QUANTA Lite GBM ELISA Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός

QUANTA Lite GBM ELISA 708740 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Το QUANTA Lite GBM αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημιποσοτικό εντοπισμό αντισωμάτων IgG έναντι Βασικής μεμβράνης νεφρικού (GBM) σε ανθρώπινο ορό. Ημιποιοτικός προσδιορισμός αντισωμάτων IgG Βασικής μεμβράνης νεφρικού σπειρώματος (glomerular basement membrane ) στον ανθρώπινο ορό ή πλάσμα για τη διάγνωση αυτοάνοσων νεφρικών διαταραχών όπως το σύνδρομο Goodpasture. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Τα αντισώματα αντι- GBM είναι σημαντικά στη παθογένεση του συνδρόμου Goodpasture. 1 Πειράματα παθητικής μεταφοράς έχουν καταδείξει ότι το αντι-gbm μπορεί να αναπαράγει βλάβη του οργάνου-στόχου. 2 Εάν δεν αντιμετωπιστεί, το σύνδρομο Goodpasture μπορεί να ακολουθήσει μια εκρηκτική πορεία με ταχεία επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας, συνοδευόμενη μερικές φορές απο σοβαρή αιμορραγία των πνευμόνων. Η έγκαιρη αναγνώριση αυτών των ασθενών είναι ιδιαίτερα σημαντική όσον αφορά στη διαχείριση και την πρόγνωση, καθώς η ανοσοθεραπεία μπορεί να βελτιώσει το αποτέλεσμα εάν ληφθεί σε επαρκώς πρώιμο στάδιο. 1 Οι αναλύσεις για αντι-gbm στην κυκλοφορία συμπεριλαμβάνουν έμμεσο ανοσοφθορισμό, 3 RIA 4 και ELISA. 5 Η σπειραματική βασική μεμβράνη αποτελείται από πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες. Έχει προσδιοριστεί ότι τα περισσότερα αυτοαντισώματα από ασθενείς με σύνδρομο Goodpasture αντιδρούν με την περιοχή μη κολλαγόνου (NC1) της αλυσίδας κολλαγόνου 3(IV). 6,7 Οι αναλύσεις ELISA που χρησιμοποιούν ειδικό 3(IV) αντιγόνο έχουν αποδειχθεί ιδιαίτερα ευαίσθητες και ειδικές για το σύνδρομο Goodpasture. 8,9 Αντι-GBM εντοπίζονται σπάνια σε υγιή άτομα και οι ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία ή βρίσκονται σε ύφεση τείνουν να έχουν χαμηλότερα επίπεδα του αντισώματος. 6 Ασθενείς με σύνδρομο Goodpasture μπορεί να εκδηλώνουν κλινικά χαρακτηριστικά που υποδεικνύουν ορισμένους τύπους αυτοάνοσης αγγειίτιδας. Για το λόγο αυτό, έχει προταθεί ότι πρέπει να συμπεριλαμβάνεται ανίχνευση των αντι-gbm αυτοαντισωμάτων μαζί με την ανάλυση των αντι-ουδετερόφιλων κυτοπλασμικών αντισωμάτων (ANCA) ως μέρος της οροδιαγνωστικής ανάλυσης ασθενών με υποψία νεφροπνευμονικού συνδρόμου. 9 Αρχη Μεθοδου Κεκαθαρμένο αντιγόνο GBM 3(IV) είναι ενσωματωμένο στα πηγαδάκια υπό συνθήκες όπου διατηρούνται οι φυσικοχημικές ιδιότητες του. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας τα αντι-gbm αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο GBM (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα GBM) 3. GBM ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο GBM, προαραιωμένο, 1.2ml 4. GBM ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο GBM, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος πορφυρός, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Solution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 1

2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 10 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων.. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι γδια διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. CLSI Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης (2 8 ο C) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 2

Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 GBM ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος GBM Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος GBM High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 3

