ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙ ΑΣ Β (HBV) ΓΕΩΡΓΙΟΥ Σ.ΓΕΡΜΑΝΙ Η ΙΑΤΡΟΥ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ-ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΓΝΘ «ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ» ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ :ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ.ΑΡΒΑΝΙΤΑΚΗΣ ΑΚΑ ΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ 2004-2005 Αριθµ.1756 ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙ ΑΣ Β (HBV) ΓΕΩΡΓΙΟΥ Σ.ΓΕΡΜΑΝΙ Η ΙΑΤΡΟΥ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005 1

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κ.ΑΡΒΑΝΙΤΑΚΗΣ, Ε.ΓΙΑΝΝΟΥΛΗΣ, Ν.ΕΥΓΕΝΙ ΗΣ, ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κ.ΑΡΒΑΝΙΤΑΚΗΣ, ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ε.ΓΙΑΝΝΟΥΛΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ν.ΕΥΓΕΝΙ ΗΣ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.ΑΝΤΩΝΙΑ ΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΑΓΟΡΑΣΤΟΣ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ.ΚΟΛΙΟΥΣΚΑΣ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.ΝΙΚΟΠΟΥΛΟΣ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως». (Νόµος 5343/32,άρθρ.202 & 2 και ν.1268/82,αρθ.50 & 8) 2

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν.ΜΠΟΝΤΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΜΑΝΘΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΥ ΤΟΜΕΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΠΑΡΧΑΡΙ ΗΣ 3

Στη Γεωργία «Ο αιώνας των πωλητών δε θα µε δεί να παζαρεύω» ΠΑΡΙΝΙ,Ωδές.«Ilussion lyrique» 1984 Σε µια λυρική ψευδαίσθηση.. Στον πατέρα µου,στη µητέρα µου στη Σοφία και στη Τατιάνα 4

ΓΛΩΣΣΑΡΙ Συντµήσεις Ακρωνύµια HBV ιός της ηπατίτιδας Β HBeAg αντιγόνο e του ιού της ηπατίτιδας B HBV DNA δεοξυριβονουκλεϊνικό οξύ του HBV Pre-core προπυρηνική περιοχή (γονίδιο) CHB XHB-χρόνια ηπατίτιδα B HBsAg αντιγόνο επιφάνειας του HBV IFN -α ιντερφερόνη-άλφα anti-hbe αντίσωµα έναντι του αντιγόνου HBe ALT αλανίνη αµινοτρανσφεράση BCP βασικός προωθητής του γονιδίου του καψιδίου basalcore prom oter PCR αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης polym erase chain reaction Pre-C mrna ριβονουκλεϊνικό οξύ-αγγελιοφόρος του προπυρηνικού γονιδίου Core mrna ριβονουκλεϊνικό οξύ του γονιδίου του πυρηνοκαψιδίου HBcAg αντιγόνο πυρηνοκαψιδίου του HBV ORF ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης open reading fram e Th1,2 Τ-λεµφοκυτταρική βοηθητική απάντηση τύπου 1 ή 2 CD4 Τ-λεµφοκύτταρα θετικά στο CD4 CD8 Τ-λεµφοκύτταρα θετικά στο CD8 HLA µείζον σύστηµα αντιγόνων ιστοσυµβατότητας CTL-Κ.Τ.Λ κυτταροτοξικά Τ-λεµφοκύτταρα 5

cytotoxic T-lym phocytes IgM antihbc αντίσωµα τύπου IgM έναντι του πυρηνοκαψιδικού αντιγόνου HBc ccc HBV DNA υπερελικωµένο πλήρες κυκλικό HBV DNA Covalently closed circularhbv DNA bdna διακλαδούµενο DNA-branched DNA AST Ασπαρτική αµινοτρανσφεράση Anti-HBs Αντισώµατα έναντι του αντιγόνου HBs log-log 10 δεκαδικός λογάριθµος U.L.N-Α.Φ.Τ ανώτερες φυσιολογικές τιµές LAM λαµιβουδίνη ADF Αδεφοβίρη HIV ιός ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου HDV ιός της ηπατίτιδας D HCV ιός της ηπατίτιδας C Primer εκκινητής Probe αλληλουχία νουκλεοτιδίων ειδική για υβριδισµό µε περιοχή του HBV DNA IU/mL διεθνής µονάδα ανά ml NK κύτταρα φυσικοί φονείς NKT κύτταρα Τ φυσικοί φονείς ANOVA µονοπαραγοντική ανάλυση ποικιλοµορφίας Single factoranalysis ofvariance SD σταθερή απόκλιση PEG -IFN -α πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη-άλφα INF γ ιντερφερόνη γ TNF-a παράγοντας νέκρωσης των όγκων-α MRPs πρωτεϊνες που συσχετίζονται µε πολλαπλή σε αντιϊκά φάρµακα αντίσταση-multidrug resistance proteins 6

JAK STA Ts IRFs κινάση τυροσίνης πρωτεϊνες ενεργοποίησης ενδοκυτταρίου µηνύµατος και ενεργοποιητές της µεταγραφής ρυθµιστικοί παράγοντες έκφρασης της ιντερφερόνης. 7

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ.... 11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.Ηπατίτιδα Be αντιγόνο-αρνητική H BeA g-αρνητική χρόνια ηπατίτιδα Β 15 1.1.Η οδός βιοσύνθεσης του HBeAg και HBcAg.19 2.Ανάδυση και επιλογή των HBeAg αρνητικών στελεχών του HBV -Ανάπτυξη της HBeAg αρνητικής XHB.22 3.Εξελικτικές δυνάµεις για την επιλογή και κυριαρχία των HBeAg αρνητικών στελεχών.24 4.Παθογένεια..27 5.Κλινική εικόνα,φυσική ιστορία της νόσου και πρόγνωση 30 6. ιάγνωση Ιογενούς ηπατίτιδας B (HBV) 33 6.1 Το HBV DNA ως δείκτης ιϊκού πολλαπλασιασµού.33 6.2 Μέθοδοι ανίχνευσης και ποσοτικής µέτρησης του HBV DNA 34 6.3 ιάγνωση της HBVλοίµωξης..35 Ειδικοί ορολογικοί δείκτες HBV λοίµωξης.38 Παράρτηµα των διαγνωστικών µεθόδων.44 7.Θεραπεία της HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β...46 7.1 Ενδείξεις θεραπείας..46 7.2 Αρχικά θεραπευτικά σχήµατα.46 7.3 Επαναληπτικά θεραπευτικά σχήµατα...47 7.4Παρακολούθηση ασθενών υπό θεραπεία και µετά τη διακοπή της θεραπεία.49 7.5 Νέες θεραπευτικές στρατηγικές και προοπτικές...50 8

ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ. 55 1.ΜΕΘΟ ΟΙ..57 1.1 Μέθοδος πολλαπλασιασµού του στόχου βασιζόµενη στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (real-time PCR am plification)...57 1.2 Μαθηµατικό πρότυπο κινητικής και δυναµικής του HBV.. 60 1.3 Ανάλυση των αποτελεσµάτων ιϊκού φορτίου - εναρµονισµός δεδοµένων στο πρότυπο (data fitting).67 1.4.Ασθενείς....68 2.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ....72 2.1.Καµπύλες πτώσης ιϊκού φορτίου του HBV -Ανάλυση µορφολογίας......72 2.2.Παράµετροι Κινητικής... 74 Εναρµονισµός δεδοµένων στο πρότυπο....75 2.3.Μεθοδολογικά προβλήµατα...75 2.4. ευτερεύοντα αποτελέσµατα από την µαθηµατική ανάλυση των κινητικών παραµέτρων...75 2.5.Κάθαρση του HBV...76 3.ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 85 4.ΠΕΡΙΛΗΨΗ...96 5.SUMMARY..98 6.ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...100 9

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙ ΑΣ Β (HBV) 10

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στη Βόρεια Αµερική και Βόρεια Ευρώπη,η πλειονότητα των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα Β χαρακτηρίζεται ορολογικά από την παρουσία του αντιγόνου HBe (HBeAg) και υψηλών τιµών ιικού φορτίου του HBV-DNA στον ορό κατά την διάρκεια της ενεργού νόσου. Στην Ελλάδα, όπως και σε άλλες περιοχές της Μεσογείου και της Ασίας απαντάται η ιδιαίτερη οντότητα της χρόνιας ηπατίτιδας Β, µε αρνητικό HBe αντιγόνο,ενεργό πολλαπλασιασµό του HBV και παρουσία του HBV-DNA στον ορό σε επίπεδα χαµηλότερα του µέσου ιικού φορτίου ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα Β µε θετικό το HBe αντιγόνο. Οι ασθενείς αυτοί έχουν συνήθως λοίµωξη µε ένα στέλεχος γονότυπου B,C και D του HBV (T-1858) µεταλλαγµένο στην προπυρηνική περιοχή (Pre-core) του γονιδιώµατος. Η µετάλλαξη αυτή (G A 1896) αναστέλλει την παραγωγή του HBeAg.Υπολογίζεται ότι το 80% έως 95% των ασθενών µε χρόνια ηπατιτίδα Β στην Ελλάδα είναι αρνητικοί στο HBeAg (γονότυπου D). Οι στόχοι της θεραπευτικής παρέµβασης στην HBeAg αρνητική XHB παραµένουν ένα ανοικτό θέµα υπό διερεύνηση. Η πλήρης εκρίζωση του ιού, δεν φαίνεται να είναι ένας ρεαλιστικά εφικτός στόχος στην XHB,καθόσον πολύ µικρές ποσότητες πολλαπλασιαζόµενου HBV είναι ανιχνεύσιµες στην πλειονότητα των ασθενών µε παρατεταµένη ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση,ακόµη και σε περιπτώσεις κάθαρσης του HBsAg. Η κάθαρση του HBsAg,η οποία παρατηρείται σε ποσοστό 20-25% των ασθενών µε µακροχρόνια ανταπόκριση, είναι δυσχερής θεραπευτικός στόχος, και απαιτεί χρόνια και παρατεταµένη παρακολούθηση.έτσι ο στόχος της θεραπευτικής παρέµβασης στην H B ea g-αρνητική ΧΗΒ περιορίζεται σε πραγµατικές συνθήκες στην ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση. Μια παρατεταµένη βιοχηµική ανταπόκριση µετά θεραπεία µε ιντερφερόνη-άλφα (IFN -a) που συνοδεύεται από υπολειπόµενα επίπεδα HBV DNA χαµηλού βαθµού,µειώνει τον κίνδυνο εµφάνισης ανατροπής της ηπατικής αντιρρόπησης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου, και συνοδεύεται µε βελτίωση του προσδόκιµου της επιβίωσης. Εάν η ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση διατηρούνται στο τέλος και για τουλάχιστον 12 µήνες µετά το πέρας της θεραπευτικής παρέµβασης,παρατηρείται ιστολογική βελτίωση στον βαθµό της ενεργού νόσου,χωρίς να επιτείνεται η ίνωση. Η µελέτη της κινητικής και δυναµικής του HBV υπό αντιϊική θεραπεία,συµβάλλει 11

στην κατανόηση των µηχανισµών της λοίµωξης,καταγράφει τα πρώιµα επαγόµενα από την θεραπεία αντιϊκά και ανοσορρυθµιστικά φαινόµενα και δράσεις και είναι δυνατόν να ερµηνεύσει τους µηχανισµούς της αποτυχίας της θεραπείας. Μια εκτενής ανάλυση των ανωτέρω δυνητικών στόχων της µελέτης αναφέρεται στο κεφάλαιο του µαθηµατικού προτύπου (µοντέλου)της κινητικής και δυναµικής του HBV.Η κινητική του HBV DNA δεν έχει περιγραφεί στη διεθνή βιβλιογραφία σε ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρόνια ηπατίτιδα Β, ιδιαίτερα µε γονότυπο D.Ο σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν το να χαρακτηρισθεί η πρώϊµη κινητική του HBV σε απάντηση σε διάφορα θεραπευτικά αντιϊκά σχήµατα σε ασθενείς µε HBeAg-αρνητική ΧΗΒ,και να διερευνηθούν τα στοιχεία των κινητικών παραµέτρων που συσχετίζονται µε την πρώϊµη ή µακροχρόνια ιϊκή ανταπόκριση. Η εργασία αυτή αποτελείται από το Γενικό και το Ειδικό µέρος.στο Γενικό µέρος περιγράφονται αναλυτικά όλα τα στοιχεία, τα οποία αφορούν την κλινική οντότητα της χρόνιας ηπατίτιδας Β,αρνητικής στο HBeAg,την µοριακή ερµηνεία της ανάδυσης και επιλογής τους ως κύριου πληθυσµού στελεχών του HBV,την µοριακή διάγνωση, επιδηµολογία, παθογένεια της χρόνιας ηπατίτιδας, και την ισχύουσα σήµερα θεραπεία. Το Ειδικό µέρος περιλαµβάνει την λεπτοµερή περιγραφή και ανάλυση του θεωρητικού προτύπου (µοντέλου) της κινητικής του HBV, µε αναφορά των αρχών, των δυνατοτήτων περιγραφής της βιολογικής συµπεριφοράς της HBV λοίµωξης, και των αδυναµιών του προτύπου (µοντέλου) στην χρήση επιπλέον σηµαντικών στοιχείων της παθογένειας της νόσου. Αναφέρονται οι ασθενείς,οι οποίοι θεραπεύθηκαν µε ποικίλα θεραπευτικά σχήµατα και µελετήθηκαν υπό αγωγή όσον αφορά στην κινητική του HBV DNA στον ορό. Στα αποτελέσµατα αναφέρονται οι παράµετροι της πρώϊµης φάσης κινητικής του HBV,οι οποίοι υπολογίσθηκαν και συσχετίσθηκαν µε την µακροχρόνια ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση.στη συζήτηση αναφέρονται τα συµπεράσµατα της µελέτης, και γίνεται εκτενής συζήτηση για την ερµηνεία των παραµέτρων της κινητικής και δυναµικής της HBV λοίµωξης οι οποίες υπολογίσθηκαν µε µαθηµατική ανάλυση στο µέλλον.ιδιαίτερη έµφαση δίδεται στην προσθήκη στοιχείων µελέτης στο µοντέλο,τα οποία θα συµβάλλουν στην πληρέστερη ερµηνεία της βιολογίας της νόσου. Για την εκπόνηση της διδακτορικής µου διατριβής εκφράζω τις θερµές ευχαριστίες µου προς τα µέλη της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής.Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Καθηγητή Παθολογίας-Γαστρεντερολογίας του Τµήµατος Ιατρικής Α.Π.Θ.και ιευθυντή της Παθολογικής Κλινικής κ.κ.αρβανιτάκη,επιβλέποντα 12

της διατριβής µου,για το θεµα που µου εµπιστεύθηκε να εκπονήσω ταυτιζόµενο µε τα ιδιαίτερα επιστηµονικά µου ενδιαφέροντα,γεγονός που επέτρεψε το ερευνητικό έργο να υλοποιηθεί σε ατµόσφαιρα επιστηµονικής εµπειρογνωµοσύνης και ελευθερίας.αυτή η συµπεριφορά µε διευρυσµένο κώδικα επιστηµονικής λεπτότητας την οποία καρπώθηκα,είναι γεγονός σπάνιο στην τρέχουσα εποχή.τον ευχαριστώ θερµά για την συνεχή καθοδήγηση του στην ολοκλήρωση της διατριβής,τις χρήσιµες υποδείξεις και συµβουλές και την ουσιαστική συµβολή του στην τελική συγγραφή του κειµένου. Τον Καθηγητή Παθολογίας-Γαστρεντερολογίας Α.Π.Θ.και ιευθυντή της Α Πανεπιστηµιακής Παθολογικής Κλινικής κ. Ε. Γιαννούλη για το ιδιαίτερο ενδιαφέρον του και τις εποικοδοµητικές υποδείξεις του.τον Αναπληρωτή Καθηγητή Παθολογίας -Γαστρεντερολογίας Α.Π.Θ., Β Πανεπιστηµιακής Παθολογικής Κλινικής,κ.Ν.Ευγενίδη για τις πρακτικές και χρήσιµες συµβουλές του. Θερµές ευχαριστίες θέλω να εκφράσω στους χαρισµατικούς δασκάλους µου κατά την εκπαίδευση µου στη Γαλλία,καθηγητές Jean-MichelPaw lotsky και Daniel D hum eaux του Νοσοκοµείου H enri M ondor, U niversite Paris X II και INSERM U 635 για όλα όσα µου προσέφεραν στον επιστηµονικό και ανθρώπινο τοµέα για πέντε χρόνια.τα χρόνια αυτά ήταν η δηµιουργικώτερη περίοδος της ζωής µου στην εκπαίδευση και έρευνα.η επιστηµονική συνεργασία µαζί τους είναι διαρκούσα και στην εκπόνηση της παρούσας µελέτης,και τους ευχαριστώ θερµά για αυτό.το θέµα της κινητικής µελέτης,της γενετικής εξέλιξης υπό θεραπεία και αντίστασης των ιών των ιογενών ηπατιτίδων,έλαβε υπόσταση από τις µελέτες στο εργαστηρίο Ιολογικής Βιολογίας του Νοσοκοµείου M ondor. Ευχαριστίες οφείλω επίσης στον Ruy Ribeiro,Los Alam os NationalLaboratory,New Mexico, USA, για την σηµαντική βοήθειά του στην χρήση και ανάλυση των αλγορίθµων του βασικού µαθηµατικού προτύπου (µοντέλου)της ιογενούς λοίµωξης. Ευχαριστώ τον εκλεκτό συνάδελφο και φίλο Ι. Ξανθάκη για την σηµαντική του συµβολή στην συλλογή των δειγµάτων και για την αµέριστη φιλική του ενθάρρυνση, ιδίως κατά το αρχικό δύσκολο διάστηµα της κλινικής µελέτης.τέλος ευχαριστώ τον κ. Ε. Πάγκαλο, ιευθυντή της Α Παθολογικής Κλινικής του Νοσοκοµείου Παπαγεωργίου όπου εργάζοµαι στο Γαστρεντερολογικό Τµήµα από το 2000, ως Επιµελητής Β ΕΣΥ για την ανθρώπινη συµπαράσταση και αµέριστη διοικητική υποστήριξη του στην ολοκλήρωση της µελέτης. 13

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 14

1.Ηπατίτιδα Β αρνητική στο αντιγόνο e /HBeAg-αρνητική Χρόνια Ηπατίτιδα Β Ο όρος ηπατίτιδα Β αρνητική στο αντιγόνο e H B ea g-αρνητική χρόνια ηπατίτιδα Β αναφέρεται στην χρόνια ιογενή λοίµωξη η οποία οφείλεται σε στελέχη του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV)τα οποία δεν παράγουν HBeAg. Στην κλινική πράξη,ο όρος HBeAg-αρνητική XHB είναι ο πλέον δόκιµος για ασθενείς µε χρόνια HBV λοίµωξη οι οποίοι είναι αρνητικοί στο HBeAg,είναι συνήθως θετικοί στο anti-hbe, έχουν αυξηµένα επίπεδα αλανίνης αµινοτρανσφεράσης (ALT)και έχουν ανιχνεύσιµα επίπεδα HBV DNA στον ορό µε µεθόδους κλασσικού υβριδισµού 1-3. Στον ορισµό του όρου δεν περιγράφονται ειδικά οι µεταλλάξεις οι οποίες ευθύνονται για την έλλειψη του HBeAg,όπως η µετάλλαξη µε κωδικόνιο-διακοπή στην προπυρηνική περιοχή,η διπλή µετάλλαξη στον βασικό προωθητή του γονιδίου core (BCP) ή άλλες µεταλλάξεις, και δεν περιλαµβάνεται το επίπεδο του πολλαπλασιασµού του HBV 4. Στη Βόρεια Αµερική και Βόρεια Ευρώπη,η πλειονότητα των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα Β χαρακτηρίζεται ορολογικά από την παρουσία του αντιγόνου HBe (HBeAg)και υψηλές τιµές ιικού φορτίου του HBV-DNA στον ορό του αίµατος κατά την διάρκεια της ενεργού νόσου. Στην Ελλάδα, όπως και σε άλλες περιοχές της Μεσογείου και της Ασίας απαντάται η ιδιαίτερη οντότητα της χρόνιας ηπατίτιδας Β, µε αρνητικό HBe αντιγόνο,ενεργό πολλαπλασιασµό του HBV και παρουσία του HBV-DNA στον ορό σε επίπεδα χαµηλότερα του µέσου ιικού φορτίου ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα Β και θετικό το HBe αντιγόνο 5-7. Οι ασθενείς αυτοί έχουν συνήθως λοίµωξη µε ένα στέλεχος γονότυπου B,C και D του HBV (T-1858) µεταλλαγµένο στην προπυρηνική περιοχή (Pre-core) του γονιδιώµατος. Η µετάλλαξη αυτή (G A 1896) αναστέλλει την παραγωγή του HBeAg.Υπολογίζεται ότι το 80% έως 95% των ασθενών µε χρόνια ηπατιτίδα Β στην Ελλάδα είναι αρνητικοί στο HBeAg (γονότυπου D) 8. Η µετάλλαξη αυτή δηµιουργεί ένα κωδικόνιο-διακοπή στη θέση 28 της προπυρηνικής περιοχής και διακοπή σύνθεσης του precore και της παραγωγής του HBeAg 9-12 (Εικόνα 1Α και 1Β). 15

Εικόνα 1Α.To µήνυµα ενθυλάκωσης του HBV και η µετάλλαξη στην προπυρηνική περιοχή που δηµιουργεί κωδικόνιο διακοπής. Η δευτεροταγής δοµή παρουσιάζεται ως µορφολογία κορµού-αγκύλης της προπυρηνικής περιοχής. εικνύεται η συχνά περιγραφόµενη µετάλλαξη στην προπυρηνική περιοχή που δηµιουργεί κωδικόνιο διακοπής (G σε A,νουκλεοτίδιο 1896) και περιγράφονται οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων-ζευγών στη θέση 1858 στους διάφορους γονότυπους του HBV.Οι γονότυποι B,D,E και G έχουν το νουκλεοτίδιο U στη θέση 1858,το οποίο µπορεί να σχηµατίζει ζεύγος είτε µε G ή µε A.Αντίθετα,οι γονότυποι A και F έχουν C,το οποίο µπορεί να σχηµατίζει ζεύγος µόνον µε το G.Ο γονότυπος C είναι δυνατόν να έχει ένα C ή ένα U.Τα ανωτέρω εξηγούν την σπάνια εµφάνιση της µετάλλαξης στην προπυρηνική περιοχή που δηµιουργεί κωδικόνιο διακοπής στους γονότυπους A και F.(Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 9). 16

Εικόνα 1Β. Ακριβής τοπογραφία των µεταλλάξεων της προπυρηνικής περιοχής (αρίθµηση)(αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 9). Τοπογραφία και φύση των µεταλλαγών που ανιχνεύονται σε σχέση µε την αλληλουχία νουκλεοτιδίων και προτεινόµενη δευτεροταγής δοµή της αλληλουχίας ενθυλάκωσης του προγονιδιώµατος του HBV.Τα αντικαθιστώµενα νουκλεοτίδια δεικνύονται σε παρενθέσεις.οι πλέον συχνά ανιχνευόµενες µεταλλαγές εντοπίζονται σε µια περιοχή 4-νουκλεοτιδίων του κορµού της δοµής. Σε πρόσφατες µελέτες σε κοινότητες από διάφορες γεωγραφικά περιοχές ο επιπολασµός HBeAg-αρνητικών στελεχών σε ασθενείς µε χρόνια HBV λοίµωξη κυµαίνεται από 50 έως 90%.Η θετικότητα για το HBeAg έχει υψηλό επιπολασµό πληθυσµιακές οµάδες των φορέων HBV νεώτερης ηλικίας. Σε παλαιότερες µελέτες µόνο λίγες χώρες εµφανίζουν µεγαλύτερο επιπολασµό HBeAg-αρνητικής σε σχέση µε HBeAg θετική ΧΗΒ, πλην όµως είναι φανερό σήµερα ότι υπάρχει µια παγκόσµια αύξηση στον επιπολασµό της HBeAg-αρνητικής ΧΗΒ 13-23 (Πίνακας 1). 17

Πίνακας 1.Επιπολασµός της XHB µε αρνητικό το HBeAg στην Ευρώπη Χώρα Έτος Αριθµός % HBeAg ve Αναφορά ασθενών Γαλλία 1994 276 22.1 Zarski, (1994) 2003 1166 57 Cadranel,(2003) Ισπανία 1996 99 63 Jardi,(1996) Ιταλία 1991 538 42 G iusti,(1991) 2003 837 90.3 G aeta,(2003) Ελλάδα 1998 36 86 Laras,(1998) Γερµανία 1999 93 84 K noll,(1999) Η απώλεια του HBeAg συνήθως συσχετίζεται µε βιοχηµική και ιστολογική ύφεση της ηπατίτιδας και σηµαντικού βαθµού ελάττωση του πολλαπλασιασµού του HBV.Η µεγάλη πλειονότητα των H B ea g-αρνητικών ατόµων έχουν φυσιολογικά επίπεδα αλανίνης αµινοτρανσφεράσης (ALT)και µη ανιχνεύσιµα επίπεδα HBV DNA µε τις κλασσικές µεθόδους υβριδισµού.όµως,µε πολύ ευαίσθητες µεθόδους όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR), υπολειπόµενα ποσά HBV DNA πολύ χαµηλού τίτλου,µπορούν να ανιχνευθούν στον ορό των περισσοτέρων HBeAg αρνητικών ατόµων. Προσδιορισµός της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του γονιδιώµατος αυτού του υπολειποµένου ιού, έδειξε ότι στις περισσότερες των περιπτώσεων πρόκειται για στελέχη HBeAg αρνητικά ή για µείγµατα τέτοιων στελεχών µε τα αρχέγονου τύπου HBeAg θετικά HBV στελέχη.ένα ποσοστό όµως ατόµων περίπου 15-30%,µε HBV λοίµωξη µε στελέχη HBeAg-αρνητικά,εµφανίζουν χρόνια ηπατίτιδα Β 24-31. Η αθροιστική επίπτωση HBeAg-αρνητικής ΧΗΒ ανέρχεται περίπου στο 25% µετά 16 έτη παρακολούθησης. Η συχνότητα των προπυρηνικά µεταλλαγµένων στελεχών στα HBeAg(+) / HBeAg(-) άτοµα ποικίλει γεωγραφικά και εξαρτάται κυρίως από τον γονότυπο του HBV.Στον γονότυπο Α και F του HBV στη θέση 1858 υπάρχει το νουκλεοτίδιο κυτοσίνη (C-1858) που αποκλείει την επιλογή της µετάλλαξης G 1896Α. Το γεγονός αυτό εξηγεί την µικρή συχνότητα προπυρηνικά µεταλλαγµένων στελεχών στην Βόρεια Ευρώπη,Βόρεια Αµερική και περιοχές της Αφρικής όπου υπερισχύει η συχνότητα του γονότυπου Α. 18

Ο δεσµός Watson-Crick µεταξύ των νουκλεοτιδίων C-1858 και G-1896 (C-G) είναι κριτικός για την σταθερότητα της δευτεροταγούς δοµής του µηνύµατος ενθυλάκωσης του H B V (περιοχή ε του HBV).Η µεταλλαγή G 1896 Α δεν είναι συµβατή µε δεσµό Watson-Crick µε το C-1858.Σε αντίθεση,οι γονότυποι B,C,D,E και G του HBV έχουν θυµιδίνη στην θέση 1858 (T-1858)που σχηµατίζει δεσµό µε Αδενίνη στην θέση 1896 (Α-1896).Έτσι προπυρηνικά µεταλλαγµένα στελέχη του HBV επιλέγονται κυρίως στον γεωγραφικό χώρο της Μεσογείου όπου υπερισχύει ο γονότυπος D του HBV.Σε ασιατικές χώρες,όπου υπάρχουν Α και µη-α γονότυποι του H B V, εκτός από τα προπυρηνικά µεταλλαγµένα στελέχη,υπάρχουν και οι µεταλλάξεις του βασικού προωθητή του πυρηνοκαψιδικού αντιγόνου (BCP).Η διπλή µετάλλαξη Α1762Τ και G 1764A, έχει ως αποτέλεσµα την µεγάλη ελάττωση παραγωγής του precore και του H B ea g, λόγω της ελάττωσης της ποσότητας του συντιθέµενου Pre-C/C m RNA 9,32. 1.1 Η οδός βιοσύνθεσης του HBeAg και HBcAg Το HBeAg (18K d) και το πυρηνοκαψιδικό αντιγόνο του ιού HBcAg (21K d) κωδικογράφονται από το προπυρηνικό και προγονιδιακό HBVRNAs (3,5K d) και µεταφράζονται αντίστοιχα από κωδικόνια έναρξης στην προπυρηνική (precore) και πυρηνική (core) περιοχές.η πυρηνική (core)πρωτείνη έχει την ενδογενή ιδιότητα να αυτοσυσσωρεύεται σε πολλά αντίγραφα σε µια πυρηνοκαψιδική δοµή. Το προπυρηνικό (precore) ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF)κωδικογράφει και ένα υδρόφοβο οδηγό πεπτίδιο το οποίο κατευθύνει το προϊόν της µετάφρασης στο ενδοπλασµατικό δίκτυο, όπου η πρωτείνη υφίσταται περαιτέρω αποδοµή στο καρβοξυλικό της άκρο και εκκρίνεται ως HBeAg 33 (Εικόνα 2Α και 2Β). 19

