«Ανάπτυξη Ταχείας Μεθόδου Ανάλυσης Επικίνδυνων Μυκοτοξινών σε Ξηρούς Καρπούς» Αρ. Κουπονιού: 58404368 01 000041 ΓΕΩΝΑΤΣ Ε.Π.Ε.

«Ανάπτυξη Ταχείας Μεθόδου Ανάλυσης Επικίνδυνων Μυκοτοξινών σε Ξηρούς Καρπούς» Αρ. Κουπονιού: 58404368 01 000041 ΓΕΩΝΑΤΣ Ε.Π.Ε. Υπεύθυνος έργου Δρ. Κων/νος Πετρωτός Εργαστήριο Μηχανικής Μεταποίησης Αγροτικών Προϊόντων Τμήμα Μηχανικής Βιοσυστημάτων Λάρισα, 2010

Τίτλος έργου: Ανάπτυξη Ταχείας Μεθόδου Ανάλυσης Επικίνδυνων Μυκοτοξινών σε Ξηρούς Καρπούς. 1. Εισαγωγή Η επιχείρηση ΓΕΩΝΑΤΣ Ε.Π.Ε. παράγει προϊόντα ξηρών καρπών και ιδιαίτερα αμύγδαλο σε ψίχα ή ολόκληρο. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα ασφάλειας των ξηρών καρπών που παράγονται είναι η πιθανή ύπαρξη μυκοτοξινών και ιδιαίτερα αφλατοξινών. Στις επιδιώξεις της επιχείρησης είναι να πραγματοποιήσει την παρούσα ερευνητική εργασία σε συνεργασία με το εργαστήριο Μηχανικής Μεταποίησης και Τροφίμων του Τμήματος Μηχανικής Βιοσυστημάτων του ΤΕΙ Λάρισας με σκοπό να δοκιμαστεί και να πιστοποιηθεί μία ταχεία, απλή και ακριβής μέθοδος εκτίμησης των μυκοτοξινών στην εισκομιζόμενη ά ύλη ώστε να είναι δυνατή η απόρριψη προβληματικών παρτίδων εισκομιζόμενης ά ύλης. Η μέθοδος θα πρέπει να είναι ταχεία και εύκολη στην εφαρμογή χωρίς ιδιαίτερες απαιτήσεις σε ακριβό εξοπλισμό. Οι μυκοτοξίνες είναι τοξικές ουσίες οι οποίες παράγονται από την ανάπτυξη μυκήτων σε τροφές και ζωοτροφές. Κρίνεται σκόπιμη η αναφορά σε ορισμένα γενικά στοιχεία για τις μυκοτοξίνες διότι οι αφλατοξίνες κατατάσσονται στην κατηγορία των μυκοτοξινών, των τοξινών δηλαδή που παράγονται από τους μύκητες. Ο αριθμός των ειδών των μυκήτων έχει υπολογιστεί ότι είναι πάνω από 100.000, ενώ τα είδη των μυκήτων που παράγουν μυκοτοξίνες στις ζωοτροφές είναι σχετικά λίγα, περίπου 220. Ο γνωστός αριθμός των μυκοτοξινών, ανέρχεται στις 60. Οι πιο γνωστές μυκοτοξίνες είναι οι αφλατοξίνες, η Τ2 τοξίνη, η Diacetoxyscirpenol, η ζεαραλενόνη και η οχρατοξίνη. Οι μυκοτοξίνες λοιπόν, είναι οργανικές χημικές ουσίες, αλειφατικές ή κυκλικές, απλής σχετικά δομής με σχετικά απλό αριθμό ατόμων άνθρακα και μοριακό βάρος. Είναι παράγωγα ή συγγενείς ενώσεις με την κουμαρίνη, τα τερπενοειδή, ανθρακινόνες, μακρολίδια, στεροειδή, και τετρονικά οξέα. Η δράση τους στους 1

ζώντες οργανισμούς είναι ηπατοτοξική, νεφροτοξική, αιμοτοξική, νευροτοξική, δερμοτοξική και πολλές έχουν καρκινογόνες ή οιστρογόνες ιδιότητες. Μερικές φορές έχουν αντιβιοτική δράση κατά των μικροβίων και καταστρέφουν την μικροβιακή χλωρίδα λ.χ. η πενικιλίνη είναι η μυκοτοξίνη του μύκητα Penicillium chrysogenum (δηλαδή της χλωραμφενικόλης). Ένα πρόβλημα που δεν έχει μελετηθεί αρκετά είναι η δράση, λόγω ενδεχόμενης συνεργίας, δυο μυκοτοξινών που υπάρχουν μαζί στην ίδια ζωοτροφή. Πιθανώς οι μυκοτοξίνες που υπάρχουν σε μη τοξικές ποσότητες στις τροφές όταν είναι μόνες τους, να γίνονται τοξικές όταν δρουν μαζί όπως συμβαίνει με πολλά αντιβιοτικά. Οι συγκεντρώσεις των μυκοτοξινών οι οποίες είναι σημαντικές για την υγεία των ζώων και των ανθρώπων, μετριούνται συνήθως σε μg/kg τροφής (ppb). Η ευαισθησία των ζώων στις μυκοτοξίνες, ποικίλει, αναλόγως του είδους του ζώου, της ηλικίας, του φύλου, της θρεπτικής κατάστασης, και της φυλής. Οι μυκοτοξίνες, οι οποίες όπως προαναφέρθηκε σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της αναπτύξεως ορισμένων μυκήτων, είτε απεκκρίνονται μέσα στο υλικό που αναπτύσσεται ο μύκητας, είτε κατακρατούνται στο εσωτερικό του κυττάρου των μυκήτων και ελευθερώνονται μετά τη θραύση του μυκηλίου. Ορισμένα είδη μυκήτων που παράγουν τις πιο γνωστές αφλατοξίνες είναι ο Aspergillus candidus, o Aspergillus flavus, o Aspergillus parasiticus, o Aspergillus ochraceus κ.α. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη των μυκήτων και κατ επέκταση των μυκοτοξινών είναι η υγρασία, η θερμοκρασία, ο αερισμός, οι γενετικές διαφορές και το μέγεθος της μόλυνσης. Έτσι οι ευνοϊκότερες συνθήκες ανάπτυξης τους είναι όταν η υγρασία είναι υψηλή (πάνω από 70%), η θερμοκρασία μεταξύ 20ºC με 30ºC, ενώ μπορούν να επιζήσουν και σε θερμοκρασίες μεταξύ 0-60ºC. Επίσης ευνοϊκές συνθήκες ανάπτυξής τους, δημιουργεί το αναερόβιο περιβάλλον, ενώ συντελεί σε μεγάλο βαθμό και το είδος του μύκητα αφού υπάρχουν και μύκητες που χρειάζονται ειδικές συνθήκες για να αναπτυχθούν. Τέλος ο αριθμός 2

των μυκήτων επηρεάζει και το βαθμό ανάπτυξής τους, έτσι ώστε όσο μεγαλύτερος ο αριθμός τους τόση μεγαλύτερη και η ανάπτυξη που παρουσιάζεται. Είναι δύσκολο να αμφισβητήσει κανείς το γεγονός ότι το ποσοστό των μυκοτοξινών που περιέχονταν σε τροφές παλιότερα, ήταν σε υψηλότερα επίπεδα από αυτό σήμερα, εξαιτίας της συντελούμενης τεχνολογικής ανάπτυξης η οποία επέφερε καταλληλότερες μεθόδους καλλιέργειας, συγκομιδής και αποθήκευσης των ζωοτροφών. Η μόλυνση των ζωοτροφών με μυκοτοξίνες μπορεί να λάβει χώρα όταν σπόρια των μυκήτων παρουσιαστούν στις ζωοτροφές κάτω από ευνοϊκές συνθήκες ανάπτυξης. Η περαιτέρω ανάπτυξή τους εξαρτάται από τους προαναφερθέντες παράγοντες θερμοκρασίας, υγρασίας. Μυκοτοξίνες μπορούν να παραχθούν και αναπτυχθούν τόσο στις καλλιέργειες στα χωράφια, όσο συνηθέστερα στις ζωοτροφές οι οποίες είναι αποθηκευμένες διότι το οξυγόνο που υπάρχει σε συνθήκες αποθήκευσης είναι μειωμένο, ευνοώντας την μυκητιακή ανάπτυξη. Επίσης η ανάπτυξη των μυκήτων λαμβάνει μέρος και σε βιομηχανικά επεξεργασμένες τροφές. Σύμφωνα με μια μέτρηση του F.A.O., το 25% των ζωοτροφών παγκοσμίως μολύνονται με μυκοτοξίνες κάθε χρόνο. Σε πολλές χώρες συμπεριλαμβανομένων και των Η.Π.Α. οι μυκοτοξίνες δεν αποτελούν μόνο ένα πρόβλημα υγείας αλλά και ένα σημαντικό οικονομικό πρόβλημα εάν ληφθούν υπόψη οι δαπάνες που επιφέρουν οι απώλειες των ύποπτων ζωοτροφών, καθώς και το κόστος που υπεισέρχεται από το πλήθος των αναλύσεων που απαιτούνται για τον έλεγχο των ζωοτροφών. 1.2. Η χημική δομή και τα είδη των μυκοτοξινων & η σχετική τοξικότητα τους Οι σημαντικότεροι τύποι μυκοτοξινών, των δευτερογενών μεταβολιτών των μυκήτων, παρατίθενται στον πίνακα που ακολουθεί: 3

Πίνακας 1. Κατηγορίες μυκοτοξινών Μυκοτοξίνη Αφλατοξίνες Ζεαραλενόνη Στεριγματοκυστίνη Ωχρατοξίνες Πατουλίνη Κιτρινίνη Πενικιλλικό οξύ Ρουμπατοξίνη Αλκαλοειδή του ergot Τ-Ζ τοξίνη Τριχοθισίνες Μύκητες Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Penecillium sp. Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium culmorum Aspergillus versicolor, Aspergillus nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Penecillium viridicatum, Penecillium ochraceus, Penecillium verrucosum Penecillium patulum, Penecillium expansum, Aspergillus clavatus Penecillium citrinum, Penecillium viridicatum Penecillium martensii, Penecillium viridicatum, Penecillium cyclopium Penecillium rubrum Claviceps purpurea Fusarium tricinctum Fusarium graminearium, Fusarium roseum 1.2.1 Αφλατοξίνες Οι αφλατοξίνες (aflatoxins) αποτελούν μία ομάδα από τις τοξικότερες ουσίες που βρίσκονται στη φύση. Οι ισχυρότατα τοξικές και καρκινογόνες αφλατοξίνες παράγονται από μύκητες (μούχλα), που αναπτύσσονται κυρίως σε ξηρά φρούτα, ξηρούς καρπούς (ιδιαίτερα στα αράπικα φιστίκια και αμύγδαλα), μπαχαρικά, σιτηρά και σε τυριά, όταν υπάρξουν κατάλληλες συνθήκες υγρασίας και θερμοκρασίας. Επίσης μπορεί να εμφανισθούν στο γάλα ζώων που έχουν τραφεί με ζωοτροφές (καλαμπόκι κλπ.), στα οποία είχαν αναπτυχθεί μύκητες (ευρωτίαση, μούχλα) [1]. Εικόνα 1. Χημικοί τύποι των κυριότερων αφλατοξινών [2]. 4

Χαρακτηριστική φυσικοχημική ιδιότητα των αφλατοξινών είναι ο έντονος φθορισμός των διαλυμάτων τους, υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας. Από την ιδιότητα αυτή προκύπτει το γράμμα που χαρακτηρίζει τις αφλατοξίνες B και G. Έτσι οι αφλατοξίνες B (B1, B2, B2a) χαρακτηρίζονται από έντονο κυανό (B: blue) φθορισμό, ενώ οι αφλατοξίνες G (G1, G2, G2a) από έντονο πράσινο (G: green) φθορισμό. Οι αφλατοξίνες M1 και Μ2 είναι μεταβολίτες των αφλατοξινών Β1 και Β2 και βρίσκονται στο γάλα (M: milk) ανθρώπων και θηλαστικών ζώων που έχουν τραφεί με τροφές μολυσμένες με αφλατοξίνες. Συντομογραφικά οι αφλατοξίνες συμβολίζονται ως: AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, κλπ. Πίνακας 2. Σύνοψη βασικών φυσικών και χημικών χαρακτηριστικών [3]. Αφλατοξίνη Μοριακός τύπος Μοριακό βάρος Β1 C 17H 12O6 312,28 Β2 C 17H 14O6 314,29 G1 C 17H 12O7 328,28 G2 C 17H 14O7 330,29 Σημείο τήξης ( ο C) 268-269 286-289 244-246 237-240 M1 C 17H 12O7 328,28 299 M2 C 17H 14O7 330,29 293 B2a C 17H 14O7 330,29 240 G2a C 17H 14O8 346,29 190 Πηγές και Ιδιότητες Παράγεται από τον Aspergillus flavus και τον Aspergillus parasiticus. Κυανός φθορισμός. Θεωρείται ως η ισχυρότερη καρκινογόνος ουσία για το ήπαρ. Παράγεται από τον Aspergillus flavus και τον Aspergillus parasiticus. Κυανός φθορισμός. Παράγεται από τον Aspergillus parasiticus. Πράσινος φθορισμός. Παράγεται από τον Aspergillus parasiticus. Πράσινος φθορισμός. Μεταβολίτης της B1 στους ανθρώπους και τα ζώα. Βρίσκεται στο μητρικό γάλα σε ποσότητες ng. Μεταβολίτης της B2 στους ανθρώπους και τα ζώα. Βρίσκεται στο γάλα (και σε γαλακτοκομικά προϊόντα) βοοειδών που τρέφονται με τροφές μολυσμένες με B2. Προϊόν προσθήκης ύδατος (καταλυόμενη από οξέα) στην B1. Κυανός φθορισμός. Προϊόν προσθήκης ύδατος (καταλυόμενη από οξέα) στην G1. Πράσινος φθορισμός. 5

Η επίδραση διάφορων φυσικών και χημικών παραγόντων στις αφλατοξίνες έχει εξετασθεί αρκετά, ώστε να διαπιστωθεί κατά πόσο είναι δυνατόν να απαλλαχθούν οι τροφές από αυτές με κάποια φυσική ή χημική διαδικασία. Συνοπτικά η επίδραση των παραγόντων αυτών έχει ως εξής: Θερμότητα: Σε ξηρά κατάσταση είναι σταθερές μέχρι το σημείο τήξης τους. Αντιθέτως, παρουσία υγρασίας σε μικρό χρονικό διάστημα καταστρέφονται, κυρίως με υδρόλυση της λακτονικής ομάδας και στη συνέχεια με αποκαρβοξυλίωση. Αλκάλια: Καταστρέφουν τις αφλατοξίνες με υδρόλυση του λακτονικού δακτυλίου. Ωστόσο, φαίνεται ότι η υδρόλυση αυτή είναι αντιστρεπτή. Παρουσία οξέος επανασχηματίζεται ο λακτονικός δακτύλιος. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες τα αλκάλια αποσπούν τη μεθοξυλική ομάδα από τον αρωματικό δακτύλιο. Οξέα: Ισχυρά ανόργανα οξέα μετατρέπουν τις αφλατοξίνες B1 και G1 στις B2a και G2a αντίστοιχα, με προσθήκη νερού στο διπλό δεσμό του ακραίου φουρανικού δακτυλίου. Οξειδωτικά μέσα: Οξειδωτικά μέσα όπως υποχλωριώδες νάτριο, υπερμαγγανικό κάλιο, χλώριο, υπεροξείδιο του υδρογόνου, υπερβορικό νάτριο φαίνεται ότι αλλοιώνουν τα μόρια, γεγονός που αποδεικνύεται από τον εξαφανισμό του χαρακτηριστικού φθορισμού τους. Αναγωγικά μέσα: Με υδρογόνωση οι αφλατοξίνες B1 και G1 μετατρέπονται στις αφλατοξίνες B2 και G2, αντίστοιχα. Με ισχυρότερα αναγωγικά μέσα, όπως το τετραϋδροβορικό νάτριο (NaBΗ 4 ) ανάγεται η κετονική ομάδα του κυκλοπεντενικού δακτυλίου των αφλατοξινών B1 και B2 (προς -CΗ2-) παρέχοντας τις αφλατοξινές RB1 και RB2 (Reduced B1, B2) [4]. 6