2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυ CLSI για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του GBM ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του GBM ELISA Low. Η τιμή του GBM ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X GBM oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. GBM ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί μετά να ταξινομηθεί σαν αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον πίνακα παρακάτω. Mονάδες Αρνητικό 0-20.0 Ασθενώς Θετικό 21-30 Eνδιάμεσο στο Ισχυρώς θετικό >30 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδηλώνει την παρουσία αντισωμάτων GBM και ενισχύει την πιθανότητα αυτοάνοσων νεφρικών διαταραχών όπως το σύνδρομο Goodpasture. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων GBM ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite GBM ELISA. Οι τιμές GBM που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Ο τίτλος του αντισώματος που λαμβάνεται από μεμονωμένα δείγματα δεν συσχετίζεται απαραίτητα με τη σοβαρότητα της νόσου και δεν πρέπει να αναφέρεται ως τέτοιος. Αντισώματα από διαφορετικούς ασθενείς μπορεί να έχουν διαφορετική ισχύ συνδέσεως αντιγόνου-αντισώματος. 2. Οι τιμές που λαμβάνονται από αυτήν την ανάλυση προορίζονται μόνο ως βοήθημα στη διάγνωση. Κάθε γιατρός πρέπει να ερμηνεύει τα αποτελέσματα σε σχέση με το ιστορικό του ασθενούς, τα φυσικά ευρήματα και άλλες διαγνωστικές διαδικασίες. Εάν είναι δυνατόν, πρέπει να λαμβάνεται η παθολογία μιας νεφρικής βιοψίας. 3. Βέλτιστα αποτελέσματα δοκιμασίας επιτυγχάνονται μόνο εάν ακολουθούνται αυστηρά οι οδηγίες της δοκιμασίας. 4

4. Χρησιμοποιείτε φρέσκο ορό ή δείγματα που έχουν καταψυχθεί μόνο μία φορά και αποψυχθεί. Δείγματα που έχουν αποθηκευθεί ακατάλληλα ή έχουν υποστεί πολλαπλούς κύκλους κατάψυξηςαπόψυξης μπορεί να δώσουν εσφαλμένα αποτελέσματα. 5. Η αναπαραγωγικότητα των αποτελεσμάτων εξαρτάται από την προσεκτική χρήση της πιπέτας, την τήρηση των χρονικών περιόδων και της θερμοκρασίας επώασης, καθώς και την κατάλληλη πλύση των ταινιών δοκιμασίας και την πλήρη ανάμιξη όλων των ανασυσταθέντων διαλυμάτων. 6. Μην ξύνετε τα επικαλυμμένα πηγαδάκια κατά τη διάρκεια της πλύσης και της αναρρόφησης. Πλύντε και γεμίστε όλα τα πηγαδάκια χωρίς διακοπή. Κατά τη διάρκεια της πλύσης, ελέγξτε ότι όλα τα πηγαδάκια είναι εξίσου γεμάτα με διάλυμα πλύσης και ότι δεν υπάρχει υπολειπόμενο διάλυμα πλύσης μετά την αναρρόφηση. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. Αναμενόμενες Τιμές Φυσιολογικές Τιμές Ελέχθησαν 248 τυχαία δείγματα ανδρών και γυναικών 15 έως 69 ετών. Όλα τα αποτελέσματα,εκτός δύο, ήταν μικρότερα από 20 units που θεωρείται τιμή αποκοπής (cut off) για την GBM. Τα δύο θετικά (0.8%) είχαν τιμές 22 και 23 μονάδες (units). Μέσος όρος τιμών GBM ήταν 4.5 units. Σχετική Ευαισθησία και Ειδικότητα 40 δείγματα περιλαμβάνοντα 20 τυχαία φυσιολογικά και 20 πρότυπου εργαστηρίου εξετάσθησαν κατά αντι- GBM με συσκευασία QUANTA Lite GBM ELISA και με άλλες δύο συσκευασίες αναφοράς.τα αποτελέσματα είναι τα εξής. QUANTA Lite GBM ELISA + - + 12 6* Σχετική Ευαισθησία 66.7% Aναφοράς Σχετική Ειδικότητα 100% ΕLISA #1-0 22 Σχετική Ευκρίνεια 85% * 2 απο τα 6 του φυσιολογικού πληθυσμού και 3 απο τα 4 υπόλοιπα ήταν αρνητικά με άλλα κιτ αναφοράς και 1 αμφίβολο. 12 δείγματα ήταν θετικα και 22 αρνητικά με τα δύο κίτ και κανένα δείγμα με QUANTA Lite TM GBM ELISA θετικό και αρνητικό με το ELISA αναφοράς. Από τα 6 δείγματα 2 ήταν απο φυσιολογικες ομάδες και 3 ήταν αρνητικά, 1 αμφίβολο θετικό με άλλο κιτ αναφοράς. Τα ακόλουθα αποτελέσματα λαμβάνονται σε σύγκριση με μια άλλη GBM ELISA αναφοράς. Για τον υπολογισμό της ευαισθησίας και της ειδικότητας, τα οριακά δείγματα πρέπει να αποκλείονται. QUANTA Lite GBM ELISA + - + 11 1* Σχετική Ευαισθησία 91.7% Aναφοράς αμφίβολο 0 3** Σχετική Ειδικότητα 96.0% ΕLISA #2-1*** 24 Σχετική Ευκρίνεια 94.6% * Δείγματα ασθενώς θετικά με το κιτ αναφοράς GBM#2 και αρνητικά με το κιτ αναφοράς GBM#1. ** 1 απο αυτά ήταν θετικό και 2 αρνητικά με το κιτ αναφοράς GBM#1. *** Αυτά ήταν θετικά με κιτ αναφοράς GBM#1. Με το αναφοράς ΕLISA #2 υπήρχαν 11 θετικά και 24 αρνητικά με τα δύο κίτ.1 Δείγμα ήταν με QUANTA Lite GBM ELISA ήταν θετικό ενώ με ΕLISA #2 αρνητικό ακι με ΕLISA #1 θετικό.ένα άλλο ήταν με QUANTA Lite GBM ELISA αρνητικό, ενώ με ΕLISA #2 θετικό και με ΕLISA #1 αρνητικό. Απο 3 αμφίβολα θετικά με QUANTA Lite TM GBM ELISA, 2 ήταν αρνητικά με ΕLISA #1και 1 θετικό. Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Αυτοαντισώματα GBM σε διάφορες ομάδες νόσων Ομαδα ΑσθενΩων Αριθμος Αριθμος Θετικός Ποσοστό (%) Φυσιολογικοί 248 2 (0.8) Autoi MPO + 15 0 PR3 + 15 0 Nόσος συνδετικού ιστού 15 0 Σύνδρομο Goodpastures 25 25 (100.0) Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα ακριβείας και αναπαραγωγικότητας μετρήθηκαν με την εξέταση αρνητικού, ισχυρά θετικού και ασθενούς θετικού δείγματος με έξι ξεχωριστές αναλύσεις σε έξι συνεχείς ημέρες. Η μέση τιμή του ισχυρά θετικού δείγματος ήταν 114.3, του ασθενούς θετικού δείγματος ήταν 25 και του αρνητικού δείγματος ήταν 17.7. Τα αποτελέσματα ανάμεσα στις εξετάσεις και κατά τη διάρκεια της εξέτασης παρουσιάζονται στον πίνακα παρακάτω. Αρνητικό Iσχυρώς θετικό Aσθενώς θετικό SD CV SD CV SD CV Ολικό 1.27 7.2% 4.05 3.5% 0.87 3.5% Εντός μετρήσεων 1.11 6.3% 2.24 2.0% 0.87 3.5% Μεταξύ μετρήσεων 1.01 5.7% 3.65 3.3% 0.65 2.6% 5

