ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΙΛΙΠΠΟΥ Χ. ΠΕΪ Η ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ Ι.Κ.Υ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΙΛΙΠΠΟΥ Χ. ΠΕΪ Η ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ Ι.Κ.Υ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΜΙΑΣ ΝΕΑΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΟΥ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ- ΣΕΡΙΝΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Τοµέα Οργανικής Χηµείας και Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας του ΑΠΘ Ηµεροµηνία προφορικής εξέτασης: 03/07/06 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αν.Καθηγητής Θ. ΓΙΑΝΝΑΚΟΥΡΟΣ Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής.Α. ΚΥΡΙΑΚΙ ΗΣ Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθηγητής Τ. ΓΙΟΥΨΑΝΗΣ Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Ζ. ΣΚΟΥΡΑΣ Αριστοτέλειο Παν/στήµιο Θεσ/νίκης Καθηγήτρια Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης Αν. Καθ/τρια Θ.ΧΟΛΗ-ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΥΑριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης Επικ. Καθ/τρια Ε. ΝΙΚΟΛΑΚΑΚΗ Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΙΛΙΠΠΟΥ Χ. ΠΕΪ Η ΧΗΜΙΚΟΥ ΥΠΟΤΡΟΦΟΥ Ι.Κ.Υ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΥ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΜΙΑΣ ΝΕΑΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΟΥ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΕΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ- ΣΕΡΙΝΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Τοµέα Οργανικής Χηµείας και Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας του ΑΠΘ Ηµεροµηνία προφορικής εξέτασης: 03/07/06 ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αν.Καθηγητής Θ. ΓΙΑΝΝΑΚΟΥΡΟΣ Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής.Α. ΚΥΡΙΑΚΙ ΗΣ Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθηγητής Τ. ΓΙΟΥΨΑΝΗΣ Μέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Ζ. ΣΚΟΥΡΑΣ Αριστοτέλειο Παν/στήµιο Θεσ/νίκης Καθηγήτρια Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης Αν. Καθ/τρια Θ.ΧΟΛΗ-ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΥΑριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης Επικ. Καθ/τρια Ε. ΝΙΚΟΛΑΚΑΚΗ Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσ/νίκης

ii Η επταµελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της ιδακτορικής ιατριβής του κ. Φιλίππου Πεΐδη, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης την 03-07-2006, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής µε τίτλο Μελέτη του βιολογικού ρόλου και των µοριακών αλληλεπιδράσεων µιας νέας οικογένειας πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες αργινίνης-σερίνης. Η επιτροπή έκρινε οµόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συµβολή στην πρόοδο της Επιστήµης. Η επιτροπή απονέµει το βαθµό «Αριστα» ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Καθηγητής.Α. Κυριακίδης Καθηγήτρια Ν. Βαβάτση-Χριστάκη Καθηγητής Ζ. Σκούρας Αναπλ. Καθηγητής Θ. Γιαννακούρος Αναπλ. Καθηγητής Τ. Γιουψάνης Αναπλ. Καθηγήτρια Θ. Χολή-Παπαδοπούλου Επικ. Καθηγήτρια Ε. Νικολακάκη

iii Φίλιππος Χ. Πεΐδης Α.Π.Θ Μελέτη του βιολογικού ρόλου και των µοριακών αλληλεπιδράσεων µιας νέας οικογένειας πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες αργινίνης-σερίνης ISBN «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Χηµείας του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

iv Αφιερωµένο στους γονείς µου και σε όσους ακόµα µ αγαπούν

v ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σελίδα 1.1. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ... 1 1.1.1. ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 1 1.1.2. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΠΥΡΗΝΙΚΗΣ ΜΗΤΡΑΣ 1 1.1.2.1. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΛΑΜΙΝΑ... 2 1.1.2.2. ΚΕΝΤΡΙΚΑ ΝΗΜΑΤΙΑ.. 6 1.1.2.3. ΙΑΧΥΤΟΣ ΣΚΕΛΕΤΟΣ. 6 1.1.2.4. ΠΥΡΗΝΙΚΑ ΣΩΜΑΤΙΑ.. 8 1.1.2.5. ΠΥΡΗΝΙΣΚΟΣ. 9 1.1.3. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ-ΜΙΑ ΣΤΑΘΕΡΗ, ΥΝΑΜΙΚΗ Ή ΦΑΝΤΑΣΤΙΚΗ ΟΝΤΟΤΗΤΑ... 11 1.1.4. S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS)... 12 1.1.5. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ... 13 1.1.6. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ. 16 1.1.7. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΜΑΤΙΣΜΑ........ 17 1.1.8. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ, ΙΣΤΟΕΙ ΙΚΟΤΗΤΑ, ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ..... 18 1.1.9. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ....... 19 1.1.10. ΣHΜΑ ΕΝΤΟΠΙΣΗΣ ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ (NMTS, Nuclear Matrix Targeting Signal)..... 20 1.2. ΠΡΩΤΕΪΝΗ p53...... 21 1.2.1. ΟΜΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53... 24 1.2.2. ΕΙΣΟ ΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ.... 26 1.2.3. ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53... 28 1.2.4. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53... 29 1.2.5. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ...... 29

vi 1.2.6. ΜΙΘΡΑΜΥΚΙΝΗ Α ΚΑΙ 5-ΦΘΟΡΟΟΥΡΑΚΙΛΗ.. 30 1.3. PROLIFERATION POTENTIAL PROTEIN-RELATED (P2P-R). 32 1.3.1. ΟΜΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R... 32 1.3.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R... 33 1.3.3. ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R. 34 1.4. ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ (SERIΝΕ/ ARGININE PROTEIN KINASES SRPK s). 34 1.4.1. ΟΜΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ.. 35 1.4.2. ΕΞΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ AΡΓΙΝΙΝΗΣ.. 38 1.4.3. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ.. 39 1.4.4 ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ - ΠΙΘΑΝΟΣ ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗΣ.. 41 1.4.4.1 ΙΑΦΟΡΕΣ ΑΛΛΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ. 44 1.4.5. SRPK ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ. 44 1.5. SCAFFOLD ATTACHMENT FACTOR-B (SAF-B). 45 1.5.1. ΟΜΗ ΤΩΝ SAF-B. 45 1.5.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ SAF-B1 ΚΑΙ SAF-B2 46 1.5.3. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ SAF-B1 ΚΑΙ SAF-B2.. 48 1.5.4. ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ SAF-B1 ΚΑΙ SAF-B2.. 49 1.5.5. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΚΑΙ SAF-B1.. 52 1.6. ΥΠΟ ΟΧΕΑΣ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Α (ESTROGEN RECEPTOR ALPHA ERα) 53 1.6.1. ΟΜΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ α... 53 1.6.2. EN ΟΚΥΤΤΑΡΙΚH ΕΝΤΌΠΙΣΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟI ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ERα... 55 1.6.3. ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΑΤΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΟΥ ERα 57 1.6.4. XHMIKOI ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ERα... 60 1.6.5. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ERα.. 62 1.7. SRC-1 (Steroid Receptor coactivator-1)... 62 1.7.1. ΟΜΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ SRC-1. 63