Εικόνα 2. Μυκοτοξικογόνοι μύκητες και μυκοτοξίνες. Παράγοντες που επιδρούν στην παραγωγή μυκοτοξινών από τους μύκητες είναι οι εξής: 1. Θερμοκρασία (7,5-40 ο C) 2. Υγρασία (> 80%) 3. Φως (μεγαλύτερη παραγωγή σε απουσία φωτός) 4. ph (ιδανικό 4-4,6) 5. Υπόστρωμα (ευνοϊκό υπόστρωμα είναι τα προϊόντα φυτικής προέλευσης) 6. Παρουσία μυκοστατικών (NaCl, σορβικό οξύ, καφεΐνη, θεοφυλλίνη, κ.ά.) Συνοπτικά, ο μηχανισμός της τοξικής δράσης των αφλατοξινών έχει ως εξής: Οι αφλατοξίνες στον οργανισμό με την επίδραση των ενζύμων της ομάδας του κυτοχρώματος P450 μεταβολίζονται στο ήπαρ προς διάφορα παραπροϊόντα, μεταξύ των οποίων βρίσκεται και μία εποξειδική ένωση. Ο μεταβολίτης αυτός σχηματίζει ένωση προσθήκης με τη γουανίνη του DNA και του RNA, γεγονός που οδηγεί σε αποπουρίνωση και θραύση της αλυσίδας των νουκλεϊνικών οξέων, με τελικό αποτέλεσμα τη διακοπή της σύνθεσης απαραίτητων πρωτεϊνών σε ιστούς ζωτικών οργάνων, όπως στο ήπαρ, στα έντερα και στο μυελό των οστών [9, 10]. 7

Εικόνα 3. Μηχανισμός της τοξικής δράσης των αφλατοξινών [11]. 1.2.2 Κιτρινίνη Η κιτρινίνη απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον μύκητα Penicillium citrinum, πριν από το δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο [15]. Ακολούθησε η ανακάλυψή της σε μία σειρά ειδών Penicillium (όπως Penicillium camemberti) και Aspergillus (Aspergillus terreus, Aspergillus niveus και Aspergillus oryzae) [16]. Πρόσφατα, η κιτρινίνη απομονώθηκε και από τους μύκητες Monascus ruber και Monascus purpureus, είδη τα οποία χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία για την παραγωγή κόκκινης χρωστικής [17]. Εικόνα 4. Χημική δομή της κιτρινίνης. Η κιτρινίνη περιέχεται στο σιτάρι, στη βρώμη, στη σίκαλη, στο καλαμπόκι, στο κριθάρι και στο ρύζι [23]. Με τη βοήθεια ανοσοτεχνικών μεθόδων είναι δυνατή η ανίχνευσή της ακόμη και σε μικροποσότητες σε όλα τα παραπάνω προϊόντα [24]. Παρ όλο που η κιτρινίνη έχει συσχετιστεί άμεσα με τα τρόφιμα, η επίδρασή της στην ανθρώπινη υγεία δεν έχει απολύτως διευκρινιστεί ακόμη. 1.2.3 Αλκαλοειδή του Ergot Τα αλκαλοειδή του ergot ή εργοτοαλκαλοειδή συγκαταλέγονται μεταξύ των σπουδαιότερων μεταβολιτών των μυκήτων. Κατηγοριοποιούνται σε: (α) ινδολοαλκαλοειδή και (β) παράγωγα του τετρακυκλικού δακτυλίου του ergot. Το 8

λυσεργικό οξύ, η κοινή δομή όλων των εργοτοαλκαλοειδών, απομονώθηκε το 1934. Κύριος εκπρόσωπος της οικογένειας είναι η εργοταμίνη [25]. Εικόνα 5. Χημική δομή της εργοταμίνης. Οι ενώσεις της κατηγορίας αυτής συγκροτούν ένα τοξικό κοκτέιλ, το οποίο παράγεται από μύκητες του γένους Claviceps. Η τοξικότητα των εργοτοαλκαλοειδών, άλλωστε, είχε αναφερθεί από την αρχαιότητα (600 π.χ.) [26]. Ο άνθρωπος ασθενεί όταν καταναλώσει δημητριακά, τα οποία έχουν μολυνθεί από μύκητες που εκκρίνουν εργοτοαλκαλοειδή, συνήθως υπό μορφή ψωμιού. Η συγκεκριμένη κατάσταση (νόσος) ονομάστηκε εργοτισμός. Δύο είδη εργοτισμού είναι χαρακτηριστικά: ο γαγγραινώδης και ο σπασμωδικός. Στη γαγγραινώδη μορφή της νόσου χαρακτηριστικό φαινόμενο είναι η διακοπή της παροχής των αρτηριών των κάτω άκρων με αίμα, ενώ όσον αφορά στη δεύτερη μορφή, η προσβολή του κεντρικού νευρικού συστήματος [27]. Ο εργοτισμός αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα στην κτηνιατρική. Τα ζώα που βρίσκονται σε άμεσο κίνδυνο είναι οι αγελάδες, τα πρόβατα, οι χοίροι και τα κοτόπουλα, με κύρια κλινικά συμπτώματα: γάγγραινα, τις αποβολές, έντονους σπασμούς, διακοπή του γάλακτος, υπερευαισθησία και αταξία [28]. Άλλωστε είναι γνωστό από τη λαϊκή παράδοση ότι εδώ και αιώνες οι μαίες των ζώων έχουν υιοθετήσει το ergot ως φάρμακο για τις αμβλώσεις, αφού είχε παρατηρηθεί ότι η βοσκή γρασιδιού μολυσμένου με εργοτοαλκαλοειδή προκαλεί αποβολές [29]. Γενικά, τα παράγωγα του ergot παρουσιάζουν μία πληθώρα δράσεων, οι οποίες καλύπτουν ένα μεγάλο φάσμα ασθενειών. Πρόσφατα, η ργοταμίνη 9

χρησιμοποιήθηκε ως φάρμακο για την ημικρανία. Άλλα παράγωγα χρησιμοποιούνται ως αναστολείς της προλακτίνης, ως αντιπαρκινσονικά και ως φάρμακα για τη θεραπεία αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων [30]. Παρ όλ αυτά, η χορήγησή τους είναι πολύ πιθανό να προκαλέσει εργοτισμό, ακόμη και σε φαρμακολογικά θεραπευτικές δόσεις [31]. 1.2.4 Φουμονισίνες Οι φουμονισίνες ανακαλύφθηκαν αρχικά και χαρακτηρίστηκαν το 1988 [32, 33]. Το μέλος της οικογένειας των φουμονισινών που απαντάται σε πληθώρα στη φύση είναι η φουμονισίνη Β1, η οποία συντίθεται από τη συμπύκνωση αλανίνης με ένα άλας του οξικού οξέος [34]. Εικόνα 6. Χημική δομή της φουμονισίνης Β1. Οι μύκητες που παράγουν φουμονισίνες είναι του γένους Fusarium και κυρίως οι: Fusarium verticillioides, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum και Fusarium nygamai [35, 36]. Ο μύκητας Fusarium verticillioides παρουσιάζει το μεγαλύτερο οικονομικό ενδιαφέρον. Αναπτύσσεται ως ενδόφυτο σε όλα σχεδόν τα είδη καλαμποκιού, χωρίς να προκαλεί απαραίτητα κάποια ασθένεια (λόγω της ύπαρξης της φουμονισίνης Β1), ωστόσο υπό κατάλληλες καιρικές συνθήκες ή μετά από τραυματισμό του φυτού από έντομα προκαλεί αποσύνθεση των φύλλων, του μίσχου και των άνθεων [37, 38, 39, 40, 41]. 10

1.2.5 Ωχρατοξίνες Η ωχρατοξίνη Α ανακαλύφθηκε αρχικά ως μεταβολίτης του μύκητα Aspergillus ochraceus το 1965, στα πλαίσια μίας μελέτης μεγάλης κλίμακας για την ανακάλυψη νέων μυκοτοξινών [56]. Μετέπειτα, η ωχρατοξίνη Α απομονώθηκε από το καλαμπόκι στις ΗΠΑ και αναγνωρίστηκε ως ισχυρή νεφροτοξίνη [57]. Εικόνα 7. Χημική δομή της ωχρατοξίνης Α. Τα μέλη της οικογένειας των ωχρατοξινών είναι μεταβολίτες διαφορετικών ειδών μυκήτων του γένους Aspergillus, όπως οι: Aspergillus alliaceus, Aspergillus auricomus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus glaucus, Aspergillus melleus και Aspergillus niger [58, 59, 60]. Επειδή ο Aspergillus niger χρησιμοποιείται ευρέως για την παραγωγή ενζύμων και κιτρικού οξέος για ανθρώπινη κατανάλωση, στη βιομηχανία είναι προφανώς απαραίτητη η επιλογή ειδών που δεν παράγουν ωχρατοξίνες [61, 62]. Παρ όλο που οι αρχικές έρευνες ενέπλεκαν όλα τα είδη του γένους Penicillium, σήμερα γνωρίζουμε ότι μόνο ο μύκητας Penicillium verrucosum που μολύνει το κριθάρι, παράγει ωχρατοξίνη [63, 64]. Η ωχρατοξίνη Α έχει ανιχνευθεί στη βρώμη, στη σίκαλη, στο σιτάρι, στους κόκκους του καφέ και στο κριθάρι, με το τελευταίο να είναι το πιο επιρρεπές στη μόλυνση. Επίσης, έχει βρεθεί σε συγκεκριμένα είδη κρασιού, ειδικά σε αυτά που παρασκευάζονται από καρπούς μολυσμένους με Aspergillus carbonarius [65, 66, 67]. Από όλες τις τοξίνες που παράγουν οι μύκητες τους γένους Aspergillus, μόνο η ωχρατοξίνη Α είναι τόσο σημαντική όσο οι αφλατοξίνες. Οι νεφροί είναι το κύριο όργανο στόχος της για όλα τα ζώα και τον άνθρωπο [68]. Πέραν από τη νεφροτοξική, παρουσιάζει επίσης ηπατοτοξική, ανοσοκατασταλτική, τερατογόνο 11

και καρκινογόνο δράση [69, 70]. Ο κύριος μηχανισμός δράσης της ωχρατοξίνης Α είναι η αναστολή του ενζύμου που υποβοηθά στη δημιουργία του συμπλόκου φαινυλαλανίνης trna [71, 72]. Επιπλέον, αναστέλλει την παραγωγή του ΑΤΡ στα μιτοχόνδρια και διεγείρει τη λιπιδική υπεροξείδωση [73, 74]. 1.2.6 Πατουλίνη Η πατουλίνη [4-υδρόξυ-4Η-φουρο(3, 2c)πυρανο-2(6Η)-όνη] παράγεται από πολλά είδη μυκήτων, αλλά πρωτοαπομονώθηκε ως αντιβιοτικό στη δεκαετία του 40 από τον μύκητα Penicillium griseofulvum. Ο ίδιος μεταβολίτης απομονώθηκε και από άλλα είδη, όπου του δόθηκαν διάφορα ονόματα όπως κλαβασίνη, κλαβιφορμίνη, εξπανσίνη, μυκοϊνη c και πενισιδίνη [84]. Εικόνα 8. Χημική δομή της πατουλίνης. Εκτός από την αντιμικροβιακή και την αντιπρωτοζωϊκή της δράση, η πατουλίνη παρουσιάζει τοξικότητα τόσο στα ζώα όσο και στα φυτά. Στα τελευταία προκαλεί έντονη αποσύνθεση (σάπισμα), κυρίως στα μήλα, στα αχλάδια και στα κεράσια. Επίσης, έχει βρεθεί σε μη επεξεργασμένους χυμούς των παραπάνω φρούτων [85]. Παρ όλο που η πατουλίνη είναι τοξική σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις σε εργαστηριακό επίπεδο, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας όρισε ως ανώτατο όριό της για τον ανθρώπινο οργανισμό τα 0.4 mg/kg/d [85]. 1.2.7 Ζεαραλενόνη Η ζεαραλενόνη, ένας δευτερογενής μεταβολίτης του μύκητα Fusarium graminearum, πήρε το όνομά της από τον συνδυασμό G. zeae, ρεσοκυκλικής οξικής λακτόνης, -έν- (διπλός δεσμός μεταξύ C1 και C2) και όνη (κετόνη C6) [86]. Σχεδόν ταυτόχρονα με τη ζεαραλενόνη, απομονώθηκε, κρυσταλλώθηκε και 12

μελετήθηκε για τις μεταβολικές του ιδιότητες ένα ανάλογό της, το οποίο ονομάστηκε F-2 [87, 88]. Εικόνα 9. Χημική δομή της ζεαραλενόνης. Η ζεαραλενόνη κατηγοριοποιείται ως μη στεροειδές οιστρογόνο ή μυκο-οιστρογόνο ή φυτο-οιστρογόνο. Βιοσυντίθεται από τους μύκητες Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium equiseti και Fusarium crookwellense, οι οποίοι μολύνουν τους καρπούς των δημητριακών [89]. Συγκέντρωση της ζεαραλενόνης, της τάξεως του 1 ppm, στην καθημερινή διατροφή οδήγησε σε υπερ-οιστρογονικό σύνδρομο στους χοίρους, ενώ ακόμη υψηλότερες συγκεντρώσεις έχουν ενοχοποιηθεί για αποβολές και άλλα προβλήματα στην αναπαραγωγή τόσο των χοίρων όσο και των προβάτων και των αγελάδων [90, 91]. Αυτός ήταν και ο λόγος, για τον οποίο η συγκεκριμένη ουσία χορηγήθηκε ως αντισυλληπτικό φάρμακο σε γυναίκες [92]. Πρόσφατα, η ζεαραλενόνη ενοχοποιήθηκε για τη μειωμένη αναπαραγωγική ικανότητα των ανδρών, χωρίς να είναι δυνατόν να εκτιμηθεί η πλήρη συμβολή της στα περιβαλλοντικά ξενοοιστρογόνα [93]. Συγκεντρωτικά, η ζεαραλενόνη και οι μεταβολίτες της παρουσιάζουν υψηλή δραστικότητα, αλλά χαμηλή τοξικότητα. Η LD50 της σε θηλυκά ποντίκια είναι υψηλότερη των 10.000 mg/kg, ενώ σε θηλυκούς χοίρους 5.000 mg/kg [92]. Ωστόσο, εκτενείς επιδημιολογικές μελέτες έχουν καταλήξει ότι δεν υπάρχει τοξικότητα στους ανθρώπους. Το όριο για την ημερήσια κατανάλωση της ζεαραλενόνης καθορίστηκε από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας στα 0.05 g/kg [94]. 13

1.3. Μέθοδοι Προσδιορισμού και Ανάλυσης Μυκοτοξινών. Οι περισσότερες μυκοτοξίνες είναι χημικά σταθερά μόρια και για το λόγο αυτό έχουν την τάση να επιβιώνουν κατά την αποθήκευση και την επεξεργασία ακόμη και μετά από μαγείρεμα σε χαμηλή θερμοκρασία (ψωμί και παραγωγή δημητριακών για πρωινό). Οι μυκοτοξίνες είναι δύσκολο να απομακρυνθούν και η καλύτερη μέθοδος ελέγχου είναι η αναστολή τους (95). Η παρουσία ενός αναγνωρισμένου μύκητα που παράγει τοξίνες, δεν σημαίνει απαραίτητα ότι θα παραχθούν οι τοξίνες διότι εμπλέκονται πολλοί παράγοντες για το σχηματισμό τους. Αντίστοιχα, η απουσία κάθε ορατής μούχλας δεν εγγυάται και την απουσία τοξινών. Οι μύκητες γενικά αναπτύσσονται σε κοιλότητες και δεν διανέμονται εξίσου στα αποθηκευμένα αγαθά. Επομένως, είναι απαραίτητη η δημιουργία ενός πρωτοκόλλου το οποίο θα διαβεβαιώνει ότι όταν ένα δείγμα λαμβάνεται για ανάλυση θα είναι αντιπροσωπευτικό ολόκληρης της μόλυνσης. Από τη στιγμή που οι μυκοτοξίνες δεν διανέμονται εξίσου στους κόκκους και στις ανάμικτες τροφές, η λήψη ενός τέτοιου δείγματος για την ανάλυση της μυκοτοξίνης είναι αρκετά δύσκολη (96). Το γεγονός ότι οι μυκοτοξίνες είναι τοξικές σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις απαιτεί ευαίσθητες και αξιόπιστες μεθόδους για την ανίχνευσή τους. Η δειγματοληψία και η ανάλυση είναι ζωτικής σημασίας αφού η αποτυχία της επίτευξης μια ικανοποιητικής επικυρωμένης ανάλυσης οδηγεί σε λανθασμένη αποδοχή ή απόρριψη προϊόντων με σοβαρές συνέπειες για τον ανθρώπινο οργανισμό. Επίσης, εξαιτίας των διαφορετικών δομών δεν υπάρχει μόνο μία τεχνική για την ανίχνευση όλων των μυκοτοξινών, αλλά αναπτύσσεται διαφορετική τεχνική ανάλογα με τις φυσικές και χημικές ιδιότητες. Ιδανική θα ήταν η ύπαρξη απλών μεθόδων που δεν θα χρειαζόταν επιστημονικό προσωπικό και που θα ήταν απλές και οικονομικές. Η εφαρμογή απλούστερων, φθηνότερων και αποτελεσματικών μεθόδων για την ανίχνευση των μυκοτοξινών είναι απαραίτητη για τη νονοθεσία των μέγιστων ορίων ποσότητας στα τρόφιμα. 14