Εικόνα 2Α. Το γονιδίωµα του HBV και του ανάλογου ιού του τρωκτικού (W oodchuck).αρίθµηση από το σηµείο περιορισµού του ενζύµου EcoRI(Lee WM). Το ιϊκό DNA είναι µερικά διπλής έλικας (κόκινος κύκλος). Η µακρά έλικα καθορισµένου µήκους (µπλέ κύκλος) κωδικογράφει επτά πρωτεϊνες από τέσσερα αλληλοεπικαλυπτόµενα πλαίσια ανάγνωσης (επιφάνειας [S], πυρηνοκαψιδίου [C] πολυµεράσης [P]και του γονιδίου X [X]),τα οποία δεικνύονται ως µεγάλα βέλη,και τρείς πρόδροµες αυτών των πρωτεϊνών περιοχές (pre C, pre S1 και pre S2). Υπάρχει πολύ σηµαντική οµοιότητα µεταξύ των δύο γονιδιωµάτων.το µέγεθος της κάθε πρωτεϊνης αναγράφεται εντός παρενθέσεως. Το αα σηµαίνει αµινοξύ. (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 33). 20

Εικόνα 2Β.Η οδός βιοσύνθεσης του HBeAg και HBcAg. Τα δύο κύρια γονιδιακά µεταγραφήµατα µεγέθους 3,5 K b, είναι το µεγαλύτερο προπυρηνικό (precore)pre-c mrna από το οποίο κωδικογράφεται η πρωτεϊνη Precore (HBeAg), και το µικρότερο προγονιδιακό Pregenom ic mrna, το οποίο κωδικογράφει την πρωτεϊνη του πυρηνοκαψιδίου core και της πολυµεράσης και αποτελεί το υπόστρωµα για την αντίστροφη µεταγραφή του γονιδιώµατος. (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 33). 21

2.Ανάδυση και επιλογή των HBeAg αρνητικών στελεχών του HBV -Ανάπτυξη της HBeAg αρνητικής XHB Η ανάδυση και επιλογή των HBeAg αρνητικών στελεχών του HBV και η ανάπτυξη της H BeA g αρνητικής Χρόνιας Ηπατίτιδας B επεξηγείται πολύ περιεκτικά στην εικόνα 3 1. Εικόνα 3.Σχηµατική αναπαράσταση της ανάδυσης και επιλογής των αρνητικών στο HBeAg µεταλλαγµένων στελεχών του HBV και ανάπτυξη της χρόνιας ηπατίτιδας Β (ΧΗΒ) µε αρνητικό HBeAg (HBeAg ve) 1.Η πλειονότητα των ασθενών εµφανίζουν σταθερά χαµηλά επίπεδα HBV DNA και φυσιολογικές τιµές ALT µετά την χρονική περίοδο της κάθαρσης του HBeAg.Τα χρονικά σηµεία της επιλογής των αρνητικών στο H B ea g στελεχών του HBV δεικνύονται µε βέλη.τα µεταλλαγµένα στελέχη (αρνητικά στο HBeAg)που επιλέγονται είτε πρώϊµα κατά την φάση της κάθαρσης του HBeAg, είτε αργότερα, µετά την οροµετατροπή του HBeAg και πολλαπλασιάζονται µε υψηλού βαθµού ρυθµό, προκαλούν ισχυρές ανοσολογικές αποκρίσεις του ξενιστή, µε αποτέλεσµα αύξηση της ALT και ανάπτυξη χρόνιας 22

ηπατίτιδας B αρνητικής στο HBeAg.(Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 1). Τα χρονικά σηµεία της ανάδυσης και επιλογής των HBeAg αρνητικών στελεχών είναι πρώϊµα κατά την χρονική περίοδο της κάθαρσης του HBeAg,ή όψιµα µετά την οροµετατροπή του HBeAg.Μετά την επιλογή τους τα HBeAg-αρνητικά στελέχη του HBV πολλαπλασιάζονται µε ταχύ ρυθµό και προκαλούν ισχυρή ανοσολογική αποκρίση του ξενιστή, µε αποτέλεσµα την αύξηση της αλανίνης αµινοτρανσφεράσης (ALT)και την ανάπτυξη HBeAg αρνητικής XHB (Εικόνα 3). Τα προπυρηνικά µεταλλαγµένα στελέχη του HBV,τα οποία αναδύονται κατά την φυσική πορεία της HBV λοίµωξης συνµεταδίδονται ab initio,ή συνυπάρχουν ως ελάσσων υποπληθυσµός γονιδιωµάτων στο σύνολο του κυρίου πληθυσµού των προπυρηνικά αρχέγονου τύπου γονιδιωµάτων κατά την χρονική περίοδο µε θετικό το HBeAg.Ο αρχέγονος τύπος του HBV έχει εξελικτικό πλεονέκτηµα έναντι των HBeAg αρνητικών στελεχών και κυριαρχεί κατά την περίοδο αυτή.το γεγονός αυτό δεν οφείλεται στην ικανότητα πολλαπλασιασµού του αρχέγονου στελέχους του HBV, αλλά στην ελαττωµένη ανοσολογική απόκριση του ξενιστή έναντι του ιού κατά την περίοδο της ανοσολογικής ανοχής. Η παρουσία του κυκλοφορούντος στον ορό διαλυτού αντιγόνου HBe είναι ένας από τους πιο σηµαντικούς παράγοντες δηµιουργίας της ανοσολογικής ανοχής του ξενιστή στον πολλαπλασιαζόµενο ιό 34-36.Το HBeAg έχει αποδειχθεί ότι συντελεί προς την κατεύθυνση Τ-κυτταρικής βοηθητικής απάντησης τύπου 2 (Τh2),ενώ ελαττώνει την Τ-κυτταρική βοηθητική απόκριση τύπου 1 (Τh1) µε επαγωγή απόπτωσης 37.Είναι ευρέως αποδεκτό ότι σε απουσία ανοσολογικά επαγόµενης ηπατοκυτταρικής βλάβης,δεν επιλέγονται HBeAg αρνητικά µεταλλαγµένα στελέχη του HBV.Είναι πιθανό ότι τα HBeAg αρνητικά στελέχη έχουν ενδογενή βιολογικά χαρακτηριστικά που τα καθιστούν λιγότερο ευάλωτα στις ανοσολογικές αντιδράσεις του ξενιστή σε σύγκριση µε τα αρχέγονα στελέχη του HBV. 23

3.Εξελικτικές δυνάµεις για την επιλογή και κυριαρχία των HBeAg αρνητικών στελεχών. Τα ανοσολογικά ή άλλα µοριακά πλεονεκτήµατα των HBeAg αρνητικών στελεχών,σε σύγκριση µε το αρχέγονο στέλεχος του HBV συνοψίζονται ως εξής : 1. Ωρισµένα HBeAg αρνητικά προπυρηνικά µεταλλαγµένα στελέχη του HBV ή στελέχη µε µεταλλάξεις στον βασικό προωθητή του γονιδίου του πυρηνοκαψιδικού αντιγόνου (BCP),είναι δυνατόν να έχουν ένα ενδογενές πλεονέκτηµα όσον αφορά τον πολλαπλασιασµό τους.το πλεονέκτηµα αυτό είναι δυνατόν να οφείλεται στους εξής παράγοντες: α) Στην αυξηµένη σταθερότητα της περιοχής ενθυλάκωσης ε που οφείλεται στην µετάλλαξη G 1896A σε στελέχη γονοτύπων µε Τ-1858. Το γεγονός αυτό είναι δυνατόν να συντελεί σε αυξηµένη ικανότητα πολλαπλασιασµού αυτών των στελεχών 38. β)η διπλή µετάλλαξη στο BCP A 1762T και G 1764A καταστέλλει το pre-core/core m RNA σχετικά µε το προγονιδιακό mrna,αυξάνοντας έτσι έµµεσα το υπόστρωµα του mrna της αντίστροφης µεταγραφής και τον πολλαπλασιασµό του ιού 32. γ)σπάνιες επιπλέον µεταλλάξεις σε κάποια HBV στελέχη µε τις BCP µεταλλάξεις (1768,1770,1772)έχει περιγραφεί ότι έχουν πλεονέκτηµα πολλαπλασιασµού 32. δ) Σε in vitro σύστηµα, η προπυρηνική πρωτείνη έχει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασµό του ιού 39. Συνεπώς οι µεταλλάξεις που αναστέλλουν την παραγωγή της,αναµένεται να έχουν θετική επίδραση στον πολλαπλασιασµό του ιού.τα πειραµατικά όµως κλινικά δεδοµένα στο συγκεκριµένο θέµα είναι αντιτιθέµενα, µε κάποιες µελέτες να επιδεικνύουν ένα πλεονέκτηµα πολλαπλασιασµού αυτών των µεταλλαγµένων στελεχών και άλλες να έχουν αντίθετα αποτελέσµατα 39-40. 2. Πρόσφατα έχει παρατηρηθεί ότι το H B ea g παρουσιάζεται πιο αποτελεσµατικά από το HBcAg στα CD4 Τ λεµφοκύτταρα και εγείρει µία ισχυρότερη CD4 Τ λεµφοκυτταρική ανοσολογική απόκριση. Συνεπώς, ηπατοκύτταρα που εκφράζουν HBeAg και HBcAg όπως τα ηπατοκύτταρα µε λοίµωξη µε το αρχέγονο στέλεχος του HBV µπορούν να εγείρουν ισχυρότερη ανοσολογική απόκριση από ειδικά CD4 T-λεµφοκύτταρα σε σύγκριση µε εκείνη των ηπατοκυττάρων µε λοίµωξη µε 24

µεταλλαγµένα HBV στελέχη που εκφράζουν µόνο HBcAg. Μία εµµένουσα ανοσολογική απόκριση και άσκηση επίµονης πίεσης στα ηπατοκύτταρα µε λοίµωξη µε το αρχέγονο στέλεχος του HBV,είναι δυνατόν σταδιακά να καταλήξει στην επιλογή των µεταλλαγµένων HBeAg αρνητικών στελεχών 41-42. 3.Με όµοιο µηχανισµό,ηπατοκύτταρα που εκφράζουν σύγχρονα HBcAg και HBeAg CD8 (Τ-κυτταροτοξικά) αναγνωρίσιµους ειδικούς επιτόπους, δυνητικά είναι προτιµώµενος στόχος της ανοσολογικής Τ-κυτταροτοξικής απόκρισης,σε σύγκριση µε κύτταρα που εκφράζουν µόνο HBcAg επιτόπους 42. 4.Οι ασθενείς µε HBeAg-αρνητική XHB εµφανίζουν HBV-ειδικά Τ-λεµφοκύτταρα στο ήπαρ και το περιφερικό αίµα (µε µελέτη ειδικών HLA-A2 τετραµερών)όπως και οι ασθενείς µε αυτοπεριοριζόµενη ηπατίτιδα Β σε αποδροµή. Το 1-9% του συνόλου των CD8 T λεµφοκυττάρων που ανευρίσκονται ενδοηπατικά αναγνωρίζουν επιτόπους του HBcAg και επιδεικνύουν έκφραση DR 43-45.Στους ασθενείς µε HBeAg αρνητική XHB,διατηρείται µία σχετική κατάσταση ισορροπίας µεταξύ της δράσης των HBVειδικών Τ λεµφοκυττάρων και του πολλαπλασιαζόµενου ιού σε µικρό βαθµό,χωρίς επαγωγή νέκρωσης ηπατοκυττάρων και φλεγµονώδους αντίδρασης ενδοηπατικά σε περιόδους ύφεσης της ενεργότητας της νόσου 43.Η ισορροπία αυτή διαταράσσεται κατά την αναζωπύρωση η οποία οφείλεται σε µεγάλη αύξηση αιφνίδια του ιϊκού πολλαπλασιασµού και την συνεπακόλουθη ανοσολογική απόκριση 43. Συνολικά λοιπόν, το σηµαντικότερο ερώτηµα είναι: ποιος είναι ο ανοσολογικός µηχανισµός που καθορίζει την επιλογή των HBeAg αρνητικών στελεχών του HBV; Το κυτταροπλασµατικό HBeAg µπορεί να χρησιµοποιήσει και την οδό του µείζονος συµπλέγµατος ιστοσυµβατότητας τάξης Ι για ανοσολογική αναγνώριση από τα CD8 Τ-κυτταροτοξικά λεµφοκύτταρα και την οδό ΙΙ για αναγνώριση από τα CD4 Τ-λεµφοκύτταρα (Εικόνα 4).Το HBcAg δεν µπορεί να χρησιµοποιήσει την οδό τάξης ΙΙ.Κατ αυτό τον τρόπο τα ηπατοκύτταρα που παράγουν κυτταροπλασµατικό HBeAg αποτελούν δυνητικό στόχο για καταστροφή και από τα CD 8 και / ή τα CD 4 Τ κύτταρα 37.Παρ όλο το ανωτέρω σκεπτικό,δύσκολα γίνεται κατανοητό το εκλεκτικό εξελικτικό πλεονέκτηµα ενός HBeAg-αρνητικού στελέχους στο επίπεδο της ανοσολογικής αναγνώρισης από τα κυτταροτοξικά Τ- λεµφοκύτταρα (CTL)-ΚΤΛ, επειδή το ηπατοκύτταρο µε HBV εκφράζει το HBcAg που έχει διασταυρούµενη µε το HBeAg αντίδραση στα CTL-ΚΤΛ ανεξάρτητα από την έκφραση του HBeAg 46,47. Παρά το γεγονός όµως αυτό, έχει διαπιστωθεί η θέση ότι όταν ελαττώνεται η 25

παραγωγή του HBcAg και µε οριακή έκφρασή του όσον αφορά στην φόρτιση της τάξης Ι αντιγόνων του µείζονος συµπλέγµατος ιστοσυµβατότητας και την αναγνώριση των (CTL)-ΚΤΛ,τότε η συνέκφραση του κυτταροπλασµατικού HBeAg συντελεί στο να καταστεί το ηπατοκύτταρο µε HBV πλέον ορατό στην HBe/HBcAg ειδική δράση των (CTL)-ΚΤΛ. Σε αυτή την περίπτωση ένα HBeAg-αρνητικό στέλεχος του HBV αντιπροσωπεύει ένα αποτελεσµατικό στέλεχος σε διαφυγή από την δράση των (CTL)-ΚΤΛ. Επειδή τα ηπατοκύτταρα δεν είναι ικανά και αποτελεσµατικά ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα για εξωγενή αντιγόνα, είναι απίθανο το κυκλοφορούν στον ορό HBeAg να είναι στόχος της ανοσολογικής απόκρισης. Στην πραγµατικότητα, το εκκρινόµενο HBeAg µπορεί να προκαλεί ανοσολογική ανοχή και ως αντιτιθέµενος µηχανισµός να ελαττώνει την ειδική στο κυτταροπλασµατικό HBeAg ανοσολογικά επαγόµενη κυτταρική βλάβη και καταστροφή 37.Σύµφωνα µε αυτήν την υπόθεση,ο HBeAg-αρνητικός ιός διαφεύγει την ανοσολογική απόκριση που στοχεύει στο κυτταροπλασµατικό HBeAg,αλλά το στέλεχος εκ διαφυγής δεν είναι πλήρες όσον αφορά το εξελικτικό πλεονέκτηµα επιβίωσης,επειδή ο ιός επίσης χάνει την δράση της εκρινόµενης ανοσορρυθµιστικής πρωτείνης του διαλυτού HBeAg,η οποία προκαλεί ανοσολογική ανοχή 37.Το γεγονός αυτό ερµηνεύει πως ένα στέλεχος από ανοσολογική διαφυγή είναι δυνατόν να είναι πλέον ανοσοπαθογόνο σε έναν ασθενή µε χρόνια ηπατίτιδα Β,εξ αιτίας του διπλού ρόλου και δράσης του HBeAg ως ανοσογόνου ή πρόξενου ανοχής 40,43. 26

4.Παθογένεια Η HBeAg-αρνητική XHB µπορεί να αναπτυχθεί κατά την χρονική περίοδο της απώλειας του HBeAg ή αργότερα κατά την χρονική περίοδο HBeAg(-)/anti- HBe(+).Ο µηχανισµός παθογένειας της ηπατοκυτταρικής βλάβης και καταστροφής, είναι η ανοσολογική αποκρίση εναντίον του ταχέως πολλαπλασιαζόµενου ιού κατά τις περιόδους αναζωπύρωσης 48 (Εικόνα 4).Ο συνεχής ιϊκός πολλαπλασιασµός στους ασθενείς µε HBeAg-αρνητική X H B προκαλεί ισχυρή ανοσολογική απόκριση µε παρόµοιους µηχανισµούς που ενεργούν στην HBeAg-θετική XHB 33. Η τυπική αλληλουχία των γεγονότων όσον αφορά στην ηπατική νεκροφλεγµονώδη αντίδραση, είναι η αύξηση των επιπέδων του HBV DNA του ορού η οποία ακολουθείται από αύξηση της αλανίνης αµινοτρανσφεράσης του ορού (ALT).Σε µερικούς ασθενείς τα επίπεδα ALT είναι ανάλογα οξείας ή κεραυνοβόλου ηπατίτιδας Β. Στην ηπατοκυτταρική βλάβη και καταστροφή συµµετέχουν κυτταρολυτικοί και µη κυτταρολυτικοί µηχανισµοί µε µεσολαβητές κυτταροκίνες. Η κυτταροτοξική Τ- λεµφοκυτταρική απόκριση σε επιτόπους του HBcAg που εκφράζονται στα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη,πιθανά είναι το αίτιο της λύσης των ηπατοκυττάρων και της αύξησης της ALT.Επιπλέον,συµµετέχουν και µη κυτταρολυτικοί µηχανισµοί καθόσον στις περισσότερες περιπτώσεις H B ea g-αρνητικής ΧΗΒ µε αύξηση της ALT,τα επίπεδα του HBV DNA του ορού ελαττώνονται πριν την µέγιστη άνοδο της ALΤ 40,43.Ο µηχανισµός αυτός έχει παρατηρηθεί επίσης στα πειραµατικά µοντέλα της οξείας ηπατίτιδας Β 49. Κλινικές µελέτες και επιδηµιολογικές παρατηρήσεις σε HBeAg αρνητικούς ασθενείς έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη της χρόνιας ηπατίτιδας είναι δυνατόν να επισυµβεί έτη ή δεκαετίες µετά την οροµετατροπή στο HBeAg.Οι παράγοντες που συντελούν σε αυτή την καθυστερηµένη αναζωπύρωση του ιϊκού πολλαπλασιασµού και της νόσου είναι άγνωστοι 50-55. 27

Εικόνα 4. Ανοσοπαθογένεια της χρόνιας ηπατίτιδας Β. [Οι λεπτοµέρειες της ανοσολογικής απόκρισης έναντι επιτόπων του H B ca g περιγράφονται στο κείµενο (Κεφάλαια 2,3,4)](Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 33). Παθογένεση της ανοσολογικής απόκρισης στην ΧΗΒ και η σχέση µεταξύ της πρόσδεσης πεπτιδίων του HBcAg από µόρια του µείζονος συστήµατος ιστοσυµβατότητας και Τ-λεµφοκυτταρικές αποκρίσεις.η οδός του συστήµατος HLA τάξης I περιλαµβάνει εσωτερική τροποποίηση των πεπτιδίων H ΒcA g, και H ΒeA g εντός των ηπατοκυττάρων,µε αποτέλεσµα την έκφραση τους κατόπιν στην επιφάνεια του ηπατοκυττάρου. Ο εναρµονισµός των πλέον ανοσογόνων πεπτιδίων στους αντιγονοπαρουσιαστκούς κυτταρικούς θυλάκους καθορίζεται από το σύνολο των αλληλουχιών του υποδοχέα του Τ-κυττάρου του ξενιστή (µορφολογία θυλάκου άνω αριστερά),το οποίο µε τη σειρά του καθορίζει την πιθανότητα µιας αποτελεσµατικής ανοσολογικής απόκρισης.η αναγνώριση από τα CD8 λεµφοκύτταρα των πεπτιδίων που παροουσιάζονται στο θύλακο πρόσδεσης αντιγόνου του HLA προάγει την απόπτωση µε µεσολάβηση του συνδεόµενου µορίου στον υποδοχέα Fas, κυτταροκινών και περφορίνης. 28

Εξωγενώς προερχόµενα (από τον ορό )αντιγόνα του HBV,είναι δυνατόν επίσης να τροποποιούνται από τα µακροφάγα και να παρουσιάζονται στα CD4 λεµφοκύτταρα µε έναν παρόµοιο µηχανισµό. Το αποτέλεσµα είναι µία αυξηµένη σύνθεση κυτταροκινών,η οποία αυξάνει τον πολλαπλασιασµό και την κλωνική έκπτυξη των Τ-λεµφοκυττάρων, αυξάνει την παρουσία των µορίων HLA τάξης I στα ηπατοκύτταρα και ελλατώνει τον ιϊκό πολλαπλασιασµό.σε κάποιες περιπτώσεις,τα CD4 λεµφοκύτταρα είναι πιθανό να επιδεικνύουν κυτταρολυτική δράση. 29

5.Κλινική εικόνα,φυσική ιστορία της νόσου και πρόγνωση Η ηλικία των ασθενών µε ΧΗΒ αρνητική στο αντιγόνο e κυµαίνεται µεταξύ 40 και 55 ετών και είναι σηµαντικά υψηλότερη από τους ασθενείς µε HBeAg-θετική ΧΗΒ στην ίδια γεωγραφική ζώνη.η αναλογία ανδρών προς γυναίκες κυµαίνεται µεταξύ 4,6 έως 17 ανάλογα µε τον πληθυσµό που µελετάται.ο συχνότερος τρόπος µετάδοσης του ιού (40% ), είναι η ενδοοικογενειακή διασπορά σε µικρή σχετικά ηλικία. Κατά την διάγνωση οι περισσότεροι ασθενείς είναι ασυµπτωµατικοί και ανακαλύπτονται τυχαία κατά την αιµοδοσία ή από την αύξηση της ALT κατά τον εργαστηριακό έλεγχο. Ένα µικρό ποσοστό ασθενών παρουσιάζει επεισόδια αναζωπύρωσης της ηπατίτιδας. Τέλος, άλλοι ασθενείς οι οποίοι εµφανίζονται µε συµπτώµατα και σηµεία,παρουσιάζουν εκδηλώσεις προχωρηµένου σταδίου χρόνιας ηπατικής νόσου 56-63. Κατά την προοπτική παρακολούθηση,παρατηρούνται δύο κύριες κλινικές µορφές ενεργότητας της νόσου 4,56 : 1) Εµµένουσα αύξηση των επιπέδων των αµινοτρανσφερασών, χωρίς αυτόµατη ύφεση, µε µέσο όρο τιµών αυξηµένο 3-4 φορές σε σχέση µε τις ανώτερες φυσιολογικές τιµές της ALT (30% -40% των περιπτώσεων) 2)Μια διαλείπουσα αύξηση της ALT µε συχνές αναζωπυρώσεις της ενεργότητας της νόσου (45-65% των περιπτώσεων)(εικόνα 5). 30

Εικόνα 5. Χαρακτηριστικό παράδειγµα διακύµανσης καµπυλών HBV DNA και ALT σε διαλείπουσα µορφή ενεργού νόσου, σε ασθενή µε XHB,αρνητική στο HBeAg (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 1).Οι αυξήσεις στις τιµές της ALT ακολουθούν στις περισσότερες περιπτώσεις τις αυξήσεις των επιπέδων του HBV DNA.Το HBV DNA µετράται σε copies/mlµε ευαίσθητη µέθοδο ποσοτικού προσδιορισµού. Μερικές φορές αυτές οι αναζωπυρώσεις είναι σοβαρές, όµοια µε οξεία ηπατίτιδα Β µε τιµές ALT άνω των 1000U /L και θετικό IgM antihbc. Οι αυξήσεις στα επίπεδα HBV DNA του ορού συνήθως προηγούνται των αυξήσεων της ALT και είναι δυνατόν να υφεθούν σηµαντικά ή να µην ανιχνεύονται. Οι ενδιάµεσοι περίοδοι ανενεργότητας µε φυσιολογικές τιµές ALT είναι δυνατόν να είναι µακρές, αλλά στην πλειονότητα των περιπτώσεων η ενεργότητα της νόσου επανέρχεται.μόνον 6% έως 15% των ασθενών επιδεικνύουν αυτόµατη ύφεση σε µακροχρόνια παρακολούθηση 1. Η διάγνωση της χρόνιας ηπατίτιδας Β µε αρνητικό HBeAg βασίζεται στα εξής:α)θετικό HBsAg µε αρνητικό HBeAg στον ορό άνω των 6 µηνών.το κριτήριο αυτό αποκλείει τους ασθενείς που βρίσκονται στο ασταθές στάδιο της οροµετατροπής στο HBeAg.β)αυξηµένα επίπεδα αλανίνης αµινοτρανσφεράσης (ALT),σταθερά,ή διαλλείποντα.γ)ενεργό πολλαπλασιασµό του HBV που τεκµηριώνεται µε το HBV DNA στον ορό και/ή το HBcAg στον ηπατικό ιστό.εάν χρησιµοποιούνται µέθοδοι ποσοτικού προσδιορισµού PCR, τότε τα επίπεδα του HBV DNA θα πρέπει να 31

υπερβαίνουν τα 10 5 αντίγραφα / ml(copies/ml). Εάν δεν ανιχνεύεται HBV DNA στον ορό και/ή HBcAg στο ήπαρ, που δεν αποκλείεται να συµβαίνει κατά την διάρκεια αναζωπύρωσης της ηπατικής νόσου, τότε είναι απαραίτητος για την διάγνωση ο συνεχής έλεγχος σε επανειληµµένες µετρήσεις,για να αποδειχθεί ότι η ηπατική νόσος οφείλεται σε λοίµωξη µε HBV.Πριν από την αναζωπύρωση της ALT,τα επίπεδα του HBV DNA αυξάνουν σηµαντικά,ενώ σε 80% περίπου των ασθενών υψηλά επίπεδα IgM anti-hbc ή ολικού anti-hbc ανιχνεύονται κατά την διάρκεια ή αµέσως µετά την αύξηση της ALT.Εάν αυτά τα διαγνωστικά κριτήρια δεν πληρούνται,η αιτιολογία της ηπατικής βλάβης σε ασθενείς µε HBsAg(+)/HBeAg (-) είναι δυνατόν να µην συσχετίζεται µε τον πολλαπλασιασµό του HBV αλλά να οφείλεται σε άλλες συνυπάρχουσες παθολογικές καταστάσεις (π.χ αλκοόλ) 64-69. Τα δεδοµένα όσον αφορά στην φυσική ιστορία της χρόνιας ηπατίτιδας Β µε αρνητικό αντιγόνο e (-) από προοπτικές µελέτες είναι περιορισµένα. Αρκετοί ασθενείς,περίπου το 40% στις πρώτες µελέτες εµφάνιζαν ιστολογικά διαπιστωµένη κίρρωση του ήπατος.επιπλέον της εµµένουσας δραστηριότητας της νόσου µε τους διαφορετικούς τύπους αύξησης των τρανσαµινασών, είναι δυνατόν να παρουσιάζονται σοβαρά έως και θανατηφόρα επισόδεια αναζωπύρωσης του ιϊκού πολλαπλασιασµού.γενικά,η µακροχρόνια πρόγνωση χωρίς θεραπευτική αγωγή είναι κακή.στην Ιταλία,το ένα τρίτο των ασθενών βρέθηκε να αναπτύσσουν κίρρωση κατά την διάρκεια χρονικού διαστήµατος κατά µέσον όρο 6 ετών.σε µια µεγάλη Eλληνική σειρά 322 ασθενών, η θνητότητα και η ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκίνου σε µια τετραετία από την αρχική διάγνωση της νόσου,ήταν 29% και 14% αντίστοιχα, ποσοστά πολύ µεγαλύτερα σε σύγκριση µε τους ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β και θετικό HBeAg.Παρά τα προαναφερθέντα,χρειάζονται µακροχρόνιες µελέτες προοπτικής παρακολούθησης των ασθενών για την πληρέστερη κατανόηση της φυσικής ιστορίας και της πρόγνωσης της χρόνιας ηπατίτιδα Β µε αρνητικό HBeAg 70-72. 32