vii 1.7.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΟΥ ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ SRC-1.. 64 1.8. PGC-1α (PPAR γ Coactivator 1α). 64 1.8.1. ΟΜΗ ΤΟΥ PGC-1α.. 65 1.8.2. EΝΤΟΠΙΣΗ ΤΟΥ PGC-1α... 66 1.8.3. AΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΟΥ PGC-1α..68 1.9. CARM1 (Co-Activator Arginine Methyltransferase 1)... 69 1.10. HNF-4α (Hepatic Nulear Factor-4 alpha).69 1.10.1. ΟΜΗ ΤΟΥ HNF-4α 70 1.10.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΟΥ HNF-4α 70 1.10.3. ΡΑΣΗ ΤΟΥ HNF-4α.. 71 1.10.4. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΚΑΙ HNF-4α. 72 ΣΚΟΠΟΣ.. 74 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ.. 76 2.1. ΧHΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ 76 2.2 ΥΛΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ.. 76 2.3. ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ. 76 2.4. ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΛΙΚΑ.. 79 2.5. ΚΑΛΛΙΕΡΓΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ YΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ. 79 2.6. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΡΑΣΗΣ TΩΝ SRPK ΜΕ ΙΝ VITRO ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΤΟΥΣ. 81 2.7. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΈΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ (PAGE).. 81 2.7. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΥΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ (SDS-PAGE).. 83 2.9. ΒΑΦΗ ΜΕ COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 84 2.10. ΑΥΤΟΡΑ ΙΟΓΡΑΦΙΑ.. 85 2.11. ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΠΗΚΤΗ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ (WESTERN BLOT). 85 2.12. ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ. 86

viii 2.13. ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ 87 2.14. ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ (PULLDOWN ASSAYS).. 89 2.15. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΠΟ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ.. 91 2.16. ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA. 92 2.17. ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)...93 2.18. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ DNA ΣΕ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ 94 2.19. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΑ 98 2.20. ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΤΥΦΛΩΝ ΑΚΡΩΝ (FILL-1N) 99 2.21 ΚΑΛΛΙΕΡΓΙΕΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ. 99 2.22 ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΠΙ ΕΚΤΙΚΩΝ ΣΕ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ (COMPETENT CELLS) 100 2.23. ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ε. COLI 101 2.24. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ DNA ΜΕ ΑΛΚΑΛΙΚΗ ΛΥΣΗ. 102 2.25. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ DNA ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΤΟ ΚΙΤ QIAGEN-TIP 500 102 2.25. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΛΑΣΜΙ ΙΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗN ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΓΑΣΙΑ.. 103 2.26. ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΥΝΤΗΞΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GST)... 113 2.28. ΠΑΡΟ ΙΚΗ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 114 2.29. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑ ΑΣ (T.L.C.)... 117 2.30. AΝΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ...117 2.30.1. ΟΚΙΜΑΣΊΑ β-γαλακτοσι ΑΣΗΣ (β-gal ASSAY)... 117 2.30.2. ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΧΛΩΡΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗΣ CAT ASSAY). 118 2.30.3. ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΛΟΥΣΙΦΕΡΑΣΗΣ 120 2.31. ΛΥΟΦΙΛΙΣΗ 120 2.32. ΣΥΣΤΗΜΑ ΥΟ ΥΒΡΙ ΙΩΝ.. 121 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. 123

ix 3.1. ΜΕΛΕΤΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΤΜΗΜΑΤΟΣ TΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΥΟ ΥΒΡΙ ΙΩΝ ΣΤΗ ΖΥΜΗ. 123 3.2. IN VITRO KAI IN VIVO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ SAF-B1 ΜΕ ΤΗΝ SRPK1a... 124 3.3. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣH ΤΟΥ ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗ p53 ΣTΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΥΟ ΥΒΡΙ ΙΩΝ ΣΤΗ ΖΥΜΗ.. 127 3.4. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ.. 128 3.5. IΝ VITRO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ SRPK1a ΚΑΙ p53.. 129 3.6. ΠΡΩΤΕΪΝΗ P2P-R 130 3.7. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ, ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΑΠΟ ΤΗΝ SRPK1a ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΤΙΣ RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ (P2P-R(442-585)). 131 3.8. IΝ VITRO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΟ ΤΜΗΜΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΤΙΣ RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ (P2P-R(442-585))... 133 3.9. IN VITRO ΚΑΙ ΙΝ VIVO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΜΕΤΑΞΥ P2P-R ΚΑΙ SAF-B. 134 3.10. ΣΥΝΕΝΤΟΠΙΣΗ P2P-R ΚΑΙ SAF-B1 ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ. 135 3.11. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ SAF-B1 ΑΝΑΣΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ TΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ. 137 3.12. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ P2P-R ΑΝΑΣΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ. 139 3.13. ΕΥΡΕΣΗ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ 140 3.14. IN VIVO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ P2P-R ΚΑΙ SAF-B ΜΕ ΤΟ ΣΥΠΛΟΚΟ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ 143 3.15. ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΙΣΤΡΑ ΙΟΛΗΣ Η TAMOXIFEN ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ ΜΕΡΟΥΣ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ

x ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ... 145 3.16. ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ SRPK1/SRPK1a ΣΕ MCF-7 ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΟΙΣΤΡΑ ΙΟΛΗΣ.. 147 3.17. ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ.. 149 3.18. ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΣΕ HepG2 ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΥΡΗΝΙΚΟ ΥΠΟ ΟΧΕΑ HNF-4α 150 3.19. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ PGC-1- RS 152 3.20. ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ PGC-1 ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΤΟΥ ΛΕΙΠΕΙ Η RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ (PGC-1- RS) 154 3.21. ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤOΥ PGC-1 ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΕΧΕΙ ΑΦΑΙΡΕΘΕΙ Η RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ ΑΠΟ ΤΙΣ SRPK1a ΚΑΙ SRPK1.. 155 3.22. IΝ VITRO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΗΝ RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ ΤΟΥ PGC-1. 156 3.23. Η ΠΛΟΥΣΙΑ ΣΕ RS ΙΠΕΠΤΙ ΙΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΟΥ PGC-1 ΕΙΝΑΙ ΜΕΡΙΚΏΣ ΥΠΕΥΘΥΝΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ HNF-4α.. 157 3.24. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ HNF-4 ΜΕ ΤΗΝ SRPK1a. 160 3.25. ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ SRPK, p53 ΚΑΙ HNF-4α ΣΕ HepG2 ΚΥΤΤΑΡΑ. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΜΙΘΡΑΜΥΚΙΝΗΣ ΚΑΙ 5- ΦΘΟΡΟΟΥΡΑΚΙΛΗΣ.. 162 3.26. Η ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ SAF-B1 ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΣΤΑ HepG2 ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΙΚΡΗ ΕΛΑΤΤΩΣΗ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕ Α ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ HNF-4α.. 164 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 167 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.. 177