Μια επιτυχημένη μέθοδος ανίχνευσης πρέπει να είναι ευαίσθητη, να έχει υψηλό βαθμό ευελιξίας σε ένα μεγάλο εύρος μεταβολιτών, αλλά και να είναι πολυ εξειδικευμένη λοταν χρειάζεται. Για εργασία στο πεδίο, η μέθοδος πρέπει να είναι ταχεία και φορητή. 1.4 Μέθοδοι προ-επεξεργασίας δειγμάτων Οι περισσότερες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό μιας μυκοτοξίνης βασίζονται στην ακριβή και σωστή απομόνωση και στις μεθόδους καθαρισμού. Κατά την ELISA δεν απαιτείται ξαθαρισμός. (97). Η προετοιμασία του δείγματος είναι ζωτικής σημασίας για ένα επιτυχημένο πρωτόκολλο και επηρεάζει την τελική επιλογή της διαδικασίας ανίχνευσης. Η μέθοδος απομόνωσης που χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση των μυκοτοξινών από το βιολογικό στρώμα, εξαρτάται από τη δομή των τοξινών. Οι πολικοί μεταβολίτες όπως οι φουμονισίνες απαιτούν προσθήκη νερού κατά την παρουσία οργανικών διαλυτών (98). Η επιλογή του διαλύτη εξαρτάται από το στρώμα από το οποίο γίνεται η εκχύλιση, αφού τα διαφορετικά χημικά μίγματα μπορούν να τον επηρεάσουν (99). Η χρήση χλωριωμένων τεχνικών για την απομόνωση μειώνεται σταδιακά διότι αποτελούν οικολογικά απόβλητα (100). Η διαδικασία του καθαρισμού που χρησιμοποιείται σε ένα πρωτόκολλο αποτελεί το πιο σημαντικό βήμα, αφού η καθαρότητα του δείγματος επηρεάζει την ευαισθησία των αποτελεσμάτων. Τα γυάλινα σκεύη που χρησιμοποιούνται πρέπει να είναι αποστειρωμένα και να μην έχουν ίχνος μυκοτοξίνης. 1.4.1 Υγρή - υγρή εκχύλιση Η υγρή-υγρή εκχύλιση (LLE) περιλαμβάνει την απομόνωση της τοξίνης λόγω διαφορετικής διαλυτότητας στην υδατική φάση και στην αμιγή οργανική φάση διαχωρίζοντας έτσι τον μεταβολίτη μέσα σε ένα διαλύτη και αφήνοντας το υπόλοιπο στην άλλη πλευρά. Διαλύτες όπως το εξάνιο και το κυκλοεξάνιο χρησιμοποιούνται για την απομάκρυνση μη πολικών μολυσμάτων (λιπίδια και χοληστερόλη). Η διαδικασία αυτή είναι αποτελεσματική για πολλές τοξίνες. Το 15

μειονέκτημα της μεθόδου είναι η απώλεια δείγματος λόγω προσρόφησης στα γυάλινα σκεύη. 1.4.2 Εκχύλιση υγρής φάσης (SPE) Η βασική αρχή της συγκεκριμένης τεχνολογίας είναι μία ποικιλία από χρωματογραφικές τεχνικές οι οποίες στηρίζονται σε μικρά απορριπτέα σφαιρίδια τα οποία πακετάρονται μαζί με το Silica gel. Το δείγμα φορτώνεται σε ένα διαλύτη, υπό συνθήκες χαμηλής πίεσης όπου οι περισσότεροι από τους μεταβολίτες απομακρύνονται και μεταφέρονται σε άλλο διαλυτη (101). Αυτά τα σφαιρίδια περιέχουν διαφορετικές δομικές φάσεις που εκτείνονται απο το silica gel, C-18 (octadecylsilane), florisil, phenyl, aminopropyl και υλικά ανταλλαγής ιόντων μέχρι τα υλικά συγγένειας όπως είναι οι ανοσοπροσροφητές και τα μοριακά πολυμερή (102, 103). Οι δεσμευμένες φάσεις ανταλλαγής ανιόντων παρέχουν καλό καθαρισμό των εκχυλίσεων που περιλαμβάνουν (FUMs). Η τεχνική της SPME (Solid Phase Micro-Extraction) σε συνδυασμό με την HPLC- UV/DAD έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία για το προσδιορισμό του μυκοφαινολικού οξέος στο τυρί [104]. Ο ίδιος συνδυασμός τεχνικών εφαρμόζεται και στον προσδιορισμό της πατουλίνης (105) Όσον αφορά στις φουμονισίνες Β1 και Β2, η τεχνική της SPE ανάστροφης φάσης (C-18) εφαρμόζεται για τον διαχωρισμό τους από δείγματα πλάσματος και ούρων, ενώ ο καθαρισμός πραγματοποιείται μέσω της HPLC ανάστροφης φάσης (106). Σήμερα, η SPE είναι η πιο δημοφιλής εργαστηριακή τεχνική ρουτίνας ανάλυσης των μυκοτοξινών. Παρ όλ αυτά, παρουσιάζει βασικά μειονεκτήματα, όπως: (α) είναι σχεδόν αδύνατον να υπάρχει μόνο μία στήλη διαχωρισμού για όλες τις μυκοτοξίνες και (β) κάθε τύπος πρέπει να χειριστεί σε διαφορετικές συνθήκες για την ανάλυση (ph, μείγμα διαλυτών κλπ.) [107]. Η silica gel είναι το πιο κοινό υλικό πλήρωσης των στηλών ανάλυσης, μιας και προσφέρει τη δυνατότητα πολλαπλής σιλανοποίησης και ανάπτυξης διαφορετικών ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Οι συγκεκριμένες στήλες ανάλυσης μπορούν 16

να χρησιμοποιηθούν είναι απευθείας, είτε και μετά από επεξεργασία για την κατάλληλη τροποποίηση των ιδιοτήτων τους [108, 109]. 1.5. Διαχωριστικές Τεχνικές 1.5.1 Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας (TLC) Παραδοσιακά η πιο διαδεδομένη τεχνική ανάλυσης των μυκοτοξινών, αφού είναι αρκετά οικονομική και προσφέρει τη δυνατότητα της ταυτόχρονης ανάλυσης μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Επιπλέον, ενδείκνυται για ποσοτικές αναλύσεις μυκοτοξινών σε δείγματα ανθρώπων και ζώων. Ωστόσο, κύρια προϋπόθεση για την ανάλυση οποιασδήποτε ουσίας είναι η προετοιμασία των δειγμάτων και ο προηγούμενος καθαρισμός τους. Ανάλογα με την κατηγορία των μυκοτοξινών πραγματοποιείται και καθαρισμός τους μέσω διαφόρων τεχνικών, όπως ELISA, HPLC, κ.ά. [110, 111]. Χαρακτηριστική αναφορά στη βιβλιογραφία είναι ο προσδιορισμός της ζεαραλανόνης με τη μέθοδο της HPLC [112]. 1.5.2 Υψηλής απόδοσης Υγρή Χρωματογραφία (HPLC) Η νέα ανάλυση των μυκοτοξινών βασίζεται στην υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ΗPLC περιλαμβάνοντας διάφορες προσροφητικές ουσίες που εξαρτώνται από τη φυσική και χημική δομή των μυκοτοξινών. Οι στήλες κανονικής και ανάστροφης φάσης χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό και τον καθαρισμό τοξινών που εξαρτώνται από την πολικότητα τους. Επίσης, χρησιμοποιούνται μικρές στήλες για την προεπεξεργασία του δείγματος και μεγάλης κλίμακας στήλες για την προετοιμασία των προτύπων διαλυμάτων των μυκοτοξινών [113-115]. Στην ουσία, τα περισσότερα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται στην HPLC για την ανίχνευση των μυκοτοξινών είναι παρόμοια. Οι πιο κοινές μέθοδοι ανίχνευσης είναι οι ανιχνευτές UV ή φθορισμού, οι οποίοι στηρίζονται στην παρουσία ενός χρωμοφόρου στα μόρια. Η HPLC αποτελεί τη βασική τεχνική ανίχνευσης των μυκοτοξινών και περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό πρωτοκόλλων για την ανάλυση της ωχρατοξίνης Α [116]. Η φασματοφωτομετρία μάζας αποτέλεσε και αυτή πρότυπη μέθοδο ανίχνευσης επιτρέποντας υψηλή ακρίβεια και εξειδικευμένη ανίχνευση των τοξινών. Οι ανιχνευτές αυτοί σχετίζονται και με άλλες μεθόδους διαχωρισμού όπως η HPLC και η GC (gas chromatography). Οι περιοριστικοί παράγοντες στη χρήση της φασματοφωτομετρίας μάζας ως εργαλείο ανάλυσης είναι το υψηλό κόστος του εξοπλισμού, οι περίπλοκες εργαστηριακές απαιτήσεις 17

και οι περιορισμοί στον τύπο των διαλυτών απομόνωση και το διαχωρισμό. που χρησιμοποιούνται στην Τα βασικά πλεονεκτήματα της HPLC είναι η υψηλή ποιότητα διαχωρισμού και η δυνατότητα συνδυασμού πολλών συστημάτων ανίχνευσης (φθορισμός, UV) με τη συγκεκριμένη τεχνολογία, επιτρέποντας έτσι πολλαπλές ανιχνεύσεις των συστατικών από ένα δείγμα. Επίσης, μπορεί και να αυτοματοποιηθεί γεγονός το οποίο της προσφέρει ένα προβάδισμα σε σχέση με την TLC και την ELISA. 1.5.3 Αέριος Χρωματογραφία (GC) Η αέριος χρωματογραφία χρησιμοποιείται φυσιολογικά για την αναγνώριση και την ποσοτικοποίηση της παρουσίας των μυκοτοξινών στα δείγματα τροφίμων και έχουν αναπτυχθεί πολλά πρωτόκολλα για αυτήν την μέθοδο. Φυσιολογικά, η μέθοδος σχετίζεται με τη φασματοφωτομετρία μάζας, τον ανιχνευτή ιονισμού φλόγας με σκοπό την ανίχνευση πτητικών προϊόντων (117). Οι περισσότερες μυκοτοξίνες δεν είναι πτητικές και επομένως πρέπει να παραγωγοποιηθούν για ανάλυση με τη χρήση GC [118]. Έχουν αναπτυχθεί πολλές τεχνικές για την παραγωγοποίηση των μυκοτοξινών. Οι χημικές αντιδράσεις όπως η πολυφλουοροακυλίωση χρησιμοποιούνται για να δώσουν ένα πτητικό υλικό [118]. Όπως και με τις άλλες μυκοτοξίνες, η οχρατοξίνη Α δεν μπορεί να καθοριστεί άμεσα από την αέριο χρωματογραφία αφού δεν είναι πτητική. Παρόλο που έχουν αναφερθεί αρκετά παραδείγματα επιτυχούς εφαρμογής της GC στην ανάλυση των μυκοτοξινών, υπάρχουν και αρκετά μειονεκτήματα. Αρχικά, τα δείγματα που χρειάζονται ανάλυση πρέπει να είναι πτητικά ή αλλιώς να μετατραπούν σε πτητικά. Επιπλέον, η θερμική σταθερότητα αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα, διότι πολλές φορές η θέρμανση αποικοδομεί τα δείγματα. Σημειώνεται ότι με διάφορες ανοσοχημικές τεχνικές, όπως η ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbant Assay), ο προσδιορισμός των αφλατοξινών στα τρόφιμα αποτελεί πλέον μία σχετικά απλή αναλυτική διαδικασία, ενώ ακριβέστερες μετρήσεις πραγματοποιούνται κατά κανόνα με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) [119]. 18

Ο προσδιορισμός των αφλατοξινών στον άνθρωπο γίνεται με τη χρήση δύο τεχνικών. Στην πρώτη μετρείται η ένωση προσθήκης AFM1-γουανίνης στα ούρα. Η παρουσία αυτού του προϊόντος μεταβολισμού δείχνει έκθεση σε αφλατοξίνες κατά τις προηγούμενες 24 ώρες. Παρ όλ αυτά δεν είναι αρκετά ικανοποιητική μέθοδος, λόγω της διάσπασης της ένωσης προσθήκης με την πάροδο του χρόνου. Όσον αφορά στη δεύτερη τεχνική, στηρίζεται στον προσδιορισμό της ένωσης προσθήκης AFB1-αλβουμίνης στο πλάσμα του αίματος. Ο προσδιορισμός είναι ακριβέστερος, θετικός κατά 90% στα θετικά δείγματα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μακροχρόνιες εκθέσεις, αφού παραμένει θετικός για 2-3 μήνες μετά την έκθεση σε αφλατοξίνες [120]. Σε αντίθεση με τις περισσότερες μυκοτοξίνες που είναι υδατοδιαλυτές, οι φουμονισίνες είναι υδρόφοβες, γεγονός που τις καθιστά δύσκολες στη μελέτη τους. Συνήθως, εκχυλίζονται με τη βοήθεια μιγμάτων μεθανόλης νερού ή με ακετονιτριλίου νερού [121]. Η ανίχνευσή τους πραγματοποιείται είτε με τη χρήση της HPLC (High Performance Liquid Chromatography), είτε μέσω φθοριζόντων χημικών ομάδων [122]. 1.6. Η Παρουσία των Διάφορων Μυκοτοξινών στα Διάφορα Τρόφιμα και Αγροτικά Προιόντα. Σε γενικές γραμμές, οι σοδειές που αποθηκεύονται για περισσότερες από μερικές μέρες γίνονται πιθανός στόχος ανάπτυξης μούχλας και σχηματισμού μυκοτοξινών. Τα βασικότερα τροφικά αγαθά που μολύνονται είναι τα δημητριακά, τα καρύδια, ο καφές, το κακάο, τα αποξηραμένα φρούτα, τα καρυκεύματα, τα αποξηραμένα μπιζέλια, τα φασόλια και φρούτα και κυρίως τα μήλα. Οι μυκοτοξίνες μπορούν επίσης να ανιχνευθούν στη μπύρα και στο κρασί που αποτελούν το αποτέλεσμα της χρησιμοποίησης μολυσμένου κριθαριού, άλλων δημητριακών και σταφυλιών κατά την παραγωγή τους. Επίσης, μπορούν να εισέλθουν μέσω του κρέατος ή άλλων ζωικών προϊόντων όπως το γάλα, τα αυγά και το τυρί ως αποτέλεσμα μολυσμένων ζώων φάρμας. Συχνά είναι γενοτυπικά εξειδικευμένοι, αλλά μπορούν να παραχθούν από 1 ή περισσότερα είδη μυκήτων. Η πλειοψηφία των μυκοτοξινών, των δευτερογενών δηλαδή μεταβολιτών, συντίθενται με απλές βιοσυνθετικές αντιδράσεις μικρών μορίων. Το αποτέλεσμα είναι ότι οι μεταβολίτες έχουν διαφορετικό εύρος τοξικών οξείων και χρόνιων επιδράσεων. Οι μυκοτοξίνες μπορούν να εμφανιστούν στην τροφική αλυσίδα ως συνέπεια της μυκητιακής μόλυνσης, είτε με την άμεση κατανάλωση από τους ανθρώπους, είτε με τη 19