6. ιάγνωση Ιογενούς ηπατίτιδας B (HBV) Η Ιολογική διάγνωση και παρακολούθηση της HBV λοίµωξης βασίζεται σε ορολογικές µεθόδους οι οποίες ανιχνεύουν ειδικά HBV αντιγόνα και anti-hbv αντισώµατα στον ορό, (Πίνακας 2) και µεθόδους που µπορούν να ανιχνεύσουν ποσοτικά ή να χαρακτηρίσουν τα στοιχεία των ιϊκών σωµατιδίων του ιού της ηπατίτιδας Β,όπως το HBV DNA και ποικίλα ιϊκά αντιγόνα.η ανίχνευση και η ποσοτική µέτρηση του HBV DNA σήµερα διαδραµατίζει κεντρικό ρόλο στην διάγνωση της λοίµωξης,στην θεραπευτική προσέγγιση και στην παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία.πλην όµως,τα επίπεδα HBV DNA που έχουν σηµασία σε διάφορες κλινικές καταστάσεις θα πρέπει να ορισθούν µε προοπτικές κλινικές µελέτες 73-75. 6.1 Το HBV DNA ως δείκτης ιϊκού πολλαπλασιασµού Η παρουσία του HBV DNA στον ορό ενός ασθενούς είναι αξιόπιστος δείκτης ενεργού (HBV)ιϊκού πολλαπλασιασµού.είναι δυνατόν να ανιχνευθεί εντός ολίγων ηµερών µετά από µία οξεία HBV λοίµωξη,φτάνει σε µέγιστα επίπεδα κατά τη φάση της οξείας ηπατίτιδας και προοδευτικά ελαττώνεται και εξαφανίζεται µε την αυτόµατη αποδροµή της HBV λοίµωξης.στους χρόνιους φορείς του HBV,η χρόνια λοίµωξη εξελίσσεται σε διαδοχικές φάσεις.τα επίπεδα του HBV DNA δεν είναι σταθερά κατά την διάρκεια του χρόνου και εξαρτώνται από την φάση της HBVλοίµωξης: Η φάση της ανοσολογικής ανοχής µετά από οξεία λοίµωξη χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα ιϊκού πολλαπλασιασµού. Η φάση της ανοσολογικής αναγνώρισης-κάθαρσης χαρακτηρίζεται από χαµηλότερα, συχνά ευρέως διακυµενόµενα επίπεδα HBV DNA. Η φάση κλινικής ανενεργότηταςενσωµάτωσης του HBV χαρακτηρίζεται από πολύ χαµηλά έως µη ανιχνεύσιµα επίπεδα ιϊκού πολλαπλασιασµού,ανάλογα µε την ευαισθησία των µεθόδων. Κατά τις φάσεις αναζωπύρωσης, τις αυτόµατες, ή επαγόµενες µε ανασοκατασταλτική θεραπεία,ο πολλαπλασιασµός του HBV έχει ως αποτέλεσµα υψηλά επίπεδα HBV DNA του ορού.κατά την διάρκεια όλων των ανωτέρω φάσεων της χρόνιας HBV λοίµωξης, το HBV DNA υπό την µορφή ενδιάµεσων µορφών πολλαπλασιασµού ή υπερελικωµένου DNA (cccdna) ανιχνεύεται στα 33

ηπατοκύτταρα µε ειδικές ευαίσθητες τεχνικές. Τα επίπεδα του HBV DNA δεν φαίνεται να συσχετίζονται µε τον βαθµό βαρύτητας της ηπατικής βλάβης,διότι η ηπατική βλάβη δηµιουργείται κυρίως κατά την φάση της ανοσολογικής αναγνώρισηςκάθαρσης και κατά τη φάση αναζωπύρωσης 76-84. 6.2 Μέθοδοι ανίχνευσης και ποσοτικής µέτρησης του HBV DNA. Οι τεχνικές ανίχνευσης και ποσοτικής µέτρησης του HBV DNA βασίζονται σε µεθόδους ενίσχυσης του τελικού «σήµατος» µετά µοριακό υβριδισµό («προσκόληση σε υβρίδιο-hybrid capture»,«διακλαδούµενο DNA branched DNA - bd N A»),ή σε µεθόδους ενίσχυσης-πολλαπλασιασµού της αρχικής ποσότητας του HBV DNA στόχου (αντίδραση πολυµεράσης-pcr, πολλαπλασιασµός µέσω µεταγραφής-tm A) 75.Ο πίνακας 3 περιλαµβάνει τις µεθόδους που είναι εµπορικά διαθέσιµες για την ανίχνευση και ποσοτική µέτρηση του HBV DNA.Οι µονάδες µέτρησης του HBV DNA που χρησιµοποιούνται στις διαφορετικές µεθόδους δεν αντιπροσωπεύουν την ίδια πραγµατική ποσότητα HBV DNA σε ένα δεδοµένο κλινικό δείγµα (π.χ ορό ασθενούς).μια µέθοδος βασιζόµενη στον υβριδισµό,η οποία χρησιµοποιεί διακλαδιζόµενα µόρια DNA (branched D N A, bd N A ) και πολλαπλασιασµό του σήµατος έχει αναπτυχθεί και χρησιµοποιείται µε σκοπό την άµεση ποσοτική µέτρηση του HBV DNA στον ορό (VersantTM HBV-DNA,Bayer Diagnostics). Επιπλέον, µια δεύτερη ποσοτική µέθοδος πολλαπλασιασµού του στόχου βασιζόµενη στην ανταγωνιστική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (com petitive PCR)έχει αναπτυχθεί και είναι διαθέσιµη σε τυποποιηµένη µορφή αντιδραστηρίων. (Amplicor HBV M onitortm,roche M olecular System s, Branchburg, New Jersey) (Gerken G.).Η βασιζόµενη στην PCR µέθοδος M onitorείναι σε σηµαντικό βαθµό πιο ευαίσθητη από την µέθοδο bdna,µε αναλυτική ευαισθησία να είναι περίπου 3 log 10 copies/mlµεγαλύτερη από αυτή του bd N A.Κατά την εµπειρία µας,περίπου το 40% των κλινικών δειγµάτων που ελέγχονται για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του HBV DNA είναι θετικά µε την PCR,αλλά αρνητικά µε την µέθοδο bdna. Η µεγαλύτερη αναλυτική ευαισθησία της PCR είναι κλινικά σηµαντική, καθώς οι περισσότεροι ασθενείς που είναι HBV DNA θετικοί µε PCR, αλλά αρνητικοί µε bd N A έχουν βιοχηµικά και / ή ιστολογικά χαρακτηριστικά χρόνιας ηπατίτίδας Β.Οι περισσότεροι από αυτούς (το 85% )ανήκουν στην οµάδα της HBeAg 34

αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β. Όσον αφορά το γραµµικό εύρος των τιµών ποσοτικού προσδιορισµού του HBV DNA που επιτυγχάνεται µε τις δύο µεθόδους,το bd N A δεικνύει γραµµικότητα µεταξύ 6,5 και 9,5 log 10 Eq/mlενώ το Monitorµεταξύ 3,0 και 5,5 log 10 copies/ml. Πρόσφατα κυκλοφόρησε εµπορικά µία νέα έκδοση του Amplicor HBV M onitortm. Προσαρµόστηκε για αυτοµατοποιηµένη µέθοδο ποσοτικού προσδιορισµού στον αναλυτή Cobas A m plicortm.πλην όµως,το γραµµικό εύρος ανίχνευσης ελαττώθηκε µε την αυτοµατοποίηση σε µόνον 10 2 έως 10 5 copies/ml(2 log 10 copies/mlέως 5 log 10 copies/ml)αντί 400-10 5,5-7 copies/mlτης αρχικής,µε το χέρι,µεθοδολογίας 85. Το γεγονός ότι το γραµµικό δυναµικό εύρος ποσοτικής µέτρησης των δύο µεθόδων αλληλοεπικαλύπτεται είναι ενδεικτικό ότι µόνον η µία εκ των δύο δεν είναι επαρκής για την αξιόπιστη ποσοτικοποίηση του HBV DNA σε όλο το εύρος των τιµών που παρατηρούνται στην κλινική πράξη. Έως σήµερα, οι ποσοτικές µονάδες µέτρησης που χρησιµοποιούνται στις διαφορετικές µέθοδοι ποσοτικού προσδιορισµού του HBV DNA δεν αντιπροσωπεύουν την ίδια ποσότητα HBV DNA σε ένα κλινικό δείγµα.σύµφωνα µε την εµπειρία µας, οι µετρώµενες τιµές του HBV DNA είναι περίπου 1log 10 χαµηλότερες στο M onitorσυγκριτικά µε το bd N A. 6.3 ιάγνωση της HBVλοίµωξης. Η διάγνωση της οξείας ιογενούς ηπατίτιδας Β βασίζεται σε ορολογικές και όχι σε µοριακές µεθόδους ανίχνευσης του HBV DNA (πίνακας 2). Η χρόνια HBV λοίµωξη, χαρακτηρίζεται από την συνεχή παρουσία του HBsAg στον ορό επί 6 τουλάχιστον µήνες. Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισµός του HBV DNA χαρακτηρίζει σε αυτή την περίπτωση τον ενεργό πολλαπλασιασµό ή µη του HBV. Η ανίχνευση και η ποσοτική µέτρηση των HBV γονιδιωµάτων µε µεθόδους βασιζόµενες στην µοριακή βιολογία έχει χρησιµοποιηθεί σε ευρεία κλίµακα. Ο άµεσος προσδιορισµός του HBV DNA στον ορό αποτελεί την πιο αξιόπιστη παράµετρο για τον χαρακτηρισµό της HBV λοίµωξης και της απάντησης στην αντιϊκή θεραπεία.επιπλέον,η ποσοτική µέτρηση του HBV DNA παρέχει σηµαντικές πληροφορίες για τα επίπεδα του ιικού πολλαπλασιασµού και µπορεί να 35

χρησιµοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης της χρόνιας ηπατίτιδας Β ή ενδεικτική παράµετρος απάντησης σε αντιϊκή φαρµακευτική αγωγή. Η πλέον κατάλληλη µέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισµό του HBV DNA στον ορό µε σκοπό την χρήση του για την αρχική αξιολόγηση ασθενών µε χρόνια HBV λοίµωξη,δεν έχει ακόµη καθορισθεί. Μία τιµή HBV DNA > 10 5 copies /ml(10 5 αντίγραφα γονιδιώµατος / ml) έχει επιλεγεί αυθαίρετα ως διαγνωστικό κριτήριο για την χρόνια ηπατίτιδα Β στη συνάντηση συµφωνίας για την Ηπατίτιδα Β στο ΝΙΗ (2000) 64,73. Πολλά προβλήµατα όµως παραµένουν ακόµη και µε αυτό τον συναινετικό ορισµό 16. Πρώτον,στις µεθόδους υπάρχει έλλειψη κοινής πρότυπης µονάδας ποσότητας HBV DNA τυποποίησης (standardization). Συνεπώς οι µέθοδοι που εκφράζουν το αποτέλεσµά τους ως ένα αντίγραφο γονιδιώµατος/ ml(genom e/copy/ml) ή ένα ισοδύναµο γονιδιώµατος/ml(genom e Eq/ml)δεν µετρούν την ίδια ποσότητα DNA. εύτερον,ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β δυνατόν να έχουν κυµαινόµενα επίπεδα HBV DNA,τα οποία σε δεδοµένες φάσεις να ελαττώνονται σε επίπεδα < 10 5 copies/ml. Τρίτον,το όριο της ποσοτικής µέτρησης του HBV DNA που συσχετίζεται µε εξέλιξη της φυσικής πορείας της χρόνιας ηπατίτιδας Β παραµένει άγνωστος. Οι ποσοτικές µέθοδοι πολλαπλασιασµού του στόχου που βασίζονται στην ανταγωνιστική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (com petitive PCR),µπορούν να ανιχνεύσουν επίπεδα HBV DNA έως 10 2 copies/ml,αλλά τα αποτελέσµατα αυτά πρέπει να ερµηνεύονται µε επιφύλαξη λόγω της αβέβαιης κλινικής σηµασίας των χαµηλών επιπέδων του HBV DNA. Η αναλυτική ευαισθησία των µεθόδων βασιζόµενων στην PCR είναι σηµαντικά µεγαλύτερη από αυτή του bd N A.Συνεπώς οι µέθοδοι µε PCR µπορούν να ανιχνεύσουν πολύ µικρές ποσότητες HBV DNA σε ασθενείς µε κλινικά και / η βιοχηµικά ευρήµατα ενεργού HBV λοίµωξης.η αυξηµένη αναλυτική ευαισθησία των µεθόδων µε PCR είναι κλινικά σηµαντική, ιδιαίτερα για την ανίχνευση ιικού πολλαπλασιασµού σε ασθενείς µε HBeAg αρνητική χρόνια ηπατίτιδα Β,οι οποίοι έχουν χαµηλότερα επίπεδα ιικού πολλαπλασιασµού από τους ασθενείς µε HBeAg θετική χρόνια ηπατίτιδα Β. 36

Γενικά, οι µέθοδοι µε PCR έχουν αποδειχθεί στην πράξη υπερβολικά ευαίσθητες,διότι δύναται να ανιχνεύσουν HBV DNA σε 34% -64% των ατόµων σε φάση χρόνιας ανενεργού HBV λοίµωξης. Η συσχέτιση µεταξύ του ιικού φορτίου του HBV DNA µετρώµενου µε ποσοτική µέθοδο µε βάση την PCR και της ενεργότητας και του σταδίου της χρόνιας ηπατίτιδας Β έχει ήδη καταγραφεί,αλλά χρειάζεται επιβεβαίωση. Αποτελεί,αναγκαιότητα η διενέργεια µιας προοπτικής κλινικής µελέτης για τον καθορισµό του κλινικά σηµαντικού ορίου ιικού φορτίου του DNA του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV DNA)σε φορείς και ασθενείς µε HBV λοίµωξη αρνητικούς στο HBe αντιγόνο (µιας ποσοτικής τιµής ή ενός εύρους τιµών καθώς είναι πιθανή αλληλεπικάλυψη τιµών). Το κλινικά σηµαντικό όριο του ιικού φορτίου αποτελεί την τιµή του HBV DNA που θα διαχωρίζει τον σηµαντικό κλινικά ιϊκό HBV πολλαπλασιασµό σε: α)ασθενείς (HBV DNA> τιµής του ορίου)µε ενεργό πολλαπλασιασµό του HBV και συνοδό χρόνια ηπατίτιδα Β δυνητικά εξελισσόµενη µε ένδειξη για αντιϊκή θεραπεία και β)φορείς HBV (HBV DNA < τιµής του ορίου)χωρίς ενεργό λοίµωξη και χωρίς ένδειξη θεραπείας. Η διάγνωση της HBeAg θετικής χρονίας ηπατίτιδας Β τίθεται σε περίπτωση θετικού HBsAg και θετικού HBeAg για τουλάχιστον 6 µήνες, σταθερής ή διαλείπουσας αύξησης των τρανσαµινασών και παρουσίας H BV D N A >100.000 copies/mlστον ορό σε ασθενείς µε αντιρροπούµενη ηπατική νόσο.η επιβεβαίωση µε ηπατική βιοψία της διάγνωσης κρίνεται προαιρετική και δεν είναι απαραίτητη όταν δεν ενδείκνυται θεραπευτική αγωγή. Χρόνιος ανενεργός φορέας του HBV χαρακτηρίζεται ένας ασθενής που έχει: α)θετικό HBsAg,αρνητικό HBeAg και συνήθως θετικό anti-hbe τουλάχιστον από 6µήνου,β)σταθερά φυσιολογικές αµινοτρανσφεράσες (τουλάχιστον 3 µετρήσεις ανά 1-3 µήνες σε διάστηµα 12 µηνών),γ)χαµηλά επίπεδα HBV DNA ορού (<100,000 copies/ml),δ)απουσία εκδηλώσεων και εργαστηριακών ευρηµάτων συµβατών µε χρονία ηπατική νόσο (π.χ.σπληνοµεγαλία,ηπατικές παλάµες,αγγειωµατώδεις σπίλοι, θροµβοπενία,υπεργαµµασφαιριναιµία).το όριο των 100,000 copies/ml έχει επιλεγεί αυθαίρετα και κατά κανόνα οι χρόνιοι ανενεργοί φορείς του HBsAg έχουν πολύ χαµηλά επίπεδα HBV DNA ορού (<30,000 copies/ml) 74. Οι χρόνιοι ανενεργοί φορείς του HBsAg δεν θα πρέπει να υποβάλλονται σε βιοψία ήπατος ή θεραπεία,αλλά θα πρέπει να παρακολουθούνται προσεκτικά γιατί 37

υπάρχει πιθανότητα µεταπτώσεώς τους σε χρονία ηπατίτιδα Β (συνήθως H B ea g- αρνητική). Η παρακολούθησή τους συνιστάται να γίνεται µε έλεγχο ALT/AST και ηµιποσοτικό προσδιορισµό IgM anti-hbc ανά 2-3µηνο τα πρώτα 2 χρόνια και ανά 6-12 µήνες στη συνέχεια.σε περίπτωση παθολογικών τιµών ALT/AST και/ή IgM anti- HBc>0.250 θα πρέπει να γίνεται έλεγχος επιπέδων HBV-DNA ορού και βιοψία ήπατος. ιάγνωση HBeAg αρνητικής χρονίας ηπατίτιδας Β τίθεται σε ασθενείς µε αντιρροπούµενη ηπατική νόσο και α)θετικό HBsAg,αρνητικό HBeAg και συνήθως θετικό anti-hbe τουλάχιστον από 6µήνου, β) σταθερή η διαλείπουσα αύξηση αµινοτρανσφερών (AST, ALT), γ) υψηλά επίπεδα HBV-DNA ορού ( 100,000 copies/ml)και δ) ιστολογικές αλλοιώσεις χρόνιας ηπατίτιδας. Η επιβεβαίωση µε ηπατική βιοψία της διάγνωσης κρίνεται απαραίτητη,λόγω της δυνητικά διαλείπουσας ενεργότητας της νόσου, µε περιόδους αυτοµάτων µακράς διαρκείας υφέσεων. Οι ασθενείς αυτοί έχουν ανιχνεύσιµο HBV-DNA ορού, µε διακυµάνσεις σηµαντικού βαθµού.εποµένως,τα κριτήρια α,β και δ σε συνδυασµό µε ανιχνεύσιµο HBV-DNA στον ορό τεκµηριώνουν τη διάγνωση. Οι ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β συνήθως έχουν IgM anti-hbc>0.250. Ειδικοί ορολογικοί δείκτες HBV λοίµωξης HBsAg (-)/Aντι-HBc(+) Στη πλειοψηφία των περιπτώσεων (90-95% ), άτοµα που παρουσιάζουν HBsAg(-)/Aντι-HBc(+) εµφανίζουν παράλληλα αντισώµατα έναντι του HBsAg, υποδηλώνοντας παλαιά HBV λοίµωξη.στο 5-10% των ασθενών,το αντι-hbc είναι ο µόνος ορολογικός δείκτης HBV λοίµωξης. Η συχνότητα ανίχνευσης µόνο αντι-hbc φαίνεται να είναι ανάλογη του επιπολασµού της HBV λοίµωξης στον µελετόµενο πληθυσµό.σε πρόσφατη µελέτη από τον Ελληνικό χώρο, σε 10.000 αιµοδοτών από τους οποίους περίπου 15% εµφάνιζε ορολογικούς δείκτες HBV λοίµωξης,5% ήταν θετικό µόνο στο αντι-hbc. Σε πληθυσµούς µε χαµηλό επιπολασµό HBV λοίµωξης,όπως οι ΗΠΑ η παρουσία µόνο αντι-hbc, συνήθως αποτελεί ψευδώς θετικό εύρηµα. Χορήγηση εµβολίου έναντι του HBV σε αυτά τα άτοµα οδηγεί στην ανάπτυξη αντι-hbs αντισωµάτων µε χαρακτήρες πρωτογενούς απάντησης. 38

Αντίθετα, σε περιοχές µε µέτρια ή υψηλή συχνότητα HBV λοίµωξης, η παρουσία αντι-hbc υποδηλώνει συνήθως παλαιά HBV λοίµωξη. Σε αυτές τις περιπτώσεις,αντι-hbs αντισώµατα δεν αναπτύσσονται από την αρχή ή ο τίτλος τους σταδιακά µειώνεται µε την πάροδο του χρόνου.τα άτοµα αυτά µπορεί να εµφανίζουν ή όχι αντι-hbe αντισώµατα. Αντι-HBc µπορεί να αποτελεί τον µόνο ορολογικό δείκτη πρόσφατης οξείας HBV λοίµωξης κατά τη περίοδο του «παραθύρου» όπου HBsAg και αντι-hbs είναι αρνητικά. Σπανιότερα, αντι-hbc αντισώµατα µπορεί να είναι ενδεικτικά µιας υποκείµενης χρονίας HBV λοίµωξης (0-10% ), όπως αυτό αποδεικνύεται µε την ανίχνευση του HBV DNA µε ευαίσθητες τεχνικές (π.χ PCR). Σε αυτές τις περιπτώσεις, η απουσία HBsAg αποτελεί ένα «ψευδώς» ή «αληθώς» αρνητικό εύρηµα.«ψευδώς» HBsAg (-)παρατηρείται σε περιπτώσεις µε πολύ χαµηλά επίπεδα ιαιµίας και αντίστοιχα χαµηλά επίπεδα HBsAg κάτω από τα όρια ευαισθησίας των µεθόδων ανίχνευσης.παρόµοια,µεταλλαγές στη σταθερή αντιγονική περιοχή «a» του HBsAg οδηγούν σε αδυναµία ανίχνευσής τους µε τις συνήθεις µεθόδους. Αντίθετα,η απουσία HBsAg είναι ένα «αληθινό» εύρηµα σε περιπτώσεις HIV ή/και HCV συλλοίµωξης που οδηγούν σε µειωµένο πολλαπλασιασµό του HBV ή σπανιότερα είναι δυνατόν να οφείλεται σε µεταλλαγές συγκεκριµένων περιοχών του HBV γονιδιώµατος που προκαλούν µειωµένη παραγωγή ή έκφραση του HBsAg. Σε αντι-hbc (+) άτοµα µε υποκείµενη χρονία HBV λοίµωξη, τα επίπεδα ιαιµίας είναι συνήθως χαµηλά (<10 4 copies/ml)και η κλινική του σηµασία πιθανώς περιορισµένη.περιπτώσεις µετάδοσης του ιού από HBsAg (-)/anti-hbc (+)άτοµα έχουν περιγραφεί στη διεθνή βιβλιογραφία µετά από µετάγγιση αίµατος,µεταµόσχευση οργάνων και σεξουαλική επαφή.η κλινική σηµασία θετικού αντι-hbc περιορίζεται σε ανοσοκατασταλµένους ασθενείς,δότες συµπαγών οργάνων ή µυελού των οστών καθώς και σε ασθενείς µε χρόνια ηπατική νόσο. Για τους λόγους αυτούς σε αρκετές χώρες συµπεριλαµβανόµενης και της Ελλάδος, έχει καθιερωθεί ο υποχρεωτικός έλεγχος των αιµοδοτών για αντι-hbc. Η µελέτη µεγαλυτέρων πληθυσµιακών οµάδων µε ευαίσθητες µεθόδους ανίχνευσης HBV DNA θα συµβάλλει σηµαντικά στην εξακρίβωση της έκτασης του φαινοµένου και της κλινικής του σηµασίας. 39

Μεταλλαγές HBsAg Μεταλλαγµένα στελέχη στη περιοχή του HBsAg αναπτύσσονται στις ακόλουθες περιπτώσεις : 1) Μετά από εµβολιασµό 2) Μετά από χορήγηση ανοσοσφαιρίνης (HBIG)σε ασθενείς που υποβλήθηκαν σε µεταµόσχευση. 3) Σε χρονία HBV λοίµωξη µε ή χωρίς λήψη ανοσοκατασταλτικών παραγόντων Οι µεταλλαγές αυτές επικεντρώνονται στη περιοχή του HBsAg µεταξύ των αµινοξέων 100-160 και αφορούν κυρίως τη σταθερή περιοχή «a,a a 139-147».Η κλινική σηµασία βασίζεται σε δύο λόγους.πρώτον,για διαγνωστικούς σκοπούς διότι µεταλλαγές στη περιοχή «a» µπορεί να οδηγήσουν σε αδυναµία ανίχνευσης του HBsAg µε τις συνήθεις εργαστηριακές µεθόδους. Στη κατηγορία αυτή υπάγονται ασθενείς µε χρονία HBV λοίµωξη που είναι HBsAg (-)/αντι-hbc(+). εύτερον,για επιδηµιολογικούς σκοπούς αφού µεταλλαγµένα στελέχη που δεν αναγνωρίζονται από τα προστατευτικά αντι-hbs αντισώµατα µπορούν να µεταδοθούν σε ασθενείς που έχουν ήδη υποβληθεί σε εµβολιασµό.οι µεταλλαγές αυτές αναπτύσσονται συνήθως σε πληθυσµούς που υποβάλλονται σε µαζικό εµβολιασµό και αποτελούν µεταλλαγές από διαφυγή («escape mutations»).η πιο συχνή µεταλλαγή αφορά τη µετατροπή γλυκίνης σε αργινίνη στο αµινοξύ 145(G 145R).Χαρακτηριστική είναι η περίπτωση της Ταϊβάν όπου µετά την καθιέρωση µαζικού εµβολιασµού το 1984, ο αριθµός των µεταλλαγµένων HBsAg στελεχών αυξήθηκε από 8% (προ εµβολιασµού)σε 28% (10 χρόνια µετά). Η συχνότητα και οι πιθανές κλινικές επιπτώσεις των HBsAg µεταλλαγών δεν έχουν µελετηθεί επαρκώς στον Ελληνικό χώρο. HBsAg (+)/Αντι-HBc(-) Η παρουσία των ανωτέρω ορολογικών δεικτών σε ασθενείς µε HBV λοίµωξη είναι σχετικά σπάνια και αφορά στις εξής περιπτώσεις: 1)Στο αρχικό στάδιο της οξείας ηπατίτιδας Β,πριν την ανάπτυξη IgM αντι-hbc 2)Στους ασθενείς µε χρονία λοίµωξη που λαµβάνουν ανοσοκατασταλτική αγωγή. Στις περιπτώσεις αυτές ανίχνευση του HBV DNA στον ορό επιβεβαιώνει την ύπαρξη υποκείµενης HBV λοίµωξης. 40