xi SUMMARY... 179 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 181

xii ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης κάτω από την άµεση καθοδήγηση του αναπληρωτή καθηγητή κ. Θ. Γιαννακούρου, τον οποίο ευχαριστώ από τα βάθη της καρδιάς µου για την υπόδειξη του θέµατος, την οργάνωση των πειραµάτων και την πολύτιµη βοήθεια που µου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εργασίας αλλά και κατά τη διόρθωση της διατριβής. Τόσο ο ίδιος, όσο και ο τρόπος µε τον οποίο προσεγγίζει την επιστήµη της Βιοχηµείας αποτελούν φωτεινά παραδείγµατα για µένα. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την επίκουρο καθηγήτρια κ. Ε. Νικολακάκη για τη στενή και ευχάριστη συνεργασία, τη συµπαράσταση εντός και εκτός εργαστηρίου, καθώς και για την πολύτιµη και ουσιαστική βοήθεια που µου προσέφερε κατά την πειραµατική διαδικασία. Της οφείλω, ανάµεσα σε άλλα, τη γνώση της πλειονότητας των τεχνικών που αποκόµισα κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής µου. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω θερµά τον καθηγητή κ.. Κυριακίδη και τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Τ. Γιουψάνη, µέλη της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, για το ενδιαφέρον τους, την άψογη συνεργασία, καθώς και τις πολύτιµες υποδείξεις τους κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τους καθηγητές κα. Ν. Βαβάτση και κ. Ζ. Σκούρα και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα.. Χολή-Παπαδοπούλου µέλη της εξεταστικής επιτροπής για τις χρήσιµες παρατηρήσεις τους και το χρόνο που διέθεσαν διορθώνοντας τα κείµενα µου. Την κα.. Χολή-Παπαδοπούλου θα ήθελα να την ευχαριστήσω ιδιαίτερα για το ενδιαφέρον της προς το πρόσωπο µου και την υποστήριξη της. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή κ. Σ. Τσιφτσόγλου για την άδεια χρήσης του χώρου των κυτταροκαλλιεργιών στον οποίο διεξήχθη ένα µεγάλο µέρος των πειραµάτων, καθώς και το υπόλοιπο εργαστήριο Φαρµακολογίας για τις διευκολύνσεις που µου παρείχαν και το ευχάριστο κλίµα συνεργασίας. Ευχαριστώ ακόµη την καθηγήτρια κ. Χατζοπούλου-Κλαδάρα για την ευκαιρία που µου έδωσε να εκτελέσω πειράµατα στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, του Τµήµατος Βιολογίας, καθώς και την ρ. Ε. Αγγελίδου για την βοήθεια στην εκτέλεση πειραµάτων ουσιαστικών για την ολοκλήρωση της διατριβής µου.

xiii Επιπλέον, οφείλω ευχαριστίες στον Dr R. Scott και στα µέλη του εργαστηρίου του College of Medicine, University of Tennessee στο Memphis τόσο για τις κατευθυντήριες υποδείξεις όσο και για την εκτέλεση πειραµάτων ουσιαστικών για τη δηµιουργία µιας πιο σφαιρικής εικόνας γύρω από το αντικείµενο της εργασίας µου. Ευχαριστίες οφείλω και σ όλο το προσωπικό και συναδέλφους-φίλους του εργαστηρίου Βιοχηµείας για τη συνεργασία τους και τη δηµιουργία ευχάριστου συναδελφικού κλίµατος µέσα στο εργαστήριο. Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγµατοποιήθηκε µε τη χορήγηση υποτροφίας από το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών και χρηµατοδοτήθηκε από το επιχειρησιακό πρόγραµµα Ηράκλειτος. Τέλος, τις περισσότερες ευχαριστίες οφείλω στους γονείς µου και την αδελφή µου, γιατί µε την ενθάρρυνση, την αµέριστη υλική και ηθική τους συµπαράσταση και κυρίως την υποµονή τους όλα αυτά τα χρόνια µπόρεσα να ολοκληρώσω ένα κύκλο της ζωής µου.

xiv ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AD: Activation Domain AML: Acute Myeloid Leukemia APS: Ammonium Persulphate AR: Androgen Receptor Arp: Actin related protein ΑSC: Activating Signal Cointegrator ATL: Adult T-cell Leukemia ΑΤΜ: Ataxia Telagiectasia Mutated gene product ATP: Adenosine Triphosphate BAF: Barrier-to-Autointegration Factor BAT: Brown Adipose Tissue BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate bhlh-pas: basic Helix-Loop-Helix-Per/ARNT/SIM interaction surface BHV : Bovine Herpes Virus-1 BRG/Brm: Brahma Related Gene/Brahma BSA: Bovine Serum Albumin BTM: Basal Transcription Machinery BUR: Base Unpairing Region CARM1: Co-Activator Arginine Methyltransferase CAT: Chloramphenicol Acetyl Transferase CB: Cajal Bodies CBP: CREB Binding Protein transcriptional coactivator cdk2: cyclin-dependent kinase CHO: Chinese Hamster Ovary CPF: yeast Cleavage and Polyadenylation Factor cpm: counts per minute CHD1: ChromoDomain protein 1 Chk2: Checkpoint kinase 2 CMV: cytomegalovirus COUP-TFI /II: Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor I/II CPKC: calcium-dependent Protein Κinase C CREB: camp Response Element Binding protein

xv CTD: DBD: DFC: DNAse : DTT: ECL: EDMD: EDTA: EGFR: ER: ERE: FBS: FC: FCS: FRAP: FXR: GC: GFP: GR: GST: HAT: HBD: ΗDAC: HEPES: HIPK2: HNF-4: hnrna: hnrnp: Carboxyl Terminal Domain DNA Binding Domain Dense Fibrillar Component Deoxyribonuclease Dithiothreitol Enhanced Chemiluminescence Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy Ethylenediaminotetracetic acid Epidermal Growth Factor Receptor Estrogen Receptor Estrogen Response Element Fetal Bovine Serum Fibrillar Center Fetal Calf Serum Fluoresence Recovery After Photobleaching Farsenoid X Receptor Granular Component Green Fluorescent Protein Glycocorticoid Receptor Glutathione-S-Transferase Histone Acetyl-Transferase Hormone Binding Domain Histone DeACetylase Ν-2-hydroxyethyl-piperazine-Ν -2-ethylsulphonic acid Homeodomain Interacting Protein Kinase-2 Hepatic Nulear Factor-4 heterogeneous nuclear RNA heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein HP1: Heterochromatin Protein 1 HRE: Hormone Response element HRP: Horseradish Peroxidase HSF1: Heat Shock Factor 1 Hsp: heat-shock protein

xvi HSV: Herpes Simplex Virus IGC: Ιnterchromatin Granule Cluster IGF: Insulin Growth Factor IgG: Immunoglobin G IPTG: Ιsopropyl-1-thio-β-D-lactopyranoside LAP: Lamina Associated Polypeptide 1 LBD: Ligand Binding Domain, LBR: Lamin B Receptor LCR: Locus Control Region LHR: Luteinizing Hormone Receptor MAGUK: Membrane Associated Guanylate Kinase Homologue MODY: Maturity Onset Diabetes of the Young MOPS: 2-(Ν-morpholine)propanesulphonic acid MTP: Microsomal triglyceride Transfer Protein NBT: Nitro Blue Tetrazolium N-CoR: Nuclear receptor-corepressor NES: Nuclear Export Signal NLS: Nuclear Localization Signal NMP: Nuclear Matrix Protein NMTS: Nuclear Matrix Targeting Signal NuMA: Nuclear Mitotic Apparatus protein NURD: Nucleosome RemoDelling Complex ONPG: Ο-Nitrophenyl-β-D-GalactoPyranoside ORC: Origin Recognition Complex ORI: ORIgins of replication Ρ2P: Proliferation Potential protein P2P-R: Proliferation Potential protein-related PABP1: Poly A Binding Protein 1 PACT: p53 Associated Cellular protein-testis derived PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis Parc: p53 associated, Parkin-like cytoplasmic protein PBS: Phosphate Buffer Saline P/CAF: p300 and CBP Associated Factor

