίστηκε η συχνότητα εμφάνισης των ωοκυττάρων κάθε σταδίου (π.χ. προλεκιθογόνων-λεκιθογόνων, λεκιθογόνων-λεκιθικών). Ως διάμετρος διαχωρισμού των προλεκιθογόνων από τα λεκιθογόνα ωοκύτταρα ορίστηκε ο διάμεσος της κλάσης μεγέθους στην οποία η συχνότητα παρατήρησης ενός προλεκιθογόνου ή ενός λεκιθογόνου ωοκυττάρου είναι ίδια και ίση 50% (ή διαφορετικά η πιθανότητα παρατήρησης του ενός ή του άλλου τύπου ωοκυττάρων είναι ίδια και ίση με 0,5). Κατ αντίστοιχο τρόπο, ως διάμετρος διαχωρισμού των λεκιθογόνων από τα λεκιθικά ορίστηκε ο διάμεσος της κλάσης μεγέθους στην οποία η συχνότητα παρατήρησης ενός λεκιθογόνου ή ενός λεκιθικού είναι ίδια και ίση 50%. H διάμετρος διαχωρισμού (ΜD 50%, ) υπολογίστηκε διαγραμματικά αντιστοιχίζοντας τη συχνότητα παρατήρησης 50% στην κλάση μεγέθους των ωοκυττάρων κάθε σταδίου. 2.7. Στατιστική ανάλυση Οι μετρήσεις της διαμέτρου των ωοκυττάρων ανά θηλυκό και στάδιο ανάπτυξης ωοκυττάρου καταχωρήθηκαν σε φύλλο εργασίας του λογισμικού προγράμματος, Microsoft Office Εxcel 2003. H ανάλυση των στοιχείων έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα, Statistica 7,0 (Stat Soft). 2. Υλικά και Μέθοδοι 6

Oι μέσες τιμές συγκρίθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA, one way, παραμετρική ανάλυση), σε επίπεδο σημαντικότητας α=0,001. Ο έλεγχος των στατιστικά σημαντικών διαφορών έγινε με τη δοκιμή Bonferoni (Ζar, 1999). Oι συχνότητες παρατήρησης των ωοκυττάρων μεταξύ των θηλυκών διαφορετικών μεγεθών, ελέγχθηκαν με την κατανομή Χ 2 (Ζar, 1999). 2. Υλικά και Μέθοδοι 7

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. Μορφομετρικά στοιχεία των θηλυκών ατόμων Τα θηλυκά που μελετήθηκαν κατατάχθηκαν σε 5 κλάσεις μεγέθους, με κριτήριο τις μετρήσεις του σταθερού μήκους (SL, cm). Στην 1 η κλάση ανήκαν τα θηλυκά με σταθερό μήκος από 19 έως 22,9cm (Πίνακας 3.1), στην 2 η κλάση τα θηλυκά μήκους από 23,6 έως 27,5cm, στην 3 η κλάση τα θηλυκά μήκους από 27,6 έως 31,8cm, στην 4 η κλάση τα θηλυκά μήκους από 31,9 έως 35,5cm και τέλος στην 5 η κλάση τα θηλυκά σταθερού μήκους από 36,5 έως και 40,3cm. To μέσο βάρος των θηλυκών ανά κλάση μεγέθους κυμάνθηκε από 376 (1 η κλάση, (ΒW)) έως 2083g (5 η κλάση, Πίνακας 3.2) ενώ ο μέσος γοναδοσωματικός δείκτης (GSI, %) από 0,1% στα ψάρια της 1 η κλάσης μέχρι 3,9% στα θηλυκά της 5 ης κλάσης. Πίνακας 3.1. Εύρος μήκους (SL: σταθερό, FL: μεσουραίο, TL:ολικό) και μέσο μήκος (±SE), (SL, FL, TL, σε cm), των θηλυκών ατόμων κάθε κλάσης μεγέθους (1-5). Κλάση μεγέθους Εύρος SL (cm) SL (cm) Εύρος FL(cm) FL (cm) Εύρος TL (cm) TL (cm) 1 19,0-22,9 21,4 (0,28) 20,7-24,5 22,6 (0,26) 23,9-28,5 26,5 (0,32) 2 23,6-27,5 26,1 (0,19) 23,5-29,2 27,6 (0,24) 27,2-34,6 32,2 (0,27) 3 27,6-31,8 29,7 (0,25) 27,1-33,9 31,4 (0,25) 33,0-39,5 36,9 (0,32) 4 31,9-35,5 33,2 (0,22) 33,3-37,1 35,1 (0,22) 39,2-43,7 41,0 (0,26) 5 36,5-40,3 37,9 (0,28) 38,4-41,9 39,9 (0,27) 43,8-48,4 46,0 (0,33) Πίνακας 3.2. Εύρος και μέση τιμή (±SE) του σωματικού βάρους (BW, g) και του γοναδοσωματικού δείκτη (GSI, %) των θηλυκών ατόμων κάθε κλάσης μεγέθους (1-5). Κλάση μεγέθους Εύρος BW (g) BW Εύρος GSI (%) GSI (%) 1 288-498 376 (14,7) 0,08-0,26 0,1 (0,02) 2 437-888 706 (17,5) 0,11-4,03 1,0 (0,15) 3 758-1381 1038 (26,4) 0,09-7,38 2,4 (0,32) 4 1138-1807 1435 (32,5) 0,31-9,37 3,3 (0,38) 5 1762-2513 2083 (59,4) 1,29-6,67 3,9 (0,43) 3. Αποτελέσματα 8

3.2. Στάδιο ωρίμανσης των θηλυκών ατόμων Τα περισσότερα θηλυκά ήταν ώριμα (στάδιο λεκιθογένεσης, F3, n=64, Πίνακας 3.3.) ενώ μόνο τρία θηλυκά ήταν σε φάση ωοτοκίας (στάδιο τελικής ωρίμανσης, F4). Σημαντική ήταν η συμμετοχή στο δείγμα, των ανώριμων (στάδιο προλεκιθογένεσης, F1, n=46) αλλά και των ωριμαζόντων θηλυκών (στάδιο πρωτογενούς αύξησης, F2, n=24). Πίνακας 3.3. Στάδιο ωρίμανσης των θηλυκών που εξετάστηκαν ανά κλάση μεγέθους. Κλάση μεγέθους F1 F2 F3 F4 Σύνολο 1 18 1 19 2 15 16 11 42 3 7 4 22 1 34 4 4 2 20 1 27 5 2 1 11 1 15 Σύνολο 46 24 64 3 137 3.3. Μορφολογική ανάλυση των ωοκυττάρων Ωογόνια Τα ωογόνια απαντούν κατά ομάδες. Περιβάλλονται από μια λεπτή αδιαφανή μεμβράνη. Τα μεγάλα ωογόνια είναι σφαιρικά, το κυτόπλασμα τους, είναι διαφανές και φέρει ένα μεγάλο σφαιρικό πυρήνα, τοποθετημένο κεντρικά.(εικόνα 3.1) Προλεκιθογόνα Τα ωοκύτταρα αυτά χαρακτηρίζονται από ένα μεγάλο πυρήνα συνήθως τοποθετημένο στο κέντρο του κυττάρου (Εικόνα 3.1). Tο μέγεθος του κυτοπλάσματος είναι αυξημένο σε σχέση με το μέγεθος του πυρήνα. Στο εσωτερικό του πυρήνα παρατηρούνται πολλοί πυρηνίσκοι (14-20) διατεταγμένοι στην περιφέρεια, εσωτερικά της πυρηνικής μεμβράνης. Τα μικρά προλεκιθογόνα είναι σφαιρικά ενώ τα μεγάλα προλεκιθογόνα τείνουν να έχουν παραβολικό σχήμα. Το κυτόπλασμα έχει τη μορφή ομοιογενούς ζώνης με έντονη οξεοφιλία. Σταδιακά το μέγεθος του κυτοπλάσματος αυξάνεται (η πυρηνοπλασματική αναλογία μειώνεται), γίνεται λιγότερο οξεόφιλο και μέσα του παρατηρούνται σκοτεινόχρωμες ζώνες πυκνού υλικού. 3. Αποτελέσματα 9