HBsAg (+)/Αντι-HBs(+) Ταυτόχρονη ανίχνευση HBsAg και αντι-hbs αντισωµάτων παρατηρείται στις ακόλουθες φάσεις της οξείας ή χρονίας HBV λοίµωξης. 1) Στάδιο της οροµετατροπής από HBsAg σε αντι-hbs της οξείας ηπατίτιδας Β. 2) Χρονία ηπατίτιδα B (20-40% ), όπου κυκλοφορούν µε τη µορφή ανοσοσυµπλεγµάτων 3)Λοίµωξη εµβολιασθέντων ατόµων από µεταλλαγµένα HBsAg στελέχη. HBsAg (-)/Αντι-HBs(+)/αντι-HBc(-) Η πλειοψηφία των ατόµων µε παρόµοια ορολογική εικόνα έχουν υποβληθεί σε εµβολιασµό στο παρελθόν.σε σπάνιες περιπτώσεις µη εµβολιασθέντων ατόµων, η ανίχνευση αντι-hbs αντισωµάτων µόνο αποτελεί ένα ψευδώς θετικό εύρηµα ή υποδηλώνει παλαιά HBV λοίµωξη µε σταδιακή απώλεια των αντι-hbc/e αντισωµάτων. HBsAg(-)/Aντι-HBs(-)/αντι-HBc(-)/HBV DNA(+) Στις περισσότερες περιπτώσεις η ανίχνευση HBV DNA µε αρνητικούς τους ορολογικούς δείκτες HBV λοίµωξης,αποτελεί ένα ψευδώς θετικό εύρηµα ιδιαίτερα όταν ο προσδιορισµός του HBV DNA έχει γίνει µε τη µέθοδο της PCR.Σπανιότερα, έχουν µεταγραφεί µεταλλαγές του HBV γονιδιώµατος που προκαλούν σηµαντική µείωση της αναπαραγωγής και έκφρασης των αντιγόνων του ιού HBsAg/HBcAg. 41

Πίνακας 2.Τυπικοί ορολογικοί δείκτες HBV λοίµωξης ΤΥΠΙΚΟΙ ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΕΙΚΤΕΣ HBV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Χρόνια HBVλοίµωξη Οξεία Παρελθούσα HBeAg(+) Φάση Αντι-HBe(+) HBV κάθαρσης- Ηπατίτιδα Β λοίµωξη φάση οροαναστροφής Ανενεργός Χρόνια ηπατίτιδα HBsAg + - + + + + Αντι-HBs - +/- - - - - Αντι-H Bc + + + + + + IgM anti-hbc + ( ) - +( ) +( ) - +( - ) HBeAg + - + + - - Αντι-HBe - +/- - -/+ + + ALT Φυσ Φυσ - Φυσ - 42

Πίνακας 3:Εµπορικά διαθέσιµοι µέθοδοι ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού του HBV DNA Κατασκευαστής Μεθοδολογία Αρχή µεθόδου υναµικό εύρος ποσοτικής µέτρησης Digene Corp.,Gaithersburg, Maryland,US HBV Digene Hybrid-Capture TM I Πολλαπλασιασµός σήµατος (Hybrid-Capture)σε σωληνάρια 700,000-560,000,000 copies/ml HBV Digene Hybrid-Capture TM ΙΙ Πολλαπλασιασµός σήµατος (Hybrid-Capture)σε µικροπλάκες 142,000-1,700,000 copies/ml Ultra-sensitive HBV Digene Hybrid- Capture TM ΙΙ Πολλαπλασιασµός σήµατος (Hybrid-Capture)σε µικροπλάκες µετά φυγοκέντρηση 4,700-57,000,000 copies/ml Roche M olecularsystem s, Pleasanton,California,USA AmplicorHBV Monitor TM Ποσοτική PCR (χειρός) 1,000-40,000,000 copies/ml Cobas AmplicorHBV Monitor TM Ηµιαυτοποιηµένη ποσοτική PCR 200-200,000 copies/ml BayerCorporation Tarrytow n, New York,USA Versant TM HBV DNA 1.0 A ssay Πολλαπλασιασµός σήµατος (branched DNA)-χειρός 700,000-5,000,000,000 genom e equivalents/m l Versant TM HBV DNA 3.0 A ssay Πολλαπλασιασµός σήµατος (branched DNA)-ηµιαυτοποιηµένo Υπό ανάπτυξη-αναλυτική ευαισθησία (600-1000 IU/ml) 43

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΤΩΝ ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ Γενικές έννοιες -Ορισµοί Οι µέθοδοι για την ανίχνευση και ποσοτική µέτρηση του HBV-DNA έχουν ωρισµένα χαρακτηριστικά,που καθορίζουν την καταλληλότητα και αξιοπιστία τους στην κλινική χρήση.πρέπει όµως να υπογραµµισθεί,ότι η κλινικά αποδεκτή χρήση µιας δεδοµένης µεθόδου εξαρτάται όχι µόνον από την καταλληλότητά της,αλλά και από τα χαρακτηριστικά του σταδίου της χρόνιας ηπατίτιδας B. α)αναλυτική ευαισθησία Η αναλυτική ευαισθησία µιας µεθόδου υποδεικνύεται από το όριο ποσοτικής ανίχνευσης του HBV-DNA, δηλαδή την µικρότερη ποσότητα αριθµού ιικών σωµατιδίων ή γονιδιωµάτων που προσδιορίζονται µε αξιοπιστία.σε αντιδιαστολή,η κλινική ευαισθησία µιας µεθόδου ορίζεται από την ικανότητά της ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού του ιικού φορτίου που έχουν κλινική σηµασία και δυνατόν να χαρακτηρίζουν τα κλινικά στάδια της χρόνιας ηπατίτιδας Β µε θετικό HBV-DNA. Η κλινική ευαισθησία µιας µεθόδου εξαρτάται από την αναλυτική ευαισθησία, η οποία οπωσδήποτε πρέπει να υπερβαίνει την προσδοκώµενή της κλινική ευαισθησία. β)ειδικότητα Η ειδικότητα µιας µεθόδου ορίζεται σαν η ικανότητά της να δίδει αρνητικό αποτέλεσµα σε δείγµα που δεν περιέχει HBV-DNA.Κάθε αύξηση της ευαισθησίας µιας µεθόδου συχνά έχει ως αποτέλεσµα σχετική απώλεια της ειδικότητας. Η οριοθέτηση της πλέον δόκιµης ισορροπίας µεταξύ των δύο αυτών παραµέτρων πρέπει να ευρεθεί στο ειδικό πλαίσιο της νόσου και των ενδείξεων της µεθόδου. γ)προγνωστική αξία Η προγνωστική αξία µιας µεθόδου ορίζεται η ικανότητά της να δίδει αποτελέσµατα σύµφωνα µε την παρατηρούµενη βιολογική πραγµατικότητα. Η θετική και η αρνητική προγνωστική αξία είναι η πιθανότητα ότι ένα θετικό ή αρνητικό αποτέλεσµα είναι αντίστοιχα ορθό.με τις ποσοτικές µεθόδους,η προγνωστική αξία µερικά εξαρτάται από τον ακριβή προσδιορισµό τιµών HBV-DNA που αντιστοιχούν σε όρια ιικού φορτίου κλινικά σηµαντικά. δ)αναπαραγωγιµότητα 44

Η αναπαραγωγιµότητα µιας µεθόδου ελέγχεται µε διάφορους τρόπους, όπως µε καθορισµό της εντός προσδιορισµού αναπαραγωγιµότητας (ακρίβεια)και της µεταξύπροσδιορισµών αναπαραγωγιµότητας.η µεταβλητότητα τιµών προσδιορισµού µιας µεθόδου εκφράζεται µε τον συντελεστή µεταβλητότητας (coefficient of variation) ή µια σταθερή απόκλιση (SD ),µετά από πολλαπλούς προσδιορισµούς του HBV-DNA των δειγµάτων.η ενδογενής µεταβλητότητα τιµών προσδιορισµού µιας ποσοτικής µεθόδου πρέπει να είναι καθορισµένη,ώστε,να αποφεύγεται η εσφαλµένη ερµηνεία µικρών διακυµάνσεων (έως 0,5 log)των τιµών του ιικού φορτίου σε συνάρτηση µε το χρόνο ως στατιστικά σηµαντική. ε)γραµµικότητα των ποσοτικών µεθόδων Το γραµµικό ή δυναµικό εύρος τιµών µιας ποσοτικής µεθόδου είναι το εύρος των τιµών του HBV-DNA εντός του οποίου ο ποσοτικός προσδιορισµός παραµένει γραµµικός.κάθε τιµή του φορτίου εκτός του γραµµικού εύρους θεωρείται σφάλµα (υπέρ-ή υποεκτιµώµενη τιµή).είναι ιδιαίτερα σηµαντική η γνώση του ανώτερου και κατώτερου ορίου του γραµµικού εύρους τιµών,ιδίως όταν οι κλινικές αποφάσεις βασίζονται σε ακριβή επίπεδα ιικού φορτίου. ζ)ακρίβεια (accuracy) Ορίζεται ως η θετική προγνωστική αξία της µεθόδου ποσοτικού προσδιορισµού για την πραγµατική αντικειµενικά µετρώµενη τιµή ιϊκού φορτίου.πολλές παράµετροι σχετικές µε τα ιολογικά χαρακτηριστικά,τις ενδογενείς ιδιότητες των µεθόδων και τις συνθήκες συλλογής και αποθήκευσης των δειγµάτων, δυνατόν να επιδρούν στην ακρίβεια της µεθόδου. 45

7.Θεραπεία της HBeAg αρνητικής χρόνιας ηπατίτιδας Β 7.1 Ενδείξεις θεραπείας Η διάγνωση HBeAg αρνητικής χρονίας ηπατίτιδας Β τίθεται σε ασθενείς µε αντιρροπούµενη ηπατική νόσο και α)θετικό HBsAg,αρνητικό HBeAg και συνήθως θετικό anti-hbe τουλάχιστον από 6µήνου,β)αυξηµένες αµινοτρανσφεράσες (AST, ALT),γ)υψηλά επίπεδα HBV-DNA ορού ( 100,000 copies/ml)και δ)ιστολογικές αλλοιώσεις χρονίας ηπατίτιδας.η βιοψία ήπατος είναι απαραίτητη για τη διάγνωση της HBeAg αρνητικής χρονίας ηπατίτιδας Β.Οι ασθενείς αυτοί έχουν ανιχνεύσιµο HBV-DNA ορού,µε διακυµάνσεις).εποµένως,τα κριτήρια α,β και δ σε συνδυασµό µε ανιχνεύσιµο HBV-DNA στον ορό τεκµηριώνουν τη διάγνωση.οι ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β συνήθως έχουν IgM anti-hbc>0.250. Ένδειξη θεραπείας έχουν όλοι οι ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β και µετρίου βαθµού νεκροφλεγµονώδη δραστηριότητα και/ή µετρίου βαθµού ίνωση στη βιοψία ήπατος. Σε αντίθεση µε την HBeAg-θετική χρονία ηπατίτιδα Β,τα επίπεδα ALT/AST δεν επηρεάζουν την ένδειξη για θεραπεία σε αυτή την οµάδα ασθενών.η ένδειξη για θεραπεία δεν επηρεάζεται επίσης από τα επίπεδα του ανιχνευόµενου HBV-DNA ορού ή IgM anti-hbc. 7.2 Αρχικά θεραπευτικά σχήµατα Eγκεκριµένες µορφές θεραπείας για ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β είναι η ιντερφερόνη (ΙFN -α),η λαµιβουδίνη και η διπιβαλική αδεφοβίρη. Κύριος στόχος της θεραπείας είναι η συνδυασµένη βιοχηµική και ιολογική µακροχρόνια απάντηση,που αξιολογείται ως ύφεση της νόσου κατά τη διάρκεια της θεραπείας και κυρίως η διατήρηση της ύφεσης µετά τη διακοπή της θεραπείας.τα κριτήρια της ύφεσης είναι α)φυσιολογικές τιµές ALT/AST και β)µη ανιχνεύσιµα ή χαµηλά επίπεδα HBV-DNA ορού (<100,000 copies/ml). Πλήρης ανταπόκριση θεωρείται η βιοχηµική και ιολογική µακροχρόνια απάντηση και η οροµετατροπή του HBsAg µε ανάπτυξη anti-hbs 86-96. Η IFN -α είναι η µόνη µορφή θεραπείας που επιτυγχάνει συνδυασµένη µακροχρόνια ανταπόκριση σε περίπου 15% -25% των ασθενών µε HBeAg αρνητική 46

χρονία ηπατίτιδα Β.Παράγοντες (προ θεραπείας ή κατά την έναρξη της θεραπείας) που να σχετίζονται ή να προβλέπουν την πιθανότητα ανταποκρίσεως δεν έχουν προσδιορισθεί. Η λαµιβουδίνη επιτυγχάνει βιοχηµική (φυσιολογικές ALT/AST)και ιολογική (µη ανιχνεύσιµο HBV-DNA ορού) ύφεση στην πλειονότητα (>65% ) των ασθενών κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους θεραπείας,αλλά µικρό ποσοστό (<15% ) των ασθενών θα παραµείνει σε µακροχρόνια συνδυασµένη ανταπόκριση µετά την πιθανή διακοπή χορηγήσεως του φαρµάκου.η διπιβαλική αδεφοβίρη επιτυγχάνει βιοχηµική και ιολογική ύφεση στην πλειονότητα (περίπου 70% )των ασθενών κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους θεραπείας,αλλά δεν υπάρχουν δεδοµένα για ποσοστά διατηρήσεως µακροχρόνιας συνδυασµένης ανταποκρίσεως µετά την διακοπή χορηγήσης. Η Ιντερφερόνη α (IFN -α) εκτός των αντενδείξεων χορηγήσεως αποτελεί την πρώτη θεραπευτική επιλογή για πρωτοθεραπευόµενους ασθενείς µε HΒeA g-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β. Εντούτοις, ο ασθενής, αφού ενηµερωθεί για τα πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα της IFN -α, λαµιβουδίνης και διπιβαλικής αδεφοβίρης, συµµετέχει στην επιλογή της µορφής θεραπείας 97-109.Η IFN -α σε ενήλικες ασθενείς της οµάδος αυτής θα πρέπει να χορηγείται σε δόση 3-6 ΜU τρεις φορές την εβδοµάδα για τουλάχιστον 12 µήνες.ανέκδοτες πρακτικές µε µακροχρόνια παρατεταµένη θεραπεία µε µικρότερες δόσεις IFN -α σε ασθενείς µε αρχική (συνήθως βιοχηµική) ανταπόκριση δεν αποτελούν τεκµηριωµένη ιατρική πρακτική και δεν πρέπει να εφαρµόζονται εκτός κλινικών δοκιµών.η λαµιβουδίνη χορηγείται σε ηµερήσια δόση 100 m g για µεγάλο χρονικό διάστηµα (>12 µήνες), αλλά η ιδανική διάρκεια χορηγήσεώς της δεν έχει διευκρινιστεί.ηβea g αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β είναι σπάνια σε παιδιά. Η διπιβαλική αδεφοβίρη χορηγείται σε ηµερήσια δόση 10 m g επίσης για µεγάλο χρονικό διάστηµα (>12 µήνες) χωρίς να έχει διευκρινιστεί η κατάλληλη διάρκεια χορηγήσεώς της. 7.3 Επαναληπτικά θεραπευτικά σχήµατα Αποτυχία σε προηγούµενη θεραπεία µε IFN -α δεν επηρεάζει την πιθανότητα ανταποκρίσεως του ασθενούς σε νέα θεραπεία µε το ίδιο ή άλλο φάρµακο.αποτυχία µε ανάπτυξη αντοχής σε προηγούµενη θεραπεία µε λαµιβουδίνη δεν επηρεάζει την πιθανότητα ανταποκρίσεως του ασθενούς σε νέα θεραπεία µε IFN -α ή διπιβαλική αντεφοβίρη,αλλά ουσιαστικά αποτρέπει την επαναθεραπεία µε λαµιβουδίνη λόγω αναµενόµενης ταχύτατης αναπτύξεως αντοχής.αρχικά δεδοµένα υποστηρίζουν ότι 47

αποτυχία µε ανάπτυξη αντοχής σε προηγούµενη θεραπεία µε διπιβαλική αδεφοβίρη δεν επηρεάζει την πιθανότητα ανταποκρίσεως του ασθενούς σε νέα θεραπεία µε λαµιβουδίνη και ίσως µε IFN -α, αλλά λογικά αποτρέπει την επαναθεραπεία µε διπιβαλική αντεφοβίρη. Εποµένως, σε ασθενή µε HBeAg-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β που δεν ανταποκρίθηκε σε αρχικό σχήµα µε IFN -α και έχει ένδειξη θεραπείας χορηγείται νέο σχήµα µε IFN -α,λαµιβουδίνη ή διπιβαλική αδεφοβίρη σε δόσεις ίδιες µε αυτές των αρχικών σχηµάτων. Η επιλογή IFN -α, λαµιβουντίνης ή διπιβαλικής αδεφοβίρης επηρεάζεται από τα προαναφερθέντα πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα των φαρµάκων,αλλά συχνά οι ασθενείς δεν επιθυµούν να λάβουν εκ νέου IFN -α στην οποία δεν είχαν ανταποκριθεί στο παρελθόν.σε ασθενή που δεν ανταποκρίθηκε σε αρχικό σχήµα µε λαµιβουδίνη και έχει ένδειξη θεραπείας είναι δυνατόν να χορηγηθεί σχήµα µε IFN -α ή διπιβαλική αδεφοβίρη σε δόσεις ίδιες µε αυτές των αρχικών σχηµάτων. Σε ασθενείς µε ΗΒeA g-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β, η θεραπεία µε λαµιβουδίνη χορηγείται κατά κανόνα επί 12 ή περισσότερους µήνες.οι κύριοι στόχοι της µακροχρόνιας χορηγήσεως λαµιβουδίνης είναι η διατήρηση της βιοχηµικής και ιολογικής υφέσεως υπό θεραπεία και η βελτίωση ή η µη επιδείνωση των ιστολογικών αλλοιώσεων ήπατος. Μακροχρόνια χορήγηση λαµιβουδίνης έχει σαφή ένδειξη σε ασθενείς µε ΗΒeA g-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β και µετρίου ή σοβαρού βαθµού ίνωση.η µακροχρόνια χορήγηση λαµιβουδίνης είναι ανεκτή και έχει σχετικά χαµηλό κόστος, αλλά σχετίζεται µε προοδευτικά αυξανόµενη ανάπτυξη YM DD µεταλλαγµένων HBV στελεχών και βιοχηµικών διαφυγών,που τον τέταρτο χρόνο θεραπείας είναι άνω το 60% 110-115. Εντούτοις, ένα ποσοστό (30-40% ) ασθενών εξακολουθεί να παραµένει σε πλήρη βιοχηµική,ιολογική και ιστολογική ύφεση κατά τον τέταρτο χρόνο θεραπείας µε λαµιβουδίνη και σαφέστατα ωφελείται από την αγωγή αυτή. Η διαθεσιµότητα διπιβαλικής αδεφοβίρης, ενός φαρµάκου αποτελεσµατικού εναντίον των ανθεκτικών στη λαµιβουντίνη HBV στελεχών, περιορίζει τα προβλήµατα από την ανάπτυξη αντοχής µε τη µακροχρόνια θεραπεία µε λαµιβουδίνη 116-122. Πρόσφατα δεδοµένα δείχνουν ότι η παράταση της θεραπείας µε διπιβαλική αδεφοβίρη πέραν των 12 µηνών σε ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β διατηρεί τα ποσοστά βιοχηµικής και ιολογικής υφέσεως του πρώτου χρόνου (70-75% ) και κατά το δεύτερο χρόνο θεραπείας χωρίς σηµαντικά προβλήµατα ανοχής, 48

ασφάλειας και ιικής αντοχής (ιική αντοχή,ν236τ,σε <2% -2.5% των περιπτώσεων στις 96 εβδοµάδες θεραπείας µε αδεφοβίρη). Παρά τα πλεονεκτήµατα της διπιβαλικής αδεφοβίρης ως µακροχρόνια θεραπεία συντηρήσεως (ασφάλεια, διατήρηση ανταποκρίσεως,σπάνια ιική αντοχή),το πολύ υψηλό κόστος της σε σχέση µε τη λαµιβουδίνη (στη χώρα µας περίπου 10πλάσιο)αποτρέπουν την επιλογή της ως αρχική θεραπεία συντηρήσεως και πιθανόν την περιορίζουν ως επιλογή για τις αποτυχίες της λαµιβουδίνης. 7.4 Παρακολούθηση ασθενών κατά της διάρκειας θεραπείας και µετά τη διακοπή Κατά τη διάρκεια της θεραπείας,οι ασθενείς µε HBeAg αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β πρέπει να ελέγχονται όπως και οι ασθενείς µε HBeAg θετική χρονία ηπατίτιδα Β. Οσοι λαµβάνουν IFN -α πρέπει να υποβάλλονται σε µηνιαίο έλεγχο µε γενική αίµατος και ALT/AST,ενώ οι ασθενείς υπό θεραπεία µε λαµιβουδίνη πρέπει να υποβάλλονται σε ανά 3µηνο έλεγχο ALT/AST,αµυλάσης,LDH,CPK.Οι ασθενείς που λαµβάνουν διπιβαλική αδεφοβίρη πρέπει να υποβάλλονται σε ανά 3µηνο έλεγχο ALT/AST, κρεατινίνης και φωσφόρου ορού. Έλεγχος για HBV-DNA ορού µε έγκυρη και ευαίσθητη µέθοδο (π.χ µε ποσοτική PCR) θα πρέπει να γίνεται στο τέλος της θεραπείας ή στους 12 µήνες παρατεταµένης θεραπείας µε λαµιβουδίνη ή διπιβαλική αδεφοβίρη. Πιθανές υποτροπές παρουσιάζονται συνηθέστερα τους πρώτους 12 µήνες µετά τη διακοπή της θεραπείας,αλλά είναι δυνατόν να εµφανισθούν και αργότερα ακόµη και µετά 2 έτη 4.Οι ασθενείς µε HBeAg αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β και συνδυασµένη βιοχηµική και ιολογική ανταπόκριση στη θεραπεία πρέπει να παρακολουθούνται επί µακρόν,τουλάχιστον 24 µήνες µετά τη διακοπή της θεραπείας,µε ανά 3µηνο έλεγχο ALT/AST.Επαναληπτικός έλεγχος για HBV-DNA ορού είναι χρήσιµο αλλά όχι επαρκώς τεκµηριωµένο,να γίνεται στους 24 µήνες από τη διακοπή της θεραπείας. Ασθενείς µε µακροχρόνια βιοχηµική και ιολογική ανταπόκριση στη θεραπεία παρακολουθούνται στη συνέχεια µε ανά 6µηνο έλεγχο ALT/AST και HBsAg/anti- HBs µέχρι την αρνητικοποίηση του HBsAg και ανάπτυξη anti-hbs (πλήρης ανταπόκριση). Ασθενείς χωρίς συνδυασµένη ανταπόκριση στη θεραπεία παρακολουθούνται ως µη θεραπευθέντες ασθενείς και επαναξιολογούνται για νέα θεραπευτική παρέµβαση. 49

Ασθενείς που λαµβάνουν µακροχρόνια (>12 µήνες)θεραπεία µε λαµιβουδίνη και παρουσιάζουν αύξηση ALT/AST στο συνήθη ανά 3µηνο έλεγχο θα πρέπει να ελέγχονται µε ALT/AST ανά µήνα και µε εκτίµηση των επιπέδων HBV-DNA ορού. Οι ασθενείς που παρουσιάζουν ALT/AST 2xΑ.Φ.Τ.και/ή HBV-DNA ορού 100,000 copies/ml και/ή σοβαρού βαθµού ίνωση ή κίρρωση θα πρέπει να λαµβάνουν θεραπεία µε διπιβαλική αδεφοβίρη,που να είναι αποτελεσµατική σε HBV ανθεκτικά στη λαµιβουδίνη στελέχη. Αντίθετα, δεν είναι σαφές ποια είναι η ορθότερη αντιµετώπιση των ασθενών µε επίµονη αύξηση ALT/AST<2xΑ.Φ.Τ.,επίπεδα HBV- DNA ορού<100,000 copies/ml και ήπιου ή µέτριου βαθµού ίνωση,αν δηλαδή µπορεί να συνεχίζουν τη θεραπεία µε λαµιβουδίνη µε µηνιαία παρακολούθηση ή αν πρέπει να λαµβάνουν θεραπεία µε διπιβαλική αδεφοβίρη. Η χρησιµότητα των τακτικών προσδιορισµών HBV-DNA ορού σε ασθενείς σε βιοχηµική ύφεση κατά τη διάρκεια µακροχρόνιας θεραπείας µε λαµιβουδίνη δεν είναι τεκµηριωµένη. 7.5 Νέες θεραπευτικές στρατηγικές και προοπτικές Οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές για τη χρόνια ηπατίτιδα B,HBeAg-ve,πέρα από την IFN -α,τη λαµιβουδίνη και την διπιβαλική αδεφοβίρη,οι οποίες βρίσκονται υπό τρέχουσα αξιολόγηση περιλαµβάνουν πολλά νεώτερα κυρίως νουκλεοσιδικά ανάλογα,ανοσορρυθµιστικά φάρµακα,καθώς και συνδυασµούς φαρµάκων 123-128. Μεταξύ των νεώτερων νουκλεοσιδικών αναλόγων,η µονοθεραπεία µε εντεκαβίρη έχει παρατηρηθεί να είναι αποτελεσµατική για την θεραπεία της XHB,HBeA g+ve και HBeAg-ve,σε µεγάλες πρόσφατες κλινικές µελέτες φάσης III.Η εµτρισιταµπίνη, η κλεβουντίνη,η β L-δεοξυθυµιδίνη υφίστανται µελέτες θεραπευτικής παρέµβασης φάσης III,όπως και το νουκλεοτιδικό ανάλογο τενοφοβίρη. Τα αρχικά αποτελέσµατα όσον αφορά παρεµβάσεις µε ανοσορρυθµιστικά φάρµακα (ιντερλευκίνη-2, ιντερλευκίνη-12, ιντερφερόνη-γ ή θεραπευτικά εµβόλια) είναι σχετικά µη ικανοποιητικά,ενώ τα αποτελέσµατα απο την χρήση της θυµοσίνης είναι µάλλον αµφιλεγόµενα. Η µονοθεραπεία µε νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα είναι απίθανο να επιτύχει κάθαρση του HBV από τα ηπατοκύτταρα και µακροχρόνιες ιολογικές και βιοχηµικές ανταποκρίσεις εκτός θεραπείας,παρά την επίτευξη ενός ισχυρού αρχικού αντιϊκού αποτελέσµατος. Επί τη βάσει της εµπειρίας µε την θεραπεία του HIV (ιού της ανοσοανεπάρκειας του ανθρώπου), η χρήση θεραπειών συνδυασµού φαρµάκων 50

φαίνεται να είναι η επόµενη λογική προοπτική στην θεραπευτική παρέµβαση στους εν λόγω δύσκολους να θεραπευθούν ασθενείς.όλοι οι συνδυασµοί φαρµάκων δεν προσφέρουν θεραπευτικό πλεονέκτηµα,και η αποτελεσµατικότητα των σχηµάτων συνδυασµού πρέπει να τεκµηριώνεται σε µεγάλες, καλά σχεδιασµένες κλινικές µελέτες.οι συνδυασµοί φαµσικλοβίρης µε λαµιβουδίνη, φαµσικλοβίρης µε IFN -α, γανσικλοβίρης µε IFN -α, ιντερφερόνης-α µε λαµιβουδίνη και λαµιβουδίνης µε αδεφοβίρη έχουν επιδείξει αθροιστικό ή συνεργικό θετικό αποτέλεσµα σε µελέτες in vitro, αλλά µη σαφές ή οριακό θεραπευτικό πλεονέκτηµα σε σύγκριση µε µονοθεραπεία σε µικρές προκαταρκτικές κλινικές µελέτες 129-131. Συµπερασµατικά,η ανάπτυξη πλέον αποτελεσµατικών σχηµάτων συνδυασµού αντιϊκών φαρµάκων, φαίνεται να προυποθέτει χρήση φαρµάκων µε συµπληρωµατικούς µηχανισµούς δράσης, µε σκοπό την πρόληψη ανάπτυξης της αντίστασης του HBV σε µακροχρόνια θεραπεία και την επίτευξη, εάν αυτό αποδειχθεί δυνατόν, µακροχρονίων θεραπευτικών ανταποκρίσεων σε µεγάλες κλινικές µελέτες φάσης III. 51