xvii PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen PF: Perichromatin Fibril PGC-1: PPAR γ Coactivator 1 PI3K: Phosphatidyl Inositol 3 Kinase PML: Promyelotic Leukemia Bodies PMSF: Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride POD: PML Oncogenic Domain PPAR: Peroxisome Proliferetor Activated Receptor PR: Progesterone Receptor PRMT: PRotein MethylTransferase PCR: Polymerase Chain Reaction PXR: Pregnane X Receptor RAR: Retinoic Acid Receptor Rb: Retinoblastoma RBBP6: RetinoBlastoma Βinding Ρrotein 6 RBQ-1: RetinoBlastoma binding protein Q-1 RFC: Replication Factor C ROR: Retinoic acid receptor-related Orphan Receptor RRM: RNA Recognition Motif RXR: Retinoid X Receptοr SAF-A: Scaffold Attachment Factor A SAF-B: Scaffold Attachment Factor B SAP: Shrimp Alkaline Phosphatase SDS: Sodium Dodecyl Sulphate SF-1: Steroidogenic factor SF2/ASF: Splicing Factor 2/Alternative Splicing factor SHP: Small Heterodimer Partner SIDD: Stress-Induced DNA Duplex Destabilization SIRT1: Silent Information RegulaTor 1 S/MARS: Scaffold/Matrix Attachment RegionS SMRT: Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid receptor SnRNP: small nuclear RiboNucleoProtein Sp1: Specificity protein 1

xviii SRC-1: Steroid Receptor Coactivator 1 SRPK: Serine/Arginine Protein Kinase SWI/SNF: SWItch/ Sucrose Non Fermentable TAF: TBP Associated Factor TBP: TATA Binding Protein TEMED: Ν,Ν,Ν,Ν-Tetramethyl-ethylene-diamine TFIIB: Transcription Factor ΙΙΒ TGF: Transforming Growth Factor TLC: Thin Layer Chromatography TR: Thyroid Receptor TRAP: Τhyroid Receptor Associated Protein Tris: Τris-hydroxymethyl-aminomethane TrxR: Thioredoxin Reductase UTR: UnTranslated Region VDR: Vitamin D Receptor VLDL: Very Low Density Lipoproteins YY1: Ying-Yang 1 β-gal: β-galactosidase β-msh: β-mercaptoethanol 5-FU: 5-Fluoruracil

1 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ Ως πυρηνική µήτρα ή πυρηνικό ικρίωµα ή πυρηνικό σκελετό (nuclear matrix or nuclear scaffold or nucleoskeleton) ονοµάζουµε το δίκτυο πρωτεϊνών (NMP s-nuclear matrix proteins) και RNA που παραµένει αδιάλυτο έπειτα από την κατεργασία πυρήνων µε µη ιονικά απορρυπαντικά, διαλύµατα αλάτων υψηλής ιοντικής ισχύος και DNAse I. Η κατεργασία αυτή έχει ως αποτέλεσµα την αποµάκρυνση της πυρηνικής µεµβράνης, της µεγαλύτερης ποσότητας DNA, των ιστονών καθώς και των διαλυτών συστατικών του νουκλεοπλάσµατος και την παραµονή µιας δοµής που είναι ορατή µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. 1.1.1. ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Έχει περάσει πάνω από µισός αιώνας από τη στιγµή που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά η πυρηνική µήτρα, ως υπολειµµατική δοµή ύστερα από εκχύλιση κυττάρων µε διαλύµατα αλάτων (Zbarskii & Depov, 1948). Το 1963 οι Smetana et al., έδειξαν πως παραµένει ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό δίκτυο στον πυρήνα κυττάρων Walker tumor, καθώς και ηπατικών κυττάρων ποντικού έπειτα από αποµάκρυνση των διαλυτών στοιχείων του πυρήνα. Ο όρος πυρηνική µήτρα πρωτοαναφέρθηκε ως δοµική και λειτουργική οντότητα από τους Berezney και Coffey το1974. 1.1.2. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ ΠΥΡΗΝΙΚΗΣ ΜΗΤΡΑΣ Η πυρηνική µήτρα αποτελείται από την πυρηνική λάµινα και την εσωτερική πυρηνική µήτρα (internal nuclear matrix), που µε τη σειρά της αποτελείται από τα κεντρικά νηµάτια (core filaments), το διάχυτο σκελετό (diffuse skeleton), τον πυρηνίσκο (nucleolus) και τα λοιπά πυρηνικά σωµάτια (nuclear bodies). Η σύσταση της µήτρας έχει υπολογιστεί σε 85-95% πρωτεΐνες και 15-5% νουκλεϊκά οξέα. Έως τώρα έχουν βρεθεί 398 πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής µήτρας (βλ. ηλεκτρονική διεύθυνση: http://www.rostlab.org/db/nmpdb/)

2 Σχήµα 1.1. Ηλεκτρονική φωτογραφία πυρηνικής µήτρας CaSki καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων µήτρας. Με Nu συµβολίζεται ο πυρηνίσκος, µε L η λάµινα ενώ είναι ορατό και ένα δίκτυο. 1.1.2.1. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΛΑΜΙΝΑ Η πυρηνική λάµινα αποτελείται από τις λαµίνες τύπου Α και Β. Όλοι οι ευκαρυωτικοί οργανισµοί, εκτός από τους µονοκύτταρους, εκφράζουν λαµίνες. Οι Β τύπου λαµίνες εκφράζονται καθ όλη την ανάπτυξη ενώ η έκφραση των λαµινών τύπου Α έχει άµεση σχέση µε τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Οι λαµίνες αλληλεπιδρούν µεταξύ τους δίνοντας διµερή τα οποία στη συνέχεια πολυµερίζονται για να µας δώσουν τα ενδιάµεσα ινίδια (intermediate filaments) πάχους 10 nm. Τα ινίδια αυτά δηµιουργούν ένα δίκτυο στη εσωτερική πλευρά της πυρηνικής µεµβράνης που ως στόχο έχει τη συντήρηση της δοµικής ακεραιότητας και του σχήµατος του πυρήνα.

3 Σχήµα 1.2. Σχηµατική αναπαράσταση του πυρηνικού φακέλου µεσοφασικού ευκαρυωτικού κυττάρου. Στον πυρηνικό φάκελο διακρίνονται η εξωτερική και εσωτερική πυρηνική µεµβράνη (outer και inner nuclear membrane), ο περιπλασµικός χώρος (periplasmatic space), οι πυρηνικοί πόροι (nuclear pore complexes), η πυρηνική λάµινα (βέλος) καθώς και η φυσική συνέχεια του πυρηνικού φακέλου στο κυτταρόπλασµα, το ενδοπλασµατικό δίκτυο (Endoplasmatic Reticulum). Σχήµα 1.3. Υπόλειµµα πυρηνικού φακέλου από ωοκύτταρα Xenopus µετά από εκχύλιση µε Triton X-100 σε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Στην εικόνα διακρίνεται το σχεδόν τετραγωνικό δίκτυο των λαµινών και τα κενά που αφήνουν οι πυρηνικοί πόροι.