Στα προλεκιθογόνα ωοκύτταρα δεν διακρίνεται η ακτινωτή ζώνη. Το ωοθυλάκιο διακρίνεται ως μια λεπτή ζώνη που περιβάλλει το ωοκύτταρο αλλά οι λεπτομέρειες της δομής του ωοθυλακίου δεν διακρίνονται. Λεκιθογόνα (πρωτογενής αύξηση) Στο κυτταρόπλασμα εμφανίζονται λιπιδιακά κυστίδια, αρχικά στην περιοχή γύρω από τον πυρήνα. Το σχήμα τους είναι σφαιρικό ή παραβολικό, είναι λευκά και απαντούν σε διάφορα μεγέθη (μικρά, μεσαία και μεγάλα). Σταδιακά μετατοπίζονται προς την περιφέρεια του κυτοπλάσματος, όπου αυξάνονται σε αριθμό και σε μέγεθος (Εικόνα 3.2). Στα μικρότερα λεκιθογόνα, το κυτόπλασμα δεν είναι πια οξεόφιλο. Ο πυρήνας χάνει τη σφαιρικότητα του και η πυρηνική μεμβράνη αποκτά μια ακανόνιστη εμφάνιση. Στην εξωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης διακρίνεται για πρώτη φορά η ακτινωτή ζώνη (χόριο). Είναι μια λεπτή ακυτταρική μεμβράνη, ανοιχτού ροζ χρώματος ανάμεσα στο ωοθυλάκιο και το κυτόπλασμα. Επίσης στο στάδιο αυτό διακρίνεται για πρώτη φορά η δομή του ωοθυλακίου. Στο εσωτερικό τμήμα του ωοθυλακίου διακρίνεται μια σειρά κυβοειδών κυττάρων (κοκκιώδης στοιβάδα) και στο εξωτερικό, το στρώμα των καλυπτικών κυττάρων (θήκη). Μεταξύ της θήκης και της κοκκιώδους στιβάδας παρεμβάλλεται μια λεπτή βασική μεμβράνη. Λεκιθικά α (α, αρχικό στάδιο, δευτερογενής αύξηση) Στο κυτόπλασμα (κυρίως στην περιφέρεια του), παρατηρούνται πληθυσμοί σφαιρικών κυστιδίων. Το μέγεθος τους είναι μικρό και βάφονται κόκκινα με την αιματοξυλίνη (Εικόνα 3.3). Στην εξωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης διακρίνεται η ακτινωτή ζώνη (χόριο) αλλά το πάχος της είναι μεγαλύτερο, συγκριτικά με το προηγούμενο στάδιο. Επίσης το ωοθυλάκιο είναι παχύτερο, κυρίως εξαιτίας της πάχυνσης των κοκκιωδών κυττάρων. Λεκιθικά β (β, τελικό στάδιο, δευτερογενής αύξηση) Στο κυτταρόπλασμα εμφανίζονται μεγάλα κοκκία (βασεόφιλα) (Εικόνα 3.4) αλλά και λιπιδιακά κυστίδια, μεγαλύτερου μεγέθους από αυτά που παρατηρούνται στα λεκιθογόνα ωοκύτταρα. Ο πυρήνας είναι λιγότερο οξεόφιλος ενώ οι πυρηνίσκοι απομακρύνονται από την πυρηνική μεμβράνη και κατανέμονται τυχαία στο πυρηνόπλασμα. Στα μεγάλα ωοκύτταρα, ο πυρήνας δεν διακρίνεται γιατί περιβάλλεται από μεγάλο αριθμό λιπιδιακών κυστιδίων και λεκιθικών κοκκίων. Το κυτόπλασμα περιορίζεται εσωτερικά της ακτινωτής ζώνης (χόριο) ως μια λεπτή, οξεόφιλη ζώνη. Η ακτινωτή ζώνη έχει παχύνει σημαντικά (είναι στο μέγιστο πλάτος) και εμφανίζεται διζωνική, με μια χαρακτηριστική κάθετη γράμμωση. Η εξωτερική ακτινωτή ζώνη είναι περισσότερο βασεόφιλη από την εσωτερική και βάφεται πιο έντονα με την εωσίνη. 3. Αποτελέσματα 10

Ώριμα ωοκύτταρα Το μέγεθος τους είναι μεγάλο και το σχήμα τους ακανόνιστο. Τα ωοκύτταρα αυτά δεν διαθέτουν εμφανή πυρήνα στο οπτικό μικροσκόπιο (Εικόνα 3.5). Στο κυτόπλασμα τους δεν διακρίνονται πλέον λεκιθικά κυστίδια ενώ τα λιπιδιακά κυστίδια είναι λίγα ή και ανύπαρκτα. Σε μερικά ωοκύτταρα διακρίνεται η λιπιδιακή σταγόνα, προερχόμενη από τη σύντηξη μικρότερων λιπιδιακών κυστιδίων. Το κυτταρόπλασμα είναι γεμάτο με ένα άμορφο και ομογενοποιημένο υλικό. Το χόριο και το ωοθυλάκιο διακρίνονται ως δύο πολύ λεπτές ζώνες που περιβάλλουν το ωοκύτταρο. Σ αυτό το στάδιο τα ωοκύτταρα έχουν χάσει την τονικότητα τους και το σχήμα τους είναι ακανόνιστο (Εικόνα 3.5). Ατρητικά ωοκύτταρα Μερικά ωοκύτταρα και κυρίως λεκιθικά, μεταπίπτουν σε ατρησία. Η ανάπτυξη τους διακόπτεται, αρχίζουν να εκφυλίζονται και ακολούθως απορροφώνται. Το σχήμα αυτών των ωοκυττάρων είναι ακανόνιστο. Διακρίνουμε εύκολα την υπερτροφία του ωοθυλακίου και την έντονη εωσινοφιλία του κυτοπλάσματος (Εικόνα 3.6). Κατά την έναρξη του εκφυλισμού τα κοκκιώδη κύτταρα παχαίνουν, πολλαπλασιάζονται, πλησιάζουν την ακτινωτή ζώνη και εισβάλλουν στο ωόπλασμα. Η ακτινωτή ζώνη αρχίζει να αποικοδομείται και προοδευτικά εξαφανίζεται. Τα λιπιδιακά κυστίδια διαρρηγνύονται και το περιεχόμενο τους απλώνεται στην περιφέρεια του κυτοπλάσματος, ως μια μάζα άμορφου, ομογενούς λευκού υλικού ενώ κατά παρόμοιο τρόπο το περιεχόμενο των λεκιθικών κυστιδίων απελευθερώνεται στο κυτόπλασμα και συγκεντρώνεται στο κέντρο του ως μια συμπαγής βασεόφιλη μάζα. Ο πυρήνας αποκτά ακανόνιστη εμφάνιση και σταδιακά απορροφάται και εξαφανίζεται. Στο τελικό στάδιο της ατρησίας, απομένουν μόνο τα κύτταρα του ωοθυλακίου (εωσινόφιλη κοκκιώδης μάζα ακανόνιστου σχήματος), μαζί με διάφορες συναθροίσεις αποικοδομημένου υλικού, καφεκίτρινου χρώματος. Τελικά το μέγεθος του ωοθυλακίου περιορίζεται σημαντικά ενώ προοδευτικά το ωοθυλάκιο απορροφάται και τελικά εξαφανίζεται. 3. Αποτελέσματα 11