Πίνακας 4.Ενδείξεις θεραπείας σε ασθενείς µε χρονία HBV λοίµωξη Χρονία HBV και HDV λοίµωξη - - -/+ -/+ <Α.Φ.Τ. >Α.Φ.Τ. Τύπος χρονίας HBV λοιµώξεως H B ea g anti-hbe ALT/AST HBV-DNA Αντιµετώπιση ΗβeA g θετική χρονία ηπατίτιδα Β + - <2xΑ.Φ.Τ. 2xΑ.Φ.Τ. + + Έλεγχος ALT/AST ανά 3 µήνες Έναρξη θεραπείας µε IFN -α ή LAM ή ADV Χρονία ανενεργός φορία HBV - -/+ <A.Φ.Τ. - Έλεγχος ALT/AST,IgM anti-hbc ανά 6 µήνες ΗΒeA g αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β - -/+ >Α.Φ.Τ. + Έναρξη θεραπείας µε IFN -α (ή LAM ή ADV) Μη αντιρροπούµενη HBV κίρρωση +/- -/+ <Α.Φ.Τ. >Α.Φ.Τ. - + Έλεγχος ALT/AST,IgM anti-hbc ανά 3 µήνες Έναρξη θεραπείας µε LAM ή ADV Χρονία HBV λοίµωξη µε ανθεκτικά στη LA M στελέχη Μέχρι µετρίου βαθµού ίνωση Σοβαρού βαθµού ίνωση,κίρρωση, Μεταµοσχευµένοι +/- +/- +/- +/- -/+ -/+ -/+ -/+ <Α.Φ.Τ. >Α.Φ.Τ.* <Α.Φ.Τ. >Α.Φ.Τ. + + + + Συνέχιση LA M ή παρακολούθηση ALT/AST Έναρξη θεραπείας µε IFN -α ή ADV* Έναρξη ADV+LAM ** Έναρξη ADV+LAM ** +/- +/- Έλεγχος ALT/AST ανά 3-6 µήνες Έναρξη θεραπείας µε IFN -α HBV-DNA + υποδηλώνει επίπεδα HBV-DNA ορού 100,000 copies/ml.επίπεδα HBV-DNA ορού <100,000 copies/ml δεν αναστέλλουν την έναρξη θεραπείας σε ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη κίρρωση ή HBeAg αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β και τουλάχιστον µετρίου βαθµού νεκροφλεγµονώδη δραστηριότητα ή µετρίου βαθµού ίνωση σε βιοψία ήπατος. IFN-α:ιντερφερόνη-άλφα,LAM :λαµιβουδίνη,adv:διπιβαλική αδεφοβίρη *Ένδειξη ενάρξεως νέας θεραπείας σε ασθενείς µε χρονία ΗΒV λοίµωξη και ανθεκτικά στη LAM HBV στελέχη έχουν µόνον ασθενείς µε επίµονη βιοχηµική διαφυγή (ALT/AST>Α.Φ.Τ.για 3 µήνες).οι ενδείξεις ενάρξεως IFN-α είναι οι ίδιες µε εκείνες των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα Β χωρίς αντοχή στη LAM.Η ένδειξη ενάρξεως µακροχρόνιας θεραπείας µε ADV είναι σχετική και αφορά αποκλειστικά ασθενείς µε µετρίου βαθµού ίνωση. **Έναρξη νέας θεραπείας σε ασθενείς µε σοβαρού βαθµού ίνωση ή κίρρωση (αντιρροπούµενη και µη) ή µεταµοσχευµένους και ανθεκτικά στη LAM H BV στελέχη µπορεί να γίνεται µε την ανίχνευση µόνον της ιολογικής διαφυγής και πριν την εµφάνιση βιοχηµικής διαφυγής.η ανάγκη συγχορηγήσεως ή διακοπής της LAM σε ασθενείς µε ανθεκτικά στη LAM H BV στελέχη που τίθενται σε θεραπεία µε ADV δεν έχει διευκρινισθεί.προς το παρόν,κρίνεται φρόνιµο όπως τουλάχιστον οι ασθενείς µε κίρρωση ή µεταµοσχευµένοι και αντοχή στη LAM συνεχίζουν τη θεραπεία µε LAM και µετά την έναρξη της ADV. 52

Πίνακας 5.Τύποι θεραπείας σε ασθενείς µε χρονία HBV λοίµωξη. Τύπος χρονίας HBV λοιµώξεως Τύπος θεραπείας Φάρµακο Θεραπευτικό σχήµα ΗΒeA g θετική χρονία ηπατίτιδα Β Αρχική Επαναθεραπεία1 Συντήρηση3 IFN -α ή LA M ή ADV IFN -α ή LA M 1* ή ADV1* LA M ή ADV ΗΒeA g αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β IFN -α (5 ΜU/24h ή 10 ΜU tiw)για 4-6 µήνες LA M ή ADV για 12 µήνες2 LA M ή ADV για >12 µήνες4 Αρχική Επαναθεραπεία1 Συντήρηση3 IFN -α (ή LA M ή ADV) IFN -α ή LA M ή ADV1 LA M ή ADV IFN -α (3-6 MU tiw)για 12 µήνες LA M ή ADV για 12 µήνες LA M ή ADV ή για >12 µήνες5 Μη αντιρροπούµενη HBV κίρρωση Αρχική LA M ή ADV LAM ή ADV για >12 µήνες6 Χρονία HBV λοίµωξη µε ανθεκτικά στη LA M στελέχη Μέχρι µετρίου βαθµού ίνωςη Αρχική Σοβαρού βαθµού ίνωση,κίρρωση, Αρχική Μεταµοσχευµένοι Χρονία HBV και HDV λοίµωξη Αρχική Επαναθεραπεία Συντήρηση2 ADV ή LA M ή IFN -α7 ADV+LAM IFN -α ADV για >12 µήνες IFN -α (9-10 ΜU tiw)για >12 µήνες IFN -α (9-10 ΜU tiw)για >12 µήνες IFN -α σε χαµηλές δόσεις-βιοχηµική ύφεση IFN -α:ιντερφερόνη-άλφα,lam :λαµιβουδίνη,adv:διπιβαλική αδεφοβίρη,tiw:τρεις φορές την εβδοµάδα.η LA M χορηγείται πάντοτε σε δόση 100 mg/24h και η ADV σε δόση 10 mg/24h. 1 Η επαναθεραπεία µε LA M ή ADV σε ασθενείς που ανέπτυξαν αντοχή στη LA M ή ADV σε προηγούµενη θεραπεία µε το συγκεκριµένο φάρµακο πρέπει να αποφεύγεται. 2 H LA M πρέπει να χορηγείται για τουλάχιστον 6 µήνες µετά την πιθανή αρνητικοποίηση HBeAg και/ή ανάπτυξη anti-hbe. 3 Θεραπεία συντηρήσεως έχει ένδειξη σε ασθενείς µε HBeAg θετική ή -αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β ή µε χρονία HBV και HDV λοίµωξη και µετρίου (σχετική ένδειξη)ή σοβαρού βαθµού (σαφής απόλυτη ένδειξη)ίνωση. 4 Θεραπεία συντηρήσεως µε LA M ή ADV σε ασθενείς µε HBeAg θετική χρονία ηπατίτιδα Β χορηγείται µέχρι επιτυχή οροµετατροπή HBeAg σε anti-hβe επί 6 µήνες ή την εµφάνιση αντοχής στη LA M και βιοχηµικής διαφυγής. 5 Θεραπεία συντηρήσεως µε LAM σε ασθενείς µε HBeAg αρνητική χρονία ηπατίτιδα Β χορηγείται µέχρι την εµφάνιση αντοχής στη LA M και βιοχηµικής διαφυγής. 6 Θεραπεία µε LA M σε ασθενείς µε µη αντιρροπούµενη HBV κίρρωση χορηγείται µέχρι την εµφάνιση αντοχής στη LA M και/ή βιοχηµικής διαφυγής 7 Εφόσον αποφασισθεί χορήγηση IFN -α σε ασθενείς µε ανθεκτικά στη LA M HBV στελέχη,η ΙFN -α χορηγείται σε σχήµατα ίδια µε αυτά που χορηγούνται σε HBeAg-θετική ή αρνητική χρονία ηπατίτιδας Β (ανάλογα µε τον τύπο του ασθενούς). 53

ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 54

ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι στόχοι της θεραπείας στην HBeAg αρνητική X H B παραµένουν ένα ανοικτό θέµα χωρίς οριστικά συµπεράσµατα. Η πλήρης εκρίζωση του ιού, δεν φαίνεται να είναι ένας ρεαλιστικά στόχος στην XHB, καθόσον πολύ µικρές ποσότητες πολλαπλασιαζόµενου HBV είναι ανιχνεύσιµες στην πλειονότητα των ασθενών µε παρατεταµένη ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση, ακόµα και σε περιπτώσεις κάθαρσης και του HBsAg. Η κάθαρση του HBsAg,η οποία είναι δυνατόν να επισυµβεί τελικά σε ποσοστό περίπου 20-25% των ασθενών µε µακροχρόνια ανταπόκριση, είναι ένας στόχος δυσχερής σε πραγµατικές συνθήκες θεραπείας, και απαιτεί παρατεταµένη παρακολούθηση.ο στόχος της θεραπευτικής παρέµβασης στην H B ea g-αρνητική ΧΗΒ περιορίζεται σε πραγµατικές συνθήκες στην ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση. Μια παρατεταµένη και µακροχρόνια βιοχηµική ανταπόκριση µετά θεραπεία µε ιντερφερόνη-άλφα (IFN -a) αν και συνήθως συνοδεύεται από υπολειπόµενα επίπεδα HBV DNA χαµηλού βαθµού, συσχετίζεται µε ελαττωµένο κίνδυνο ανατροπής της ηπατικής αντιρρόπησης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου και µε βελτίωση του προσδόκιµου επιβίωσης. Εάν η ιολογική και βιοχηµική ανταπόκριση διατηρείται στο τέλος και για τουλάχιστον 12 µήνες µετά το πέρας της θεραπείας, παρατηρείται η ιστολογική βελτίωση και στασιµότητα στην εξέλιξη της νόσου. Η µελέτη της κινητικής και δυναµικής του HBV υπό αντιϊική θεραπεία 132-137 συµβάλλει την κατανόηση των µηχανισµών της λοίµωξης, καταγράφει τα πρώιµα επαγόµενα από την θεραπεία αντιϊκά και ανοσορρυθµιστικά φαινόµενα και δράσεις και είναι δυνατόν να ερµηνεύσει την αιτιολογία των αποτυχιών της θεραπείας.λεπτοµερής ανάλυση των ανωτέρω δυνατών στόχων της µελέτης αναφέρεται στο κεφάλαιο του µαθηµατικού προτύπου (µοντέλου)κινητικής και δυναµικής του HBV.Η κινητική του HBV DNA δεν έχει µελετηθεί επαρκώς σε ασθενείς µε HBeAg-αρνητική χρόνια ηπατίτιδα Β, ιδιαίτερα γονότυπου D. Ο σκοπός της µελέτης ήταν το να χαρακτηρισθεί η πρώϊµη κινητική του HBV σε απάντηση σε διάφορα θεραπευτικά αντιϊκά σχήµατα σε ασθενείς µε HBeAgαρνητική ΧΗΒ,και να διερευνηθούν τα στοιχεία εκείνα των κινητικών παραµέτρων που συσχετίζονται µε την πρώϊµη ή µακροχρόνια ιολογική ανταπόκριση. Τα 55

αποτελέσµατα της µελέτης των παραµέτρων της πρώϊµης κινητικής του HBV θα αξιολογηθούν για να ερµηνεύσουν τα τελικά σηµεία της ανταπόκρισης στο τέλος της θεραπείας ή της µακροχρόνιας ιολογικής και βιοχηµικής ανταπόκρισης.εκτός από την θεραπεία µε IFN -a η οποία είναι δυνατόν να επιτύχει παρατεταµένη ανταπόκριση σε ένα µικρό ποσοστό (15 έως 25% ) των ασθενών µε HBeAg-αρνητική ΧΗΒ,η µονοθεραπεία µε νουκλεοσιδικά ανάλογα είναι απίθανο να συµβάλλει στη κάθαρση του HBV από τα ηπατοκύτταρα και σε παρατεταµένη ανταπόκριση παρά την ισχυρή αντιϊκή δράση. Με βάση την εµπειρία της θεραπευτικής αντιµετώπισης του συνδρόµου επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) και του ιού HIV η χρήση συνδυασµού αντιϊκών φαρµάκων φαίνεται να είναι το επόµενο λογικό βήµα στην θεραπεία των ασθενών µε HBeAg-αρνητική ΧΗΒ που αποτελούν δύσκολη κατηγορία 138. Η αποτελεσµατικότητα των θεραπευτικών σχηµάτων συνδυασµού δεν είναι παρόµοια και δεν είναι δυνατόν να προεκταθεί συµπερασµατικά από δεδοµένα που ισχύουν µόνον in vitro ή µικρές προκαταρκτικές µελέτες,αλλά πρέπει να αποδειχθεί µε την κινητική µελέτη του HBV σε κλινικές δοκιµές φάσης ΙΙΙ 94-96. Συνδυασµοί λαµιβουδίνης µε πεγκυλιωµένης ιντερφερόνης-άλφα (Peg-IFN -a) ή ανοσορρυθµιστικά φάρµακα,όπως και θεραπευτικά εµβόλια,είναι σε εξέλιξη σε κλινικές µελέτες φάσης ΙΙΙ.Προς το παρόν είναι ασαφές εάν η µακροχρόνια θεραπεία µε οποιοδήποτε από τα νέα αντιϊκά φάρµακα είναι δυνατόν να επάγει παρατεταµένη ανταπόκριση υπό αγωγή ή µακροχρόνια ύφεση µετά το τέλος της αγωγής σε υψηλό ποσοστό ασθενών µε HBeAg-αρνητική ΧΗΒ.Επιπλέον,είναι άγνωστο σήµερα εάν συνδυασµοί φαρµάκων µε συµπληρωµατικούς µηχανισµούς αντιϊκής και ανοσορρυθµιστικής δράσης σε µακροχρόνια θεραπεία ενδείκνυται να χρησιµοποιηθούν για την πρόληψη της αντίστασης και την επαγωγή σε σηµαντικό ποσοστό παρατεταµένης απάντησης. 56

1.ΜΕΘΟ ΟΙ 1.1 Μέθοδος πολλαπλασιασµού του στόχου βασιζόµενη στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (real-time PCR am plification) Με βάση τα αποτελέσµατα µε άλλους ιούς,χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα µελέτη η PCR πραγµατικού χρόνου, η οποία πιθανά θα αποτελέσει την µέθοδο εκλογής για την ποσοτική µέτρηση των επιπέδων του HBV-DNA στο µέλλον,λόγω της δυναµικής της για αυξηµένη ευαισθησία,αναπαραγωγιµότητα,µεγάλο γραµµικό (δυναµικό)εύρος τιµών,υψηλή ειδικότητα και πλήρη αυτοµατισµό 75. Η PCR πραγµατικού χρόνου βασιζόµενη στο χηµικό σύστηµα Taqm an (A pplied B iosystem s Inc. Foster City, California, USA), στο σύστηµα κυκλωτή φωτός (LightCyclerTM,Roche Molecularsystem s)και σε άλλες τεχνολογίες µπορεί τώρα να εφαρµοσθεί για το HBV-DNA. Αυτή η µεθοδολογία επιτρέπει τον πολλαπλασιασµό του στόχου και την ανίχνευση του προϊόντος σε ένα µόνο µικρό φιαλίδιο.μια αλληλουχία νουκλεοτιδίων ειδική για υβριδισµό µε αλληλουχίες του HBV DNA συνδεδεµένη µε φθορίζουσα χρωστική (probe),επιτρέπει την ανίχνευση του προϊόντος της PCR HBV άµεσα κατά την παραγωγή του. Κάθε επιτυχής κύκλος PCR λοιπόν έχει ως αποτέλεσµα τον εκθετικό πολλαπλασιασµό ενίσχυση του προϊόντος της PCR και της έντασης του φθορισµού που ανιχνεύεται και ποσοτικοποιείται σε πραγµατικό χρόνο.το σύστηµα Taqm antm, για παράδειγµα,βασίζεται σε ένα σύνολο εκκινητών για την PCR (primers) και σε µία αλληλουχία ειδική για υβριδισµό µε το HBV DNA (probe). Μία χρωστική αναφοράς (reporter dye) (6-καρβοξυ-φλουορεσκεϊνη)συνδέεται οµοιοπολικά στο 5 άκρο της αλληλουχίας υβριδισµού,και µία χρωστική φαλκίδευσης (quencherdye,6 καρβόξυ τετραµεθύλ -ροδαµίνη)ενσωµατώνεται στο 3 άκρο. 57

Εικόνα 6. Ακριβής τοπογραφία των εκκινητών (primers) και της αλληλουχίας υβριδισµού νουκλεοτιδίων επί του γονιδιώµατος (probe)που χρησιµοποιήθηκαν στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (Real-time PCR). Συγκεκριµένα PC1 1744-1761,PC2 1940-1959 και η αλληλουχία υβριδισµού 1854-1879. Εάν στο προϊόν της PCR υπάρχει ο στόχος (HBV DNA), η αλληλουχία υβριδισµού προσκολλάται ειδικά µεταξύ των εγγύς και άπω εκκινητών (primers).η δραστηριότητα 5-3 εξωνουκλεάσης,που διαθέτει η Taq πολυµεράση, διασπά την αλληλουχία υβριδισµού (probe) µεταξύ της χρωστικής αναφοράς και της χρωστικής φαλκίδευσης. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσµα µία αύξηση του σήµατος φθορισµού αναφοράς που είναι ανάλογο µε την ποσότητα του συσσωρευµένου προϊόντος. Το διορθωµένο σήµα αναφοράς (Rn)υπολογίζεται µε διαίρεση του αριθµού του σήµατος αναφοράς µε τον αριθµό του παθητικού σήµατος αναφοράς. Η αριθµητική τιµή του διορθωµένου σήµατος αναφοράς πλην την αριθµητική τιµή του σήµατος αναφοράς πριν την PCR αυξάνεται καθώς ο στόχος πολλαπλασιάζεται,µέχρι του σηµείου που η αντίδραση τείνει στο µέγιστο δυνατό σηµείο (plateau).μετά τον πολλαπλασιασµό,η επεξεργασία και η ανάλυση των δεδοµένων που δηµιουργήθηκαν σε πραγµατικό χρόνο, διενεργείται µε ειδική συσκευή (ΑΒ Prism 7700 sequence detector,applied B iosystem s Inc.).Ο κύκλος ουδός (Ct) ορίζεται ως ο κύκλος εκείνος της αντίδρασης PCR κατά τον οποίο πρωτοανιχνεύεται το σήµα αναφοράς. 58

Αυτός ο ουδός ανίχνευσης εξαρτάται από την αρχική ποσότητα του HBV DNA.Όλη η διαδικασία µπορεί να ολοκληρωθεί σε 5 ώρες, συµπεριλαµβανοµένης και της αποµόνωσης του DNA από τον ορό του ασθενούς. Η PCR πραγµατικού χρόνου πραγµατοποιείται σε ένα µόνο στάδιο,απαιτεί ένα µόνο µικροφιαλίδιο,ένα µόνο ένζυµο και ένα ζεύγος εκκινητών µε µία φθορίζουσα αλληλουχία υβριδισµού (probe). Η ανάλυση των αποτελεσµάτων µετά την PCR µπορεί να επιτευχθεί µε χρήση υπολογιστή συνδεδεµένου στον ανιχνευτή του ΑΒΙ 7700. Η µεθοδολογία εκλογής για την ποσοτική µέτρηση του HBV DNA πρέπει να έχει την µεγαλύτερη δυνατή ευαισθησία και ειδικότητα,και ένα γραµµικό δυναµικό εύρος τιµών εκτεινόµενο σε όλο το φάσµα των παρατηρούµενων τιµών µέτρησης.η έκφραση της αριθµητικής τιµής του αποτελέσµατος θα πρέπει να είναι κατά πρώτη εκλογή σε IU/mlκατά την Παγκόσµια Οργάνωση Υγείας. Το γραµµικό ή δυναµικό εύρος τιµών µιας ποσοτικής µεθόδου είναι το εύρος των τιµών του HBV-DNA εντός του οποίου η ποσοτική µέτρηση παραµένει γραµµική.κάθε τιµή ιικού φορτίου εκτός του γραµµικού εύρους αποτελεί σφάλµα (υπέρ-ή υποεκτιµηµένη)τιµή.είναι ιδιαίτερα σηµαντική η γνώση του ανώτερου και κατώτερου ορίου του γραµµικού εύρους τιµών,ιδίως όταν η θεραπευτική προσέγγιση βασίζεται σε ακριβή επίπεδα ιικού φορτίου.η PCR που διενεργείται σε πραγµατικό χρόνο αντίδρασης (Real-time PCR),είναι η πλέον σύγχρονη µέθοδος που πληρεί τα παραπάνω καθοριστικά κριτήρια. Οι αρχικές αναφορές αποδίδουν στην µέθοδο γραµµικό εύρος τιµών από 10 2 έως 10 9 αντίγραφα (copies) DNA/ml(2log 10 9log 10 copies/ml) και οι σταθερές µεταβλητότητας (συντελεστές) δεικνύουν ικανοποιητική ακρίβεια και αναπαραγωγιµότητα σε όλο το δυναµικό φάσµα µετρούµενων τιµών. Επιπρόσθετα,το γεγονός ότι η αντίδραση της PCR διενεργείται σε ένα µόνο κλειστό µικροφιαλίδιο είναι καθοριστικό για την µεγάλη ελάττωση του κινδύνου διασποράς πολλαπλασιασθέντος προϊόντος της PCR (cd N A ). Η εν λόγω µεθοδολογία για την ποσοτική µέτρηση του HBV DNA πρέπει να εφαρµοσθεί σε ευρεία βάση στις λεγόµενες πραγµατικές κλινικές συνθήκες. Με βάση των κλινικά,βιοχηµικά και ιστολογικά δεδοµένα για κάθε ασθενή η φορέα και την ακριβή και αξιόπιστη ποσοτική µέτρηση του αντίστοιχου ιικού φορτίου του HBV-DNA θα υπολογισθεί η ευαισθησία, ειδικότητα, θετική και αρνητική προγνωστική αξία και η ακρίβεια ως κριτηρίου ενός συγκεκριµένου ουδού HBV- 59

DNA που θα χαρακτηρίσει την χρόνια HBV ηπατική νόσο σε αντιδιαστολή µε την HBV λοίµωξη-φορία χωρίς ηπατική νόσο. Ο Παγκόσµιος Οργανισµός Υγείας καθιέρωσε διεθνές πρότυπο για την παγκόσµια προτύπωση των µονάδων µέτρησης του HBV DNA,το οποίο ορίσθηκε ως µία διεθνής µονάδα (IU)HBV DNA.Όταν ολοκληρωθεί και γίνει αποδεκτή,όπως στην περίπτωση του ιού της ηπατίτιδας C(HCV),η µετατροπή σε διεθνείς µονάδες στην θέση των µη προτυπωµένων αντιγράφων γονιδιώµατος HBV ως µέτρο της ποσοτικής µέτρησης του HBV DNA,αυτή η IU θα πρέπει να προτιµάται και να χρησιµοποιείται από όλες τις εµπορικά διαθέσιµες µεθόδους προσδιορισµού HBV DNA.Το δυναµικό γραµµικό εύρος ακριβούς ποσοτικής µέτρησης του HBV DNA των διαθέσιµων µεθόδων αναφέρεται στον πίνακα 2,σε µη προτυπωµένες µονάδες µέτρησης. είγµατα µε ιϊκό φορτίο µεγαλύτερης τιµής από το ανώτερο όριο γραµµικής περιοχής της µεθόδου,πρέπει να επανελέγχονται από αραίωση 1/10 ή 1/100 του δείγµατος,προκειµένου η ποσοτική µέτρηση να είναι ακριβής µόνον εντός του δυναµικού-γραµµικού εύρους των τιµών της κάθε µεθόδου. Σε οποιοδήποτε µέθοδο,διαφορές τιµών λιγότερο από 0,5 log (λιγότερο από το τριπλάσιο) δεν θα πρέπει να αξιολογούνται ως σηµαντικά διαφορετικές µεταξύ τους,καθόσον η διαφορά αυτή είναι δυνατόν να οφείλεται σε ενδογενή ή µεταξύ ασθενών διακύµανση και όχι σε πραγµατική διαφορά τιµών HBV DNA. 1.2 Μαθηµατικό πρότυπο (µοντέλο)κινητικής και δυναµικής του HBV Το πρότυπο (µοντέλο) κινητικής και δυναµικής του HBV, είναι ή σύνθετη µαθηµατική έκφραση της κατωτέρω περιγραφόµενης αλληλουχίας γεγονότων στις αλληλεπιδράσεις του ιού µε τον ξενιστή,που λαµβάνεται υπ όψη όσον αφορά στην παθοφυσιολογία της HBV λοίµωξης σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β ή κίρρωση 137 (Εικόνα 7). 60

Εικόνα 7. ιαγραµµατική αναπαράσταση του µαθηµατικού προτύπου για την θεραπεία του HBV.Το πρότυπο απεικονίζει τα υγιή κύτταρα στόχους, Τ; τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη I;και τα ελεύθερα κυκλοφορούντα στον ορό πλήρη ιϊκά σωµατίδια,v.οι παράµετροι του µοντέλου είναι d=ρυθµός θανάτου των υγιών κυττάρων στόχων δ =ρυθµός θανάτου των κυττάρων µε HBV λοίµωξη;ρ= ρυθµός µη κυτταρολυτικής κάθαρσης των κυττάρων Ι;(δ +ρ=δ=συνολικός ρυθµός κάθαρσης των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη); c=ρυθµός κάθαρσης των ελευθέρων κυκλοφορούντων στον ορό πλήρων ιϊκών σωµατιδίων;ε=αποτελεσµατικότητα του φαρµάκου στην αναστολή παραγωγής ιϊκών σωµατιδίων,η=αποτελεσµατικότητα του φαρµάκου στην πρόληψη νέων λοιµώξεων p=ρυθµός της παραγωγής ιϊκών σωµατιδίων ανά κύτταρο µε λοίµωξη; β=ρυθµός λοίµωξης νών υγιών κυττάρων στόχων; S=ρυθµός παραγωγής νέων υγιών κυττάρων στόχων. (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 137). Τα κύτταρα-στόχοι Τ,είναι τα ηπατοκύτταρα χωρίς HBV λοίµωξη,τα οποία αναπαράγονται µε ένα σταθερό ρυθµό s και καταστρέφονται in vivo µε ένα ρυθµό d. Ο αριθµός τους στο ήπαρ ενός ενηλίκου ατόµου είναι κατά προσέγγιση περίπου 2Χ10 11 κύτταρα.τα κύτταρα-στόχοι προσβάλλονται από τα υπάρχοντα πλήρη ιϊκά HBV σωµατίδια µε µηχανισµό λοίµωξης de novo,µε ένα ρυθµό β ανά υγιές κύτταρο ανά ιϊκό σωµατίδιο.αυτό το σύνολο ή η «δεξαµενή» των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη,µε σύµβολο Ι,παράγει και απελευθερώνει εξωκυττάρια HBV πλήρη ιϊκά σωµατίδια µε ένα ρυθµό κατά µέσο όρο p ιϊκά σωµατίδια ανά κύτταρο µε HBV ανά ηµέρα. Σε αυτό το συγκεκριµένο πρότυπο θεωρούνται δύο πιθανά συµβάµατα επαγόµενα από την θεραπευτική παρέµβαση,τα οποία έχουν ως αποτέλεσµα την ελάττωση του ιϊκού φορτίου. Μια ελάττωση της παραγωγής των ιϊκών σωµατιδίων από τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη κατά ένα κλάσµα (1-ε)και /ή του ρυθµού της de novo λοίµωξης µε HBV των ηπατοκυττάρων κατά ένα κλάσµα (1-η). Η 61

καµπύλη της ελάττωσης του ιϊκού φορτίου µετά έναρξη θεραπείας είναι στην πλειονότητα των περιπτώσεων διφασική. Η τυπική διφασική καµπύλη που παρατηρείται στην πράξη µετά 24-48 ώρες από την έναρξη της θεραπείας, ερµηνεύεται µόνο µε την παραδοχή µερικής αναστολής παραγωγής ιϊκών σωµατιδίων µε συντελεστή ε (ε <1)(Εικόνα 8Α και Β). Εικόνα 8. Σχηµατική αναπαράσταση της αποτελεσµατικότητας ε-efficacy <1. Eάν ε=1,η πτώση του ιϊκού φορτίου θα ήταν µονοφασική (Α).Ο χρόνος που θεωρητικά απαιτείται για ελάττωση του HBV DNA από 10 8 στο 1 αντίγραφο γονιδιώµατος ή 1 διεθνή µονάδα, είναι σε πολλές περιπτώσεις µεγαλύτερος του έτους (Β) (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 134). Μετά την ταχεία πρώτη φάση της καµπύλης ελάττωσης του HBV DNA, παρατηρείται µια αργή δεύτερη φάση ελάττωσης του ιϊκού φορτίου.η κλίση της καµπύλης αυτής τείνει να εκφράζεται µαθηµατικά από την τιµή δ (ρυθµός καταστροφής των ηπατοκυττάρων µε HBV προ θεραπείας). Η εξάλειψη του HBV είναι δυνατόν να επιτυγχάνεται και µε δράση κυτταροκινών, χωρίς αναγκαία καταστροφή των ηπατοκυττάρων µε HBV και εξαρτάται από τον συντελεστή αποτελεσµατικότητας ε. 62

Τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη,κατά την κατάσταση ισορροπίας της λοίµωξης,ανέρχονται στο 10-40% του συνολικού αριθµού των ηπατοκυττάρων στην χρόνια ηπατίτιδα Β. Κατά την κατάσταση ισορροπίας τα HBV ιϊκά σωµατίδια µετρώνται και εκφράζονται ποσοτικά ως το ιϊκό φορτίο στον ορό του αίµατος των ασθενών, V (συγκέντρωση ιϊκών σωµατιδίων). Στη φάση ισορροπίας τα ιϊκά σωµατίδια καταβολίζονται µε ένα ρυθµό C ανά ηµέρα,στο διαµέρισµα καταβολισµού τους το οποίο είναι υποθετικά είναι δικτυοενδοθηλιακό σύστηµα και το ήπαρ.ο ρυθµός της παραγωγής των ιϊκών σωµατιδίων ανά ηµέρα στη φάση ισορροπίας ισούται µε τον καταβολισµό τους C ανά ηµέρα,και κατ αυτόν τον τρόπο τα επίπεδα του ιϊκού φορτίου παραµένουν σταθερά και δεν αυξάνονται προοδευτικά.τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη (Ι) καταστρέφονται µε ένα µεταβλητό ανά ασθενή και ανά κύτταρο ρυθµό δ (παρά το γεγονός ότι αξιωµατικά θεωρείται ο ρυθµός αυτός σταθερός κατά παραδοχή),είτε από την δράση των κυτταροτοξικών Τ λεµφοκυττάρων,εάν αυτά ευρίσκονται κοντά στην κυτταρική περιοχή τους, είτε µε τον µηχανισµό της απόπτωσης. Επιπρόσθετα,η κάθαρση του ιού από τα ηπατοκύτταρα µε HBV,(Ι), είναι δυνατή από την βιολογική δράση συγκεκριµένων κυτταροκινών ( IFN -γ και TNF-α )καθώς και από άλλους δυνητικά ενεργώντες πλην αγνώστους προς το παρόν µηχανισµούς,µε αποτέλεσµα στα κύτταρα Ι να εξαλείφεται ο HBV (πιθανά και το ccc DNA)µε ρυθµό ρ και τα κύτταρα αυτά να ξαναγίνονται µέλη του συνόλου των υγιών, χωρίς HBV λοίµωξη,ηπατοκυττάρων (Τ).Έτσι,ο συνολικός ρυθµός κάθαρσης των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη είναι δ= δ +ρ. Η ανάλυση της κινητικής και δυναµικής του HBV βασίσθηκε στο ισχύον καθορισµένο µοντέλο της ιογενούς λοίµωξης, το οποίο περιγράφεται από το ακόλουθο σύστηµα των διαφορικών εξισώσεων. dt/dt= s dt (1 -η)βvt (Eξίσωση 1) di/dt= (1 -η)βvt -δi (Eξίσωση 2) dv /dt= (1 -ε)pi-cv (Eξίσωση 3) 63

Υποθέτοντας µία προ θεραπείας κατάσταση σταθεράς ισορροπίας και σταθερή την παράµετρο Τ (ηπατοκύτταρα στόχοι του HBV)η λύση των εξισώσεων είναι 1 c+ δ 2εc V () t = V0[( 1 ) e 2 θ c+ δ 2ε c + 1( + ) e θ λ1( t τ ) λ2( t τ ) όπου λ1,λ2 τιµές eigen. λ1 = 0.5(c + δ + θ), λ2 = 0.5(c + δ -θ),και 2 θ = ( c δ) + 4(1 ε)(1 η) cδ ] Αυτή η λύση περιλαµβάνει και προβλέπει µια καθυστέρηση,τ,µεταξύ της έναρξης της χορήγησης της θεραπείας και του αποτελέσµατός της (έναρξη πτώσης) στο ιϊκό φορτίο (επίπεδα HBV DNA ορού),και είναι έγκυρη για όλους τους χρόνους t (t>τ)µετά από αυτή την καθυστέρηση.για t <τ,η λύση είναι V (t)=v o,όπου Vo είναι το αρχικό ιϊκό φορτίο προ θεραπείας. Οι κύριες θεωρητικές παραδοχές-αξιώµατα είναι : α)σταθερός ρυθµός παραγωγής ιϊκών σωµατιδίων β)σταθερός ρυθµός καταβολισµού ιϊκών σωµατιδίων γ)σταθερός ρυθµός καταστροφής ηπατοκυττάρων µε HBV δ) επαγωγή αναστολής πολλαπλασιασµού-παραγωγής HBV ιϊκών σωµατιδίων µετά καθυστέρηση ολίγων ωρών από την έναρξη θεραπείας. ε) εν λαµβάνονται υπόψη τα επαγόµενα από την θεραπεία ανοσολογικά φαινόµενα (δυναµικά) που δυνατόν επηρεάζουν την καµπύλη λόγω της εξαιρετικής πολυπλοκότητας των παραδοχών και της µαθηµατικής ανάλυσης. ζ) Σε συνολική θεώρηση, δεν είναι δυνατόν προς το παρόν να αναλυθούν ως παράγοντες του προτύπου ο πολλαπλασιασµός των ηπατοκυττάρων,η αύξηση της καταστροφής των ηπατοκυττάρων µε HBV σε συγκεκριµένα χρονικά σηµεία και η ενδοκυττάρια κάθαρση του HBV. Επίσης δεν είναι δυνατή προς το παρόν η περιγραφή της παράλληλης κινητικής της ενζυµατικής δραστηριότητας της ALT (αλανίνης αµινοτρανσφεράσης). Τα ηπατοκύτταρα µε HBV εµπεριέχουν περίπου 10 µόρια ccc HBV DNA ανά κύτταρο (ενδοκυττάρια δεξαµενή ccc D N A ). Εάν ο συνολικός αριθµός των ηπατοκυττάρων είναι κατά προσέγγιση 2Χ10 11,και το 10% έχουν HBV λοίµωξη, 64

τότε περίπου 2Χ10 10 κύτταρα εµπεριέχουν τον ιό. Ο συνολικός αριθµός των αντιγράφων του ccc HBV DNA στο ήπαρ, εάν υποθέσουµε ότι υπάρχουν 10 αντίγραφα ανά κύτταρο µε HBV, ανέρχεται σε 2Χ10 11 αντίγραφα κατά απόλυτο αριθµό (11 log 10 ). Ένα φάρµακο ή ένα σχήµα συνδυασµού φαρµάκων,µε µεγάλη θεραπευτική αποτελεσµατικότητα στην HBV λοίµωξη µε κριτήριο την εκρίζωση και εξάλειψη του ιού,θα πρέπει να ελαττώνει σηµαντικά τον συνολικό αριθµό των αντιγράφων του ccc DNA στο ήπαρ κατά ποσότητα τάξης αρκετών λογαρίθµων (log 10 ).Ένας µεγάλος βαθµός αποτελεσµατικότητας ενός φαρµάκου, ε, όσον αφορά την αναστολή του ρυθµού παραγωγής ιϊκών σωµατιδίων είναι ένας εξαιρετικά σηµαντικός δεύτερος παράγοντας, καθόσον συντελεί στην δραστική ελάττωση του αριθµού νέων ηπατοκυττάρων µε de novo H BV λοίµωξη και της δεξαµενής νεοσυντιθέµενων αντιγράφων ccch B V DNA. Ένα κύριο θέµα στην κινητική και δυναµική µελέτη της HBV λοίµωξης,είναι η δεύτερη φάση της ελάττωσης του HBV DNA.Από την άποψη της µαθηµατικής ανάλυσης η δεύτερη φάση της ελάττωσης του ιϊκού φορτίου αξιωµατικά-κατά υπόθεση-ερµηνεύεται λόγω της καταστροφής-θανάτου των ηπατοκυττάρων µε HBV µε ρυθµό δ από τα κύτταρα «φυσικούς φονείς» ΝΚ ή ΝΚΤ,ή τα κυτταροτοξικά Τ λεµφοκύτταρα,ή την εξάλειψη του πολλαπλασιαζόµενου ιού και του ccc DNA από τα κύτταρα µε την δράση αντιϊκών κυτταροκινών χωρίς κυτταρική καταστροφή (ρ). Αυτή η δεύτερη φάση εµφανίζει µεγάλου βαθµού ποικιλοµορφία στην µαθηµατική κατανοµή των τιµών και καµπυλών που την περιγράφουν σε διαφορετικούς ασθενείς και διαφορετικά θεραπευτικά σχήµατα.υπάρχει η υπόθεση ότι κάποια κύτταρα µε HBV (από το σύνολο των Ι ηπατοκυττάρων ) δεν έχουν στην τοπογραφική τους γειτνίαση κύτταρα ΝΚ,ΝΚΤ ή κυτταροτοξικά Τ λεµφοκύτταρα και επιπλέον δεν ευρίσκονται στην περιοχή παραγωγής και δράσης των ειδικών αντιϊκών κυτταροκινών.κατά αυτό τον τρόπο είναι θεωρητικά δυνατό να δηµιουργείται σε µια υπαρκτή θεωρητικά, αλλά µη καθορισµένη βιολογικά διάσταση ο ανθεκτικός «τρίτος χώρος» στον κύκλο ζωής του HBV. Υπάρχουν δεδοµένα και ενδείξεις ότι κάποιοι προνοµιακοί χώροι είναι δυνατόν να διαδραµατίζουν ένα ρόλο όσον αφορά τον ανθεκτικό «τρίτο χώρο» του κύκλου ζωής του ιού,καθώς ο HBV είναι δυνατό να επιτύχει λοίµωξη εξωηπατικών ιστών και τα ειδικά έναντι του HBV κυτταροτοξικά λεµφοκύτταρα µπορούν να 65

αναγνωρίσουν ιϊκά αντιγόνα στο ήπαρ,αλλά όχι στον νεφρό ή τον εγκέφαλο των HBV διαγονιδιακών ποντικών. Με αυτή την µαθηµατική υποθετική παραδοχή είναι δυνατόν να ερµηνευθούν τα φαινόµενα της ποικιλοµορφίας των καµπυλών δεύτερης φάσης (επίπεδες µε µικρή κλίση καµπύλες,καµπύλες τρίτης φάσης,σύνθετες καµπύλες ή κλιµακωτές καµπύλες ιϊκής κινητικής). Αποτελεί κύριο ερώτηµα βιολογικής σηµασίας, εάν ένα ισχυρό αντιϊκό φάρµακο ή σχήµα συνδυασµού είναι δυνατόν να έχει αποτελεσµατικότητα στον ανθεκτικό θεωρητικά υπαρκτό «τρίτο χώρο» του κύκλου ζωής του ιού. Το φάρµακο αυτό ή το σχήµα θα πρέπει να αναστέλλει την παραγωγή ιϊκών σωµατιδίων και ccc HBV DNA στα κύτταρα του χώρου αυτού,έως την χρονική στιγµή που θα καταστραφούν από φυσικό θάνατο-απόπτωση και όχι από τους εξασκώµενους από το ανοσολογικό σύστηµα µηχανισµούς κυτταροτοξικής δράσης. Ένα σηµαντικό ερώτηµα,επίσης,για την δεύτερη φάση καµπύλης ελάττωσης του ιϊκού φορτίου υπό θεραπεία µε καθαρά αντιϊκά φάρµακα ή σχήµατα θεραπευτικά συνδυασµού αντιϊκών,είναι ο µηχανισµός µε τον οποίο επάγουν αυτή την ελάττωση η οποία προϋποθέτει δράση του ανοσολογικού συστήµατος του ασθενή έναντι του HBV και όχι µόνον απλή αντιϊκή δράση. Η καθαρά αντιϊκή δράση των φαρµάκων εξασκείται και ερµηνεύει την πρώτη φάση της καµπύλης ελάττωσης του ιϊκού φορτίου.η ανωτέρω παρατήρηση εγείρει ως θέµα τον µηχανισµό της έµµεσης αλλά κλινικά σηµαντικής ανοσοενισχυτικής δράσης των φαρµάκων τα οποία αναστέλλουν την σύνθεση των ελίκων του HBV DNA δρώντας ως αντιϊκά. Η δευτερογενής αυτή ανοσορρυθµιστική δράση των αντιϊκών φαρµάκων είναι δυνατόν να ερµηνεύεται από µηχανισµούς που επισυµβαίνουν µετά από αρχικές ελαττώσεις 1-3 log 10 του HBV DNA στον ορό του αίµατος των ασθενών. Το γεγονός αυτό υπογραµµίζεται και ενισχύεται από την παρατήρηση ότι η θεραπεία µε λαµιβουδίνη σε ασθενείς µε χρόνια HBV λοίµωξη µπορεί να αυξήσει την συχνότητα ανίχνευσης και να βελτιώσει την βιολογική δράση των κυκλοφορούντων στην περιφέρεια ειδικών βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ λεµφοκυττάρων έναντι του HBV. Επιπρόσθετα πειραµατικά δεδοµένα που υποστηρίζουν αυτή την άποψη έχουν πρόσφατα αναφερθεί σε πειραµατικά µοντέλα HBV λοίµωξης σε ζώα,στα οποία η αποτελεσµατικότητα θεραπευτικού εµβολιασµού ενισχύεται σηµαντικά µετά 66

τη χρήση αντιϊκής θεραπευτικής αγωγής.η µελέτη της κινητικής και δυναµικής του HBV µπορεί να βοηθήσει στην πληρέστερη κατανόηση των µηχανισµών δράσης των αντιϊκών φαρµάκων και να βελτιώσει την συνολική αντιµετώπιση των ασθενών µε χρόνια ηπατίτιδα Β. Η ύπαρξη ευαίσθητων και ακριβών µεθόδων ποσοτικής µέτρησης του ccc H B V D N A στον ηπατικό ιστό είναι δυνατόν να βελτιώσει την ερµηνεία της µαθηµατικής ανάλυσης της κινητικής του HBV σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β οι οποίοι λαµβάνουν αντιϊκή αγωγή.τα δεδοµένα και αποτελέσµατα της κινητικής µελέτης και τα αντίστοιχα του ccc HBV DNA θα πρέπει να συνερµηνευθούν σε απώτερο χρόνο,µε τα κλινικά αποτελέσµατα της θεραπευτικής ανταπόκρισης,των ασθενών µε χρόνια HBV λοίµωξη οι οποίοι θεραπεύθηκαν για µακρό χρονικό διάστηµα µε κριτήρια παρατεταµένης ή µη ιολογικής ανταπόκρισης. 1.3 Ανάλυση των αποτελεσµάτων ιϊκού φορτίου -εναρµονισµός δεδοµένων στο πρότυπο (data fitting) Για τον υπολογισµό των ατοµικών ανά ασθενή παραµέτρων έγιναν ατοµικές µη γραµµικές συσχετίσεις µε την µέθοδο των ελάχιστων τετραγώνων (non-linearleast squares fits) χρησιµοποιώντας έναν αλγόριθµο Levenberg-Marquardt. Προκαταρκτικά,καµπύλες συσχετίσεων τιµών ιϊκού φορτίου έγιναν για κάθε ασθενή καθ όλο το διάστηµα των τριών πρώτων µηνών της θεραπείας του. Για την πλήρωση, όµως, του αξιώµατος εγκυρότητας του µαθηµατικού προτύπου ότι ο αριθµός των κυττάρων-στόχων λοίµωξης µε HBV παραµένει σταθερός,οι καµπύλες συσχετίσεων περιορίσθηκαν στα δεδοµένα που συλλέχθηκαν κατά τον πρώτο µήνα της θεραπείας.όλες οι παράµετροι ήταν ελεύθεροι µε εξαίρεση την παράµετρο η,η οποία θεωρήθηκε σταθερά µε τιµή 0,5 για όλους τους ασθενείς.ο χρόνος ηµιζωής των ιϊκών σωµατιδίων υπολογίσθηκε από την µετρώµενη τιµή της παραµέτρου c µε τον τύπο ln (2)/c και ο χρόνος ηµιζωής των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη ln(2)/δ. Στην στατιστική ανάλυση,χρησιµοποιήθηκε η δοκιµασία χ2 για την ανάλυση συγκρίσεων µεταξύ κατηγορικών παραµέτρων. Μονοπαραγοντική ανάλυση ποικιλοµορφίας (single factor analysis of variance) (ANOVA) έγινε για να εξετασθούν οι συσχετίσεις µεταξύ της κάθε θεραπείας και της κάθε κινητικής παραµέτρου. Ποσοτικές µεταβλητές συγκρίθηκαν µεταξύ των οµάδων µε την δοκιµασία tγια τον έλεγχο της στατιστικής σηµαντικότητας των συσχετίσεων. 67

ΑΣΘΕΝΕΙΣ Μελετήθηκαν προοπτικά πενήντα (n=50) ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητική στο HBeAg. Η λοίµωξη µε τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV)ήταν µε στελέχη γονότυπου D σε όλους τους ασθενείς. Η διάγνωση της χρόνιας ηπατίτιδας Β µε αρνητικό το HBeAg βασίσθηκε σε : α)hbsag θετικό µε HBeAg αρνητικό στον ορό για περισσότερο χρονικό διάστηµα από 6 µήνες, β) αυξηµένα επίπεδα αλανίνης αµινοτρανσφεράσης (ALT), είτε σταθερά, είτε διαλλειπόντως, γ)hbv DNA στον ορό σε επίπεδα >100.000 copies/ml (AmplicorM onitor) και δ)ιστολογικές αλλοιώσεις χρόνιας ηπατίτιδας στην ηπατική βιοψία εκτιµώµενα µε το τροποποιηµένο σύστηµα ταξινόµησης του σταδίου και της ενεργότητας της νόσου κατά Ishak 139. Τα κύρια κριτήρια εισόδου στην µελέτη ήταν : 1)Ενήλικοι ασθενείς ηλικίας από 18 έως 69 ετών,µε χρόνια ηπατίτιδα Β,αρνητική στο HBeAg (HBeAg-ve)χωρίς προηγούµενη θεραπευτική παρέµβαση. 2)οι ασθενείς ήταν αρνητικοί σε λοιµώξεις µε τους ιούς HCV,HIV,HDV. 3) οι ασθενείς δεν είχαν ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα µε διενέργεια αξονικής τοµογραφίας ήπατος σε τριπλή φάση (αρτηριακή,πυλαίας,ισοδυναµίας)σε αξονικό τοµογράφο ελικοειδή PQ 5000 (4,6 B1). 4)τα επίπεδα της a-1 εµβρυϊκής σφαιρίνης ορού ήταν < 50 ng/ml, 5)τα επίπεδα της ALT ήταν > 1.5 και < 10X Α.Φ.Τ (ανώτερη φυσιολογική τιµή), 6)ηπατική βιοψία έως και ένα έτος πριν την είσοδο στη µελέτη µε βαθµολογία κατά Ishak τουλάχιστον > 6 συνολικά (ίνωση >1), 7) ασθενείς µε αντιρροπούµενη κλινικά ηπατική νόσο,χωρίς κιρσούς οισοφάγου, ασκίτη,ηπατική εγκεφαλοπάθεια,ίκτερο και κυτταροπενίες από υπερσπληνισµό, 8)επίπεδα HBV DNA του ορού > από 10 5 copies/ml. 9) οι ασθενείς έδωσαν την ενηµερωµένη τους συγκατάθεση για την µελέτη,καθώς και συµφώνησαν πλήν των συχνών διαδοχικών αιµοληψιών του πρώτου µήνα της θεραπείας για µέτρηση του ιϊκού φορτίου, να υποβάλλονται σε µηνιαία κλινική 68

φυσική εξέταση και σε βασικό αιµατολογικό έλεγχο (γενική εξέταση αίµατος,χρόνο προθροµβίνης,βιοχηµικό έλεγχο,γενική εξέταση ούρων). 10) η κύρια µετρώµενη παράµετρος αποτελεσµατικότητας ήταν η µακροχρόνια ιολογική ανταπόκριση όπως αυτή ορίζεται µε βάση την µεθοδολογία που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα µελέτη. Οι ασθενείς ήταν άνδρες 40/50 (80% ) µε µέση ηλικία 40 ετών + 11.1 (σταθερή απόκλιση)και ALT κατά µέσο όρο 71.6 + 63.9 IU/L (σταθερή απόκλιση). Το ποσοστό κίρρωσης στην ηπατική βιοψία ήταν 10/50 (20% ). Οι ασθενείς θεραπεύθηκαν µε ένα από τα κατωτέρω αναφερόµενα θεραπευτικά σχήµατα επί 48 εβδοµάδες: ώδεκα ασθενείς (n=12)έλαβαν µόνον ιντερφερόνη α-2α 4.5 MU,τρεις φορές την εβδοµάδα (IFN -α) έκα ασθενείς (n=10)έλαβαν µόνον λαµιβουδίνη 100m g ηµερησίως (LA M ) έκα ασθενείς (n=10) έλαβαν IFN -α σε συνδυασµό µε LAM στις προαναφερθείσες για κάθε φάρµακο δόσεις, Έξι ασθενείς (n=6)έλαβαν πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη α-2α 180µg µια φορά την εβδοµάδα (PEG -IFN -α) Επτά ασθενείς (n=7) έλαβαν PEG -IFN -α σε συνδυασµό µε LA M (PEG -IFN -α+la M )στις προαναφερθείσες για κάθε φάρµακο δόσεις και, Ένδεκα ασθενείς (n=11) έλαβαν αδεφοβίρη 10m g ηµερησίως (ADF) σε συνδυασµό µε LA M 100m g ηµερησίως (ADF+LAM ). Από αυτή την τελευταία οµάδα ασθενών,οι 6 ασθενείς επαναθεραπεύθηκαν µε το σχήµα ADF+LAM µετά την αποτυχία του πρώτου θεραπευτικού σχήµατος το οποίο χρησιµοποιήθηκε. Το HBV DNA του ορού προσδιορίσθηκε ποσοτικά µε την χρήση µεθοδολογίας αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης σε πραγµατικό χρόνο (realtime PCR) µε ουδό ανίχνευσης (αναλυτικη ευαισθησία της µεθόδου) 350 IU/mlκαι έκφραση ποσότητος σε ιεθνείς µονάδες (IU) µε βάση πρότυπη ποσότητα χορηγηθείσα από την Acrom etrix.σε όλες τις περιπτώσεις τα επίπεδα του HBV DNA µετρήθηκαν στον ορό των ασθενών πριν την έναρξη της αγωγής,τουλάχιστον µία φορά. Στους ασθενείς που έλαβαν PEG -IFN -α, PEG -IFN -α+la M και σε επτά ασθενείς που έλαβαν LA M τα επίπεδα του HBV DNA µετρήθηκαν κατά την έναρξη της αγωγής,κατόπιν στις 8 ώρες (8h),1,2,4,5 και 7 ηµέρες και σε 2,3,4,5,6,8,12, 69

18,24 εβδοµάδες µετά την έναρξη της αγωγής.στην οµάδα ADF+LAM η συλλογή ήταν παρόµοια,πλην του δείγµατος των 8 ωρών µετά την έναρξη της αγωγής. Οι µετρήσεις έγιναν σε περισσότερα δείγµατα στους 3 από τους ασθενείς µε LA M και σε όλους τους ασθενείς που έλαβαν IFN -α η IFN -α+la M.Το HBV DNA ορού µετρήθηκε σε δείγµατα κατά την έναρξη θεραπείας,κατόπιν κάθε 6h έως 48h και κατόπιν κάθε 12h έως την ηµέρα 5. Κατόπιν µετρήθηκε σε δείγµατα που ελήφθησαν κάθε δεύτερη ηµέρα έως την 15η ηµέρα,κάθε τρίτη ηµέρα έως την ηµέρα 30 και κατόπιν κάθε µήνα έως τον 6 0 µήνα της αγωγής.σε όλους τους ασθενείς µετά τις πρώτες 24 εβδοµάδες (ή 6 µήνες αντίστοιχα)της αγωγής µετρήθηκε κάθε 3 µήνες HBV DNA έως το τέλος της αγωγής των 48 εβδοµάδων και σε 6 και 12 µήνες µετά το τέλος της θεραπείας προκειµένου να διερευνηθεί µακροχρόνια ιολογική ανταπόκριση των ασθενών στην θεραπεία. Πρέπει να αναφερθεί ότι συνολικά έγινε συλλογή 10 έως 26 δειγµάτων ορού κατά την διάρκεια του πρώτου µήνα της αγωγής,µε σκοπό τον χαρακτηρισµό της κινητικής και δυναµικής του HBV.Τα ιϊκά φορτία πριν την έναρξη της αγωγής, υπολογιζόµενα ως ο µέσος των µετρήσεων του HBV DNA κάθε ασθενή έως και τον χρόνο µηδέν t=0 της έναρξης,διακυµάνθηκαν από 4.690 IU/mlέως 1.53x10 9 IU/ml (Πίνακας 6),µε έναν µέσον όρο 1.2x10 8 +3.2x10 8 IU/ml. εν υπήρχαν σηµαντικού στατιστικά βαθµού διαφορές στα µέσα ιϊκά φορτία προ θεραπείας µεταξύ των οµάδων των ασθενών µε τις αντίστοιχες θεραπείες. 70

Πίνακας 6. Ιϊκά φορτία προ θεραπείας για τους ασθενείς που αναλύθηκαν (µετά εναρµόνιση στο µοντέλο) µέσες τιµές ± σταθερή απόκλιση (SD ). Αρ.Ασθενών Αγωγή Προ-θεραπείας V 1 IFN 4.18e+07 2 IFN 7.23e+07 3 IFN 1.04e+07 4 IFN 1.66e+04 5 IFN 4.50e+05 6 IFN 3.80e+05 30 IFN 2.68e+06 31 IFN 1.67e+06 45 IFN 7.77e+05 1.45e+07 ± 2.55e+07 8 LA M 4.34e+05 9 LA M 2.84e+07 11 LA M 2.91e+07 12 LA M 1.37e+08 13 LA M 5.28e+07 14 LA M 5.76e+07 15 LA M 4.16e+04 16 LA M 5.49e+04 3.82e+07 ± 4.61e+07 18 IFN +LA M 2.10e+08 19 IFN +LA M 3.22e+07 20 IFN +LA M 3.96e+06 21 IFN +LA M 1.27e+09 22 IFN +LA M 3.11e+07 35 IFN +LA M 2.00e+08 37 IFN +LA M 2.00e+06 2.50e+08 ± 4.60e+08 23 PEG +LA M 7.83e+05 24 PEG +LA M 1.53e+09 25 PEG +LA M 1.53e+07 26 PEG +LA M 7.65e+08 27 PEG +LA M 6.79e+07 28 PEG +LA M 4.69e+03 29 PEG +LA M 2.40e+05 3.40e+08 ± 5.95e+08 40 PEG 1.03e+08 41 PEG 2.01e+07 42 PEG 7.95e+04 43 PEG 2.30e+08 8.84e+07 ± 1.04e+08 11b A D F+LA M 6.03e+03 12b A D F+LA M N A 14b A D F+LA M 3.23e+06 27b A D F+LA M N A 47 ADF+LAM 1.27e+05 48 ADF+LAM 6.38e+04 50 ADF+LAM 1.97e+04 6.90e+05 ± 1.42e+05 71