4 Πειράµατα απαλοιφής γονιδίου (κnock-out) της λαµίνης Α είχαν ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία εύθραυστων πυρήνων οι οποίοι ήταν πιο επιµήκεις από τους φυσιολογικούς (Sullivan et al., 1999). Οι λαµίνες τύπου Α έχουν ουδέτερο ισοηλεκτρικό σηµείο και συνδέονται µε την εσωτερική πυρηνική µεµβράνη µέσω των πρωτεϊνών LAP1 (Lamina Associated Polypeptide 1) και emerin ενώ οι τύπου Β είναι όξινες και συνδέονται µε την µεµβράνη µέσω των πρωτεϊνών LBR (Lamin B Receptor) και LAP2. Κατά τη διάρκεια της µίτωσης που ο πυρηνικός φάκελος καταστρέφεται, οι λαµίνες τύπου Α και κάποιες από τις πρωτεΐνες που συνδέονται µε αυτές φωσφορυλιώνονται, µε αποτέλεσµα να διαλυτοποιούνται ενώ οι τύπου Β παραµένουν προσκολληµένες σε µεµβρανώδη σωµατίδια (Georgatos et al., 1994). Περιοχή µε δοµή α- ελικοειδούς ράβδου NLS CaaX P P Σχήµα 1.4. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής των λαµινών. Στο σχήµα διακρίνεται προς το Ν- τελικό άκρο η περιοχή µε δοµή α-έλικας (α-helical rod domain) που θεωρείται υπεύθυνη για το διµερισµό τους και για τη δηµιουργία ανωτέρων δοµών. Στο C-τελικό άκρο υπάρχουν το σήµα πυρηνικής εντόπισης (NLS, Nuclear localization Signal) και το CaaX (C=κυστεΐνη, a=αλειφατικό αµινοξύ, Χ=οποιοδήποτε αµινοξύ) µοτίβο που είναι υπεύθυνο για την συγκράτηση των λαµινών στην πυρηνική µεµβράνη µέσω ισοπρενυλίωσης. ιακρίνονται επίσης και οι θέσεις φωσφορυλίωσης. Σχήµα 1.5. Σχηµατική αναπαράσταση του διµερισµού και της δηµιουργίας ανωτέρων δοµών από τις λαµίνες. Με τους µεγάλους κύκλους συµβολίζονται τα C-τελικά άκρα ενώ µε µικρά τα Ν- τελικά. Έως τώρα έχει αναφερθεί ένας µεγάλος αριθµός αλληλεπιδράσεων τόσο των ίδιων των λαµινών όσο και των των πρωτεϊνών που βρίσκονται προσκολληµένες πάνω τους µε συστατικά της χρωµατίνης. Οι λαµίνες, στην πολυµερισµένη τους

5 µορφή, δεσµεύονται στις περιοχές S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS) του DNA (Luderus et al., 1992) καθώς και σε ιστόνες (Taniura et al., 1995). O LBR αλληλεπιδρά µε την ετεροχρωµατινική πρωτεΐνη HP1 (Ye and Worman, 1996) και η πρωτεΐνη LAP2 µε την χρωµοσωµική πρωτεΐνη BAF (Barrier-to-Autointegration Factor) (Furukawa, 1999). Επίσης, ο LBR και η πρωτεΐνη LAP2 έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν µε την χρωµατίνη (Ye and Worman, 1994, Foisner and Gerase, 1993), απευθείας µε DNA (Duband-Goulet and Courvalin, 2000, Furukawa et al., 1997) καθώς και µε τις ιστόνες Η3 και Η4 (Polioudaki et al., 2001). Η πυρηνική λάµινα εµπλέκεται επίσης στη διαδικασία αντιγραφής του γενετικού υλικού αλλά και στη διαδικασία της σύνθεσης RNA. Σχήµα 1.6. Σχηµατική αναπαράσταση της περιοχής του πυρήνα γύρω από την πυρηνική λάµινα καθώς και των αλληλεπιδράσεων των λαµινών µε άλλα µόρια. Με κόκκινες γραµµές συµβολίζονται οι λαµίνες ενώ µε µπλε µόρια mrna. Με µωβ κύκλους συµβολίζεται η G-ακτίνη, µε καφέ η profilin, µε πορτοκαλί οι παράγοντες µεταγραφής και µε πράσινο οι Arps. Η χρωµατίνη φαίνεται σαν µπλε ή γκρι σκιά. Arp: Actin related protein, PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen, RFC: Replication Factor C, pol: polymerase.

6 ιάσπαση της πυρηνικής λάµινας έχει ως αποτέλεσµα τη διακοπή της σύνθεσης του DNA στη φάση της επιµήκυνσης (Spann et al., 1997). Επιπλέον, ορισµένα κοµµάτια της πρωτεΐνης LAP2 µπορούν να αναστείλουν ή να ενισχύσουν την αντιγραφή (Gant et al., 1999). Aλληλεπίδραση των λαµινών τύπου Α µε την φωσφορυλιωµένη µορφή της πρωτεΐνης Rb (Retinoblastoma) αναστέλλει την µεταγραφή συγκεκριµένων γονιδίων του κυτταρικού κύκλου (Mancini et al., 1994). Αποµένει να διαλευκανθεί αν τα µόρια αυτά της λαµίνης βρίσκονται στην πυρηνική περιφέρεια ή αποτελούν µέρος του εσωτερικού πυρηνικού ικριώµατος. Προς την δεύτερη άποψη συνηγορεί και ο συνεντοπισµός µέρους των λαµινών µε παράγοντες µατίσµατος στο εσωτερικό του πυρήνα (Kumaran et al., 2002). Τέλος, µεταλλάξεις στις λαµίνες τύπου Α οδηγεί σε ασθένειες όπως η EDMD (Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy), καρδιοµυοπάθεια, λιποδυστροφία και άλλες. 1.1.2.2. ΚΕΝΤΡΙΚΑ ΝΗΜΑΤΙΑ Τα κεντρικά νηµάτια αποτελούν µέλος της οικογένειας των ενδιάµεσων ινιδίων (intermediate filaments) µε πάχος 10 nm. Σηµαίνονται µε αντισώµατα απέναντι στις συντηρηµένες ακολουθίες των ενδιάµεσων ινιδίων όπως αυτών της λαµίνης Α (Hozak et al., 1995) και των κυτoκερατινών (Ocampo et al., 2005). 1.1.2.3. ΙΑΧΥΤΟΣ ΣΚΕΛΕΤΟΣ Χρησιµοποιούµε τον όρο διάχυτος σκελετός για την πολύπλοκη δοµή που βρίσκεται προσκολληµένη στα κεντρικά νηµάτια. Η δοµή αυτή αποτελείται από σύµπλοκα νουκλεϊκών οξέων µε πρωτεΐνες. Στις πρωτεΐνες συµπεριλαµβάνονται οι ετερογενείς πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες C1/2 και A (He et al., 1991) καθώς και η λαµίνη Α (Hozak et al., 1995). Ένα σηµαντικό συστατικό αυτού του σκελετού αποτελεί και η πρωτεΐνη NuMA (NUclear Mitotic Apparatus protein), µια µεγάλη σε µέγεθος πρωτεΐνη (>250 KDa), µε διαµόρφωση coiled-coil που εµπλέκεται στο µηχανισµό της µίτωσης (He et al., 1995) και δεσµεύεται στις περιοχές S/MARS του DNA (Harborth, et al., 1999). Πειράµατα διδιάστατης ηλεκτροφόρησης αποκάλυψαν την ύπαρξη τουλάχιστον 12 πρωτεϊνών στο διάχυτο πυρηνικό σκελετό, που ονοµάστηκαν matrins (Nakayasu and Berezney, 1991). Από τις πρωτεΐνες αυτές έχει µελετηθεί µόνο µία, η p250. Η p250