Εικόνα 3.1. Ιστολογικές τομές του Pagrus pagrus στο στάδιο της προλεκιθογένεσης. Εικ.3.1.1: Γενική άποψη της ωοθήκης στο στάδιο της προλεκιθογένεσης. Εικ.2-5: Λεπτομέρειες των προλεκιθογόνων ωοκυττάρων. κυτ:κυτόπλασμα, πλκ ω:προλεκιθογόνα ωοκύτταρα, πυρ:πυρήνας, πυρν:πυρηνίσκος, σ ι:συνδετικός ιστός, ωθλκ:ωοθυλάκιο, ωογ:ωογόνια. Μήκος κλίμακας: 30.77μm. 3. Αποτελέσματα 12

Εικόνα 3.2. Ιστολογικές τομές του Pagrus pagrus στο στάδιο της πρωτογενής αύξησης. Εικ.3.2.1: Γενική άποψη της ωοθήκης στο στάδιο της πρωτογενούς αύξησης. Εικ.3.2.2-4: Λεπτομέρειες των λεκιθογόνων ωοκυττάρων θ:θήκη, κυτ:κυτόπλασμα, λεκγ ω: λεκιθογόνα ωοκύτταρα, λιπ κσ:λιπιδιακά κυστίδια, πλκ ω:προλεκιθογόνα ωοκύτταρα, πυρ:πυρήνας, πυρν:πυρηνίσκος, φλ μ:φλοιώδη μοίρα, χ:χόριο. Μήκος κλίμακας:30-77μm. 3. Αποτελέσματα 13

Εικόνα 3.3. Ιστολογικές τομές του Pagrus pagrus στο στάδιο της έναρξης της δευτερογενής αύξησης. Εικ.3.3.1: Γενική άποψη της ωοθήκης στο στάδιο της έναρξης της δευτερογενής αύξησης.εικ.3.3.2-5: Λεπτομέρειες των λεκιθικών α ωοκυττάρων. θ:θήκη, λεκ α ω: λεκιθικά α ωοκύτταρα, λιπ κσ:λιπιδιακά κυστίδια, λεκ κσ:λεκιθικά κυστίδια, πυρ:πυρήνας, πυρν:πυρηνίσκος, χ:χόριο. Μήκος κλίμακας:30-77μm. 3. Αποτελέσματα 14

Εικόνα 3.4. Ιστολογικές τομές του Pagrus pagrus στο τελικό στάδιο της δευτερογενής αύξησης. Εικ.3.4.1: Γενική άποψη της ωοθήκης στο τελικό στάδιο της δευτερογενής αύξησης.εικ.3.4.2-4: Λεπτομέρειες των λεκιθικών β ωοκυττάρων. ακτ ζ εσ:ακτινωτή ζώνη εσωτερικά, ακτ ζ εξ:ακτινωτή ζώνη εξωτερικά, θ:θήκη, κυτ:κυτόπλασμα, λεκ β ω:λεκιθικά β ωοκύτταρα, λιπ κσ:λιπιδιακά κυστίδια, λεκ κσ:λεκιθικά κυστίδια, πυρ:πυρήνας, πυρν:πυρηνίσκος, χ:χόριο. Μήκος κλίμακας:30-77μm. 3. Αποτελέσματα 15

Εικόνα 3.5. Ιστολογικές τομές του Pagrus pagrus στο στάδιο της τελικής ωρίμανσης. Εικ.3.5.2: Ώριμα ωοκύτταρα το μέγεθος τους είναι μεγαλύτερο από τα λεκιθικά β. Εικ.3.5.2-3: Λεπτομέρειες των ώριμων ωοκυττάρων. κυτ:κυτόπλασμα, λεκ λέκιθος, χ:χόριο, ωρ ω:ώριμο ωοκύτταρο. Μήκος κλίμακας:30-77μm. 3. Αποτελέσματα 16

Εικόνα 3.6. Ιστολογικές τομές του Pagrus pagrus σε ατρησία. Εικ.3.6.1: Γενική άποψη ωοθήκης από λεκιθικά ατρητικά ωοκύτταρα. Εικ.3.6.2-5: Λεπτομέρειες ατρητικών ωοκυττάρων. ατρ ω:ατρητικά ωοκύτταρα, κυτ:κυτόπλασμα, λιπ κ:λιπιδιακά κυστίδια, λεκ κσ:λεκιθικά κυστίδια, χ:χόριο. Μήκος κλίμακας:30-77μm. 3. Αποτελέσματα 17

3.4. Μορφομετρική ανάλυση 3.4.1. Διάμετρος των ωοκυττάρων Ο Πίνακας 3.4. δείχνει τη μέση διάμετρο των ωοκυττάρων στα διάφορα στάδια ανάπτυξης σε σχέση με το μέγεθος των θηλυκών (κλάσεις μεγέθους). Αρχικά παρατηρούμε την αυξανόμενη διαβάθμιση του μεγέθους των ωοκυττάρων από την προλεκιθογένεση προς την τελική ωρίμανση, σε όλες τις κλάσεις μεγέθους. Γενικά, παρατηρούμε ότι το μέγεθος των ωοκυττάρων δεν διαφοροποιείται σημαντικά στα θηλυκά διαφορετικών μεγεθών ανεξάρτητα από το στάδιο ανάπτυξης των ωοκυτάρων. Η μέση διάμετρος των προλεκιθογόνων ήταν μεταξύ 59 και 67μm, με μόνη εξαίρεση τα άτομα της κλάσης 1, δηλαδή τα μικρόσωμα και ανώριμα θηλυκά στα οποία ήταν μόλις 8μm (Πίνακας 3.4.). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι στα άτομα των κλάσεων 4 και 5 (άτομα ολικού μήκους μεγαλύτερου των 39cm), το μέγεθος των προλεκιθογόνων ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από αυτό στις κλάσεις 1, 2 και 3. Στα ψάρια της κλάσης 1, δεν παρατηρήθηκαν λεκιθογόνα ωοκύτταρα, στοιχείο που δείχνει ότι τα θηλυκά δεν ωριμάζουν σ αυτά τα μήκη. Όμως, στα μεγαλύτερα θηλυκά, το μέγεθος των λεκιθογόνων κυμάνθηκε μέσα σε ένα στενό εύρος τιμών και συγκεκριμένα από 131 έως και 144μm (Πίνακας 3.4.). Η στατιστική ανάλυση έδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση του μεγέθους των ωοκυττάρων σε σχέση με το μέγεθος των θηλυκών, με μόνη εξαίρεση τις κλάσεις 3, 5 και 2, 4, στις οποίες οι μέσες τιμές δεν διέφεραν σημαντικά. Η μέση διάμετρος των λεκιθικών α ωοκυττάρων (αρχή δευτερογενούς αύξησης) διαφοροποιήθηκε από τα 216 έως τα 241μm (διάμετρος έναρξης της δευτερογενούς αύξησης). Η στατιστική ανάλυση έδειξε μια στατιστικά σημαντική μείωση του μεγέθους των λεκιθικών α, στα πολύ μεγάλα θηλυκά (κλάσεις 4 και 5), συγκριτικά με τα μικρότερα θηλυκά (κλάσεις 2 και 3). Το μέσο μέγεθος των λεκιθικών β ωοκυττάρων, πήρε τιμές από 299 έως 312μm. Η ανάλυση δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές του μεγέθους των ωοκυττάρων (2, 3, 4, και 5, p>0,001) με μόνη εξαίρεση μια σημαντική αύξηση στα θηλυκά της 5 ης κλάσης αλλά σε επίπεδο σημαντικότητας, α=0,05. 3. Αποτελέσματα 18