χρησιμοποίηση ως τροφή ζωικού κεφαλαίου. Οι μυκοτοξίνες αντιστέκονται πολύ στην αποσύνθεση και στην πέψη, οπότε παραμένουν στην τροφική αλυσίδα στο κρέας και τα γαλακτοκομικά προϊόντα. Ούτε οι επεξεργασίες θερμοκρασίας, όπως το μαγείρεμα και το πάγωμα, δεν καταστρέφουν τις μυκοτοξίνες. 1.7. Συνέπειες των Μυκοτοξινών στους Ζώντες Οργανισμούς και στον Άνθρωπο. 1.7.1 Οι Μυκοτοξίνες στις Ζωοτροφές. Οι μυκοτοξίνες που συναντώνται συχνά στις ζωοτροφές είναι οι αφλατοξίνες, οι ωχρατοξίνες και οι μυκοτοξίνες του μύκητα Fusarium. Αυτές διαφέρουν στις τοξικές τους επιπτώσεις και στην επικράτησή τους μεταξύ των περιοχών (Πίνακας 1). Αυτές οι μυκοτοξίνες έχουν χρόνιες επιπτώσεις στη ζωή των ζώων. Όταν χρησιμοποιούνται εν αγνοία μολυσμένα συστατικά στην παραγωγή τροφής, τα ζωικά είδη μπορεί να αναπτύξουν οξεία μυκοτοξίκωση. Οι αφλατοξίνες, οι ωχρατοξίνες και οι μυκοτοξίνες που προκαλούν τρέμουλο οδηγούν επίσης στη δηλητήριαση των κατοικιδίων ζώων λόγω κατανάλωσης μολυσμένης τροφής. Οι δομές των σημαντικότερων μυκοτοξινών 20

1.7.1.1 Αφλατοξίνες Οι αφλατοξίνες είναι ηπατοτοξικές και καρκινογενείς. Σκύλοι που εκτίθενται σε 0.5-1mg αφλατοξίνης ανά κιλό βάρους σώματος εμφανίζουν κατάθλιψη, πολυδιψία, πολυουρία, εμέτους και ηπατίτιδα (7) και πεθαίνουν σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα (5-7 ημέρες). Η ανορεξία, ο λήθαργος, ο ίκτερος, η διασπειρόμενη ενδοαγγειακή συγκόλληση και ο θάνατος έχουν αναφερθεί σε σκύλους που εκτίθενται σε 0.05-0.3 mg αφλατοξίνης ανά κιλό τροφής σε διάστημα 6-8 εβδομάδων. Οι Newberne and Wogan (12) προκάλεσαν επαγωγή κακοηθών όγκων σε ποντίκια εντός 80 εβδομάδων έκθεσής τους σε 15ng αφλατοξίνης Β1 ανά κιλό τροφής. Η ανορεξία και η κατάθλιψη αποτελούν τα δύο πιο ορατά συμπτώματα αφλατοξίκωσης στους σκύλους αν και έχουν αναφερθεί και πολλά περιστατικά αιφνίδιου θανάτου. Σε περιπτώσεις ζώων φάρμας, οι μολύνσεις από αφλατοξίνες εμμένουν για πολλούς μήνες πριν τη διάγνωσή τους, επηρεάζοντας έτσι ένα μεγάλο αριθμό ζώων (19). Η άμεση διάγνωση από τους κτηνίατρους και οι διαδικασίες ταχείας ανάκλησης διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον περιορισμό τέτοιων ραγδαίων μολύνσεων. Οι τροφές άγριων πουλιών αναφέρονται ως οι πιο επιμολυσμένες μεταξύ διαφορετικών τύπων ζωοτροφών σε πολλές έρευνες, πιθανώς εξαιτίας της χρήσης καλαμποκιού, καρυδιών και σπόρων ως βασικά συστατικά (25). Αντίθετα, οι εμπορικές τροφές γατών και σκύλων έχουν σε γενικές γραμμές μικρότερη περιεκτικότητα σε αφλατοξίνες οπότε η επίδρασή τους είναι ανεπαρκής για να προκαλέσει αξιοσημείωτα συμπτώματα. Η χρόνια όμως έκθεση σε αυτές έχει ηπατοτοξικές και καρκινογόνες συνέπειες. Ένας μεγάλος αριθμός μυκήτων που παράγουν αφλατοξίνες, έχουν επίσης ανιχνευθεί στις εμπορικές ζωοτροφές (30). Για παράδειγμα, ο Aspergillus flaνus, βρέθηκε σε 14 από τα 60 δείγματα ζωοτροφών σε έλεγχο στην Πορτογαλία (30). Σε άλλη έρευνα ανιχνεύθηκε σημαντική ανάπτυξη του Aspergillus spp. σε εμπορικές ζωοτροφές με ποσοστό υγρασίας 20-25% μετά από επώαση 4 εβδομάδων. Παρόλο που η παρουσία τοξικογενών μυκήτων δεν έχει απαραίτητα ως αποτέλεσμα την παραγωγή μυκοτοξινών, η αναστολή της μυκητιασικής ανάπτυξης στις ζωοτροφές μπορεί να ελαχιστοποιήσει τον κίνδυνο των μυκοτοξικώσεων. 21

1.7.1.2 Ωχρατοξίνες Οι ωχρατοξίνες παράγονται από διάφορα είδη Aspergillus και Penicillium spp μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται και τα είδη A. ochraceus και P. errucosum (10). Απαντώνται κυρίως σε σπόρους δημητριακών αλλά και σε ζωικά παραπροϊόντα λόγω της υψηλής συγγένειάς τους με τις πρωτεΐνες του πλάσματος και του μεγάλου χρόνου ημιζωής στους ζωικούς ιστούς (Πίνακας 1). Υπάρχουν 4 ομόλογα ωχρατοξινών: Α, Β, C και D. Η ωχρατοξίνη Α είναι η πιο συχνή, ενώ οι ωχρατοξίνες Α και C είναι οι πιο τοξικές (1). Οι ωχρατοξίνες ως διυδροϊσοκουμαρίνες που περιέχουν φαινυλαλανίνη, πιστεύεται ότι δρουν μέσω αναστολής του μεταβολισμού της φαινυλαλανίνης (31). Επίσης, η ωχρατοξίνη Α περιέχει και ένα τμήμα χλωριούχου φαινόλης, μια προκαρκινογόνο ομάδα που προκαλεί ηλεκτρονιόφιλη προσβολή στο DNA (28). Οι ωχρατοξίνες συσσωρεύονται αρχικά στους νεφρούς εξαιτίας της υψηλής αιματικής ροής (32). Επιπλέον, η ωχρατοξίνη Α εμπλέκεται με μονοπάτια μεταγωγής σήματος σε νανομοριακές συγκεντρώσεις στα νεφρικά κύτταρα, οδηγώντας σε εξειδικευμένες μεταβολές στη λειτουργία και στο φαινότυπο αλλά όχι σε νέκρωση (33). Η ωχρατοξίνη Α αποτελεί νεφροτοξίνη των ζωικών ειδών. Έκθεση 2 εβδομάδων σε 0,3mg ωχρατοξίνης ανά κιλό βάρους σώματος είναι θανατηφόρα σε νεαρά σκυλιά, τα οποία εμφανίζουν σοβαρή βλάβη νεφρών, ανορεξία, εμέτους, απώλεια βάρους, εντερική αιμορραγία, αφυδάτωση και εξάντληση (34). 1.7.1.3 Μυκοτοξίνες Fusarium Οι μυκοτοξίνες αυτές αποτελούν χημικά και βιολογικά μία διαφορετική ομάδα συστατικών. Τα τριχοθηκένια, μία οικογένεια 100 σύνθετων ενώσεων τετρακυκλικών σεσκουιτερπενοειδών, παράγονται από τα είδη F. graminearum, F. sporotrichioides, και Stachybotrys chartarum (44). Η ζεαραλενόνη παράγεται 22

αρχικά από το F. Graminearum, F. aνenaceum και F. nivale. H φουμονισίνη και το φουσαρικό οξύ παράγονται από πολλά είδη Fusarium. Το καλαμπόκι, το σιτάρι και το κριθάρι που παράγονται στη βόρεια Αμερική είναι συχνά μολυσμένα με δεοξυνιβαλενόλη (το πιο συχνό τριχοθηκένιο) (51). Τα τριχοθηκένια προκαλούν εμέτους, γαστροεντερικό ερεθισμό και ανασοκαταστολή (1). Οι Hughes et al. (52) αναφέρουν ανορεξία και εμέτους σε σκύλους και γάτες που εκτέθηκαν σε 4,5 και 7,7mg δεοξυνιβαλενόλη ανά κιλό τροφής αντίστοιχα. Η ζεαραλενόνη από την άλλη πλευρά, είναι μία οιστρογονική μυκοτοξίνη (53). Διατροφική έκθεση 7 ημερών σε 200μg ζεαραλενόνης ανά κιλό βάρους σώματος προκαλεί μεταβολές στο αναπαραγωγικό σύστημα των σκύλων (55). Οι φουμονισίνες αναστέλλουν τη σύνθεση και το μεταβολισμό των σφιγγολιπιδίων και καταστρέφουν πολλούς ζωικούς ιστούς (1). Επίσης, η φουμονισίνη Β1 βρέθηκε ότι προκαλεί καρκίνο του ήπατος και των νεφρών σε τρωκτικά (56). Το φουσαρικό οξύ αποτελεί έναν πιθανό αναστολέα της β-υδροξυλάσης της ντοπαμίνης, καταστέλλοντας τη σύνθεση της νορεπινεφρίνης στον εγκέφαλο από σκύλους, γάτες, κουνέλια και ποντικούς (59). Παρατηρήθηκαν μειωμένη όρεξη, έμετοι, απώλεια βάρους και υπόταση μετά από διατροφική έκθεση σκύλων σε 50mg φουσαρικού οξέος ανά κιλό βάρους σώματος για 30 μέρες και 6 μήνες (60). 1.7.1.4 Μυκοτοξίνες που προκαλούν τρόμο Οι μυκοτοξίνες που προκαλούν τρόμο παράγονται από τους μύκητες Penicillium, Aspergillus, and Claνiceps (6). Αντίθετα με τις αφλατοξίνες, την ωχρατοξίνη Α και τα τριχοθηκένια, οι μυκοτοξίνες που προκαλούν τρόμο σπάνια συναντώνται σε συστατικά τροφής αλλά συνήθως παράγονται κατά την αλλοίωση των τροφίμων. Οι σκύλοι εκτίθενται σε αυτές τις μυκοτοξίνες όταν τρέφονται με μουχλιασμένα απορρίμματα (προϊόντα καθημερινότητας, καρύδια, σπόροι, ψωμί και μακαρόνια) (64). Περισσότερες από 20 μυκοτοξίνες έχουν ταξινομηθεί ως αυτές που προκαλούν τρόμο με κυριότερες τα πενιτρέμιο Α και ροκεφορτίνη (65). Οι πλειοψηφία αυτών των μυκοτοξινών αποτελούν αλκαλοειδή ινδόλης και προκαλούν εμέτους, αταξία και τρόμο πιθανώς παρεμποδίζοντας τους ανασταλτικούς νευροδιαβιβαστές όπως τη γλυκίνη και το γ-αμινοβουτυρικό οξύ του κεντρικού νευρικού συστήματος (68). Έκθεση σε 0,175mg πενιτρεμίου Α ανά κιλό βάρους σώματος είναι αρκετό για να επάγει μυικό τρόμο στους σκύλους (67). Τέλος, έχουν καταγραφεί τουλάχιστον 10 αναφορές τέτοιου είδους μυκοτοξικώσεων σε σκύλους 23

λόγω της κατανάλωσης απορριμμάτων από το 1979 κυρίως στη βόρεια Αμερική (64, 67, 68, 71, 78). 1.7.1.5. Μυκοτοξίνες που Επιδρούν στον Άνθρωπο. Πίνακας. Οι κλάσεις των σημαντικότερων μυκοτοξινών και των φυσιολογικών τους επιδράσεων ΤΟΞΙΝΗ Αφλατοξίνες Κιτρινίνες Τριχοθηκένια Κυκλοπιαζονικό οξύ Φουμονισίνες Μονιλιφορμίνη Οχρατοξίνες Πατουλίνη Ζεαραλενόνη Κιτρεοβιριδίνη Στεριγματοκυστίνη ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΤΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΏΝ Καρκινογόνος δράση, οξεία ηπατίτιδα, κατεστραμμένο ανοσοποιητικό σύστημα Νεφροτοξικότητα Ανοσοκατασταλτικά, γαστροεντερική αιμορραγία Καρκινογόνος δράση, διάρροια, βλαβες ήπατος, νεφρών, υπερευαισθησία, κατάθλιψη Καρκινογόνος δράση, ηπατοτοξικές Καρκινογόνος δράση, απώλεια βάρους, εσωτερική αιμορραγία Καρκινογόνος δράση, ηπατοτοξικές, νεφροτοξικές και τερατογενετικές Αιμορραγία πνευμόνων και εγκεφάλου Ενεργότητα οιστρογόνων Νευροτοξικότητα Καρκινογόνος δράση, διάρροια, βλαβες ήπατος, νεφρών Ορισμένα είδη μυκήτων Aspergillus μπορούν να παράγουν μυκοτοξίνες. Αυτά τα είδη Aspergillus δεν παράγουν συνεχώς μυκοτοξίνες, αλλά μπορεί να προκληθεί η παραγωγή από διάφορους παράγοντες όπως το στρες. Οι μυκοτοξίνες αυτές παράγονται κυρίως από το είδος Aspergillus flavus και ονομάζονται αφλατοξίνες. 1.7.1.6 Ασπεργίλλωση Το σύνολο των ασθενειών που προκαλούνται στον άνθρωπο, από την έκθεση στον Aspergillus είναι γνωστό ως ασπεργίλλωση. Οι κύριες ασθένειες της ασπεργίλλωσης είναι οι εξής: Αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση Οξεία διηθητική ασπεργίλλωση 24

1.7.1.6.1 Αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση Η αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση συνήθως προκαλείται από τον μύκητα Aspergillus fumigatus. Η αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση (ABPA) είναι μια ασθένεια όπου το ανοσοποιητικό σύστημα ενός ατόμου είναι υπερευαίσθητο σε σπόρια μυκήτων. Αυτή η υπερευαισθησία προκαλεί αλλεργικές αντιδράσεις στο πρόσωπο, καθώς το ανοσοποιητικό σύστημα προσπαθεί να εκδιώξει τα σπόρια από το σώμα. Οι άνθρωποι με κυστική ίνωση ή άσθμα είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι στην αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση, με περίπου το 5% των ασθματικών να υφίστανται αυτήν την ασθένεια σε κάποια στιγμή στη ζωή τους. Συμπτώματα: Δυσκολία στην αναπνοή και δύσπνοια Συριγμός Τα συμπτώματα του άσθματος, κρίσεις άσθματος Βλεννώδης βήχας Βήχας με αιμόπτυση Παραρρινοκολπίτιδα (μόλυνση ή φλεγμονή των κόλπων) Απώλεια της όρεξης Πυρετός Γενική δυσφορία και αδιαθεσία Σε μεταγενέστερα στάδια μπορεί να προκαλέσει βλάβη στους πνεύμονες (ίνωση) Οι αφλατοξίνες είναι εξαιρετικά τοξικές, καρκινογόνες, μεταλλαξιογόνες και ανοσοκατασταλτικές ουσίες. Η αφλατοξίνη Β1 θεωρείται ως το ισχυρότερο γνωστό καρκινογόνο του ήπατος με αποδεδειγμένη γεννοτοξικότητα. Χαρακτηριστικά, αναφέρεται ότι η καρκινογόνος δράση του είναι περίπου 1000 φορές ισχυρότερη του βενζοπυρενίου, ενός πολυπυρηνικού υδρογονάνθρακα που αποτελεί το δραστικότερο μεταλλαξιογόνο συστατικό του καπνού των τσιγάρων [5]. Το πρόβλημα των αφλατοξινών αναγνωρίσθηκε ως σημαντικό διατροφικό πρόβλημα όταν το 1960 προκλήθηκε σοβαρή ασθένεια (νέκρωση του ήπατος) στα πουλερικά και κυρίως στις γαλοπούλες στη Μ. Βρετανία, από την οποία πέθαναν 25