7 ταυτίζεται µε µια µορφή της RNA πολυµεράσης II και ανοσοκατακρηµνίζεται µε σύµπλοκα µατίσµατος του RNA (Mortillaro et al., 1996). Το κύριο νουκλεΐνικό οξύ του διάχυτου σκελετού είναι ετερογενές RNA (hnrna), το οποίο κατά ένα µεγάλο ποσοστό δεν αποτελεί πρώιµο mrna που οδηγείται στη συνέχεια εκτός πυρήνα, αλλά στοιχείο που συνεισφέρει στη δοµική ακεραιότητα της χρωµατίνης. Ως επιβεβαίωση τούτου ήρθε η παρατήρηση ότι κατεργασία κυττάρων µε ριβονουκλεάσες ή αναστολείς της RNA πολυµεράσης ΙΙ έχει ως αποτέλεσµα την «κατάρρευση» της χρωµατίνης σε πυκνές δοµές που προσοµοιάζουν την ετεροχρωµατίνη (Derenzini et al., 1981). Ένα τέτοιο RNA, που διαθέτει την ικανότητα να δεσµεύεται στην πυρηνική µήτρα και δεν κωδικοποιεί πρωτεΐνη, µε δεδοµένο ρόλο στη συντήρηση της χρωµατινικής δοµής και στον επιγενετικό έλεγχο, αποτελεί το XIST, ένα πολυαδενυλιωµένο RNA µε την ικανότητα να απενεργοποιεί χρωµοσώµατα (Clemson et al., 1996). Σχήµα 1.7. Ηλεκτρονική φωτογραφία πυρηνικού σκελετού HeLa καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων µήτρας. Με L συµβολίζεται η πυρηνική λάµινα, ενώ είναι ορατά τα κεντρικά νηµάτια αλλά και ο διάχυτος σκελετός (βέλος).

8 1.1.2.4. ΠΥΡΗΝΙΚΑ ΣΩΜΑΤΙΑ Τα πυρηνικά σωµάτια αποτελούν έναν ετερογενή πληθυσµό δοµών συνδεδεµένων στο διάχυτο σκελετό. Σ αυτά συµπεριλαµβάνονται τα σωµάτια Cajal (CB s) (Cajal Bodies ή Coiled Bodies) (Gedge et al., 2005), τα σωµάτια PML (Promyelotic Leukemia Bodies) (Stuurman et al., 1992), τα εργοστάσια αντιγραφής (replication factories) (Hozak et al., 1993), τα διαχρωµατινικά κοκκιώδη συµπλέγµατα (Ιnterchromatin Granule Clusters) (IGC s) (Fey et al., 1986) και τα περιχρωµατινικά νηµάτια (Perichromatin Fibrils) (PF s) (Van Driel et al., 1995). Τα σωµάτια Cajal ανακαλύφθηκαν από τον Santiago Ramon y Cajal το 1903. Εντοπίζονται στην περιφέρεια των πυρηνίσκων ή στο εσωτερικό τους. Καταστρέφονται στη µίτωση και επαναδηµιουργούνται στην G 1 φάση. Aποτελούν σηµεία βιογένεσης των snrnps (Gall et al., 1999), επεξεργασίας των πρώιµων mrna των ιστονών (Wu et al., 1993) και συναρµολόγησης των συµπλόκων µεταγραφής (Murphy et al., 2002). Ριβοσώµατα ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ: Μεταγραφή και επεξεργασία RNA Γονίδια pol I ΠΥΡΗΝΙΣΚΟΣ: Συναρµολόγηση ριβοσωµάτων mrna Γονίδια pol II Τρανσκριπτοσώµατα pol ΙΙ Τρανσκριπτοσώµατα pol ΙΙΙ Τρανσκριπτοσώµατα pol Ι ΣΩΜΑΤΙΑ CAJAL: Συναρµολόγηση «εργοστασίων» µεταγραφήςεπεξεργασίας RNA (Τρανσκριπτοσώµατα pol I, II και III) Γονίδια pol III snornp s snrnp s, πρωτεΐνες Σχηµα 1.8. Προτεινόµενο µοντέλο της λειτουργίας των σωµατίων Cajal. H βασική υπόθεση είναι ότι τα σύµπλοκα των RNA πολυµερασών συναρµολογούνται στα σωµάτια αυτά πριν καταλήξουν στα γονίδια στόχους τους.

9 Τα σωµάτια PML (ή σωµάτια Kremer ή σωµάτια ND10 ή POD s (PML Oncogenic Domains)) έχουν διάµετρο 0,5 µm και αποτελούνται από έναν κεντρικό πυρήνα που περιβάλλεται από έναν πυκνό δακτύλιο, ο οποίος περιέχει κυρίως την πρωτεΐνη PML. Μια άλλη ενδιαφέρουσα πρωτεΐνη που εντοπίζεται σε αυτά τα σωµάτια είναι η Rb (Retinoblastoma). Πιστεύεται πως διαδραµατίζουν κάποιο ρόλο στον έλεγχο της µεταγραφής (Hodges et al., 1998), στην επιδιόρθωση του DNA (Bischof et al., 2001) και αποτελούν στόχους ιικής µόλυνσης (Maul et al., 1998). Τα σωµάτια αυτά κέρδισαν την προσοχή του επιστηµονικού κόσµου όταν ανακαλύφθηκε ότι διασπώνται σε ασθενείς που εµφανίζουν µία µετατόπιση (t15;17:q22;q21) που οδηγεί σε µία µορφή λευχαιµίας (Acute Promyelocytic Leukemia) (Daniel et al., 1993). Η πρωτεΐνη PML λειτουργεί ως αρνητικός ρυθµιστής της ανάπτυξης (Hodges et al., 1998) και ως ογκοκατασταλτικός παράγοντας (Grimwade and Solomon, 1997). Αύξηση των επιπέδων της µπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση (Wang et al., 1998c), ενώ µια ισοµορφή της έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη p53 (Fogal et al., 2000). Στα «εργοστάσια» αντιγραφής εκτός από DNA ανιχνεύονται η κινάση cdk2 (cyclin-dependent kinase), διάφορες κυκλίνες, το PCNA, και η DNA µεθυλοτρανσφεράση, συστατικά όλα του µηχανισµού αντιγραφής (Wansink et al., 1994). Τα διαχρωµατινικά κοκκιώδη συµπλέγµατα (IGC s) αποτελούν χώρους όπου αποθηκεύονται υπό µορφή συµπλόκων οι παράγοντες µατίσµατος του RNA και βρίσκονται σε γειτονία µε τα περιχρωµατινικά νηµάτια (PF s), όπου λαµβάνει χώρα η µεταγραφή και η ωρίµανση του RNA µε παράγοντες που προέρχονται από τα IGC s (Spector, 1996). Στα IGC s εντοπίζεται και η πρωτεΐνη NuMA, η οποία συνδέεται µε τα σύµπλοκα των παραγόντων µατίσµατος (van Driel et al., 1995). Στα PF s εντοπίζονται ετερογενή ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύµπλοκα (hnrnp s) (Fakan et al., 1976), η RNA πολυµεράση ΙΙ, διάφοροι παράγοντες µεταγραφής καθώς και παράγοντες µατίσµατος (Fakan et al., 1984). 1.1.2.5. ΠΥΡΗΝΙΣΚΟΣ Οι πυρηνίσκοι είναι οι περιοχές σύνθεσης του rrna και συγκρότησης των ριβοσωµικών υποµονάδων. Αποτελούν τις πιο διακριτές µορφές µέσα στον πυρήνα καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου εκτός της µίτωσης οπότε και αποσυγκροτούνται, ενώ επανασυγκροτούνται στην G 1 φάση. εν καλύπτονται από