Πίνακας 3.4. Μέσος όρος (±SE) της διαμέτρου των ωοκυττάρων (μm) σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης ανά κλάση μεγέθους των θηλυκών. Σε παρένθεση ο αριθμός των μετρήσεων για κάθε στάδιο ωοκυττάρου. Με διαφορετικά γράμματα οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0,001, ANOVA). Πρωτογενής αύξηση Δευτερογενής αύξηση Κλάση μεγέθους θηλυκών Προ- λεκιθογόνα Λεκιθογόνο Λεκιθικό α Λεκιθικό β 1 8,24±0,2 (2807) a _ 2 3 4 59,22±0,31 133,42±0,93 241,4±4,22 303,03±3,70 (7050) b (1920) a (166) a (236) a 60,76±0,2 141,33±0,5 238,28±2,1 300,49±2,80 (4524) c (1529) b (393) a (513) a 67,17±0,2 130,59±0,5 215,86±1,0 299,28±2,49 (3591) d (1184) a (350) b (627) a 5 63,37±0,47 143,84±1,50 227,82±3,15 312,23±3,10 (1882) e (668) b (134) ab (260) b1 3.4.2. Συχνότητα εμφάνισης των ωοκυττάρων κατά στάδιο ανάπτυξης και κλάση μεγέθους των θηλυκών Στην κλάση μεγέθους 1, το σύνολο των ωοκυττάρων ήταν προλεκιθογόνα, στοιχείο που μαρτυρά την απουσία ωριμαζόντων θηλυκών στο εύρος ολικού μήκους από 19 έως 22,9cm (εύρος SL κλάσης 1). Στις υπόλοιπες κλάσεις και μάλιστα και στις τρεις, το μεγαλύτερο μέρος των ωοκυττάρων, αποτελούνταν από προλεκιθογόνα (62-75%) και λεκιθογόνα ωοκύτταρα (20-22%). Η συχνότητα παρουσίας των προλεκιθογόνων ωοκυττάρων αν και ήταν στο 75% στην κλάση 2, μειώθηκε στα επόμενα μεγέθη των θηλυκών και σταθεροποιήθηκε γύρω από το 60% στις επόμενες κλάσεις (3-5). Τα ωοκύτταρα στην αρχή της δευτερογενούς αύξησης (λεκιθικά α), συγκροτούσαν μια σημαντικά μικρότερη ομάδα με συχνότητα εμφάνισης από 1,8 έως 6% και κατά παρόμοιο τρόπο τα ωοκύτταρα στο τέλος της δευτερογενούς αύξησης (λεκιθικά β) συνιστούσαν μια ομάδα με μικρές συχνότητες, οι οποίες κυμαίνονταν από 2,5 έως και 10,8%. Αξίζει να σημειωθεί ότι στα θηλυκά της κλάσης μεγέθους 2, στα οποία για πρώτη φορά παρατηρήθηκαν δευτερογενή ωοκύτταρα (λεκιθικά α και β), οι συχνότητες παρουσία τους ήταν μικρές (1,8 και 2,5% αντίστοιχα), αλλά αυξήθηκαν σημαντικά και σταθεροποιήθηκαν στις επόμενες κλάσεις (Πίνακας 3.5). Επιπλέον, ενώ τα δευτερογενή ωοκύτταρα συνιστούσαν σημαντικά μικρότερο μέρος του συνολικού πληθυσμού σε όλες τις 1 Σε α=0,05 3. Αποτελέσματα 19

κλάσεις μεγέθους και ενώ στις κλάσεις 2 και 3 οι συχνότητες τους ήταν παρόμοιες (p>0.001), στις κλάσεις 4 και 5, η συχνότητα των λεκιθικών β ήταν σχεδόν διπλάσια αυτής των λεκιθικών α, στοιχείο που υποδηλώνει ότι αναπτύχθηκαν περισσότερα λεκιθικά β στις κλάσεις μεγέθους 4 και 5. Πίνακας 3.5. Συχνότητα εμφάνισης των ωοκυττάρων (%) κατά στάδιο ανάπτυξης και κλάση μεγέθους θηλυκών. Έλεγχος με τη δοκιμή Χ2. Με διαφορετικά γράμματα συμβολίζονται τα στατιστικά σημαντικά διάφορα ποσοστά (p<0.001). Κλάσεις μεγέθους θηλυκών Στάδιο ανάπτυξης 1 2 3 4 5 Προλεκιθογόνα 100 75,3 a 65,2 a 62,7 a 64,3 a Λεκιθογόνα - 20,4 b 21,8 b 20,4 b 22,4 b Λεκιθικά α - 1,8 c 5,6 c 6,0 c 4,5 c Λεκιθικά β - 2,5 c 7,3 c 10,8 d 8,7 d 3.4.3. Κατανομή του μεγέθους των ωοκυττάρων κάθε σταδίου, ανάλογα με το μέγεθος των θηλυκών Εξετάζοντας την κατανομή του μεγέθους των ωοκυττάρων κάθε σταδίου σε σχέση με το μέγεθος των θηλυκών, διαπιστώνουμε ότι το μέγεθος των ωοκυττάρων κατανέμεται με παρόμοιο τρόπο σε όλες τις κλάσεις των θηλυκών (Εικόνα 3.7). Μοναδική εξαίρεση αποτελούν τα λεκιθογόνα ωοκύτταρα τα οποία έχουν μια πιο ευρεία και ομαλή κατανομή στην κλάση 5 (Εικόνα 3.7, κλάση 5). Ειδικότερα, το μέγεθος των προλεκιθογόνων ωοκυττάρων, στην κλάση 1 κυμαίνεται από 17 έως 32μm, στις κλάσεις 2 και 3 το μέγεθος του κύριου πληθυσμού κυμαίνεται από 17-182 μm, ενώ στις κλάσεις 4 και 5 από 17 έως 167 μm. Στην κλάση 1, τα λεκιθογόνα απαντούν μέσα στο εύρος από 17-32 μm (97% του πληθυσμού), στην κλάση 2 από 77 έως 92 μm (25,6%), στην κλάση 3, στο εύρος από 62 έως 77 μm (26,3%) και τέλος στις κλάσεις 4 και 5 στο εύρος από 77 έως 92 μm (27 και 26% αντίστοιχα, Εικόνα 3.7). Το μέγεθος των λεκιθογόνων ωοκυττάρων κυμαίνεται από 77 έως 137 μm σε όλες τις κλάσεις (δεν υπάρχουν λεκιθογόνα ωοκύτταρα στην κλάση μεγέθους 1). Στις κλάσεις 2 και 3, τα λεκιθογόνα μεγέθους από 122 έως 137 μm έχουν τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης (19% 3. Αποτελέσματα 20

και 16% αντίστοιχα), ενώ στις κλάσεις 4 και 5, η κλάση λεκιθογόνων από 107 έως 122 μm (18%) και από 122 έως 137 μm αντίστοιχα (16%). Τέλος το μέγεθος των λεκιθικών ωοκυττάρων κυμαίνεται από 167 έως και 484 μm. Σε όλες τις κλάσεις των θηλυκών, τα λεκιθικά ωοκύτταρα μεγέθους από 197 έως και 392μm, συνιστούν τον κύριο πληθυσμό. Σε αντίθεση με τους άλλους τύπους ωοκυττάρων, δεν υπάρχουν κύριες ομάδες μεγέθους μέσα στο εύρος εξάπλωσης τους. Αντίθετα, ο πληθυσμός τους κατανέμεται σχεδόν ομοιόμορφα μέσα στο συγκεκριμένο εύρος μεγέθους (197-392μm) με συχνότητες από 4 έως και 10%. 3. Αποτελέσματα 21