περίπου 100.000 πτηνά. Αρχικά, τα αίτια αυτής της περίεργης ασθένειας ήταν άγνωστα και έτσι η ασθένεια ονομάστηκε "Turkey 'X' disease". Αργότερα, διαπιστώθηκε ότι η αιτία ήταν η ανάπτυξη του μύκητα Aspergillus flavus στις πτηνοτροφές, από τον οποίο πήραν και το όνομα οι αφλατοξίνες (A. fla. toxin) [6]. Από τότε, το πρόβλημα της παρουσίας των αφλατοξινών στα τρόφιμα και σε ζωοτροφές θεωρείται πολύ σημαντικό και έχουν καθιερωθεί συστηματικοί έλεγχοι και ανώτατα όρια στα διάφορα τρόφιμα. Το ανώτερο επιτρεπόμενο όριο για ολικές αφλατοξίνες στην Ευρωπαϊκή Ένωση είναι 4μg/Kg, ενώ το όριο για την αφλατοξίνη Β1 (AFB1) είναι τα 2μg/Kg τροφίμου. Η νομοθεσία δεν παρέχει απόλυτη ασφάλεια, αλλά μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο για επιβλαβείς συνέπειες, λόγω της υψηλής τοξικότητας της αφλατοξίνης Β1. Στις ΗΠΑ το όριο είναι 20μg/Kg για σιτηρά και καλαμπόκι που προορίζονται για ζωοτροφές σε νεαρά ζώα και ιδιαίτερα κοτόπουλα, ενώ το όριο μπορεί να φθάσει τα 200-300μg/Kg για ζωοτροφές που προορίζονται για μεγάλα ζώα (αγελάδες, χοίρους) [7]. Οι αφλατοξίνες προκαλούν σημαντική ετήσια ζημιά στη γεωργική παραγωγή ορισμένων προϊόντων. Σύμφωνα με τον FAO (Food Agricultural Organization), το 25% των φυτικών γεωργικών προϊόντων σε παγκόσμια κλίμακα παρουσιάζουν μολύνσεις από μυκοτοξίνες. Στις ΗΠΑ, οι μολύνσεις των γεωργικών προϊόντων με αφλατοξίνες κοστίζουν ετησίως στους παραγωγούς περίπου 100 εκ. δολάρια, ενώ μόνο από τις αφλατοξίνες στα αράπικα φιστίκια, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρύτατα στις ΗΠΑ για την παρασκευή φιστικοβούτυρου, το ετήσιο κόστος αγγίζει τα 26 εκ. δολάρια. Όσον αφορά στην Ελλάδα, υπάρχει σοβαρό πρόβλημα αφλατοξινών στα γεωργικά προϊόντα. Έλληνες επιστήμονες εξετάζουν εδώ και δεκαετίες τις σωστές πρακτικές για την αποφυγή της μόλυνσης των σιτηρών, των ξηρών καρπών κλπ., από μύκητες, όπως και τις συγκεντρώσεις των αφλατοξινών στο γάλα και σε άλλα τρόφιμα. Συστηματικά ελέγχονται οι εισαγωγές σιτηρών και ξηρών καρπών (φιστίκια) από χώρες της Ασίας και Αφρικής, όπου η εμφάνιση των αφλατοξινών είναι συχνή λόγω της υγρασίας στους καρπούς και των υψηλών θερμοκρασιών. Η επικινδυνότητα των αφλατοξινών αυξάνεται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις ατόμων που πάσχουν από ηπατικές νόσους. Επιστημονικές έρευνες έχουν δείξει ότι κατά τη 26

μόλυνση με τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV), η έκθεση σε αφλατοξίνες αυξάνει τον κίνδυνο για ηπατοκυτταρικό καρκίνο (hepatocellular carcinoma, HCC). Ο ιός HBV καθιστά δύσκολο το μεταβολισμό των αφλατοξινών από τα ηπατοκύτταρα κι έτσι η ένωση προσθήκης αφλατοξίνης Μ1-DNA παραμένει για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στο ήπαρ, αυξάνοντας την πιθανότητα βλάβης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53. Θεωρείται ότι ο εμβολισμός κατά της ηπατίτιδας Β των κατοίκων περιοχών της Ασίας και της Αφρικής όπου ενδημεί ο ιός HBV, θα μειώσει σημαντικά τις ηπατικές βλάβες σε πληθυσμούς που συχνά τρέφονται με μουχλιασμένα τρόφιμα [12]. Η κιτρινίνη έχει συσχετιστεί τόσο με την ασθένεια του «κίτρινου ρυζιού» στην Ιαπωνία, όσο και με τη χρόνια νεφροπάθεια των χοίρων [18]. Δρα ως νευροτοξίνη σε όλα τα ζώα, μολονότι η οξεία τοξικότητά της διαφοροποιείται από είδος σε είδος [19]. Αξίζει να αναφερθεί ότι η LD50 της (50% Lethal Dose) για τις πάπιες είναι 57 mg/kg, για τα κοτόπουλα 95 mg/kg, ενώ για τα κουνέλια 134 mg/kg [20]. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η κιτρινίνη δρα συνεργιστικά με την ωχρατοξίνη Α, με τελικό αποτέλεσμα την καταστολή της σύνθεσης του RNA στους νεφρούς ποντικών [21, 22]. Όσον αφορά στα ζώα, οι φουμονισίνες προσβάλλουν τα ζώα με διαφορετικούς τρόπους, κυρίως μέσω του μεταβολισμού των σφιγκολιποειδών [42, 43, 44, 45]. Πιο συγκεκριμένα, προκαλούν λευκοεγκεφαλομαλακία στους ίππους και στα κουνέλια [46, 47], πνευμονικό οίδημα και υδροθώρακα στους χοίρους [48], καθώς και ηπατοκαρκίνωμα στα ποντίκια [49]. Στους ανθρώπους, η φουμονισίνη Β1 έχει συσχετιστεί με τον καρκίνο του οισοφάγου [50, 51]. Χαρακτηριστικό παράδειγμα οξεία έκθεσης στη φουμονισίνη Β1 παρατηρήθηκε σε κατοίκους 27 χωριών της Ινδίας, όπου η κατανάλωση άζυμου ψωμιού από καλαμπόκι προκάλεσε έντονους πόνους, και διάρροια [52]. Τέλος, αξίζει να σημειωθεί ότι ο Παγκόσμιος Οργανισμός Έρευνας του Καρκίνου (International Agency for Research on Cancer) κατέταξε τις φουμονισίνες στην ομάδα 2Β, τις πιθανές καρκινογόνες ουσίες [53]. Ωχρατοξίνη Α έχει ανιχνευθεί στο αίμα, στον ορό και στο γάλα ζώων και ανθρώπων [75], ενώ συχνά υπάρχει στο χοιρινό κρέας που πρόκειται να καταναλωθεί [76]. Θεωρείται υπεύθυνη για την νεφροπάθεια των χοίρων, ασθένεια η οποία κυρίως ενδημεί στη Δανία και στις Σκανδιναβικές χώρες [77]. Επιπρόσθετα, έχει συσχετιστεί τόσο με το θάνατο των πουλερικών, όσο και στην ανθρώπινη νεφροπάθεια [78, 79]. Με βάση την έκθεση ενός ατόμου στην ωχρατοξίνη και την πληθώρα των τοξικολογικών δεδομένων σε πειραματόζωα, η Ευρωπαϊκή Ένωση των Επιστημονικών Επιτροπών καθόρισε ως 27

ανώτατο όριο της ωχρατοξίνης Α για τον ανθρώπινο οργανισμό τα 5 ng/kg/d [80]. Πολλές επίσης χώρες έχουν καθιερώσει δικά τους όρια, τα οποία διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους [81, 82]. Τέλος, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Έρευνας του Καρκίνου κατέταξε τις ωχρατοξίνες στις πιθανά καρκινογόνες ουσίες (κατηγορία 2Β) [83]. 1.8. Τα Κυριότερα Δημοσιοποιημένα Συμβάντα Επιμόλυνσης με Μυκοτοξίνες. Όπως και τα προηγούμενα χρόνια, το 2008 οι μυκοτοξίνες αποτελούν την πιο επικίνδυνη κατηγορία συναγερμού με το μεγαλύτερο αριθμό περιστατικών. Ο οργανισμός RASFF έλαβε το 2008 ένα συνολικό αριθμό 931 κοινοποιήσεων για μυκοτοξίνες, από τις οποίες οι 902 ήταν αφλατοξίνες. Αυτό σημαίνει ότι η μειωμένη τάση των προηγούμενων χρόνων αντιστρέφεται με μία αύξηση της τάξης 28% για τις αφλατοξίνες και 23% για τις μυκοτοξίνες. Αναλογικά, έγιναν περισσότερες κοινοποιήσεις για τις αφλατοξίνες εξαιτίας της σημαντικής αύξησης φυστικιών, προϊόντων φυστικιών και σπόρων. Το διάγραμμα που ακολουθεί απεικονίζει αυτήν την αύξηση στα προϊόντα φρούτα και λαχανικά και προϊόντα δημητριακών. Το 2008 παρατηρήθηκε αύξηση των κοινοποιήσεων κατά 46 στα επίπεδα των αφλατοξινών στα δημητριακά και στα προϊόντα δημητριακών. Αυτές οι κοινοποιήσεις σχετίζονται με το ρύζι (28 κοινοποιήσεις), κυρίως από το Πακιστάν (19 κοινοποιήσεις) και λιγότερο από την Ινδία (4 κοινοποιήσεις) και με το καλαμπόκι (18 κοινοποιήσεις) κυρίως από την Ινδία και από την Κολομβία (5 κοινοποιήσεις). 28

1.8.1 Περιστατικά και η σημασία των μυκοτοξινών στα τρόφιμα στις αναπτυσσόμενες χώρες Οι σοδιές σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές είναι πιο ευαίσθητες σε μολύνσεις από μυκοτοξίνες σε σχέση με αυτές των εύκρατων περιοχών εξαιτίας της υψηλής υγρασίας και θερμοκρασίας που αποτελούν βέλτιστες συνθήκες για το σχηματισμό των τοξινών (Thomson and Henke, 2000). Ο οργανισμός τροφίμων και γεωργίας των Ενωμένων Εθνών (The Food and Agricultural Organization) εκτιμά ότι περισσότερο από το 25% των σοδιών είναι επιμολυσμένες με μυκοτοξίνες (WHO, 1999). Παρόλα αυτά, η παρουσία μυκοτοξινών (κυρίως αφλατοξίνες και φουμονισίνες) στα τρόφιμα παραβλέπεται πολύ συχνά στην Αφρική λόγω της δημόσιας άγνοιας για την ύπαρξή τους, της έλλειψης μηχανισμών ελέγχου, της απόρριψης προϊόντων τροφίμων σε σκουπιδότοπους και της εισαγωγής των μολυσμένων τροφίμων στην τροφική αλυσίδα του ανθρώπου κατά τη διάρκεια χρόνιας έλλειψης τροφής εξαιτίας της ανυδρίας, των πολέμων και της πολιτικής και οικονομικής αστάθειας (MERCK, 2006). WHO 2006, Lewis, 2005 Οι αφλατοξίνες απαντώνται κυρίως στο καλαμπόκι και στα φυστίκια και οι φουμονισίνες σε διάφορες ποικιλίες ρυζιού στην Αφρική (Bankole et al., 2006). Μερικές έρευνες επίσης αναφέρουν την παρουσία της ωχρατοξίνης Α, τριχοθηκενίων και ζεαραλενόνης (Bankole et al., 2006). Η δηλητηρίαση από αφλατοξίνες σχετίζεται με τη βρώση ρυζιού που έχει αποθηκευτεί σε υγρασία (Lewis et al., 2005). Το 2004 στην Κένυα καταγράφηκε η πιο σοβαρή επιδημία δηλητηρίασης από αφλατοξίνες με 317 περιπτώσεις ασθενών και 125 θανάτους. Η 29

συγκομιδή του ρυζιού που εμπλέκεται στην συγκεκριμένη αφλατοξίκωση έγινε το Φεβρουάριο (ακατάλληλη εποχή, μεγάλο ποσοστό υγρασίας). Τα επίπεδα των αφλατοξινών στο καλαμπόκι που αναλύθηκε από τις τοπικές φάρμες της περιοχής ήταν αρκετά υψηλότερο από το επιτρεπτό ανώτατο όριο (20ppb) σε σύγκριση με το καλαμπόκι άλλων περιοχών της ηπείρου. 1.9. Νομοθεσία Μηχανισμοί ρύθμισης των μυκοτοξινών έχουν καθιερωθεί σε περίπου 100 χώρες μεταξύ των οποίων οι 15 είναι αφρικανικές, με σκοπό την προστασία του καταναλωτή από τις επιβλαβείς επίδράσεις αυτών των μυκοτοξινών (Fellinger, 2006; Barug et al., 2003; Van Egmond, 2002). Τα επιτρεπτά όρια αφλατοξινών κυμαίνονται μεταξύ 4-30 ppb αφλατοξίνης, ανάλογα με τις ρυθμίσεις της εκάστοτε χώρας (FDA, 2004; Henry et al., 1999). Στην Αμερική, το ανώτατο επιτρεπτό όριο αφλατοξινών στα τρόφιμα είναι 20 μg/kg, ενώ στην Ευρώπη μόλις 4 μg/kgω(ec, 2006; Wu, 2006). 1.10. Το Μέγεθος του Προβλήματος του σε Διάφορες Χώρες Διεθνώς. Οι μυκοτοξίνες παράγονται από τους μύκητες κατά την παραγωγή, συγκομιδή, αποθήκευση και επεξεργασία των τροφίμων. Καθώς η σοδειά μολύνεται, η ανάπτυξη των μυκήτων συνεχίζεται με αυξανόμενη ζωτικότητα μετά τη συγκομιδή και κυρίως στις συνθήκες αποθήκευσης. Οι γενότυποι, η λειψυδρία, οι τύποι του εδάφους και η ενεργότητα των εντόμων αποτελούν καθοριστικούς παράγοντες της μόλυνσης (Cole et al., 1995). Η υγρασία, η θερμοκρασία και ο αερισμός κατά το στέγνωμα και την αποθήκευση αποτελούν επίσης σημαντικούς παράγοντες. Τα κονίδια του Aspergillus flavus αποτελούν τη μεγαλύτερη πηγή πρωτογενούς εμβολιασμού στις καλλιέργειες ρυζιού (Scheidegger and Payne, 2003). Ο μύκητας σχηματίζει πολλά σκληρώτια στους κατεστραμμένους από τα έντομα κόκκους ρυζιού πριν τη συγκομιδή. Αυτά διασπείρονται στο έδαφος κατά τη συγκομιδή και παράγουν κονιδιοφόρα και κονίδια και εισέρχονται στους πυρήνες. Στη συνέχεια τα μυκήλια διασπείρονται επιφανειακά μεταξύ των κόκκων και διεισδύουν σε αυτούς μέσω του περικαρπίου. Η βλάβη του ρυζιού από έντομα αποτελεί επομένως την προδιάθεση για μόλυνση από μυκοτοξίνες και λειτουργεί σαν δείκτης προειδοποίησης. Τα έντομα μεταφέρουν τους σπόρους από τις επιφάνειες των φυτών στο εσωτερικό των πυρήνων ή των μίσχων ή δημιουργούν ασυνέχειες λόγω 30