10 µεµβράνη. Στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο εµφανίζονται ως φωτεινές ζώνες (ινώδη κέντρα Fibrillar Centers (FC s)) που περιβάλλονται από ένα πυκνό ινώδες σώµα (Dense Fibrillar Components (DFC s) το οποίο είναι καθηλωµένο σε ένα κοκκιώδες σώµα (Granular Component (GC)). Τα ινώδη κέντρα αποτελούν χώρους εντόπισης του rdna, της RNA πολυµεράσης Ι, της τοποισοµεράσης Ι και άλλων πρωτεϊνών απαραίτητων για τη µεταγραφή του ριβοσωµικού RNA. Στα ινώδη κέντρα γίνεται η σύνθεση του rrna, το οποίο στη συνέχεια µετατοπίζεται στα πυκνά ινώδη σώµατα όπου και αρχίζει η ωρίµανσή του. Στα κοκκιώδη σώµατα ολοκληρώνεται η ωρίµανση του και δηµιουργούνται τα πρώιµα ριβοσώµατα. Σχήµα 1.9. Οργάνωση του πυρηνίσκου σε Hep-2 καρκινικά κύτταρα λάρυγγα. F=ινώδες συστατικό, FC=ινώδες κέντρο, DFC=πυκνό ινώδες κέντρο, G ή GC=κοκκιώδες συστατικό, Ch=συµπυκνωµένη χρωµατίνη, Ni=ενδιάµεσος χώρος.

11 1.1.3. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ-ΜΙΑ ΣΤΑΘΕΡΗ, ΥΝΑΜΙΚΗ Ή ΦΑΝΤΑΣΤΙΚΗ ΟΝΤΟΤΗΤΑ Υπάρχουν επιστήµονες που αµφισβητούν την ύπαρξη της πυρηνικής µήτρας. Και αυτό γιατί ο ανοσοφθορισµός σε ολόκληρα κύτταρα δεν µας έχει δώσει την εικόνα ενός δικτύου ανάλογου του κυτταροσκελετού αλλά κουκίδων (speckles), γεγονός που όµως µπορεί να οφείλεται στη µη διαθεσιµότητα επιτόπων, τα οποία βρίσκονται θαµµένα στην πυκνή χρωµατίνη. Οι σκεπτικιστές υποστηρίζουν πως η αποµάκρυνση των νουκλεϊκών οξέων δηµιουργεί φαινόµενα ανακατανοµής και συσσωµάτωσης των πυρηνικών πρωτεϊνών. Επιπλέον θεωρούν πως η κατεργασία µε άλατα επηρεάζει την αλληλεπίδραση µεταξύ πρωτεϊνών. Σε αντίθεση µε τις παραπάνω παρατηρήσεις και εικασίες έρχονται δύο µελέτες. Από εικόνες που έχουν ληφθεί από ζωντανά κύτταρα θηλαστικών αποκαλύφθηκε πως ο παράγοντας µατίσµατος SF2/ASF σε πολλές περιπτώσεις εγκαταλείπει τις περιοχές συσσώρευσης του και κινείται σε σχετικά ευθείες τροχιές (Mistelli et al., 1997 και http://www.cshl.org/labs/spector). Το γεγονός αυτό συνηγορεί µε την ύπαρξη ενός δικτύου ινιδίων που χρησιµεύει ως «ράγες» για την µετακίνηση µορίων στον πυρήνα. Το ίδιο φαινόµενο έχει παρατηρηθεί και σε µόρια pre-mrna (Ishov et al., 1997). Στη δεύτερη µελέτη που χρησιµοποιήθηκε ανοσοφθορισµός σε πυρήνες εµβρύων Drosophila στη βλαστοδερµική φάση, δύο πρωτεΐνες µε την ικανότητα να µεταναστεύουν µεταξύ κεντροσωµατίου και πυρήνα, οι CP60 και CP190, παρατηρήθηκαν ως συστατικά 2 διαφορετικών δικτύων. Τα δύο αυτά δίκτυα δεν αλληλεπικαλύπτονταν ούτε µεταξύ τους, ούτε µε την χρωµατίνη. Επιπλέον συνέχιζαν να υπάρχουν και στη µετάφαση, µετά την αποδιάταξη του πυρηνικού φακέλου, γεγονός που αποκλείει την πιθανότητα συσσώρευσης µονοµερών µορφών των πρωτεϊνών στα κενά µεταξύ της χρωµατίνης (Oegema et al., 1997). Η τρίτη σχολή έρχεται να γεφυρώσει τις δύο παραπάνω απόψεις και υποστηρίζει πως η πυρηνική µήτρα δεν αποτελεί µία στατική δοµή που προϋπάρχει αλλά ένα δυναµικό δίκτυο του οποίου η συγκρότηση επάγεται τοπικά από γεγονότα που λαµβάνουν χώρα στον πυρήνα. Η άποψη αυτή ενισχύεται από την παρατήρηση ότι οι hnrnp s, µόλις απελευθερωθούν από τις περιοχές δέσµευσης του RNA, δηµιουργούν ινίδια (Lothstein et al., 1985), των οποίων η δοµή και οι διακλαδώσεις

12 που δηµιουργούν σχεδόν ταυτίζονται µε αυτές που προκύπτουν από παρασκευές πυρηνικού ικριώµατος (Tan et al., 2000). 1.1.4. S/MARS (Scaffold/Matrix Attachment RegionS) Στην πυρηνική µήτρα έχουν βρεθεί να παραµένουν προσκολληµένες αλληλουχίες DNA ύστερα από κατεργασία µε DNAse I, που ονοµάζονται S/MARS (Berezney & Jeon, 1995). Επίσης ως S/MARS χαρακτηρίζονται οι περιοχές του DNA που δεσµεύονται σε παρασκευές πυρηνικής µήτρας παρουσία DNA συναγωνιστή. Σχεδόν όλα τα S/MARS είναι πλούσια σε ΑΤ (πάνω από 65% της σύστασης τους) και σχηµατίζουν µονόκλωνες ή περιοχές µη σύζευξης βάσεων (BUR s-base Unpairing Regions). Ταυτίζονται µε τις περιοχές SIDD (Stress-Induced DNA Duplex Destabilization). Αρκετά S/MARS είναι συντηρηµένα στην εξέλιξη όχι τόσο όσον αφορά την αλληλουχία τους όσο τη σχετική τους θέση ως προς αντίστοιχα γονίδια. Τα S/MARS µοιράζονται κάποια από τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: εµπεριέχουν ή γειτονεύουν µε περιοχές έναρξης της αντιγραφής (ORIgins of replication - ORI), εµπεριέχουν περιοχές δέσµευσης οµοιωτικών πρωτεϊνών δηλαδή τις αλληλουχίες ΑΤΤΑ, ΑΤΤΤΑ ή ΑΤΤΤΤΑ, εµπεριέχουν αλληλουχίες δέσµευσης ή κοπής από τις τοποισοµεράσες Ι ή ΙΙ ή/και εµπεριέχουν περιοχές δέσµευσης παραγόντων µεταγραφής. Οι ιδιότητες τους οφείλονται όχι σ αυτήν καθ αυτήν την αλληλουχία τους αλλά στη δευτερογενή δοµή που αποκτούν εξαιτίας της αλληλουχίας τους. Χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: στις δοµικές ακολουθίες (structural-constitutive) που περιλαµβάνουν αυτές που είναι µόνιµα προσκολληµένες στην µήτρα και σκοπός τους είναι διατηρούν την χρωµατινική δοµή και τις λειτουργικές (functional-facultative) που εµπεριέχουν ιστοειδικές περιοχές δέσµευσης παραγόντων µεταγραφής και µπορούν να αποκολληθούν από αυτήν. Με µια υπολογιστική προσέγγιση βρέθηκε ότι περίπου το 11% των περιοχών DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες τόσο στο ανθρώπινο, όσο και στο γονιδίωµα του ποντικού αποτελούν S/MARS. Επιπλέον βρέθηκε πως η πλειονότητα των S/MARS εµφανίζεται πριν την 5 περιοχή των γονιδίων (Glazko et al., 2003). Τα S/MARS απέχουν µεταξύ τους 5-200 Κbp ανάλογα µε το κύτταρο στο οποίο περιέχονται. Στο µεταφασικό χρωµόσωµα βρέθηκε πως η κατανοµή των S/MARS είναι εκπληκτικά οµοιογενής, υποδηλώνοντας πως η χρωµατίδα δηµιουργείται από την ιεραρχική αναδίπλωση της χρωµατίνης (Strukov et al., 2003).