17-32 47-62 77-92 107-122 137-152 167-182 197-212 227-242 257-272 287-302 317-332 347-362 377-392 407-422 437-452 467-484 17-32 47-62 77-92 107-122 137-152 167-182 197-212 227-242 257-272 287-302 317-332 347-362 377-392 407-422 437-452 467-484 17-32 47-62 77-92 107-122 137-152 167-182 197-212 227-242 257-272 287-302 317-332 347-362 377-392 407-422 437-452 467-484 17-32 47-62 77-92 107-122 137-152 167-182 197-212 227-242 257-272 287-302 317-332 347-362 377-392 407-422 437-452 467-484 17-32 47-62 77-92 107-122 137-152 167-182 197-212 227-242 257-272 287-302 317-332 347-362 377-392 407-422 437-452 467-484 100 80 60 40 20 0 Κλάση 1 προλεκιθογ 30 25 20 15 10 5 0 Κλάση 2 προλεκιθογόνα λεκιθογόνα Λεκιθικά 30 25 20 15 10 5 0 Κλάση 3 προλεκιθογόνα λεκιθογόνα Λεκιθικά 30 25 20 15 10 5 0 Κλάση 4 προλεκιθογόνα λεκιθογόνα Λεκιθικά 30 25 20 15 10 5 0 Κλάση 5 προλεκιθογόνα λεκιθογόνα Λεκιθικά Εικόνα 3.7. Συχνότητες κατανομής των ωοκυττάρων κατά μέγεθος (διάμετρος, μm) ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης (προλεκιθογόνα, λεκιθογόνα, λεκιθικά) και το μέγεθος των θηλυκών ατόμων (κλάσεις μεγέθους 1-5). Οι συχνότητες κατονομής προέρχονται από την εισαγωγή του συνόλου των μετρηθέντων ωοκυττάρων του Πίνακα 3.4. για κάθε κλάση μεγέθους. 3. Αποτελέσματα 22

3.4.4. Διάμετρος διαχωρισμού των ωοκυττάρων κατά στάδιο ανάπτυξης Όπως φάνηκε στην προηγούμενη παράγραφο, υπάρχουν σημαντικές αλληλεπικαλύψεις μεταξύ προλεκιθογόνων και λεκιθογόνων ωοκυττάρων αλλά και μεταξύ λεκιθογόνων και λεκιθικών. Μάλιστα δε οι αλληλεπικαλύψεις αυτές παρατηρούνται σε όλα τα θηλυκά, ανεξάρτητα από το μέγεθος τους. Ωστόσο, οι αλληλεπικαλύψεις αυτές είναι πιο έντονες μεταξύ λεκιθογόνων και λεκιθικών και λιγότερο έντονες μεταξύ προλεκιθογόνων και λεκιθογόνων. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.8 όπου απεικονίζονται οι κλάσεις μεγέθους στις οποίες διαχωρίζονται τα ωοκύτταρα με κριτήριο τη διάμετρο του 50% (MD 50% ), τα προλεκιθογόνα διαχωρίζονται από τα λεκιθογόνα στην κλάση μεγέθους από 107 έως 122μm σε όλες τις κλάσεις θηλυκών. Κατά παρόμοιο τρόπο η κλάση διαχωρισμού των λεκιθογόνων από τα λεκιθικά δεν διαφοροποιείται πολύ μεταξύ των θηλυκών (κλάσεις 2-5) και κυμαίνεται στο εύρος από 197 έως 212μm, στις κλάσεις 3, 4 και από 227 έως 257 στις κλάσεις 2 και 5 (Εικόνα 3.8). 3. Αποτελέσματα 23

17-32 32-47 47-62 62-77 77-92 92-107 107-122 122-137 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 212-227 227-242 242-257 257-272 272-287 287-302 302-317 317-332 17-32 32-47 47-62 62-77 77-92 92-107 107-122 122-137 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 107-122 122-137 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 212-227 227-242 242-257 257-272 272-287 287-302 17-32 32-47 47-62 62-77 77-92 92-107 107-122 122-137 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 122-137 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 212-227 227-242 242-257 257-272 272-287 287-302 17-32 32-47 47-62 62-77 77-92 92-107 107-122 122-137 137-152 152-167 167-182 182-197 197-212 212-227 107-122 137-152 167-182 197-212 227-242 257-272 287-302 317-332 347-362 100 100 90 80 Διάμετρος διαχωρισμού Φ1 από Φ2 (κλάση 2) 90 80 Διάμετρος διαχωρισμού Φ2 από Φ3 (κλάση 2) 70 70 60 50 40 107-122μm 60 50 40 242-257μm 30 30 20 20 10 10 0 0 100 100 90 80 Διάμετρος διαχωρισμού Φ1 από Φ2 (κλάση 3) 90 80 Διάμετρος διαχωρισμού Φ2 από Φ3 (κλάση 3) 70 70 60 50 107-122μm 60 50 212-227μm 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 100 90 80 Διάμετρος διαχωρισμού Φ1 από Φ2 (κλάση 4) 100 90 80 Διάμετρος διαχωρισμού Φ2 από Φ3 (κλάση 4) 70 60 50 40 30 20 10 0 107-122μm 70 60 50 40 30 20 10 0 197-212μm 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Διάμετρος διαχωρισμού Φ1 από Φ2 (κλάση 5) 107-122μm 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Διάμετρος διαχωρισμού Φ2 από Φ3 (κλάση 5) 242-257μm 0 0 Εικόνα 3.8. Κλάση διαχωρισμού των ωοκυττάρων διαφορετικών σταδίων (προλεκιθογόνα, λεκιθογόνα, λεκιθικά), με κριτήριο το μέγεθος (διάμετρος, μm) και τη συχνότητα παρατήρησης του 50%, για κάθε κλάση μεγέθους θηλυκών (κλάσεις μεγέθους: 1 έως 5). 3. Αποτελέσματα 24