της θρέψης των προνυμφών από τους μίσχους ή τους πυρήνες (Munkvold and Hellminch, 2000). Οι κατεστραμμένοι πλέον πυρήνες δίνουν την ευκαιρία στους μύκητες να διαπεράσουν το προστατευτικό κάλυμμα του υμένα και να εγκαταστήσουν τη μόλυνση στο εσωτερικό του καρπού (St. Leger et al., 2000). Επιπρόσθετα, φαίνεται ότι υπάρχει μία συσχέτιση μεταξύ της κοινωνικοοικονομικής κατάστασης των περισσότερων χωρών της Αφρικής και της έκθεσης στις μυκοτοξίνες. Ένα σημείο που πρέπει να σημειωθεί, είναι ότι το καλαμπόκι κανονικά αποθηκεύεται σε σιταποθήκες, αλλά η αποθήκευση ακατάλληλα ξηραμένου ρυζιού στα σπίτια παρατηρείται σε περιόδους έλλειψης τροφής,η οποία διευκολύνει την επιμόλυνση των τροφίμων με μυκοτοξίνες (Azziz- Baumgartener et al., 2005). Ο ανεπαρκής αερισμός των σπιτιών και τα ακάθαρτα δάπεδα προωθούν την μυκητισιακή ανάπτυξη σε υγρούς καρπούς ρυζιού. Οι συνθήκες λειψυδρίας στρεσσάρουν τα φυτά και τα καθιστούν ευάλωτα σε μολύνσεις από τον μύκητα Aspergillus spp (Robertson, 2005; Holbrook et al., 2004). Άλλοι παράγοντες που ευνοούν την επιμόλυνση με μυκοτοξίνες είναι οι στρεσσογόνοι παράγοντες κατά την ανάπτυξη των φυτών, η αργοπορημένη συγκομιδή των σοδειών, η υψηλή υγρασία, οι μη επιστημονικές τεχνικές αποθήκευσης και η έλλειψη ενημέρωσης. Επιδημιολογικές μελέτες ανθρώπινων πληθυσμών που εκτίθενται σε τροφές που είναι μολυσμένες φυσικά από τις αφλατοξίνες αποκαλύπτουν μία συσχέτιση μεταξύ μεγάλης επίπτωσης καρκίνου του ήπατος στην Αφρική και σε άλλες χώρες εκτός της συγκεκριμένης ηπείρου και της διατροφικής πρόσληψης αφλατοξινών (MERCK, 2006). Σε ασθενείς που πάσχουν από ηπατίτιδα Β και C, συχνό φαινόμενο στις συγκεκριμένες χώρες, η κατανάλωση αφλατοξινών αυξάνει τον κίνδυνο καρκίνου του ήπατος 10 φορές περισσότερο σε σύγκριση με την απλή έκθεση σε αφλατοξίνες υγιών ατόμων (Turner et al., 2003). Επιπρόσθετα, πρόσφατες έρευνες αναφέρουν αλληλεπίδραση μεταξύ χρόνιας έκθεσης σε μυκοτοξίνες και κακής διατροφής, ανοσοκαταστολής και ασθενειών όπως η ελονοσία και το AIDS (Gong et al., 2003, 2004). Μία πρόσφατη έρευνα στη Γκάνα έδειξε ότι υψηλά επίπεδα της αφλατοξίνης 31

Β1 στο πλάσμα του αίματος σχετίζονται με χαμηλά ποσοστά λευκοκυττάρων (Jiang et al., 2005). Οι μυκοτοξίνες αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες των μυκήτων (για παράδειγμα, μεταβολίτες οι οποίοι δεν είναι απαραίτητοι για τη φυσιολογική ανάπτυξη και αναπαραγωγή των μυκήτων) οι οποίοι προκαλούν παθολογικές αλλαγές στα ζωικά είδη (1). Αποτελούν συνθετικές ενώσεις χαμηλού μοριακού βάρους με ποικίλες χημικές δομές και βιολογικές ιδιότητες (εικόνα 1). Ένας μεγάλος αριθμός δευτερογενών μεταβολιτών των μυκήτων έχουν προσδιοριστεί ως μυκοτοξίνες, οι οποίες μολύνουν τα γεωργικά αγαθά παγκοσμίως. Τα πιο σημαντικά είδη μυκήτων που παράγουν μυκοτοξίνες με αντίκτυπο την ανθρώπινη υγεία είναι τα Fusarium, Pencillium και Aspergillus (2). Η εισβολή των μυκήτων και η παραγωγή τοξινών στα αγροστώδη μπορεί να συμβούν πριν και κατά τη διάρκεια της συγκομιδής, κατά την επεξεργασία, τη μεταφορά και την αποθήκευση. Η θερμοκρασία και η υγρασία επηρεάζουν άμεσα το ρυθμό ανάπτυξης τόσο των μυκήτων όσο και των τύπων και των συγκεντρώσεων των παραγόμενων τοξινών (1). Υπολογίζεται ότι ο αντίκτυπος των μυκοτοξινών στις βιομηχανίες διατροφής και ζώων φάρμας προκαλεί απώλεια 5 δισεκατομυρίων δολλαρίων στις ΗΠΑ και στον Καναδά (3). Επειδή οι σπόροι δημητριακών χρησιμοποιούνται συχνά ως συστατικά των εμπορικών ζωωτροφών, οικόσιτα ζώα όπως σκύλοι, γάτες, κουνέλια και πουλιά εκτίθενται συχνά στις επιδράσεις των μυκοτοξινών. Παραπροϊόντα των δημητριακών μετατρέπονται συχνά σε ζωωτροφές ακόμη και αν περιέχουν υψηλά επίπεδα των μυκοτοξινών σε σύγκριση με ακατέργαστα δημητριακά (4,5). 1.10.1 Δημόσιοι Κανόνες Ρύθμισης για τις Μυκοτοξίνες στις Ζωοτροφές. Η ρύθμιση της σύστασης των ζωοτροφών σε μυκοτοξίνες παγκοσμίως εστιάζει κυρίως σε ζώα φάρμας και λιγότερο στα ζώα συντροφιάς (σκύλοι και γάτες). Στις περισσότερες χώρες, η ζωοτροφή ρυθμίζεται από ένα μέγιστο όριο παρουσίας μυκοτοξινών. Για τις ΗΠΑ και τον Καναδά για παράδειγμα, υπάρχει ένα μέγιστο όριο 20μg/kg για τις αφλατοξίνες Β1, Β2, G1 και G2 όλων των ζωοτροφών (80) (πίνακας 4). Η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θέσει ένα επιτρεπτό όριο 20μg/kg για την 32

αφλατοξίνη Β1 και συγκεκριμένες οδηγίες για τη δεοξυνιβαλενόλη και τη φουμονισίνη (83). Οι ρυθμίσεις των μυκοτοξινών διαφέρουν μεταξύ των χωρών 1.10.2 Ουσίες Απομάκρυνσης και Εξουδετέρωσης των Μυκοτοξινών. Από τότε που αναφέρθηκαν οι μυκοτοξικώσεις (αρχές της δεκαετίας του 60) οι ερευνητές σε όλο τον κόσμο έψαχναν επισταμένα τρόπους να περιορίσουν ή να ελαχιστοποιήσουν τις επιδράσεις αυτών των αναπόφευκτων μολύνσεων. Λόγω της μεγάλης ποικιλότητας των μυκοτοξινών και των διαφόρων χημικών παράγωγών τους, οι οποίες είναι ικανές να μολύνουν τις ζωοτροφές, η προστασία από τις μυκοτοξικώσεις αποδείχθηκε σχετικά δύσκολο εγχείρημα. Μεταξύ όλων των διαθέσιμων προσεγγίσεων για να ελεγχθεί η επιμόλυνση με μυκοτοξίνες, η απλούστερη στρατηγική βασίζεται στην πρόληψη της δημιουργίας της μυκοτοξίνης στις τροφές. Ακόμα και με τις σημερινές σύγχρονες τεχνολογίες είναι πολύ δύσκολη η πρόβλεψη ή αποτροπή της ύπαρξης τους, είτε προ της συγκομιδής είτε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης και της επεξεργασίας των ζωοτροφών. Όταν οι πρώτες ύλες έχουν προσβληθεί από μυκοτοξίνες, η εξάλειψη του προσβληθέντος προϊόντος είναι η πιο αποτελεσματική μέθοδος για να αποφευχθούν τα προβλήματα που θα ακολουθήσουν από την κατανάλωσή του. Δυστυχώς, λόγω της δυσκολίας που υπάρχει στη λήψη αντιπροσωπευτικού δείγματος, είναι αρκετά αμφίβολος ο ακριβής προσδιορισμός του μεγέθους της προσβολής για κάθε τροφή. Η μη πρακτικότητα και το κόστος που συνοδεύει την αντικατάσταση αυτών των υλικών συνεπάγεται ότι αυτή η πρακτική δεν εφαρμόζεται τόσο συχνά όσο συστήνεται. Έτσι, οι μυκοτοξίνες συνήθως υπάρχουν στις ζωοτροφές και επιφέρουν σημαντικές οικονομικές απώλειες στις γεωργοκτηνοτροφικές εκμεταλλεύσεις. Εκτός αυτού, οι μυκοτοξίνες προκαλούν ανησυχία για τη δημόσια υγεία, επειδή τα ζώα που καταναλώνουν μολυσμένες με μυκοτοξίνες τροφές αφήνουν κατάλοιπα αυτών των τοξινών στα παραγόμενα ζωικά προϊόντα. Η απομάκρυνση ή εξουδετέρωση των μυκοτοξινών από μία προσβεβλημένη ζωοτροφή επιτυγχάνεται με φυσικές, χημικές και βιολογικές μεθόδους. Οι χημικές διαδικασίες, όπως η επεξεργασία με οξέα, η αμμωνιοποίηση, η οζονοποίηση και η αντίδραση με τροφικά πρόσθετα όπως το δισουλφιδικό νάτριο έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικά στην αποδόμηση και στην τελική εξουδετέρωση της αφλατοξίνης. Οι βιολογικές μέθοδοι που πρωταρχικά συμπεριελάμβαναν την αποδόμηση της τοξίνης από μικροοργανισμούς, καταλαμβάνουν όλο και περισσότερο χώρο, αφού δείχνουν τα 33

θετικότερα αποτελέσματα. Οι φυσικές διαδικασίες, όπως η ταξινόμηση, η θερμική απενεργοποίηση, η ακτινοβολία ή η εξαγωγή του προσβληθέντος προϊόντος έχουν σημειώσει επίσης αρκετή επιτυχία. Η κάθε μέθοδος απομάκρυνσης ή αποτοξίνωσης για υλικά ζωοτροφών που έχουν προσβληθεί από μυκοτοξίνες πρέπει να πληρεί τους παρακάτω όρους: 1. Να είναι αποτελεσματική στην απομάκρυνση, καταστροφή και εξουδετέρωση της μυκοτοξίνης. 2. Να μην παράγει τοξικά ή καρκινογόνα/μεταλλαξιογόνα κατάλοιπα, ούτε στα επεξεργασμένα ούτε στα ζωικά προϊόντα που προέρχονται από ζώα που καταναλώνουν αυτές τις ζωοτροφές. 3. Να μη μεταβάλλουν τις θρεπτικές ιδιότητες των ζωοτροφών ή να επηρεάζουν τη λήψη τους. 4. Να είναι οικονομικά και τεχνολογικά αποδεκτές, έτσι ώστε να μην επηρεάζουν σημαντικά το κόστος του τελικού προϊόντος. Πολλές από τις φυσικές, χημικές και βιολογικές μεθόδους είναι αποτελεσματικές στη μείωση, καταστροφή ή εξουδετέρωση των μυκοτοξινών, όμως σπάνια ανταποκρίνονται σε άλλες εξίσου σημαντικές απαιτήσεις. Οι κυριότερες διατροφικές προσεγγίσεις, όπως η συμπλήρωση των θρεπτικών συστατικών ή πρόσθετων με προστατευτικές ιδιότητες κατά των μυκοτοξινών και η προσθήκη μη θρεπτικών ουσιών με ιδιότητες μείωσης της βιοδιαθεσιμότητας των μυκοτοξινών, μπορούν να καθαρίσουν ή να αποτοξινώσουν τα προσβληθέντα υλικά και συγχρόνως να πληρούν και τους ανωτέρω όρους. Η χρήση διατροφικών μη θρεπτικών συμπληρωμάτων με ιδιότητες απομάκρυνσης των μυκοτοξινών είναι η πιο πρακτικά εφαρμόσιμη μέθοδος. Αποτελεσματική είναι μία ουσία που αποτρέπει ή ελαχιστοποιεί την απορρόφηση της τοξίνης από τον γαστρεντερικό σωλήνα του ζώου. Η ιδανική ουσία πρέπει να είναι αποτελεσματική σε διάφορες μυκοτοξίνες, μιας και τα υλικά συνήθως προσβάλλονται με περισσότερες της μίας μυκοτοξίνης. Επιπρόσθετα, πρέπει να είναι απαλλαγμένες από ακαθαρσίες, τυχόν γεύσεις και οσμές. Τέλος, για να είναι πρακτικά εφαρμόσιμες και χρηστικές οι ουσίες αυτές πρέπει να έχουν λογικές τιμές και να μην καταλαμβάνουν μεγάλο μέρος στα ολοκληρωμένα σιτηρέσια. Η χρήση των μη θρεπτικών ουσιών απομάκρυνσης πρέπει να μειώνει την τοξική δράση της μυκοτοξίνης και τη δυνατότητα μεταφοράς 34

της τοξίνης στην ανθρώπινη τροφική αλυσίδα. Οι κύριες κατηγορίες ουσιών είναι τα πυριτικά ορυκτά, ο ενεργοποιημένος άνθρακας, οι πολυμερείς ενώσεις, τα προϊόντα χλωροφύλλης και προϊόντα που προέρχονται από τη ζύμη. Ενεργοποιημένος Άνθρακας. Είναι μια άμορφη μάζα κάρβουνου που θερμαίνεται απουσία αέρα και στη συνέχεια επεξεργάζεται με οξυγόνο, με σκοπό να δημιουργηθούν εκατομμύρια πόροι μεταξύ των ατόμων του άνθρακα. Η πηγή του άνθρακα επιλέγηκε από μία ποικιλία υλικών, όπως τα κελύφη των καρυδιών, το μαλλί, τα βρύα. Αυτή η προσροφητική σκόνη χρησιμοποιείται ευρέως σε περιπτώσεις οξέων δηλητηριάσεων από τον 19 ο αιώνα μέχρι σήμερα, ενώ είναι πολύ αποτελεσματική στην εξουδετέρωση της αφλατοξίνης και άλλων μυκοτοξινών. Οι ιδιότητές του εξαρτώνται από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων του μεγέθους των πόρων, της επιφάνειας, της δομής της μυκοτοξίνης και της δόσης χορήγησης. Ορυκτά πυριτίου. Η μεγαλύτερη και πολυπλοκότερη ομάδα εξουδετερωτικών ουσιών των μυκοτοξινών είναι τα ορυκτά πυριτίου, η οποία διαχωρίζεται σε δύο σημαντικές υποομάδες, τη φυλλοπυριτική και την τεκτοπυριτική. Στους αργίλους που ανήκουν στη φυλλοπυριτική ομάδα συμπεριλαμβάνεται κυρίως ο μπεντονίτης, ενώ στις τεκτοπυριτικές ουσίες ανήκει ο σημαντικός και ευρέως χρησιμοποιημένος ζεολίτης. Χολεστυραμίνη. Μία ένωση που χρησιμοποιείται σήμερα στην ιατρική για την απορρόφηση των οξέων της χολής από τον γαστρεντερικό σωλήνα, αλλά και ως φάρμακο για τη θεραπεία της υπερλιπιδαιμίας. Η χολεστυραμίνη είναι ικανή να απομονώσει την ωχρατοξίνη και τη ζεαραλενόνη. Παράγωγα χλωροφύλλης (χλωροφυλλίνη). Η χλωροφυλλίνη, το υδατοδιαλυτό παράγωγο της χλωροφύλλης των φυτών, είναι αποτελεσματική στη μείωση της τοξικότητας που προέρχεται από τις αφλατοξίνες. Οι ερευνητές απέδιδαν τις χημειοπροστατευτικές ιδιότητες αυτού του παράγωγου της χλωροφύλλης στην αντιοξειδωτική του δράση. Πρόσφατες μελέτες όμως αποκάλυψαν ότι το ενδιάμεσο προϊόν μεταξύ της 35