2.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.1.Καµπύλες πτώσης ιϊκού φορτίου του HBV -Ανάλυση µορφολογίας Στους περισσότερους ασθενείς τα επίπεδα του HBV DNA έδειξαν διφασική µορφολογία καµπυλών πτώσης του ιϊκού φορτίου µετά την έναρξη της θεραπείας. Όπως περιγράφηκε σε προηγούµενες µελέτες,η διφασική καµπύλη πτώσης του ιϊκού φορτίου χαρακτηρίζεται από µία πρώϊµη, ταχεία πτώση του HBV DNA,η οποία ακολουθείται από µία βραδύτερη σε ρυθµό δεύτερη φάση ελάττωσης. Η αρχική ελάττωση κατά την πρώτη φάση χαρακτηρίζεται από την µαθηµατική ανάλυση µε τον ρυθµό κάθαρσης C των ελεύθερα κυκλοφορούντων στον ορό ιϊκών σωµατιδίων,ενώ η καµπύλη πτώσης της δεύτερης φάσης αντανακλά τον ρυθµό καταστροφής (κάθαρσης)των ηπατοκυττάρων µε HBV.Αυτή η δεύτερη φάση σε γενικές γραµµές χαρακτηρίζεται από µία από δύο δυνητικά παρατηρούµενες µορφολογίες καµπυλών. Η πρώτη µορφολογία χαρακτηρίζεται από µια βραδεία σε ρυθµό ελάττωση κατά την δεύτερη φάση,ενώ η δεύτερη µορφολογία από µια επίπεδη ή σχεδόν επίπεδη δεύτερη φάση.σε δύο περιπτώσεις (ασθενείς P3 και P27) υπήρξε ένα πολύ µακρύ χρονικό διάστηµα καθυστέρησης µεταξύ του χρονικού σηµείου έναρξης της θεραπείας και ενός καταγραφόµενου αποτελέσµατος της θεραπείας στο ιϊκό φορτίο. Σε προηγούµενα δηµοσιευµένη ανάλυση παρατηρήθηκε µορφολογία καµπυλών πλέον σύνθετη από την κλασσική διφασική καµπύλη σε ασθενείς µε HBV λοίµωξη υπό θεραπεία, αλλά οι ασθενείς αυτοί έπασχαν από χρόνια ηπατίτιδα Β θετική στο HBeAg (XHB HBeAg θετική).ενώ οι περισσότεροι από τους ασθενείς που περιελήφθησαν στην παρούσα µελέτη εµφάνισαν µία καθαρά διφασική µορφολογία καµπύλης πτώσης του ιϊκού φορτίου,η καµπύλη σε ορισµένους ασθενείς (όπως π.χ στον ασθενή 4 κατά την διάρκεια του πρώτου µήνα αγωγής και στους ασθενείς 15, 18, 19, 23, 27, 28, και 29 κατά µεγαλύτερο του µηνός διάστηµα) φαίνεται να εµφανίζει οµοιότητα µε την µορφολογία της κλιµακωτής καµπύλης (staircase)που έχει περιγραφεί προηγουµένως. Τα επίπεδα του HBV DNA σε 37 ασθενείς ήταν αρνητικά κάτω από τον ουδό ανίχνευσης των 350 IU/mlεντός 24 εβδοµάδων από την έναρξη θεραπείας.σε όλες όµως τις περιπτώσεις των ασθενών που θεραπεύθηκαν επί ένα έτος και κατόπιν παρακολουθήθηκαν προοπτικά επί ένα έτος µετά των διακοπή της θεραπείας, η κάθαρση του ιού σε επίπεδα µη ανιχνεύσιµα δεν ήταν µακροχρόνια.ιολογική και 72

βιοχηµική υποτροπή µετά το τέλος της αγωγής εµφανίσθηκε σε όλους τους ασθενείς µε παροδική κάθαρση υπό θεραπεία του HBV DNA,σε διάστηµα 3 έως 12 µηνών µετά το τέλος της αντίστοιχης αγωγής.πρέπει να σηµειωθεί το γεγονός ότι όλοι οι ασθενείς είχαν λοίµωξη µε στέλεχος γονότυπου D του HBV,ο οποίος εµφανίζει κατά την διεθνή εµπειρία ιδιαίτερη αντοχή και ανθεκτικότητα σε όλες τις χρησιµοποιούµενες θεραπείες µε αντιϊκά ή ανοσορρυθµιστικά φάρµακα. Η κατά µέσον όρο πτώση του ιϊκού φορτίου µετά 48 ώρες από την έναρξη της θεραπείας ήταν 0,86 log 10 IU/ml.Αυτή η ελάττωση του HBV DNA κατά το διάστηµα των πρώτων 48 ωρών ήταν στατιστικά σηµαντικά διαφορετική ανά θεραπευτικό σχήµα (ANOVA,P=0.0001)Οι κατά µέσον όρο πτώσεις του ιϊκού φορτίου ήταν: 1,45 log 10 IU/ml, 1,14 log 10 IU/ml 1,05 log 10 IU/ml, 0,57 log 10 IU/ml 0,48 log 10 IU/ml,και 0,48 log 10 IU/ml για τους ασθενείς που θεραπεύθηκαν µε λαµιβουδίνη (LAM ), αδεφοβίρη σε συνδυασµό µε λαµιβουδίνη (ADF+LAM ), Ιντερφερόνη-α σε συνδυασµό µε λαµιβουδίνη (IFN α+la M ), πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη-α σε συνδυασµό µε λαµιβουδίνη (PEG -IFN -α+la M ), IFN α και PEG -IFN -α αντίστοιχα. Οι αρχικές αυτές διαφορές έτειναν να είναι λιγότερο εκσεσηµασµένες σε συνάρτηση µε τον χρόνο, και σε 1 µήνα όλες οι οµάδες ασθενών εµφάνισαν ελλάτωση του ιϊκού φορτίου όµοιου βαθµού (µεταξύ -2,9 και 3,5 log 10 IU/ml)πλήν της µονοθεραπείας µε κλασσική ιντερφερόνη (IFN α),-1,5 log 10 IU/ml.Τα επίπεδα του HBV DNA και η πτώση του ιϊκού φορτίου συγκρίθηκαν επίσης σε όλες τις οµάδες ασθενών που έλαβαν διαφορετικά θεραπευτικά σχήµατα κατά την ηµέρα 7, 21,28 και στις 12 εβδοµάδες αγωγής.οι αναλύσεις αυτές έδειξαν ότι οι ασθενείς που έλαβαν κλασσική IFN α εµφάνισαν ελάττωση ιϊκού φορτίου µικρότερου βαθµού κατά την ηµέρα 7 (P=0.13), ηµέρα 21 (P=0.03), ηµέρα 28 (P=0.01) και στις 12 εβδοµάδες αγωγής (P=0.08) συγκρινόµενοι µε τους ασθενείς που έλαβαν οποιαδήποτε διαφορετική θεραπεία.ανάλυση των δεδοµένων του ιϊκού φορτίου µετά µετατροπή των τιµών σε φυσικούς λογαρίθµους,έδειξαν επίσης σηµαντική θετική συσχέτιση µεταξύ του HBV DNA προ έναρξης θεραπείας και του HBV DNA την ηµέρα 28 και στις 12 εβδοµάδες αγωγής,(p<0.001). 73

2.2.Παράµετροι Κινητικής Οι παράµετροι της κινητικής και δυναµικής του HBV οι οποίες υπολογίσθηκαν από την ανάλυση µε µη γραµµική συσχέτιση µε την µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων για κάθε ένα ασθενή παρουσιάζονται στον πίνακα 7.Οι κατά µέσον όρο τιµές για τον ρυθµό κάθαρσης των ιϊκών σωµατιδίων (C) και των ηπατοκυττάρων µε HBV (δ)ήταν 1.9+2.7/ηµέρα και 0.14+0.22/ηµέρα αντίστοιχα.ο υπολογιζόµενος αντίστοιχα χρόνος ηµιζωής ήταν 0.7+0.5/ηµέρες (17+12 ώρες)/για τα ιϊκά HBV σωµατίδια και 18.7+39.2 ηµέρες για τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη.η υπολογιζόµενη κατά µέσον όρο αποτελεσµατικότητα (ε)-efficacy όλων των σχηµάτων θεραπευτικής παρέµβασης τα οποία χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη ήταν 0.86+0.20,και η κατά µέσον όρο καθυστέρηση (τ) µεταξύ έναρξης θεραπείας και καταγραφοµένου αποτελέσµατος επίδρασης στο ιϊκό φορτίο ήταν 0.6+0.8ηµέρες (14+19 ώρες),µη συµπεριλαµβανόµένων 2 ασθενών που εµφάνισαν πολύ µεγάλες χρονικές αρχικές καθυστερήσεις (ο ασθενής 3 µε IFN -α,24 ηµέρες και ο ασθενής 27 µε PEG -IFN -α+la M,10.7 ηµέρες).τα επίπεδα του HBV DNA πριν την έναρξη της θεραπείας ήταν ο πλέον σηµαντικός προγνωστικός παράγοντας για την ανταπόκριση των ασθενών στην θεραπεία. Οι ασθενείς που εµφάνισαν µη ανιχνεύσιµα επίπεδα HBV DNA (< 350 IU/ml) στις 7 ή 8 εβδοµάδες από την έναρξη της αγωγής,είχαν σηµαντικά χαµηλότερα επίπεδα HBV DNA κατά την έναρξη, ανεξάρτητα από το σχήµα θεραπευτικής παρέµβασης που ακολουθήθηκε.επιπλέον,τα επίπεδα HBV DNA πρό της έναρξης αγωγής συσχετίσθηκαν µε τον ρυθµό καταστροφής (κάθαρσης)των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη (P=0.00005) και την αποτελεσµατικότητα των φαρµάκων (P=0.03).Όταν η ανάλυση στρωµατοποιήθηκε µε βάση τα βασικά επίπεδα του HBV DNA βρέθηκε µια σηµαντικού βαθµού µεγαλύτερη αρχική αντιϊκή αποτελεσµατικότητα (ε) στις οµάδες LA M και LAM +ADV (P=0.046), και ένας µεγαλύτερος ρυθµός καταστροφής (κάθαρσης) των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη στην οµάδα της PEG -IFN -α (P=0.049). Όπως περιγράφηκε ανωτέρω, µε την ανάλυση παρατηρήθηκαν δύο τύποι µαθηµατικών καµπυλών ελάττωσης του HBV DNA.Ο πρώτος τύπος (Τύπος 1)που χαρακτηρίζεται από µία ταχεία πρώτη φάση και µια βραδύτερου βαθµού δεύτερη φάση,καθορίσθηκε ως ο τύπος που έχει ένα χρόνο ηµιζωής των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη µικρότερο από 120 ηµέρες.ο δεύτερος τύπος (Τύπος 2),ο οποίος επίσης χαρακτηρίζεται από µία ταχεία πρώτη φάση αλλά σχετικά επίπεδη δεύτερη 74

φάση,καθορίσθηκε ως ο τύπος που έχει ένα χρόνο ηµιζωής των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη µεγαλύτερο από 120 ηµέρες. 34 ασθενείς από την µαθηµατική ανάλυση εµφάνισαν τον τύπο 1,ενώ οι υπόλοιποι 8 από τους ασθενείς των οποίων τα πειραµατικά δεδοµένα εναρµονίσθηκαν µε το περιγραφόµενο µοντέλο κινητικής και δυναµικής του HBV εµφάνισαν τον τύπο 2 (Εικόνα 9,Εικόνα 10).Κατά µέσο όρο,οι ασθενείς µε καµπύλη πτώσης του HBV DNA του τύπου 1 είχαν υψηλότερα ιϊκά φορτία προ θεραπείας από αυτούς που εµφάνισαν τον τύπο 2 (P=0.04, M ann- Whitney).Ενώ όλοι οι ασθενείς που έλαβαν αγωγή µε IFN -α+la M εµφάνισαν τύπο 1, το ποσοστό των ασθενών µε τον κάθε τύπο (1 ή 2) δεν φάνηκε να διαφέρει σηµαντικά ανάλογα µε το θεραπευτικό σχήµα που ακολουθήθηκε.οι µαθηµατικές τιµές των παραµέτρων που υπολογίσθηκαν για ε,c, και τ δεν διέφεραν στατιστικά σηµαντικά µεταξύ ασθενών µε τύπο 1 ή 2 καµπύλης πτώσης του HBV DNA. Εναρµονισµός δεδοµένων στο πρότυπο (µοντέλο) 2.3 Μεθοδολογικά προβλήµατα. Για µερικούς ασθενείς,κατά την ανάλυση των καµπυλών πτώσης του ιϊκού φορτίου τα δεδοµένα δεν ήταν δυνατόν να εναρµονισθούν στο µαθηµατικό πρότυπο (µοντέλο) που χρησιµοποιήθηκε, Το γεγονός αυτό παρατηρήθηκε στις ακόλουθες περιπτώσεις : α)η θεραπεία δεν επέφερε πτώση του ιϊκού φορτίου (5 περιπτώσεις-ασθενείς P10, P17,P32,P38,P46) β)το ιϊκό φορτίο εµφάνισε ταχύτατη πτώση σε επίπεδα <350 IU/mlκατά την πρώτη εβδοµάδα αγωγής µε αποτέλεσµα την µειωµένη συγκέντρωση δεδοµένων για εναρµονισµό (4 περιπτώσεις-ασθενείς P24b,P34,P36,P49). γ) Η δειγµατοληψία που δεν ήταν επαρκής στον καθορισµένο χρόνο από το πρωτόκολλο (5 περιπτώσεις ασθενείς P7,P26b,P33,P39,P51). 2.4. ευτερεύοντα αποτελέσµατα από την µαθηµατική ανάλυση των κινητικών παραµέτρων Παρά το γεγονός ότι µε µονοπαραγοντική ανάλυση ποικιλοµορφίας (ανάλυση ANOVA) δεν διαπιστώθηκαν µεταξύ των οµάδων σηµαντικές διαφορές στις παραµέτρους της κινητικής και δυναµικής του HBV όταν δεν έγινε διαστρωµάτωση της ανάλυσης µε βάση τα επίπεδα HBV DNA προ έναρξης αγωγής (Εικόνα 11),οι 75

ασθενείς που έλαβαν LAM ή LAM +AD F βρέθηκε ότι εµφάνιζαν υψηλότερες τιµές ε και c (P=0.11 και P=0.10,αντίστοιχα)σε σύγκριση µε τις άλλες ενοποιηµένες οµάδες. Επιπρόσθετα,οι ασθενείς στην οµάδα της IFN -α είχαν µικρότερη τιµή δ (P=0.06)και οι ασθενείς στην οµάδα της PEG -IFN -α και PEG -IFN -α +LA M είχαν σηµαντικά χαµηλότερη τιµή C (P=0.01) από τους ασθενείς σε όλες τις άλλες οµάδες των θεραπευτικών σχηµάτων.οι εναρµονισµοί (fits) του κατά µέσον όρο ιϊκού φορτίου των ασθενών σε κάθε οµάδα θεραπευτικού σχήµατος κατά τον πρώτο µήνα της θεραπείας έδειξε παρόµοιες τάσεις όπως και οι ανωτέρω αναφερθέντες εναρµονισµοί κατ άτοµο.ειδικότερα,ο εναρµονισµός των µετρήσεων κατά µέσον όρο της οµάδας LA M και LAM +ADF έδειξε την υψηλότερη τιµή ε και µια σχετικά υψηλή τιµή C σε σύγκριση µε τις άλλες οµάδες.επιπρόσθετα,ο εναρµονισµός των δεδοµένων της οµάδας της IFN α είχε την χαµηλότερη τιµή του δ, και ο εναρµονισµός των δεδοµένων της οµάδας της PEG -IFN α και PEG -IFN α+la M είχε την χαµηλότερη τιµή της παραµέτρου C. Οι παράµετροι δ του ρυθµού καταστροφής των ηπατοκυττάρων µε HBV και της φαρµακευτικής αποτελεσµατικότητας ε ήταν οι µόνοι κινητικοί παράµετροι που συσχετίζονταν µε το κατά µέσο όρο προ θεραπείας ιϊκό φορτίο. 2.5.Κάθαρση του HBV Στη παρούσα µελέτη ως πρώϊµη κάθαρση του HBV από τον ορό του αίµατος των ασθενών,ορίζεται η ελάττωση των επιπέδων του HBV DNA κάτω από τον ουδό ανίχνευσης των 350 IU/mlτης µεθόδου που χρησιµοποιήθηκε,κατά τις πρώτες 24 εβδοµάδες της αγωγής.σε όλες τις περιπτώσεις που επιτεύχθηκε πρώϊµη κάθαρση του HBV,τα επίπεδα του HBV DNA παρέµειναν µη ανιχνεύσιµα καθ όλη τη διάρκεια της χορηγούµενης θεραπείας των 48 εβδοµάδων.με βάση τον ανωτέρω ορισµό,τριανταεπτά (n=37)ασθενείς εµφάνισαν πρώϊµη κάθαρση του HBV.Μετά το τέλος της καθορισµένης χρονικά αγωγής µε βάση το πρωτόκολλο της µελέτης στην κάθε µια θεραπευτική οµάδα,όλοι οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν επί 48 επιπλέον εβδοµάδες,µε σκοπό να διαπιστωθεί εάν η πρώϊµη κάθαρση του HBV DNA ήταν και µακροχρόνια προοπτικά κατά τη πάροδο του χρόνου.η µακροχρόνια ή κατά δεύτερο ορισµό εµµένουσα ιολογική ανταπόκριση αποτελεί το σηµαντικότερο αντικειµενικά, πλην της απώλειας του HBsAg,κλινικό κριτήριο ιολογικής ανταπόκρισης στην θεραπεία.η µέτρηση των επιπέδων του HBV DNA στον ορό των ασθενών στις 48 εβδοµάδες µετά το τέλος της χορηγηθείσας σε κάθε περίπτωση αγωγής,έδειξε ότι σε 76

καµιά περίπτωση πρώϊµης κάθαρσης του HBV,η κάθαρση αυτή δεν διατηρήθηκε µακροχρόνια.o ιϊκός πολλαπλασιασµός και τα επίπεδα του HBV DNA επανήλθαν στον ορό σε ποσότητα µεγαλύτερη των 350 IU/ml. Τα επίπεδα του HBV DNA µετρήθηκαν σε 48 εβδοµάδες µετά το τέλος της αγωγής και σε 12 και 24 εβδοµάδες µετά αγωγή. Ιολογικές υποτροπές παρατηρήθηκαν να πρωτοεµφανίζονται στα 3 χρονικά διαστήµατα του ιολογικού ελέγχου (12, 24, 48 εβδοµάδες). Σε όλες τις περιπτώσεις η ιολογική υποτροπή συνυπήρχε ή παρατηρήθηκε εντός µηνός από την βιοχηµική υποτροπή ( αύξηση της A LT).Στις οµάδες των ασθενών IFN α,peg - IFN +LA M και IFN α+la M υπήρχε από ένας ασθενής στην κάθε οµάδα µε επίπεδα HBV DNA µεγαλύτερα από 350IU/ml, αλλά µικρότερα από 5.000 IU/mlκαι φυσιολογικές τιµές ALT ορού στις 12, 24 και 48 εβδοµάδες. Πρέπει εδώ να σηµειωθεί ότι τα αποτελέσµατα αυτά της µακροχρόνιας ιολογικής ανταπόκρισης είναι αυτά που αναµένονται για ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητική στο HBeAg. Όλοι οι ασθενείς είχαν λοίµωξη µε στέλεχος του ιδιαίτερα ανθεκτικού γονότυπου D του HBV (INNO-LiPA HBV genotype assay-innogenetics). Στις µεγάλες,φάσης III κλινικές µελέτες θεραπείας σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητική στο H B ea g, ο γονότυπος D εµφάνιζε µικρότερα ποσοστά ιολογικής,βιοχηµικής ή συνδυασµένης µακροχρόνιας ανταπόκρισης αλλά η διαφορά δεν ήταν σηµαντική συγκριτικά µε τους γονότυπους Β και C. Όσον αφορά στην πρώϊµη ιολογική ανταπόκριση εντός των πρώτων 12 εβδοµάδων από την έναρξη της αγωγής,δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση µε την µορφολογία καµπυλών κινητικής του HBV τύπου 1 ή τύπου 2 (Χρόνος ηµιζωής των ηπατοκυττάρων µε HBV υπολογιζόµενος µικρότερος ή µεγαλύτερος από 120 ηµέρες αντίστοιχα). Για παράδειγµα αναφέρονται 5 ασθενείς µε πρώϊµη ιολογική ανταπόκριση εντός των πρώτων 12 εβδοµάδων (ασθενείς 15, 16, 23, 28 και 29).Οι 3 είχαν µορφολογία καµπύλης τύπου 2 και οι 2 τύπου 1 (παραποµπή στις ατοµικές καµπύλες ανά ασθενή- µορφολογία καµπύλης κινητικής). Όπως αναφέρεται στα κύρια αποτελέσµατα της µελέτης,τα επίπεδα του HBV DNA προ έναρξης της αγωγής ήταν ο πλέον σηµαντικός προγνωστικός παράγοντας για την ανταπόκριση (πρώϊµη ιολογική ) στη θεραπεία και όχι η µορφολογία και η κλίση των επιµέρους καµπυλών.οι οκτώ ασθενείς µε µορφολογία καµπύλης Τύπου 2 είχαν κατά µέσο όρο χαµηλότερο ιϊκό φορτίο προ έναρξης αγωγής από τους 34 ασθενείς µε µορφολογία καµπύλης Τύπου 1 (P=0.04,M ann-whitney).η µαθηµατική ανάλυση των παραµέτρων κινητικής και δυναµικής του HBV έδειξε ότι η παράµετρος 77

δ ήταν µικρότερη και η παράµετρος ε µεγαλύτερη στους ασθενείς που είχαν HBV DNA µη ανιχνεύσιµο στις 12 εβδοµάδες σε σύγκριση µε αυτούς που είχαν ανιχνεύσιµο (>350 IU/ml) P=0.08 για το δ,p=0.045 για το ε.οι τιµές για τις παραµέτρους C και τ δεν διέφεραν σηµαντικά µεταξύ των δύο προαναφερθέντων οµάδων.οι ασθενείς µε µη ανιχνεύσιµα HBV DNA επίπεδα στις 12 εβδοµάδες είχαν σηµαντικά χαµηλότερα επίπεδα ιϊκού φορτίου προ έναρξης αγωγής,από εκείνους που είχαν ανιχνεύσιµα επίπεδα HBV DNA κατά την δεδοµένη χρονική στιγµή (P=0.007). 78

Πίνακας 7. Παράµετροι κινητικής του HBV Ασθενής V0 (IU/ml) c (ηµέρα-1) δ (ηµέρα-1) ε τ (ηµέρες) V ηµι-ζωή (ηµέρες) Iηµι-ζωή (ηµέρες) 1 5.4E+07 2.32 0.072 0.7269 1.60 0.30 9.6 2 6.5E+07 0.42 0.000 0.9652 0.00 1.64 >120 3 9.6E+06 2.81 0.000 0.9535 24.00 0.25 >120 4 1.5E+04 0.24 0.053 0.8554 2.87 2.84 13.2 5 3.6E+05 1.30 0.061 0.9879 0.34 0.53 11.4 6 3.3E+05 1.32 0.036 0.9527 0.00 0.52 19.2 30 2.6E+06 17.36 0.008 0.5587 0.92 0.04 90.8 31 1.7E+06 1.30 0.027 0.3635 0.00 0.53 25.5 45 5.50E+05 0.64 0.113 0.9851 0.00 1.08 6.1 8 4.1E+05 6.19 0.135 0.9224 1.18 0.11 5.1 9 3.7E+07 2.22 0.139 0.9664 0.75 0.31 5.0 11 3.8E+06 1.81 0.172 0.9340 0.61 0.38 4.0 12 5.2E+07 1.71 0.188 0.8958 0.00 0.40 3.7 13 5.8E+05 0.77 0.029 0.9983 0.00 0.90 23.9 14 5.8E+07 1.93 0.292 0.9644 0.12 0.36 2.4 15 3.6E+04 2.09 0.000 0.9822 0.70 0.33 >120 16 1.3E+04 0.69 0.064 0.9904 0.03 1.01 10.9 18 7.3E+07 0.55 0.028 0.9995 0.00 1.26 25.1 19 3.0E+07 1.58 0.133 0.7788 0.44 0.44 5.2 20 1.3E+06 0.87 0.023 0.9980 0.00 0.79 29.9 21 1.0E+09 1.49 0.184 0.8013 0.25 0.47 3.8 22 3.4E+07 1.06 0.155 0.9405 0.25 0.65 4.5 35 1.8E+08 0.81 0.189 0.9963 0.00 0.85 3.7 37 2.0E+06 0.87 0.067 0.9336 0.00 0.80 10.4 23 3.1E+05 0.77 0.000 0.9985 1.77 0.90 >120 24 1.3E+08 0.62 0.164 0.9123 1.00 1.13 4.2 25 5.7E+06 0.61 0.003 0.8852 0.13 1.15 >120 26 1.0E+09 0.54 0.718 0.3312 2.57 1.29 1.0 27 4.3E+07 0.76 1.266 0.6763 10.67 0.92 0.5 28 2.8E+03 0.46 0.000 0.9829 1.15 1.50 >120 29 2.3E+05 1.30 0.076 0.9904 0.91 0.53 9.1 40 1.0E+08 5.86 0.420 0.8105 0.27 0.12 1.7 41 1.2E+07 3.39 0.199 0.5092 0.76 0.20 3.5 42 4.7E+04 1.53 0.031 0.9838 2.79 0.45 22.3 43 2.4E+08 1.94 0.244 0.2241 1.00 0.36 2.8 11b 6.0E+03 1.54 0.000 0.9418 0.00 0.45 >120 12b 1.0E+07 1.74 0.237 0.8552 1.00 0.40 2.9 14b 3.0E+06 1.63 0.262 0.9856 0.00 0.42 2.6 27b 1.5E+07 1.03 0.166 0.7648 1.31 0.67 4.2 47 9.6E+04 1.18 0.067 0.9918 0.00 0.59 10.3 48 5.4E+04 1.33 0.013 0.9901 0.00 0.52 54.3 50 2.0E+04 1.57 0.000 0.9778 0.45 0.44 >120 Μέση τιµή 7.67E+07 1.91 0.14 0.86 1.42 0.69 18.66 Σταθερή απόκλιση 2.21E+08 2.73 0.22 0.20 3.97 0.51 39.20 79

Εικόνα 9. Τύπος 1 Μορφολογία ελάττωσης του HBV DNA P 01 P 04 100000000 100000 10000000 1000000 10000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 HBV RNA (IU/ml) 1000 100 100 10 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 05 P 06 1000000 1000000 100000 100000 HBV RNA (IU/ml) 10000 1000 100 HBV RNA (IU/ml) 10000 1000 100 10 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 08 P 09 1000000 100000000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 100 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days HBV RNA (IU/ml) 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1-30 -25-20 -15-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days 100000000 10000000 P 11 1000000000 100000000 P 12 1000000 10000000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 HBV RNA (IU/ml) 1000000 100000 10000 1000 100 100 10 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days 80

Εικόνα 9. Τύπος 1 Μορφολογία ελάττωσης του HBV DNA (συνέχεια) P 13 P 14 1000000000 100000000 100000000 10000000 10000000 1000000 HBV RNA (IU/ml) 1000000 100000 10000 1000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 100 100 10 10 1-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 1 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 16 P 18 100000 1000000000 100000000 10000 10000000 HBV RNA (IU/ml) 1000 100 HBV RNA (IU/ml) 1000000 100000 10000 1000 10 100 10 1-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 19 P 20 100000000 10000000 10000000 1000000 1000000 100000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 100 HBV RNA (IU/ml) 10000 1000 100 10 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 21 P 22 10000000000 100000000 HBV RNA (IU/ml) 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days HBV RNA (IU/ml) 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days 81

Εικόνα 9. Τύπος 1 Μορφολογία ελάττωσης του HBV DNA(συνέχεια) P 24 P 26 10000000000 10000000000 1000000000 1000000000 100000000 100000000 HBV RNA (IU/ml) 10000000 1000000 100000 10000 1000 HBV RNA (IU/ml) 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 100 10 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 27 P 29 100000000 1000000 HBV RNA (IU/ml) 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 100 10 1-5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days 82

P 02 P 03 100000000 100000000 10000000 10000000 1000000 1000000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 100 100 10 10 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 1 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 15 P 23 100000 1000000 10000 100000 HBV RNA (IU/ml) 1000 100 HBV RNA (IU/ml) 10000 1000 100 10 10 1-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 1-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days P 25 P 28 100000000 10000 10000000 1000000 1000 HBV RNA (IU/ml) 100000 10000 1000 HBV RNA (IU/ml) 100 100 10 10 1-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 1 0 5 10 15 20 25 30 35 Days Days Εικόνα 10. Τύπος 2 Μορφολογία ελάττωσης του HBV DNA Ο τύπος 1 ορίσθηκε ότι αντιστοιχεί σε υπολογιζόµενο από την κινητική χρόνο ηµιζωής των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη µικρότερο των 120 ηµερών,ενώ ο τύπος 2 σε χρόνο µεγαλύτερο των 120 ηµερών.οι ασθενείς 1-7 έλαβαν IFN -α, οι ασθενείς 8-16 έλαβαν LA M,οι ασθενείς 17-22 έλαβαν IFN -α+la M,και οι ασθενείς 23-29 έλαβαν PEG -IFN - α+la M. P= ασθενής. 83