Βιβλιογραφία 1. Peters, DK, et al. Treatment and prognosis in anti-basement membrane antibody-mediated nephritis. Transpl Proc, 14: 513, 1982. 2. Lerner, RA, et al. The role of anti-glomerular basement membrane antibody in the pathogenesis of human glomerulonephritis. J Exp Med, 126: 989, 1967. 3. McPhaul, JJ and Dixon, FJ. The presence of anti-glomerular basement membrane antibodies in peripheral blood. J Immunol, 103: 1168, 1969. 4. Boman, C and Lockwood, CM. Clinical application of a radio-immunoassay for auto-antibodies to glomerular basement membrane. J Clin Lab Immunol, 17: 197, 1985. 5. Wieslander J, et al. Anti-basement membrane antibody: Immunoenzymic assay and specificity of antibodies. Scan J Clin Lab Invest, 41: 763, 1981. 6. Hudson, B, et al. Biology of disease Goodpasture Syndrome: Molecular architecture and function of basement membrane antigen, Lab Inv, 61: 256, 1989. 7. Hellmark, T, et al. Characterization of anti-gbm antibodies involved in Goodpasture's syndrome. Kidney Int, 46: 823, 1994. 8. Johansson, D, et al. Characterization of a non-goodpasture auto-antibody to type IV collagen. Nephrol Dial Transplant, 8: 1205, 1993. 9. Bygren, P, et al. Anti-neutrophil cytoplasm antibodies, anti-gbm antibodies and anti-dsdna antibodies in glomerulonephritis. Europ J Clin Inv, 22: 783, 1992. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.): 1 858-805-7950 support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628740GRC July 2014 Revision 6 6