χλωροφυλλίνης και της αφλατοξίνης είναι πραγματικά η κύρια ένωση που ευθύνεται για τη χημειοπροστασία. Παράγωγα προερχόμενα από τη ζύμη. Αρχικά, μελέτες με ζυμοκύτταρα οδήγησαν στον προσδιορισμό ειδικού μέρους του κυτταρικού τοιχώματος της ζύμης, το οποίο αντιδρά με τις μυκοτοξίνες. Η βελτίωση των τεχνικών επέτρεψε την παραγωγή τροποποιημένων ειδικά κυτταρικών τοιχωμάτων της ζύμης, τα οποία έχουν την ιδιότητα να απορροφούν διάφορες μυκοτοξίνες. Το προϊόν αυτό είναι εμπορικά διαθέσιμο ως Mycosorb (Alltech Inc). Η απορροφητική δυνατότητα του συμπλέγματος των υδατανθράκων των κυτταρικών τοιχωμάτων της ζύμης προσφέρει μία ενδιαφέρουσα εναλλακτική λύση στους ανόργανους απορροφητές. Ο μπεντονίτης και ο ενεργοποιημένος άνθρακας γενικά, χρησιμοποιούνται σε μεγάλες ποσότητες (>1,0% του σιτηρεσίου) στις ζωοτροφές. Όμως σε ζώα όπως τα κοτόπουλα και τα νεαρά χοιρίδια, όπου η πρόσληψη της τροφής μπορεί να περιορίσει την οικονομική αποδοτικότητά τους, είναι σημαντικό τα μη θρεπτικά πρόσθετα των τροφών να καταλαμβάνουν το μικρότερο δυνατό χώρο. Εκτός αυτού, υψηλά επίπεδα συμμετοχής μπορεί να αυξήσουν την εξουδετερωτική δράση της ουσίας και έτσι να μειώσουν τη βιοδιαθεσιμότητα άλλων σημαντικών θρεπτικών ουσιών. Αντίθετα, η υψηλή σχέση μεταξύ τοξίνης και απορροφητικότητας των παραγώγων του κυτταρικού τοιχώματος της ζύμης, επιτρέπει τη χρήση τους στη μικρότερη δυνατή ποσότητα (<0,1% του σιτηρεσίου) [14]. 1.11. Στρατηγικές Πρόληψης. Οι μυκοτοξίνες είναι σε γενικές γραμμές χημικά και θερμικά σταθερές σύνθετες ενώσεις. Οι περισσότερες τεχνικές πρόληψης εστιάζουν στην απομάκρυνση της μόλυνσης νωρίς κατά την επεξεργασία ή στην παρεμπόδιση των μυκοτοξικώσεων in vivo χωρίς όμως την εγγύηση της θρεπτικής ποιότητας. 1.11.1Τεχνικές επεξεργασίας Υπάρχουν τρεις κύριες τεχνικές επεξεργασίας για τη μείωση της σύστασης σε μυκοτοξίνες στα δημητριακά: κοσκίνισμα, πλύσιμο και γυάλισμα. Σπασμένοι, κατεστραμμένοι και ανώμαλα ανεπτυγμένοι καρποί αποτελούν ιδανικά 36

υποστρώματα ανάπτυξης μυκήτων. Οι περισσότερες μυκοτοξίνες ανιχνεύονται σε υψηλές συγκεντρώσεις σε αυτά τα κλάσματα όπως επίσης και στην σκόνη και στα θραύσματα που δημιουργούνται κατά το χειρισμό των σπόρων. Ο διαχωρισμός αυτών των πιο μολυσμένων κλασμάτων από τους καρπούς μπορεί να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα των σπόρων δημητριακών σε μυκοτοξίνες. Οι Trenholm et al. (124) ερεύνησαν την αποτελεσματικότητατου κοσκινίσματος στο καλαμπόκι, στο σιτάρι και στο κριθάρι επιμολυσμένα με 5-23mg δεοξυνιβαλενολης ανά κιλό και 0,5-1,21mg ζεαραλενόνης ανά κιλό. Μετά από τη διαδικασία του κοσκινίσματος περιείχαν 67-83% λιγότερες μυκοτοξίνες με παράλληλη απώλεια 34-69% τμήματος του καρπού. Οι μέθοδοι πλύσεων πλεονεκτούν λόγω του γεγονότος ότι άρχικά οι μυκοτοξίνες συναντώνται στην εξωτερική επιφάνεια των σπόρων. Οι Treholm et al. (125) ήταν οι πρώτοι ερευνητές που αναφέρουν μία μέθοδο πλύσεων για την απολύμανση σπόρων που περιέχουν δεοξυνιβαλενόλη και ζεαραλενόνη. Μετά από την πρώτη πλύση με διάλυμα ανθρακικού νατρίου και δύο επόμενες πλύσεις με απεσταγμένο νερό, το κριθάρι και το καλαμπόκι εμφάνισαν 72-74% και 80-87% μείωση στην περιεκτικότητα με δεοξυνιβαλενόλη και ζεαραλενόνη αντίστοιχα. Ένα μεγάλο μειονέκτημα αυτών των μεθόδων είναι ότι οι νωποί σπόροι δημητριακών χρειάζονται ξήρανση στη συνέχεια, προκαλώντας έτσι ένα επιπλέον κόστος για τους κατασκευαστές. Οι House et al. (127) ανέπτυξαν μία λειαντική μέθοδο γυαλίσματος κατά την οποία παρατηρήθηκε 66% απομάκρυνση της δεοξυνιβαλενόλης με παράλληλη απώλεια κριθαριού κατά 15% χωρίς ύγρανση των σπόρων. Επίσης, η χρησιμοποίηση όζοντος αποτελεί αποτοξινωτική μέθοδο για τους σπόρους που επιμολύνονται με μυκοτοξίνες (129,130). Ασθενή οργανικά οξέα όπως το βενζοϊκό, το οξικό, και το προπιονικό οξύ αναστέλλουν την ανάπτυξη των μυκήτων οξινίζοντας το κυτταρόπλασμα των κυττάρων των μυκήτων (132). 1.11. 2 Συμπληρώματα θρεπτικών ουσιών Ένας μεγάλος αριθμός συμπληρωμάτων θρεπτικών ουσιών έχουν προταθεί ως θεραπευτικά μέσα μειώνοντας τις βλάβες που υφίστανται οι ιστοί από τις μυκοτοξίνες. Αυτά τα θρεπτικά συστατικά περιλαμβάνουν ουδέτερα αμινοξέα, αντιοξειδωτικά και πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Τα συμπληρωματικά αμινοξέα αρχικά μειώνουν το βαθμό επίδρασης των μυκοτοξινώ στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Το φιυσαρικό οξύ, η Τ-2 τοξίνη και η δεοξυνιβαλενόλη αυξάνουν τις συγκεντρώσεις της τρυπτοφάνης στο αίμα και στον εγκέφαλο καθώς και της 37

σεροτονίνης οδηγώντας σε αδυναμία κατάποσης και εμέτους (133, 134). Είναι πιθανό τα συμπληρωματικά αμινοξέα (λευκίνη, ισολευκίνη, βαλίνη, τυροσίνη και φαινυλαλανίνη) να ανταγωνίζονται με την τρυπτοφάνη για τους ενεργούς μεταφορείς μταξύ εγκεφάλου και αίματος αναστέλλοντας την πρόσληψη τρυπτοφάνης από τον εγκέφαλο που επάγεται από τις μυκοτοξίνες και συνεπώς την υπερτοξικότητα (135). Επειδή οι αφλατοξίνες Β1, η δεοξυνιβαλενόλη, η Τ-2 τοξίνη και η ωχρατοξίνη Α καταστρέφουν τις κυτταρικές μεμβράνες με υπεροξείδωση των λιπιδίων μελετήθηκαν διάφορες αντιοξειδωτικές ουσίες και βρέθηκε ότι το σελήνιο και οι βιταμίνες Α, C και Ε μειώνουν τις τοξικές επιπτώσεις των μυκοτοξινών in vivo και in vitro (137, 141). Tα αντιοξειδωτικά δρουν σαν αναγωγείς των ανιόντων υπεροξειδίου και με αυτόν τον τρόπο προστατεύουν τις κυτταρικές μεμβράνες και το DNA απο βλάβες που επάγονται από τις μυκοτοξίνες (136). Τα ω3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα αναφέρεται ότι μειώνουν την νεφροπάθεια που επάγεται από τα IgA. Οι Shi and Pestka (146) αναφέρουν ότι το συμπλήρωμα διατροφής με εικοσαπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) καταστέλλει την ανάπτυξη της ασθένειας σε ποντίκια που τους είχan χορηγηθεί 20mg δεοξυνιβαλενόλης ανά κιλό τροφής. Πιστεύεται ότι το εικοσαπεντανοϊκό οξύ μειώνει την παραγωγή της ιντερλευκίνης 6 που επάγεται από την δεοξυνιβαλενόλη και έτσι ελαττώνει τη φλεγμονώδη βλάβη των νεφρών (149). 1.11.3 Παράγοντες διαχωρισμού των μυκοτοξινών Οι παράγοντες διαχωρισμού των μυκοτοξινών όπως ο ενεργοποιημένος ξυλάνθρακας, τα ανόργανα άλατα του πυριτίου και η χολεστιραμίνη παρεμποδίζουν την εντερική απορρόφηση των μυκοτοξινών στα ζώα (150). Οι περισσότεροι από αυτούς τους παράγοντες είτε προσροφούν συγκεκριμένες μυκοτοξίνες, είτε απαιτείται υψηλή συγκέντρωση στις ζωοτροφές, προκαλούν άλλες επιπλοκές στην υγεία και συνήθως έχουν πολύ υψηλό κόστος για τη βιομηχανική εφαρμογή. Φυσιολογικά, απαντώνται ως πολυμερή γλυκομαννανών στο κυτταρικό τοίχωμα ζύμης, έχουν μεγάλη προσροφητική ικανότητα για πρόσδεση πολλών ειδών μυκοτοξινών και παρεμποδίζουν τις μυκοτοξικώσεις σε αρκετά μεγάλο βαθμό (153, 164). 38

1.11.4 Μικροβιακή απενεργοποίηση των μυκοτοξινών Η εφαρμογή μικροοργανισμών ικανών να αποτοξινώνουν τις μυκοτοξίνες σε μη τοξικούς μεταβολίτες στις ζωοτροφές πιστεύεται ότι αναστέλλει τις μυκοτοξικώσεις (159). Οι μικροοργανισμοί αυτοί δρουν στο γαστρεντερικό σωλήνα πριν την απορρόφηση των μυκοτοξινών. Ένα βακτηριακό στέλεχος για παράδειγμα, που απομονώθηκε από το υγρό στομάχου βρέθηκε ότι απενεργοποιεί τα τριχοθηκένια ανάγοντας τους δακτύλιους οξειδίου (160). 1.11.5 Βιολογικός έλεγχος. Οι εξάρσεις μολύνσεων από μυκοτοξίνες οδήγησε στον καθορισμό διάφορων στρατηγικών βιοελέγχου όπως η ανάπτυξη ατοξικών μυκήτων βιοελέγχου οι οποίοι ανταγωνίζονται τα υψηλής συγγένειας τοξικογενή στελέχη στο πεδίο, μειώνοντας έτσι τα επίπεδα των μυκοτοξινών στις σοδειές (Cleveland et al., 2003; Dorner et al., 1999). Οι ερευνητές του διεθνούς ινστιτούτου της τροπικής γεωργίας (IITA) βρήκαν ένα λιγότερο τοξικογενές στέλεχος του A. flavus το οποίο αναπτύσσεται στους κόκκους των δημητριακών που αποθηκεύονται σε θερμές και υγρές συνθήκες, οι οποίες μπορούν να αντικαταστήσουν τα επιβλαβή στελέχη που παράγουν τεράστιες ποσότητες τοξινών. Πιθανοί παράγοντες βιοελέγχου περιλαμβάνουν ατοξικά στελέχη των A. flavus και A. parasiticus τα οποία μετά την εισαγωγή τους στο έδαφος των αναπτυσσόμενων σοδειών οδηγούν σε 74,3-99,9% μείωση της μόλυνσης από αφλατοξίνες στα φυστίκια στις ΗΠΑ (Dorner et al., 1998). Τα κριτήρια που αποτιμούν την αποτελεσματικότητα των παραγόντων βιοελέγχου των μυκοτοξινών, περιλαμβάνουν την ικανότητα αποίκησης των υποστρωμάτων-στόχων ή τμημάτων των φυτών καθώς και την ικανότητα να είναι ενεργοί υπό διάφορες περιβαλλοντικές συνθήκες στο πεδίο ή κατά την αποθήκευση (Bacon et al., 2001). 1.11.6 Χημικός έλεγχος. Η κατάλληλη χρησιμοποίηση μικροβιοκτόνων κατά τη διαδικασία της παραγωγής ελαχιστοποιεί τη μυκητισιακή λοίμωξη και την παρασιτική εμφάνιση των εντόμων στις σοδειές και συνεπώς την επιμόλυνση από μυκοτοξίνες. Η μόλυνση από φουμονισίνες μπορεί να μειωθεί με εφαρμογή μυκητοκτόνων (prochloraz, 39

propiconazole, epoxyconazole, tebuconazole cyproconazole and azoxystrobin) (Haidukowski et al., 2004; Matthies and Buchenauer, 2000). 1.11.7 Αποτοξίνωση. Η αποτοξίνωση τροφίμων επιμολυσμένων με μυκοτοξίνες επιτυγχάνεται μέσω χημειοπροστασίας ή μέσω εντερικής απορρόφησης. Η χημειοπροστασία των αφλατοξινών περιγράφεται με τη χρησιμοποίηση ενός αριθμού χημικών σκευασμάτων (για παράδειγμα, Oltipraz και Chlorophylin) ή με τη διατροφική μεσολάβηση όπως μπρόκολα και πράσινο τσάι που είτε αυξάνουν τις διαδικασίες αποτοξίνωσης σε έναν οργανισμό είτε αναστέλλουν την παραγωγή των εποξειδίων τα οποία οδηγούν σε χρωμοσωμική βλάβη (Hayes et al., 1998). Η εντερική απορρόφηση στηρίζεται στην ανακάλυψη ορυκτών αργίλου όπως για παράδειγμα το Novasil, το οποίο μπορεί να προσροφήσει επιλεκτικά τις μυκοτοξίνες ώστε να παρεμποδίσει την απορρόφησή τους από το γαστροεντερικό σωλήνα (Wang et al., 2005; Phillips, Lemke and Grant, 2002). Παρόλα αυτά, με την εντερική απορρόφηση υπάρχει κίνδυνος οι μη ειδικοί παράγοντες προσρόφησης να παρεμποδίσουν την πρόσληψη των ιχνοστοιχείων της τροφής (Mayura et al., 1998). Πρόσφατα βρέθηκε ότι απαραίτητα έλαια και υδατικά εκχυλίσματα του Aframomum danielli μπορούν να μειώσουν τη συγκέντρωση της ωχρατοξίνης Α στο κακάο κατά 64-95% (Aroyeun and Adegoke (2007). Παρόλο που η οχρατοξίνη είναι σταθερό μόριο, το 40-90% καταστρέφεται κατά το καβουρδισμα των κόκκων καφέ. 1.12. Μέθοδοι και Δυνατότητες Πρόληψης του Προβλήματος. Η αλλοίωση των αποθηκευμένων σπόρων (μούχλιασμα) από τους μύκητες καθορίζεται από ένα εύρος παραγόντων, οι οποίοι ταξινομούνται σε 4 κατηγορίες: 1. ενδογενείς διατροφικοί παράγοντες 2. εξωγενείς παράγοντες 3. παράγοντες κατεργασίας 4. μικροβιακοί παράγοντες 40

Εικόνα. Αλληλεπίδραση ενδογενών και εξωγενών παραγόντων στην τροφική αλυσίδα πριν τη συγκομιδή, κατά τη συγκομιδή /ξήρανση και κατά την αποθήκευση. 1.12.1 Βασικοί Έλεγχοι Μετά τη Συγκομιδή Ακριβής ρύθμιση μετρήσεων υγρασίας. Αποτελεσματική και άμεση ξήρανση των νωπών σπόρων δημητριακών. Παράλληλη ρύθμιση του χρόνου αποθήκευσης και της θερμοκρασίας πριν τη ξήρανση με σκοπό την εξασφάλιση των βέλτιστων συνθηκών υγρασίας. Σιτάρι, κριθάρι, βρώμη 14 14.5%, καλαμπόκι 14%, ρύζι 13 14%. Υποδομές για ταχεία απόκριση περιλαμβάνοντας προετοιμασία για διαχωρισμό και κατάλληλες συνθήκες μεταφοράς. 41