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ιστοκυτολογικές ιδιαιτερότητες της ωογένεσης Σε γενικές γραμμές η διαδικασία της ωογένεσης δεν διαφοροποιείται σημαντικά από αυτή των άλλων τελεόστεων και ειδικά ειδών της οικογένειας των Σπαροειδών. Η ωογένεση αρχίζει στα αρχέγονα βλαστικά κύτταρα, από τα οποία με διαδοχικές μιτώσεις σχηματίζονται πολυάριθμοι πληθυσμοί ωογονίων. Τα ωογόνια είναι τα μικρότερα γεννητικά κύτταρα που βρίσκονται στις ωοθήκες του φαγκριού. Μάλιστα δε, παρουσιάζουν κοινή μορφολογία με τα ωογόνια άλλων τελεόστεων (Anderson, 1968, Bruslé and Bruslé, 1978, Tyler & Sumpter 1996, Grier 2000). Επιπλέον, όπως και σε άλλα είδη τελεόστεων, τα ωογόνια συναθροίζονται κατά ομάδες μέσα στα ωοφόρα ελάσματα (Bruslé, 1980, Selman & Wallace, 1989, Tyler & Sumpter, 1996). Στους περισσότερους τελεόστεους τα κύτταρα αυτά παραμένουν καθόλη τη διάρκεια της ζωής πολλαπλασιάζονται μιτωτικά, και συντηρούν μια σταθερή παραγωγή ωογονίων σε όλη τη ζωή των θηλυκών. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο παρατηρούμε πολλά ωογόνια στις ωοθήκες θηλυκών όλων των μεγεθών και όλων των ηλικιών. Τα ωογόνια με τη διαδικασία της μείωσης και παράλληλα με τη μετακίνηση τους μέσα στο βλαστικό επιθήλιο, προς την ωοθηκική κοιλότητα, μετατρέπονται σε προλεκιθογόνα ωοκύτταρα. Τα ωοκύτταρα αυτά είναι σε επαφή με τα ωογόνια μέσα σε κυτταρικούς θύλακες (cell nests), έχουν βασεόφιλο κυτόπλασμα λόγω της συσσώρευσης RNA και ένα μεγάλο πυρήνα με πολλούς πυρηνίσκους (14-20), κατ αντιστοιχία με τα προλεκιθογόνα άλλων τελεόστεων (Spadella et al. 2005). Όταν εξέλθουν από τον κυτταρικό θύλακα, περιβάλλονται από κύτταρα του ωοθυλακίου (κύτταρα θήκης, κοκκιώδη κύτταρα) και σχηματίζουν τα ωοθυλάκια. Τα κύτταρα του ωοθυλακίου του φαγκριού είναι επίπεδα και περιβάλλουν το ωοκύτταρο ως ένα λεπτό επιθηλιακό στρώμα. Η δομή και η οργάνωση του ωοθυλακίου είναι ίδια με αυτή άλλων τελεόστεων (Wallace & Selman 1981, Grier 2000, Spadella et al., 2005). Κατά τη διάρκεια της ωογένεσης το ωοθυλάκιο παχαίνει, εξαιτίας της πάχυνσης των κοκκιωδών κυττάρων (Yamagami et al., 1992, Kokokiris et al., 2001). Στα προλεκιθογόνα ωοκύτταρα, η παρουσία πολλαπλών πυρηνίσκων στη περιοχή γύρω από το πυρήνα αποτελεί ένδειξη έντονης μεταγραφικής δραστηριότητας. Αυτή η δραστηριότητα προκαλεί την έντονη βασεοφιλία του κυτοπλάσματος, λόγω της συσσώρευσης μεγάλων ποσοτήτων RNA αλλά και την σημαντική αύξηση του πυρηνικού και κυτοπλασματικού όγκου, εξαιτίας της ανάπτυξης μεγάλου αριθμού υποκυτταρικών οργανιδίων (πρωτογενής αύξηση), (Spadella et al., 2005). Σε αντίθεση με άλλους ερευνητές, που εντόπισαν το σωμάτιο Balbiani, στο κυτταρόπλασμα κοντά στον πυρήνα του προλεκιθογόνου ωοκυττάρου από παρατηρήσεις σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Tyler & Sumpter, 1996, Selman & Wallace, 1989, Spadella et al., 2005), στην εργασία αυτή δεν παρατηρήσαμε το σωμάτιο Balbiani κατά τις παρατηρήσεις μας στο οπτικό μικροσκόπιο. Το σωμάτιο Balbiani, συμμετέχει στη παραγωγή κυτοπλασματικών οργανιδίων ενώ σύμφωνα με τους Dettlaf & Vassetzky (1988) παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της λεκιθογένεσης. Ανάμεσα στο ωοθυλάκιο και στο κυτόπλασμα και ειδικά στο στάδιο της πρωτογενούς αύξησης διακρίναμε καθαρά την ακτινωτή ζώνη (χόριο). Η ακτινωτή ζώνη συμβάλλει στη διατήρηση της ακεραιότητας του αβγού μέχρι να αναπτυχθεί πλήρως το έμβρυο (Yamagami et al., 4. Συζήτηση 25

1992). Η προοδευτική αύξηση του πάχους της ακτινωτής ζώνης, οφείλεται στη σύνθεση και εναπόθεση άμορφου υλικού (Tesoriero, 1997, Cruz-Landim & Cruz-Höfling, 1989, Quagio- Grassiotto & Guimarães, 2003). Η εναπόθεση αυτού του υλικού έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό πόρων ή κενών μέσα από τα οποία εκτείνονται προς τα έξω, οι κυτταροπλασματικές μικρολάχνες του ωοκυττάρου, καθιστώντας εφικτή την επικοινωνία του ωοκυττάρου με τα κύτταρα του ωοθυλακίου. Η συνέχεια της ακτινωτής ζώνης διακόπτεται μόνο στο ύψος της μικροπύλης απ όπου θα διέλθει το σπερματοζωάριο κατά τη γονιμοποίηση. Στο στάδιο της πρωτογενούς αύξησης, στα λεκιθογόνα ωοκύτταρα διακρίναμε την παρουσία λιπιδιακών κυστιδίων, με σχήμα σφαιρικό ή παραβολικό, με χρώμα λευκό και σε πολλά διαφορετικά μεγέθη. Τα λιπιδιακά κυστίδια, μεταφέρουν λεκιθικό υλικό, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί στο σχηματισμό της λεκίθου των αβγών (Ng & Idler 1983). Η παρουσία τους σηματοδοτεί την έναρξη της λεκιθογένεσης (Arocha 2002, Abou-Seedo et al., 2003). Μερικά κυστίδια στη περιφέρεια του ωοπλάσματος σχηματίζουν μια διακριτή ζώνη εσωτερικά του ωοκυττάρου, τη φλοιώδη μοίρα (cortical alveoli). Η φλοιώδης μοίρα έχει παρατηρηθεί σε ωοκύτταρα και άλλων τελεόστεων (Wallace & Selman 1981, Tyler & Sumpter, 1996, Patino & Sullivan 2002, Arocha 2002, Spadella et al., 2005). Η φλοιώδης μοίρα, είναι απαραίτητη κατά τη γονιμοποίηση, αφού τα κυστίδια της απελευθερώνουν το περιεχόμενο τους μέσα στον περιλεκιθικό χώρο, τροποποιώντας τη δομή του λεκιθικού φακέλου. Μ αυτό τον τρόπο εμποδίζουν την πολυσπερμία, δηλαδή την είσοδο πολλών σπερματοζωαρίων για τη γονιμοποίηση του ωοκυττάρου. Μετά την πρωτογενή αύξηση, ακολούθησε μια δεύτερη φάση αύξησης του μεγέθους των ωοκυττάρων (δευτερογενής αύξηση). Μέσα στο ωόπλασμα παρατηρήθηκαν μεγάλοι πληθυσμοί εωσινόφιλων κυστιδίων που κατανέμονταν σε όλο το χώρο από την ωοκυτταρική μεμβράνη και μέχρι τον πυρήνα, προκαλώντας μια σημαντική αύξηση στο μέγεθος του ωοκυττάρου. Τα κυστίδια αυτά περιέχουν τη λεκιθογενίνη (Ramos, 2003). Η λεκιθογενίνη είναι μια φωσφολιποπρωτεϊνη, η οποία παράγεται στο ήπαρ και αποθηκεύεται στο ωόπλασμα. Αποτελεί το κύριο συστατικό της λεκίθου των αβγών των τελεόστεων και αποθηκεύεται μέχρι την τελική ωρίμανση μέσα σε σφαιρικά κυστίδια (Ng & Idler 1983). Όπως έχουν αποκαλύψει μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε ωοκύτταρα του φαγκριού, η λεκιθογενίνη, στη μορφή μικρών κοκκίων μπαίνει στο ωόπλασμα διαμέσου των κυτοπλασματικών προεκτάσεων των κοκκιωδών κυττάρων του ωοθυλακίου. Ακολούθως τα κοκκία συνενώνονται και σχηματίζουν μεγαλύτερους σχηματισμούς, τα κυστίδια (Fostier et al., 2000). Κατά τη δευτερογενή αύξηση παρατηρήσαμε πολύ μεγάλα ωοκύτταρα ακανόνιστου σχήματος, χωρίς πυρήνα, με ένα λεπτό ωοθυλάκιο και μια λεπτή ακτινωτή ζώνη. Μέσα στο ωόπλασμα αυτών των ωοκυττάρων υπήρχε ένα άμορφο και ομογενοποιημένο υλικό και μερικές λιπιδιακές σταγόνες συγκεντρωμένες στη μια άκρη του ωοκυττάρου. Τα ωοκύτταρα αυτά ήταν ενυδατωμένα ωοκύτταρα, στη φάση λίγο πριν την ωορρηξία (ωοκύτταρα στο στάδιο της τελικής ωρίμανσης) και ο όγκος τους ήταν σχεδόν διπλάσιος αυτού των λεκιθικών ωοκυττάρων. Το άμορφο υλικό τους προέρχονταν από την σύντηξη των λεκιθικών κυστιδίων και αντίστοιχα οι λιπιδιακές σταγόνες από τη σύντηξη των λιπιδιακών κυστιδίων (Wallace & 4. Συζήτηση 26