Εικόνα 11. Μέση τιµή επιπέδων HBV DNA ανά θεραπευτική οµάδα κατά τη διάρκεια του πρώτου µήνα της αγωγής. 2.00E +01 1.80E +01 1.60E +01 1.40E +01 LN HBV RNA 1.20E +01 1.00E +01 8.00E +00 IFN LA M IFN+LAM PEG+LAM 6.00E +00 4.00E +00 2.00E +00 0.00E +00 0 7 14 21 28 Days 84

3.ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μελετήθηκε η πρώϊµη κινητική και δυναµική του HBV σε ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητικής στο HBeAg που λαµβάνουν αγωγή επί 48 εβδοµάδες µε IFN - α,la M,IFN -α +LA M,LAM +AD F,PEG -IFN -α και PEG -IFN -α+la M,µε σκοπό την κατανόηση των µηχανισµών της δράσης της αντιϊκής θεραπείας και την ερµηνεία των κινητικών δεδοµένων µε την αρχική και µακροχρόνια ιολογική ανταπόκριση.η ανάλυση της δυναµικής της HBV λοίµωξης βασίσθηκε στο ισχύον σήµερα βασικό σύγχρονο επιστηµονικά πρότυπο (µοντέλο)της ιογενούς λοίµωξης.παρατηρήθηκε ευρεία διακύµανση στις τιµές των παραµέτρων που υπολογίσθηκαν µεταξύ των διαφορετικών οµάδων ασθενών,αλλά και µεταξύ διαφορετικών ασθενών εντός της κάθε οµάδας θεραπείας. Η ευρεία αυτή διακύµανση είναι ενδεικτική των διαφορετικών µηχανισµών λοίµωξης,δράσεων αντιϊκής αγωγής και αποτυχίας της θεραπείας σε κάθε περίπτωση, και σηµαίνει ότι λειτουργούν εξατοµικευµένοι µηχανισµοί ιδιαίτερα σε κάθε ασθενή.οι φαρµακευτικοί συνδυασµοί,δεν φαίνεται µε τους όρους και τα κριτήρια κινητικής µελέτης τον πρώτο µήνα της αγωγής να εµφανίζουν αθροιστικό ή συνεργιστικό αποτέλεσµα στην κινητική του HBV. Η κάθαρση του HBV DNA στις 12 εβδοµάδες (H BV D N A <350 IU/ml), προβλέπεται από την ανάλυση των δυναµικών παραµέτρων ε και δ,αλλά κυρίως συσχετίζεται µε χαµηλά επίπεδα HBV DNA προ θεραπείας.οιαδήποτε θεραπεία και αν λαµβάνουν οι ασθενείς τα επίπεδα του HBV DNA πρό θεραπείας φαίνεται να είναι το ισχυρότερο προγνωστικό στοιχείο για την αρχική (πρώϊµη) ιολογική ανταπόκριση,όπως αυτή ορίζεται ανωτέρω,από οιαδήποτε κινητική και δυναµική παράµετρο του HBV.Επιπρόσθετα είναι πολύ σηµαντικό το εύρηµα ότι υπήρχε θετική συσχέτιση των επιπέδων HBV DNA πρό θεραπείας µε τον ρυθµό κάθαρσης των ηπατοκυττάρων µε HBV (P=0.00005) και αρνητική µε την φαρµακευτική αποτελεσµατικότητα ε (P=0.03).Όταν η ανάλυση στρωµατοποιήθηκε µε βάση τα επίπεδα του HBV DNA προ αγωγής,παρατηρήθηκε σηµαντικά µεγαλύτερη αρχική αντιϊκή αποτελεσµατικότητα στις οµάδες LA M και LAM +ADF (P=0.046) και µεγαλύτερος ρυθµός κάθαρσης των ηπατοκυττάρων µε HBV στις οµάδες PEG -IFN -α (P=0.049). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης αποδεικνύουν ότι είναι πρωταρχικής σηµασίας η διαστρωµάτωση της ανάλυσης µε βάση τα επίπεδα του HBV DNA προ 85

της έναρξης αγωγής,όταν συγκρίνονται θεραπευτικά σχήµατα για την ιϊκή κινητική και την κλινική ανταπόκριση (αρχική ιολογική ανταπόκριση).επίσης δείχνουν ότι οι αναστολείς του HBV (αντιϊκά)όπως η λαµιβουδίνη (LAM )ή η αδεφοβίρη (ADF), εµφανίζουν καλλίτερη αρχική αντιϊκή αποτελεσµατικότητα από την PEG -IFN -α στους ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητική στο HBeAg,αλλά η διαφορά τείνει να εξαφανισθεί κατά την διάρκεια της θεραπείας, επειδή η PEG -IFN -α επιφέρει ταχύτερο ρυθµό κάθαρσης των ηπατοκυττάρων µε HBV,γεγονός που αναµένεται θεωρητικά µε βάση τις ανοσορρυθµιστικές και ανοσοτροποιητικές ιδιότητες της IFN -α. Στην µελέτη οι αρχικές διαφορές στην κατά µέσο όρο ελάττωση του HBV DNA µεταξύ των ασθενών στις διαφορετικές οµάδες θεραπείας, έτειναν να είναι λιγότερο εκσεσηµασµένες µε το χρόνο και σε 1 µήνα,όλες οι οµάδες είχαν παρόµοια ελάττωση ιϊκού φορτίου (µεταξύ -2.9 και -3.5 log 10 ),πλήν της οµάδας της κλασσικής IFN -α που εµφάνισε µικρότερου βαθµού ελάττωση (-1.5 log 10 ).Η σύγχρονη κλινική αντίληψη για τις διαθέσιµες θεραπείες σήµερα,για τους ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητική στο HBeAg,είναι ότι αυτές σχετίζονται µε µικρά ποσοστά µακροχρόνιας ανταπόκρισης. Ως αποτέλεσµα, η αγωγή µε νουκλεοσιδικά και νουκλεοτιδικά ανάλογα συνήθως συνεχίζεται επί διάστηµα µεγαλύτερο του έτους και επί µακρόν, µια στρατηγική που ενέχει τον κίνδυνο εµφάνισης ιολογικής αντίστασης των στελεχών του HBV,και άγνωστη προς το παρόν ασφάλεια των ασθενών στην προοπτική µακροχρόνιας θεραπείας. Μια πρόσφατη µεγάλη κλινική µελέτη έδειξε ότι ασθενείς µε χρόνια ηπατίτιδα Β αρνητική στο HBeAg,είχαν σηµαντικά µεγαλύτερο ποσοστό ανταπόκρισης 24 εβδοµάδες µετά την διακοπή της θεραπείας µε πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη άλφα-2α συγκριτικά µε λαµιβουδίνη. Η προσθήκη της λαµιβουδίνης στην πεγκυλιωµένη ιντερφερόνη άλφα-2α, σε συνδυασµό ab initio δεν βελτίωσε το ποσοστό της παρατηρούµενης ανταπόκρισης µετά θεραπεία σε παρακολούθηση των 24 εβδοµάδων 140. Ενώ οι περισσότεροι από τους ασθενείς της παρούσας µελέτης έδειξαν µία σαφή µορφολογία διφασικής καµπύλης πτώσης του ιϊκού φορτίου,η µορφολογία της καµπύλης σε κάποιους ασθενείς όπως του ασθενή 4 κατά τον πρώτο µήνα θεραπείας και των ασθενών 15,18,19,23,27,28 και 29 κατά τις πρώτες 24 εβδοµάδες φαίνεται να εµφανίζει κάποια οµοιότητα µε την «κλιµακωτή»-staircase-µορφολογία που έχει 86

περιγραφεί σε HBeAg θετικούς ασθενείς 137.Ο λόγος αυτών των εξαιρέσεων από το διφασικό πρότυπο (µοντέλο)και της ποικιλοµορφίας και ετερογένειας των καµπυλών µεταξύ διαφορετικών ασθενών ανεξαρτήτως τύπου αγωγής,δυνατόν να ερµηνευθεί από την σηµαντική ανοσολογική συνιστώσα της HBV λοίµωξης. Ο ιός της ηπατίτιδας Β είναι ένας µη κυτταροπαθογόνος ιός και τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη καθαίρονται µε καταστροφή (κυτταρικό θάνατο επαγόµενο από την ανοσολογική απόκριση),ή µε µη κυτταρολυτική κάθαρση του cccdna δια µέσου κυτταροκινών οι οποίες παράγονται από τα κυτταροτοξικά λεµφοκύτταρα ΚΤΛ (CTL). Συγκεκριµένα, µετά την αντιγονική ενεργοποίηση τους, τα ΚΤΛ (CTL) επάγουν ένα αποπτωτικό µήνυµα στα ηπατοκύτταρα στόχους τους, προκαλώντας κυτταρικό θάνατο. Επίσης εκρίνουν IFN γ και TNF α, κυτταροκίνες που έχει αποδειχθεί ότι αναστέλουν την έκφραση γονιδίων του HBV,το cccd N A, και τον πολλαπλασιασµό του ιού in vivo,καθαίροντας µε αυτό τον τρόπο τα κύτταρα. Η µη κυτταρολυτική κάθαρση του HBV από τα ηπατοκύτταρα µε τη δράση των ΚΤΛ (CTL), είναι σηµαντικά πιο αποτελεσµατική ως µηχανισµός από τον επαγόµενο κυτταρικό θάνατο 40 (Εικόνα 12).Το αποτέλεσµα µιας λοίµωξης εξαρτάται από την σχετική ισορροπία αυτών των δύο δράσεων,µε µία κυρίως µη κυτταρολυτική κάθαρση να οδηγεί στην κάθαρση του HBV από τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη, ενώ η κυρίως αντίδραση κυτταρικού θανάτου να συνεπάγεται χρόνια παραµονή της λοίµωξης και χρόνια ηπατική νόσο.το γεγονός της δυνητικά ελλειπούς κάθαρσης του ccc HBV DNA από το ηπατοκύτταρο,ενώ έχει καταργηθεί η έκφραση γονιδίων και ο πολλαπλασιασµός του ιού,έχει ως παράδοξο αποτέλεσµα τη χρόνια παραµονή της λοίµωξης,καθόσον ο ιός γίνεται χαρακτηριστικά ανοσολογικά «αόρατος» χωρίς την κάθαρση του µεταγραφικού του υποστρώµατος. 87

Εικόνα 12. Μη κυτταρολυτική κάθαρση του HBV από το ηπατοκύτταρο,µε την δράση κυτταροκινών που παράγονται από CTL λεµφοκύτταρα (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 40). Η δεύτερη φάση της καµπύλης κινητικής συσχετίζεται µε τον ρυθµό κάθαρσης και καταστροφής των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη. Έτσι τα «επίπεδα» στιγµιότυπα που παρατηρούµε στις καµπύλες της δεύτερης φάσης είναι δυνατόν να ερµηνευθούν από µία καθυστερηµένη ή χαµηλής έντασης ανοσολογική απόκριση ή οποία επιβραδύνει την απώλεια των κυττάρων µε λοίµωξη. Αρχικά,η αντιϊκή θεραπεία αναστέλλει µερικά την παραγωγή νέων ιϊκών σωµατιδίων µε ταχεία πτώση των επιπέδων του HBV DNA,αλλά επιπρόσθετα είναι απαραίτητη µια ισχυρή ανοσολογική απόκριση για να επιφέρει την ελάττωση του ιϊκού φορτίου κατά την δεύτερη φάση,ως αποτέλεσµα απώλειας κυττάρων που παράγουν ιϊκά σωµατίδια. Στους ασθενείς αυτούς οι οποίοι δεν εγείρουν αυτή την ανοσολογική απόκριση παρατηρείται µια πολύ βραδεία ελάττωση του ιϊκού φορτίου. Αυτός ο ίδιος µηχανισµός µπορεί να ερµηνεύσει την µορφολογία καµπύλης που χαρακτηρίζεται ως κλιµακωτή (staircase)ή µε εναλλάξ επίπεδα τµήµατα καµπύλης δεύτερης φάσης. 88

Μια υπόθεση είναι ότι αρχικά αυτοί οι ασθενείς έχουν µία ασθενή ανοσιακή απάντηση διότι η θεραπεία ελαττώνει την παραγωγή ιϊκών σωµατιδίων ανά ηπατοκύτταρο,αλλά όχι τον αριθµό των κυττάρων µε HBV λοίµωξη.το γεγονός αυτό οδηγεί σε ελάττωση αρχικά του ιϊκού φορτίου και κατόπιν σε επίπεδη φάση, καθώς παρατηρείται µια κατάσταση ισορροπίας. Εάν αυτή η νέα κατάσταση ισορροπίας είναι 2 λογαρίθµους (logs) κάτω από το αρχικό ιϊκό φορτίο, η φαρµακευτική αποτελεσµατικότητα αναστολής της παραγωγής νέων ιϊκών σωµατιδίων,ε,θα είναι 99%.Αυτό σηµαίνει ότι,κατά µέσον όρο τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη ακόµη παράγουν το 1% της ποσότητας ιϊκών σωµατιδίων όπως αρχικά προ αγωγής. Εάν η ανοσιακή απάντηση διεγείρεται όταν επάγεται µια σηµαντική πτώση του ιϊκού φορτίου, τότε ο αριθµός των κυττάρων µε λοίµωξη µειώνεται µε αποτέλεσµα µία επιπλέον ελάττωση του ιϊκού φορτίου. Η υπόθεση αυτή είναι δύσκολο να επιβεβαιωθεί µε πειραµατικά δεδοµένα δυναµικής υπό αγωγή µελέτης της ανοσιακής απάντησης.η υπόθεση αυτή συνηγορεί στις πρόσφατες αναφορές ότι η αντιϊκή θεραπεία µε λαµιβουδίνη µπορεί να συντελεί στη βελτίωση της λειτουργίας και δράσης των Τ-λεµφοκυττάρων.Μια δεύτερη υπόθεση,όπως έχει προταθεί για τον HIV,είναι ότι δύο ή περισσότεροι υποπληθυσµοί ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη µπορεί να υπάρχουν µε διαφορετικούς µεταξύ τους χρόνους ηµιζωής.οι πληθυσµοί των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη είναι επίσης δυνατό να εµφανίζουν ετερογένεια όσον αφορά την έκφραση αντλιών εξόδου από το κύτταρο των αντιϊκών φαρµάκων, όπως η P- γλυκοπρωτεϊνη και οι πρωτεϊνες που συσχετίζονται µε πολλαπλή αντίσταση σε αντιϊκά φάρµακα (M RPs-multidrug resistance proteins). Για παράδειγµα,σε κύτταρα µε µικρή ποσοτικά έκφραση MRP-4 τα φάρµακα επάγουν την αναστολή παραγωγής HBV σωµατιδίων πρώϊµα κατά τη θεραπεία,ενώ σε δεύτερο χρόνο,λόγω αύξησης των επιπέδων του φαρµάκου µε την διάρκεια της αγωγής ή λόγω καταστροφής των κυττάρων µε υπερέκφραση MRP-4,παρατηρείται περαιτέρω αναστολή της παραγωγής των ιϊκών σωµατιδίων µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία µιας νέας,σε χαµηλότερο επίπεδο,σταθερής κατάστασης.επίσης εάν ο HBV µπορεί να συνδεθεί αντιστρεπτά στα δενδριτικά κύτταρα, στα δευτερογενή λεµφικά όργανα (σπλήνα και λεµφαδένες)όπως ο HIV,τότε επιπλέον υπάρχουν και άλλοι µηχανισµοί προκειµένου να ερµηνευθούν οι καµπύλες ελάττωσης του ιϊκού φορτίου. Εάν τα ανωτέρω συµβαίνουν στα ηπατοκύτταρα, τότε πολλαπλές καταστάσεις σε δυναµική εξέλιξη και σταθερά επίπεδα συµµετέχουν οδηγώντας σε 89

κλιµακωτή ελάττωση του ιίκού φορτίου. Στο πλαίσιο των υποθέσεων της ετερογένειας των πληθυσµών των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη,είναι και η µη πλήρης κάθαρση του ccc H B V D N A από το ηπατοκύτταρο,ενώ έχει καταργηθεί η έκφραση γονιδίων και ο πολλαπλασιασµός του ιού στο κύτταρο αυτό,γεγονός που δηµιουργεί αντίγραφα ανοσολογικά «αόρατου» ιού σε υποπληθυσµό ηπατοκυττάρων µε µεγάλο χρόνο ηµιζωής.επίσης,τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη υπολογίζεται ότι είναι 1000 φορές περισσότερα σε αριθµό από τα ειδικά έναντι του HBV κυτταροτοξικά CTL λεµφοκύτταρα.είναι λοιπόν πιθανό,ότι σε κάποιες περιοχές του ήπατος,τα ηπατοκύτταρα µε HBV λοίµωξη δεν έχουν στην περιοχή τους σε στενή συσχέτιση CTL ειδικά λεµφοκύτταρα. Ο πληθυσµός αυτών των ανθεκτικών σε κάθαρση από την ανοσολογική απόκριση ηπατοκυττάρων αποτελεί τον λεγόµενο «τρίτο χώρο», άγνωστο παράγοντα προς το παρόν, µε το ισχύον πρότυπο, της διαµόρφωσης της ιϊκής κινητικής. Εάν οποιαδήποτε από τις ανωτέρω υποθέσεις είναι σηµαντική in vivo,τότε η πτώση του HBV DNA υπό αντιϊκή αγωγή είναι δυνατόν να µην περιγράφεται επαρκώς µόνον από διφασικές καµπύλες.όπως είναι πρόδηλο από τα αποτελέσµατα της µελέτης, κάποιοι ασθενείς εµφανίζουν κάθαρση ιϊκών σωµατιδίων µε πολύ γρήγορους ρυθµούς,ενώ σε άλλους η κάθαρση των ιϊκών σωµατιδίων γίνεται µε πολύ αργό ρυθµό.η µορφολογία των καµπυλών πτώσης του HBV DNA µπορεί να είναι πλέον σύνθετη από την τυπική διφασική µορφολογία, µε κάποιους ασθενείς να εµφανίζουν και επιπλέον φάσεις, εγείροντας ερωτήσεις σχετικά µε την ανάγκη βελτίωσης του βασικού µοντέλου ιϊκής κινητικής και δυναµικής.το να περιληφθούν µηχανισµοί και κυτταρολυτικοί (δ ) και µη κυτταρολυτικής κάθαρσης των ηπατοκυττάρων µε HBV (ρ) οι οποίοι συνεκτιµούνται στον υπολογισµό του συνολικού ρυθµού κάθαρσης των κυττάρων µε HBV λοίµωξη δ=δ +ρ, έχει ως αποτέλεσµα την πλέον ρεαλιστική και ακριβή επιστηµονικά απόδοση του θεωρητικού µαθηµατικού µοντέλου. Στο παρόν πρότυπο,ο ρυθµός παραγωγής των ιϊκών σωµατιδίων υποτίθεται ότι είναι σταθερός. Σε πλέον σύνθετα πρότυπα στα οποία επίσης υπολογίζεται ο αριθµός των αντιγράφων του cccd N A ανά κύτταρο, ο ρυθµός παραγωγής είναι δυνατόν να υπολογίζεται ανάλογα µε το περιεχόµενο cccd N A ανά κύτταρο σε κάθε ασθενή. Μια δεύτερη αξιωµατική παραδοχή είναι ότι κατά την διάρκεια της θεραπείας ο αριθµός των κυττάρων-στόχων παραµένει κατά προσέγγιση σταθερός, και κατά την έναρξη της θεραπείας κάθε άτοµο βρίσκεται σε σταθερή κατάσταση.σε 90

πλέον σύνθετα πρότυπα,µπορεί να χρησιµοποιηθούν δεδοµένα,εάν φυσικά είναι δυνατόν να συλλέγονται δυναµικά κατά την διάρκεια της αγωγής,τα οποία αφορούν τον αριθµό ή ποσοστό των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη (ανίχνευση ιϊκών αντιγόνων HBcAg ή HBeAg µε ανοσοιστοχηµεία πριν την έναρξη της αγωγής και στον 1, 3 ή 6 µήνα της αγωγής.) Αν και η πολυµεράση του HBV, η οποία αναστέλεται από τα αντιϊκά φάρµακα (λαµιβουδίνη, αδεφοβίρη), είναι πιθανό να συµµετέχει στον σχηµατισµό του cccd N A, οι κυτταρικές πολυµεράσες είναι από µόνες τους ικανές να κλείσουν το κενό που αντιστοιχεί στην µονή έλικα (-)DNA του γονιδιώµατος του HBV,να δηµιουργήσουν πλήρη την συµπληρωµατική (+) έλικα του DNA,και άλλοι κυτταρικοί παράγοντες κατόπιν να µετατρέψουν την δοµή αυτή σε cccd N A. Με βάση την ανωτέρω αλληλουχία γεγονότων,τότε,η de novo λοίµωξη των υγιών ηπατοκυττάρων είναι πιθανόν να µην επηρεάζεται σηµαντικά µε τους αναστολείς (αντιϊκά φάρµακα) της αντίστροφης µεταγραφάσης-πολυµεράσης του HBV.Για να ενσωµατώσουµε την πιθανότητα της δράσης των αντιϊκών φαρµάκων και της ιντερφερόνης-α στην de novo λοίµωξη,έγινε εισαγωγή στο πρότυπο µιας παραµέτρου η οποία περιγράφει την αποτελεσµατικότητα του φαρµάκου στην αναστολή νέων κύκλων λοίµωξης των υγιών ηπατοκυττάρων, ώστε ο ρυθµός λοίµωξης µε το φαρµάκο να είναι (1-η)β.Για να εναρµονίσουµε το πρότυπο (fit)µε τα δεδοµένα,χρησιµοποιήθηκε n=0.5 (µικρό ποσοστό στη λογαριθµική κλίµακα του συντελεστή αναστολής de novo λοιµώξεων).στις µελέτες του Nowak 133 et al.και Tsiang 134 et al, οι ερευνητές υπέθεσαν ότι η θεραπεία σταµατά όλες τις νέες λοιµώξεις,δηλαδή n=1. Η παραδοχή αυτή απλοποιεί την υποκείµενη θεωρία του πρότυπου,αλλά σε καµµιά περίπτωση δεν είναι πραγµατική. Σύµφωνα µε τα ανωτέρω η παράµετρος πρέπει να έχει µικρότερη τιµή από την µονάδα.για παράδειγµα,υπολογίζεται ότι ο εναρµονισµός (fit)των δεδοµένων του ιϊκού φορτίου, µε απόδοση στον συντελεστή ή τιµής η=0 ή η=1 αποδίδει υπολογιζόµενες τιµές για τις παραµέτρους κινητικής c, δ και ε µε διαφορές του επιπέδου του 5% µεταξύ των 2 παραδοχών.η παραδοχή η=1 έχει ως αποτέλεσµα µια υπερτίµηση της παραµέτρου C και υποτίµηση των παραµέτρων δ και ε σε σύγκριση µε την υπόθεση να είναι η<1.είναι πλησιέστερα στην βιολογική πραγµατικότητα να χρησιµοποιείται η παραδοχή η<1.στην παρούσα µελέτη,όπως έχει αναφερθεί στα αποτελέσµατα,οκτώ από τους ασθενείς των οποίων τα δεδοµένα εναρµονίσθηκαν µε 91

το µοντέλο επέδειξαν επίπεδη καµπύλη δεύτερης φάσης (µορφολογία καµπύλης Τύπου 2),δηλαδή µη πτώση του ιϊκού φορτίου κατά την δεύτερη φάση. Είναι σαφές από την ανάλυση του µοντέλου που χρησιµοποιήθηκε ότι εάν η=1,τότε θεωρητικά αυτή η επίπεδη φάση δεν είναι δυνατόν να υπάρξει,και ότι κατά την διάρκεια της θεραπείας η πτώση του ιϊκού φορτίου συνεχίζει µέχρι το µηδέν (V=0).Αντίθετα,εάν το η είναι <1,θεωρητικά µια νέα σταθερή κατάσταση µπορεί να δηµιουργηθεί όταν ο ρυθµός δηµιουργίας νέων ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη ισορροπεί τον ρυθµό συνολικής κάθαρσης τους,δηλαδή (1-η) β V T=δI. Με το πλήρες πρότυπο κινητικής και δυναµικής του HBV,αποδεικνύεται ότι µε το η<1,µία επίπεδη καµπύλη δεύτερης φάσης µπορεί να παρατηρηθεί ακόµη και αν ο ρυθµός καταστροφής των ηπατοκυττάρων µε HBV λοίµωξη δεν είναι µηδενικός.ο ρυθµός κάθαρσης των ελεύθερων κυκλοφορούντων στο ορό ιϊκών σωµατιδίων, C, έχει µεγαλύτερη ποικιλοµορφία και ετερογένεια τιµών από ότι έχει περιγραφεί σε άλλες µελέτες 133, 134.Ο υπολογιζόµενος κατά µέσον όρο χρόνος ηµιζωής των ελευθέρων ιϊκών σωµαταιδίων ήταν στην παρούσα µελέτη 17+12 ώρες,πολύ µεγαλύτερος από ότι του HIV και του HCV.Μια δυνητική διαφορά µεταξύ της κάθαρσης του HIV και του HCV,σε σύγκριση µε αυτή του HBV είναι τα πολύ υψηλότερα ιϊκά φορτία που χαρακτηρίζουν την HBV λοίµωξη, όπως και η παρουσία στον ορό µεγάλης ποσότητας (10 13 /ml)των µη λοιµογόνων 22mm µεγέθους σφαιρικών και νηµατοειδών σωµατιδίων,τα οποία δεν περιέχουν HBV DNA (Εικόνα 13Α και 13 Β). Εικόνα 13Α. Πλήρη ιϊκά σωµατίδια του HBV,σε συνύπαρξη µε σφαιρικά και νηµατοειδή κενά γονιδιώµατος σωµατίδια στον ορό (22 nm )(Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 33). 92

Ηλεκτρονική µικροφωτογραφία ενός αρνητικά χρωσµένου παρασκευάσµατος ορού ασθενούς θετικού στο HBsAg και στο HBV DNA.Τα πλήρη ιϊκά σωµατίδια του HBV είναι σφαιρικά σωµατίδια µε διπλό κέλυφος και έχουν µέγεθος 42 nm,µε µία δοµή πυρηνοκαψιδίου εσωτερικά µεγέθους 27 έως 32 nm.οι µορφές των σφαιρικών και νηµατοειδών κενών γονιδιώµατος σωµατιδίων των 22 nm διακρίνονται σαφώς διαφορετικές των πλήρων ιϊκών σωµατιδίων. Εικόνα 13Β.Όµοια µε την εικόνα 13 Α,σχηµατική αναπαράσταση (Αναπαραγωγή µε άδεια του εκδότη από βιβλιογραφία 33). Εάν το ήπαρ είναι,όπως πιστεύεται,ένας πρωτογενής χώρος κάθαρσης των ιϊκών σωµατιδίων,η ελαττωµένη κάθαρση του HBV είναι δυνατόν να οφείλεται σε υπολειτουργία δράσης του δικτυοενδοθηλιακού συστήµατος του ήπατος, πιθανά απότοκη της µεγάλης ποσότητας των κυκλοφορούντων µη λοιµογόνων σωµατιδίων, τα οποία υπερκατακλύζουν το σύστηµα και επιβραδύνουν τους µηχανισµούς κάθαρσης των λοιµογόνων ιϊκών σωµατιδίων. Η λεπτοµερέστερη µελέτη της κάθαρσης προυποθέτει ποσοτικό προσδιορισµό της συγκέντρωσης των 22 m m µη λοιµογόνων ιϊκών σωµατιδίων στον ορό των ασθενών. Μία τελευταία σηµαντική διαφορά του σύνθετου πρότυπου που χρησιµοποιήσαµε στην παρούσα µελέτη σε σύγκριση µε τα προηγούµενα,είναι το ότι 93