Κατάλληλες συνθήκες αποθήκευσης σε όλα τα στάδια όσον αφορά τον έλεγχο υγρασίας και θερμοκρασίας, τη γενικευμένη διατήρηση των κανόνων υγιεινής κατά την αποθήκευση με σκοπό την παρεμπόδιση των παρασίτων. Ικανότητα ακριβούς αναγνώρισης των μυκητισιακών μολύνσεων, των σταδίων και των επιπέδων των μυκοτοξινών. Λειτουργία των εγκεκριμένων ενισχυτικών συστημάτων. Το γεγονός αυτό απαιτεί ρυθμίσεις γθα αποδοχή και απόρριψη. 1.12.2 Πρόληψη μολύνσεων πριν τη συγκομιδή. Κατάλληλη επιλογή υβριδίων καλαμποκιού Ισορροπημένη γονιμοποίηση Αποφυγή αργοπορημένης συγκομιδής Αποτελεσματικός έλεγχος παρασίτων 1.12.3 Πρόληψη μολύνσεων μετά τη συγκομιδή. ελαχιστοποίηση του χρόνου μεταξύ συγκομιδής και ξήρανσης αποτελεσματικός καθαρισμός του καλαμποκιού πριν την αποθήκευση επαρκής ξήρανση τήρηση κανόνων υγιεινής απουσία παρασίτων στην αποθήκευση με θέρμανση καθαρή ανιχνευσιμότητα από το πεδίο στην αποθήκη 42

2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ & ΣΥΖΗΤΗΣΗ 2.1. ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΑΧΕΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΟΛΙΚΩΝ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΩΝ Αρχικά έγινε μία αναζήτηση στο διαδίκτυο για έρευση γρήγορων τεστ που να προσδιορίζουν ολικές αφλατοξίνες και ειδικά σε ξηρούς καρπούς που είναι και η εξειδίκευση των δραστηριοτήτων της επιχείρησης ΓΕΩΝΑΤΣ Ε.Π.Ε. με σκοπό να υιοθετηθεί το πλέον κατάλληλο για την περίπτωση της επιχείρησης και να δοκιμαστεί σε προϊόντα της ώστε να πιστοποιηθεί η εφαρμογή του και να εκπαιδευτεί το προσωπικό της επιχείρησης στην αποτελεσματική εκτέλεση του ώστε να ελέγχει την ποιότητα των α υλών και των προϊόντων της όσον αφορά την ύπαρξη σ αυτά περιεκτικότητα ολικών αλφατοξινών μεγαλύτερης από το όριο συγκέντρωσης των 4 ppb. Η ακρίβεια και η πιστότητα της ταχείας ανάλυσης όπως και ο συνολικός χρόνος εκτέλεσης της αποτέλεσε κριτήριο για την αναζήτηση των διαφόρων εναλλακτικών λύσεων. Οι πιο άμεσα διαθέσιμες λύσεις στην ελληνικά αγορά ήταν δύο (2) και με δύο δυνατότητες επιλογής α) άμεσου τέστ με χρήση τέστ τύπου ταινίας (strip test) με άμεση απάντηση αν η περιεκτικότητα σε ολικές αφλατοξίνες ήταν περισσότερο η λιγότερο των 4 ppb και β) Μέτρηση των ολικών αφλατοξινών με χρήση φωτόμετρου τύπου elisa η οποία μέθοδος αν και επίσης απλή ήταν περισσότερο χρονοβόρα σε σχέση με το τέστ ταινίας. Οι εταιρείες που διακινούν τα ενλόγω τέστ στον ελληνικό χώρο είναι : A) Η εταιρεία NOVACEL ΠΕΡΙΟΧΗ ΑΓΓΕΛΑΚI, ΠΑΙΑΝΙΑ ΑΘΗΝΑ Τ.Κ 19002 Τ.Θ 120 ΤΗΛ. +30 210 6663680, +30 2106917343 η οποία είναι αντιπρόσωπος της Αυστριακής εταιρείας βιοχημικών προϊόντων ROMER και διαθέτει δύο προϊόντα προσδιορισμού ολικών αφλατοξινών και συγκεκριμένα : 43

To -AgraStrip Total Aflatoxin Test (4ppb Cutoff). -AgraQuant Mycotoxin ELISA Test Kit και ειδικά ο τύπος COKAQ1100 που έχει δυνατότητα προσδιορισμού ολικών αφλατοξινών με κατώτερο όριο ανίχνευσης το 1 ppb και εύρος έως 20 ppb. Tα τεχνικά χαρακτηριστικά των προϊόντων αυτών δίνονται παρακάτω : 44

45

46

47

48

49

B) Eταιρεία NEOGEN 620 LESHER Place, Lansing, MI 48912-USA www.neogen.com Neogen Europe tel : 00441292525600 H συγκεκριμένη εταιρεία διαθέτει δύο προϊόντα κατάλληλα για προσδιορισμό μυκοτοξινών και συγκεκριμένα: - Reveal SQ for aflatoxins το οποίο έχει όμως ευαισθησία μέχρι 10 ppb δηλαδή χειρότερη από την επιθυμητή στα 4 ppb και χρειάζεται και ειδικός αναγνώστης όπως φαίνεται από το φυλλάδιο προδιαγραφών που ακολουθεί. - Veratox HS το οποίο είναι τέστ με χρήση φωτόμετρου elisa και δίνει ποσοτική τιμή με κατώτερο όριο ανίχνευσης 0,5 ppb που σημαίνει ότι καλύπτει την περιοχή του ορίου των 4 ppb και μπορεί να απαντήσει ποσοτικά αν το δείγμα των ξηρών καρπών έχει συγκέντρωση ολικών μυκοτοξινών ανώτερη ή κατώτερη του ορίου των 4 ppb. Η περιοχή γραμμικότητας του ποσοτικού προσδιορισμού είναι από 0-8 ppb αλλά και για ανώτερες τιμές μυκοτοξινών μπορούμε να απαντήσουμε άμεσα αν το δείγμα είναι θετικό ή αρνητικό και με κατάλληλη αραίωση να προσδιορίσουμε την ακριβή τιμή ποσοτικά. Τα τεχνικά φυλλάδια με λεπτομέρειες των παραπάνω τέστ της NEOGEN ακολουθούν: 50

NEOGEN Product : Reveal SQ for aflatoxins 51

52

53

NEOGEN Product :Veratox HS 54

55

56

Από το παραπάνω αποτέλεσμα της έρευνας πιθανών μεθόδων για απλή και γρήγορη εκτίμηση της επιμόλυνσης των ξηρών καρπών με αφλατοξίνες το συμπέρασμα ήταν ότι βρέθηκε μόνο μία προσβάσιμη απλή μέθοδος εκτίμησης της συγκέντρωσης των μυκοτοξινών με σύστημα ΝΑΙ/ΟΧΙ για το όριο των 4 ppb καθώς η ισοδύναμη μέθοδος της NEOGEN είχε το μειονέκτημα ότι έκανε την ίδια εκτίμηση με ευαισθησία τα 10 ppb ολικών μυκοτοξινών. Επιπλέον, όσον αφορά της επίσης απλές μεθόδους με φωτόμετρο τύπου elisa, και οι δύο μέθοδοι των εταιρειών ROMER και ΝΕΟGEN ήταν αρχικά αποδεκτές αλλά η μέθοδος της NEOGEN ήταν φτηνότερη όσον αφορά τα αναλώσιμα της και κατά 10 min ταχύτερη. Υπό το πρίσμα των παραπάνω ευρημάτων υιοθετήθηκε η τακτική να αξιολογηθούν οι δύο αυτές μέθοδοι και συγκεκριμένα: Α) AgraStrip Total Aflatoxin Test (4ppb Cutoff). (εταιρεία ROMER) Β) Veratox HS elisa quantitative test (εταιρεία ΝΕΟGEN) Και γίνει πιστοποίηση τους με σύγκριση των αποτελεσμάτων τους με αποτελέσματα ολικών αφλατοξινών με χρήση έγκυρης και διακριβωμένης με 17025 μεθόδου με χρήση HPLC. Για το λόγο αυτό στάλθηκαν δείγματα έξι ξηρών καρπών που λήφθηκαν από την εταιρεία ΓΕΩΝΑΤΣ Ε.Π.Ε. στα εργαστήρια της εταιρείας ROMER στην Αυστρία όπου υπάρχει διαπιστευμένη με ISO 17025 μέθοδος HPLC για τον προσδιορισμό των ολικών αφλατοξινών με σκοπό την ανάλυση τους και την λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων για να συγκριθούν με αυτά των δύο άλλων απλής διαδικασίας αναλυτικών πρωτοκόλλων. Τα δείγματα των ξηρών καρπών ήταν 1) ΜΑΥΡΟ ΚΑΡΥΔΙ 2) ΛΕΥΚΟ ΚΑΡΥΔΙ 3)ΤΡΙΜΜΕΝΟ ΑΜΥΓΔΑΛΟ 4)ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΑΜΥΓΔΑΛΟ ΜΕ ΦΛΟΥΔΑ 5)ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΑΜΥΓΔΑΛΟ ΧΩΡΙΣ ΦΛΟΥΔΑ 6)ΦΥΣΤΙΚΙΑ ΑΙΓΙΝΗΣ ΨΥΧΑ 57

2.2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ HPLC. Το σχετικό αίτημα και τα αποτελέσματα της πιστοποιημένης μεθόδου καταγράφονται παρακάτω : 58

59

60

Στον Πίνακα που ακολουθεί καταγράφονται αναλυτικά τα αποτελέσματα που απέστειλε το Εργαστήριο Αναλυτικών δοκιμών της ROMER Αυστρίας ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1. Αποτελέσματα αναλυτικών δοκιμών με HPLC για ολικές αφλατοξίνες σε ξηρούς καρπούς της εταιρείας ΓΕΩΝΑΤΣ Ε.Π.Ε. ΔΕΙΓΜΑ ΕΙΔΟΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙ-ΚΟΤΗΤΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ Νο: ΣΕ ppb 1 ΜΑΥΡΟ ΚΑΡΥΔΙ <0,6 ΑΡΝΗΤΙΚΟ 2 ΛΕΥΚΟ ΚΑΡΥΔΙ <0,6 ΑΡΝΗΤΙΚΟ 3 ΤΡΙΜΜΕΝΟ ΑΜΥΓΔΑΛΟ <0,6 ΑΡΝΗΤΙΚΟ 4 ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΑΜΥΓΔΑΛΟ ΜΕ <0,6 ΑΡΝΗΤΙΚΟ ΦΛΟΥΔΑ 5 ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΑΜΥΓΔΑΛΟ <2,1 ΑΡΝΗΤΙΚΟ ΧΩΡΙΣ ΦΛΟΥΔΑ 6 ΦΥΣΤΙΚΙΑ ΑΙΓΙΝΗΣ ΨΥΧΑ Δεν πραγματοποιήθηκε - Από τα αποτελέσματα του παραπάνω Πίνακα 2.1 προκύπτει ότι τα πέντε από τα έξι προσκομισθέντα από την εταιρεία δείγματα ήταν όλα αρνητικά και το έκτο δείγμα δεν αναλύθηκε λόγω μη καταλληλότητας της μεθόδου για το είδος του δείγματος (μη πιστοποιημένο πρωτόκολλο για φιστίκια αιγίνης). 2.3. ΔΟΚΙΜΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ AGRASTRIP THΣ ΕΑΙΡΕΙΑΣ ROMER. Από την μελέτη της προβλεπόμενης διαδικασίας ανάλυσης όπως αυτή δίνεται στο φυλλάδιο της εταιρείας προκύπτει η παρακάτω περιγραφή του αναλυτικού πρωτοκόλλου: 61

ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΜΕ ΧΡΗΣΗ STRIP TEST ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΛΙΚΩΝ ΜΥΚΟΤΟΞΙΝΩΝ Α) ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ. Αποθήκευση των τέστ κιτ και των αντιδραστηρίων σε θερμοκρασία από 2-25 C. Τα τέστ κιτ και οι οπές ανάλυσεις θα πρέπει να διατηρούνται στα αρχικά τους υλικά συσκευασίας. Πριν την ανάλυση τα υλικά θα πρέπει να φέρονται όλα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Τα ταινίες των τέστ χρησιμοποιούνται μόνο μία φορά. Απαγορεύεται η κατάψυξη των αντιδραστηρίων και των ταινιών τέστ διότι τα καταστρέφει. Απαιτείται λεπτομερής καθαρισμός των σκευών που χρησιμοποιούνται στο τέστ για αποφυγή επιμόλυνσης με αφλατοξίνες. Β) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ-ΒΗΜΑΤΑ Λαμβάνουμε δείγμα του ξηρού καρπού και με χρήση μύλου άλεσης το αλέθουμε μέχρι να λεπτομεριστεί αρκετά. Λαμβάνουμε αντιπροσωπευτικό δείγμα 10 γραμμαρίων από το αλεσμένο υλικό το οποίο αφού ζυγιστεί με ακρίβεια τοποθετείται σε καθαρό βάζο με καπάκι. Στο βάζο αυτό τοποθετείται επίσης όγκος 20 ml διαλύματος μεθανόλης (70/30 v/v-μεθανόλης/νερό) ή διαλύματος αιθανόλης 50/50 v/v σε νερό. Το βάζο κλείνει και ακολουθεί έντονη ανάδευση για τουλάχιστον 1 min. Στην συνέχεια το υλικό αφήνεται να καθιζάνει και το υπερκείμενο υγρό φιλτράρεται μέσω ηθμού WHATMAN No 1 και συλλέγεται το διαυγασμένο διήθημα που πρόκειται να αποτελέσει το διαυγασμένο διάλυμα μέτρησης. 62

Γ) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ. Αφαιρούμε το καπάκι από την μικροοπή ανάλυσης. Με χρήση πιπέτας με ρύγχος μίας χρήσεως τοποθετούμε μέσα στην μικροοπή 50 μl αντιδραστηρίου από το ειδικό μπουκάλι που δίνεται μαζί με το κιτ και το αναδεύουμε με αναρόφηση για 5 τουλάχιστον φορές με χρήση της πιπέτας. Στην συνέχεια προσθέτουμε 50 μl δείγματος αφού αντικαταστίσουμε το ρύγχος της μικροπιπέτας με νέο και αναδεύουμε με τρείς (3) τουλάχιστον αναρροφήσεις με χρήση της μικροπιπέτας. Τοποθετούμε μία ταινία μέτρησης(test strip) στο υγρό μέσα στην μικρο-οπή και αφήνουμε να εξελιχθεί η αντίδραση για 5 min ώστε να αναπτυχθούν οι κόκκινες γραμμές ανάδευσης. Αφαιρούμε την ταινία στα 5 min και διαβάζουμε το αποτέλεσμα ως εξής - Αν έχει σχηματιστεί μία κόκκινη γραμμή στο επάνω μέρος και τίποτα άλλο : ΘΕΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ= ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΟΛΙΚΩΝ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΩΝ > 4 ppb. - Aν έχουν σχηματιστεί δύο κόκκινες γραμμές έστω και αχνές : 63

ΑΡΝΗΤΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ= ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΟΛΙΚΩΝ ΑΦΛΑΤΟΞΙΝΩΝ < 4 ppb. - Αν δεν έχει σχηματιστεί καμία γραμμή ή μία μόνο στο κάτω μέρος της ταινίας (όχι εμφάνιση της απαραίτητης γραμμής ελέγχου στο πάνω μέρος) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΑΠΑΡΑΔΕΚΤΟ-ΤΟ ΤΕΣΤ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΠΑΝΑΛΗΦΘΕΙ. Επειδή πολλές φορές το δείγμα περιέχει υψηλό ποσοστό λιπαρών (π.χ. περίπτωση καρυδιού) ή χρωμοφόρων ομάδων όπως στην περίπτωση της ψύχας του φυστικιού Αιγίνης ή ακόμα περιέχει πρωτείνες σε σημαντικό βαθμό μία σημαντική βελτίωση που μπορεί να εισαχθεί στο τέστ είναι η χρήση ειδικού μικροφίλτρου που προμηθεύεται από την εταιρεία για να καθαρίζεται το δείγμα και να διευκολύνεται η ανάλυσή του. Ο τύπος του μικροφίλτρου ο οποίος είναι κατάλληλος για δείγματα ξηρών καρπών είναι : mycosep 112 Και η τεχνικές του προδιαγραφές και η διαδικασία χρήσης του είναι η παρακάτω : 64

Εφαρμογή πίεσης Πρωτογενές Εκχύλισμα Δείγμα αφλατοξινών προς ανάλυση Ακαθαρσίες Σχήμα 2.1 Η αρχή λειτουργίας της στήλης καθαρισμού εκχυλίσματος ολικών αφλατοξινών 65