Selman 1981). Στο στάδιο αυτό αρχίζει η μετακίνηση του πυρήνα προς το ζωικό πόλο, στη περιοχή της μικροπύλης για να ακολουθήσει η διάρρηξη του πυρήνα και η ολοκλήρωση της μείωσης (απόκτηση του απλοειδούς αριθμού χρωμοσωμάτων) κατά τη διέγερση του ωαρίου από το σπερματοζωάριο. Ατρητικά ωοκύτταρα Στις ώριμες ωοθήκες, αναγνωρίστηκε ένας σημαντικός αριθμός ατρητικών ωοκυττάρων και κυρίως λεκιθικών ωοκυττάρων που είχαν μεταπέσει σε ατρησία. Η ατρησία είναι μια διαδικασία εκφυλισμού των ωοκυττάρων, μετά από την για οιοδήποτε λόγο διακοπή της ανάπτυξης τους και εκδηλώνεται με την ανάπτυξη φαγοκυτταρικής δραστηριότητας από τα ίδια τα κύτταρα του ωοθυλακίου (Bazzoli & Rizzo, 1995). Αν και η ατρησία μπορεί να παρατηρηθεί σε ωοκύτταρα όλων των σταδίων ανάπτυξης, συνήθως παρατηρείται με μεγαλύτερη συχνότητα σε δευτερογενή ωοκύτταρα (Bazzoli & Rizzo, 1995, Μiranda et al., 1999). Ο μηχανισμός ανάπτυξης της ατρησίας και οι παράγοντες ελέγχου της ατρησίας στις ωοθήκες των τελεόστεων δεν είναι γνωστοί (Miranda et al., 1999) αλλά η καταπόνηση και γενικά όλοι οι παράγοντες που προκαλούν καταπόνηση (π.χ. διατροφικές ελλείψεις, συνθήκες αιχμαλωσίας, ρύπανση, κ.ά.) συντελούν στην εντατικοποίηση της ατρησίας των γονάδων (Guraya et al., 1975, Tyler & Sumpter, 1996). Πάντως η ατρησία είναι ένας παράγοντας που μειώνει σημαντικά την δυνητική γονιμότητα ενός είδους και επιπλέον είναι εξαιρετικά δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί (Hunter et al., 1992). Μέγεθος των ωοκυττάρων σε σχέση με το μέγεθος των θηλυκών Στην εργασία αυτή παρατηρήσαμε δύο σημαντικές αυξήσεις στο μέγεθος του ωοκυττάρου κατά τη διάρκεια της ωογένεσης. Μάλιστα δε, το εύρος αυτών των αυξήσεων ήταν το ίδιο για τα ωοκύτταρα των αντίστοιχων σταδίων, σε όλα τα θηλυκά ανεξάρτητα από το μέγεθος τους. Η πρώτη αύξηση αρχίζει στο μέγεθος των 60μm, με την ανάπτυξη υποκυτταρικών οργανιδίων και έντονης μεταγραφικής δραστηριότητας και καταλήγει στο μέγεθος των 130-140μm παράλληλα με την εμφάνιση λιπιδιακών κυστιδίων (πρωτογενής αύξηση). Η δεύτερη αύξηση αρχίζει στο μέγεθος των 130-140μm, με την προοδευτική συσσώρευση λεκιθογενίνης στη μορφή των λεκιθικών κυστιδίων και καταλήγει στο μέγεθος των 300-312μm 1. Το μέγεθος αυτό δεν αντιστοιχεί στο μέγεθος του αβγού που ισοδυναμεί με 1 mm (Κοκοκύρης, 1998). Το λεκιθικό ωοκύτταρο του φαγκριού γίνεται ώριμο και αποκτά το μέγεθος του αβγού, μετά από ενεργή πρόσληψη νερού (ενυδάτωση) για την ομογενοποίηση της λεκίθου και την απόκτηση του πελαγικού χαρακτήρα του (ρύθμιση πλευστότητας), (Κοκοκύρης, 1998). 1 Οι τιμές αυτές αν και αντιπροσωπευτικές, είναι ενδεικτικές του πραγματικού μεγέθους των ωοκυττάρων. Αντιστοιχούν σε ωοκύτταρα που έχουν υποστεί συρρίκνωση κατά την επεξεργασία των ιστών για την παραγωγή τομών και ως εκ τούτου δεν ανταποκρίνονται στις πραγματικές τιμές μεγέθους των νωπών και ανεπεξέργαστων ωοκυττάρων που παίρνουμε κατά τη βιοψία των ωοθηκών. 4. Συζήτηση 27

Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των ωοκυττάρων ενός συγκεκριμένου σταδίου ανάπτυξης αλλά και το μέγεθος των ωοκυττάρων αυτού του σταδίου δεν μεταβάλλονται σε σχέση με το μέγεθος (και κατ επέκταση με την ηλικία) των θηλυκών φαγκριών. Μοναδική εξαίρεση αποτελούν τα προλεκιθογόνα ωοκύτταρα το μέγεθος των οποίων αυξάνεται προοδευτικά καθώς αυξάνεται το μέγεθος των θηλυκών. Τα προλεκιθογόνα ωοκύτταρα προκύπτουν από τη διαφοροποίηση των ωογονίων. Φαίνεται δε, ότι υπάρχει μια προοδευτική αύξηση του μεγέθους τους, η οποία ολοκληρώνεται όταν αυτά είναι έτοιμα να μεταπέσουν σε λεκιθογόνα. Είναι πολύ πιθανό ότι τα πολύ μεγάλα προλεκιθογόνα στα πολύ μεγάλα θηλυκά (π.χ. σε αυτά των κλάσεων 3, 4 και 5) δημιουργούνται σε προγενέστερους αναπαραγωγικούς κύκλους (άγνωστο σε πόσους) και αυξάνονται μέχρι να μπουν στην πρωτογενή αύξηση. Αν και δεν είναι γνωστοί οι μηχανισμοί και τα μέσα αυτής της στρατολόγησης, είναι πολύ πιθανό η στρατολόγηση αυτή να επηρεάζεται από το μέγεθος των προλεκιθογόνων ωοκυττάρων. Πολλαπλή εναπόθεση και γονιμότητα απροσδιόριστου τύπου Κατά την διάρκεια της ωογένεσης, τα ωοκύτταρα αναπτύσσονται με τρεις διαφορετικούς τρόπους: (1) σύγχρονα, (2) σύγχρονα κατά ομάδες και (3) ασύγχρονα (Selman & Wallace, 1989). Στη πρώτη περίπτωση όλα τα ωοκύτταρα αναπτύσσονται και ωριμάζουν ταυτόχρονα. Αυτός ο τύπος ανάπτυξης απαντά σε είδη που αναπαράγονται και ωοτοκούν μια φορά κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Στη δεύτερη περίπτωση, μέσα στις ωοθήκες υπάρχουν τουλάχιστον δυο πληθυσμοί ωοκυττάρων, αυτά που ωριμάζουν και αυτά που βρίσκονται σε φάση λεκιθογένεσης ή και προλεκιθογένεσης. Αυτός ο τύπος είναι ο πιο κοινός μεταξύ των τελεόστεων. Τέλος στην τρίτη περίπτωση, μέσα στις ωοθήκες και σε κάθε χρονική στιγμή, υπάρχουν περισσότερες από δυο ομάδες ωοκυττάρων, οι οποίες μάλιστα βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης. Αυτός ο τύπος δεν είναι ιδιαίτερα κοινός και είναι ο λιγότερος μελετημένος μεταξύ των τελεόστεων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας, μέσα στις ωοθήκες τους φαγκριού και σε οποιαδήποτε στιγμή κατά την ωογένεση, υπάρχουν ωοκύτταρα όλων των σταδίων ανάπτυξης (προλεκιθογόνα, λεκιθογόνα, λεκιθικά α και β και ώριμα). Μάλιστα δε η σύνθεση των ωοκυτταρικών πληθυσμών εμφανίζει μια αξιοσημείωτη σταθερότητα σε όλα τα μεγέθη των θηλυκών. Τα προλεκιθογόνα ωοκύτταρα συνιστούν την μεγαλύτερη ομάδα (62-75%), ακολουθούν τα λεκιθογόνα (20-22%) και τέλος τα λεκιθικά ωοκύτταρα (4-17%). Σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, το φαγκρί είναι ένας πολλαπλός αποθέτης και έχει μια γονιμότητα αποσδιόριστου τύπου (κατά Hunter & Macewicz 1985, Hunter et al., 1992), επειδή τα ωοκύτταρα του αναπτύσσονται ασύγχρονα και όχι κατά ομάδες. Εκτός όμως από τις συχνότητες παρουσίας των ωοκυττάρων διαφορετικών σταδίων, οι συχνότητες κατανομής των ωοκυττάρων ανάλογα με το μέγεθος, μας έδειξαν ότι οι κατανομές ήταν συνεχείς, το μέγεθος των ωοκυττάρων αλληλεπικαλύπτονταν και τέλος δεν υπήρχε κανένα κενό στα μεγέθη των ωοκυττάρων, τέτοιο που να διαχωρίζει τα ωοκύτταρα που συνιστούν μια ξεχωριστή ομάδα (batch fecundity) και θα ωριμάσουν σε αβγά. Οι διαπιστώσεις μας συμφωνούν με τα αποτελέσματα άλλων ερευνών, από τις οποίες φαίνεται ότι το φαγκρί ωοτοκεί πολλές φορές κατά τη διάρκεια της περιόδου ωοτοκίας (Kokokiris et al., 4. Συζήτηση 28

1999, 2000, 2001, Mylonas et al., 2004 ), ωοτοκώντας όμως σε κάθε πράξη ωοτοκίας έναν αριθμό αβγών, που δεν είναι εύκολο να προσδιορίσουμε. Σε αντίθεση με την εργασία των Spadella et al., (2005) στο ερμαφρόδιτο είδος S. marmoratus (μία από τις ελάχιστες εργασίες της μορφομετρικής περιγραφής των ωοκυττάρων σε σχέση με το μέγεθος των θηλυκών), οι οποίοι περιέγραψαν μια αύξηση του μεγέθους των ωοκυττάρων ενός δεδομένου σταδίου ανάπτυξης σε κλάσεις μεγέθους 1-3 και σταθεροποίηση του μεγέθους στις κλάσεις 4 και 5, τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας έδειξαν ότι το μέγεθος των ωοκυττάρων σταθεροποιείται γύρω από μια συγκεκριμένη τιμή για κάθε στάδιο ήδη από τη πρώτη γεννητική ωρίμανση (κλάση μεγέθους 2) και επιπλέον η τιμή αυτή είναι ίδια και σταθερή σε όλες τις κλάσεις μεγέθους. Επιπλέον, σε αντίθεση με το είδος S. marmoratus, η συχνότητα παρουσίας των λεκιθογόνων ωοκυττάρων τείνει να σταθεροποιείται στο φαγκρί ήδη από την πρώτη γεννητική ωρίμανση (κλάση μεγέθους 2) και των λεκιθικών ωοκυττάρων από την 2 η γεννητική ωρίμανση (κλάση μεγέθους 3) και δεν παρουσιάζει μεταβολή αυξανομένου του μεγέθους των θηλυκών. Όμως σε συμφωνία με τα αποτελέσματα στο είδος S. marmoratus, διαπιστώσαμε μια προοδευτική αύξηση της αφθονίας των λεκιθικών β στα μεγαλόσωμα θηλυκά των κλάσεων 4 και 5 (3 η και 4 η γεννητική ωρίμανση). Οι διαφορές αυτές υποδηλώνουν τον εξειδικευμένο χαρακτήρα την ωογένεσης στα διάφορα είδη των ψαριών και επιβεβαιώνουν την άποψη των Greeley et al., (1987), σύμφωνα με τους οποίους για την σωστή ερμηνεία του προτύπου ανάπτυξης των ωοκυττάρων σε ένα είδος, είναι απαραίτητο να προηγηθεί μια συστηματική μελέτη της σχέσης ανάμεσα στο μέγεθος και στο στάδιο ανάπτυξης των ωοκυττάρων. Σύμφωνα με τους Spadella et al., (2005), η παραγωγή της λεκιθογενίνης διακόπτεται όταν η συγκέντρωση της έχει φθάσει μια συγκεκριμένη τιμή, ικανή για να υποστηρίξει την εξέλιξη της εμβρυογένεσης μετά τη γονιμοποίηση. Η αύξηση της συχνότητας εμφάνισης των λεκιθικών β ωοκυττάρων στις κλάσεις μεγέθους 3, 4, και 5 αλλά και η σταθεροποίηση του μεγέθους των λεκιθικών β ωοκυττάρων από την κλάση μεγέθους 2, πιθανόν υποδηλώνουν ότι στα θηλυκά φαγκριά το τέλος της λεκιθογένεσης επέρχεται όταν βρίσκονται στην κλάση μεγέθους 2, (δηλαδή στα 23 έως 27cm σταθερού μήκους SL) και ότι τα θηλυκά ωοτοκούν σ αυτό το μέγεθος για πρώτη φορά. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται και από το γεγονός του ότι δεν παρατηρήθηκαν ούτε λεκιθογόνα ούτε λεκιθικά ωοκύτταρα σε θηλυκά με σταθερό μήκος μικρότερο από τα 23cm (κλάση μεγέθους 1). Είναι πολύ πιθανό ότι στα θηλυκά μικρότερου μήκους από αυτό των 23cm τα ωοθυλάκια δεν έχουν ωριμάσει ακόμα για να παράγουν την 17β-οιστραδιόλη που είναι απαραίτητα για τη διέγερση του ήπατος με σκοπό την παραγωγή της λεκιθογενίνης (Aida et al., 1973, Kokokiris et al., 2000). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των Kokokiris et al., (1999) σύμφωνα με τους οποίους, τα θηλυκά φαγκριά ωριμάζουν για πρώτη φορά στην ηλικία των 3-4 χρόνων αλλά περισσότερα από το 50% των θηλυκών, ωριμάζουν στην ηλικία των 4-5 χρόνων. Τέλος, στην εργασία αυτή παρατηρήσαμε μια μεγάλη ποικιλία μεγεθών για κάθε στάδιο ανάπτυξης ωοκυττάρων αλλά και αλληλεπικαλύψεις μεταξύ των διαφορετικών σταδίων, οι οποίες διατηρούνταν με την ίδια ένταση σε όλα τα θηλυκά ανεξάρτητα από το μέγεθος τους. Τα αποτελέσματα μας είναι παρόμοια με αυτά των Spadella et al., (2005) στο είδος S. 4. Συζήτηση 29