13 Σύνδεση Μεταγραφή Τερµατισµός ΜΗΤΡΑ ΜΗΤΡΑ ΜΗΤΡΑ ΣΥΜΠΛΟΚΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ Αποσύνδεση Σχήµα 1.10. οµικά και λειτουργικά S/MARS και µεταγραφή. Ένα ρεπλικόνιο (τµήµα DNA που αντιγράφεται από µία κοινή αρχή) µε τα δοµικά του S/MARS καθηλωµένα στη µήτρα αρχίζει να µεταγράφεται. Για την έναρξη της µεταγραφής το λειτουργικό S/MAR συνδέεται και αυτό µε τη µήτρα για να φέρει το γονίδιο σε επαφή µε τον µηχανισµό της µεταγραφής. Το µεταγραφικό σύµπλοκο παραµένει καθηλωµένο ενώ το DNA είναι αυτό που κινείται. Μετά το πέρας της διαδικασίας το λειτουργικό S/MAR αποµακρύνεται από τη µήτρα Τα S/MARS που έχουν µήκος πάνω από 1 Κbp θεωρούνται ως «φράγµατα» της χρωµατινικής δοµής και παίζουν ουσιώδη ρόλο στην πυρηνική δοµή και λειτουργία. Πιστεύεται ότι στον πυρήνα ενός κυττάρου θηλαστικού οργανώνονται τα 25x10 6 νουκλεοσώµατα σε 60000 χρωµατινικές θηλιές των 70 Kbp κατά µέσο όρο, µέσω των S/MARS ακολουθιών (Bode et al., 2000). Θεωρείται λοιπόν ότι οι θηλιές αυτές αποτελούν τοπολογικά αποµονωµένες µονάδες στις οποίες διαδικασίες όπως η αντιγραφή ή η συµπύκνωση της χρωµατίνης µπορεί να ρυθµίζεται ανεξάρτητα. Κάποιες απ αυτές παραµένουν συµπυκνωµένες και εποµένως ανενεργές ακόµα και σε ευχρωµατινικές περιοχές ενώ άλλες ανοιχτές και ενεργές. 1.1.5. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ Μία από τις πρώτες in vivo ενδείξεις ότι η πυρηνική µήτρα διαδραµατίζει βασικό ρόλο στην αντιγραφή ήρθε όταν οι Pardoll et al., (1980) έδειξαν πως το νεοσυντιθέµενο DNA κινείται από τη βάση των θηλιών προς την περιφέρεια τους.

14 Αρχή της G1 φάσης Τέλος της G1 φάσης S φάση Σχήµα 1.11. Σχηµατική αναπαράσταση της συγκρότησης του ORC ολοσυµπλόκου και της καθήλωσης του στην πυρηνική µήτρα. Το ORC 2-5 σύµπλοκο είναι δεσµευµένο στα ORI του DNA (πορτοκαλί κύκλος) καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Στο τέλος της G 1 φάσης

15 δηµιουργείται το ολοσύµπλοκο ORC 1-5 το οποίο προσκολλάται στην πυρηνική µήτρα (γκρι). Η αποσύνδεση του ORC 1 έπειτα από την έναρξη της αντιγραφής προκαλεί την επιστροφή του ORC 2-5 στην αρχική του κατάσταση. εν είναι ξεκάθαρο σε ποιο ORI παραµένει δεσµευµένο το ORC 2-5. Άλλο ένα στοιχείο προς την κατεύθυνση αυτή ήρθε όταν οι Croft et al., (1999) έδειξαν ότι στο µεσοφασικό πυρήνα το ανθρώπινο χρωµόσωµα 19 καταλαµβάνει µια πιο εσωτερική θέση από το χρωµόσωµα 18 και συνδέεται εκτενέστερα µε την πυρηνική µήτρα, ενώ είχε προηγουµένως δειχθεί από τους Dutrillaux et al., (1976) ότι το χρωµόσωµα 19 αντιγράφεται πριν το 18. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα το DNA είναι οργανωµένο σε 10 4 ρεπλικόνια τα οποία αντιγράφονται µία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο στην S φάση. Για να επιτευχθεί αυτό το DNA παίρνει την µορφή θηλιών που προσκολλούνται στην πυρηνική µήτρα (Hozak et al., 1993,1994). Κάθε θηλιά αντιπροσωπεύει ένα ξεχωριστό ρεπλικόνιο µε τα ORI του µέσα στη θηλιά και το τέλος του προσκολληµένο στο πυρηνικό ικρίωµα στο τέλος της θηλιάς. Στο τέλος της G 1 φάσης τα ORI συνδέονται µε την πυρηνική µήτρα (Djeliova et al., 2001) µάλλον µέσω των ORC (Origin Recognition Complexes) (Ohta et al., 2003) και αποσυνδέονται µετά την έναρξη της αντιγραφής στην S φάση. Οι αλληλουχίες S/MARS έχουν αποµονωθεί µαζί µε ORI (Pemov et al., 1998). Συστάδες από αρκετά ρεπλικόνια αντιγράφονται µαζί στα «εργοστάσια» αντιγραφής (replication factories) που εντοπίζονται πάνω στον πυρηνικό σκελετό (Berezney et al., 2000). Τα «εργοστάσια» αντιγραφής προσκολληµένα στην µήτρα διατηρούν τη δραστικότητα τους µετά από πέψη µε DNAse και εκχύλιση µε ήπιες συνθήκες και δεν διαφέρουν µικροσκοπικά από αυτά των άθικτων κυττάρων (Radichev et al., 2005). Kαταλαµβάνουν συγκεκριµένα σηµεία στον πυρήνα τα οποία είναι τα ίδια για συγκεκριµένες αλληλουχίες DNA, για την ίδια περίοδο της S φάσης και συντηρούνται και στις µελλοντικές γενεές (Ma et al., 1998). Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, το DNA από κάθε ρεπλικόνιο περνάει µέσα από αυτά τα «εργοστάσια» (Hozak et al., 1993,1994), τα οποία µετά τη λήξη της σύνθεσης DNA της συστάδας αποσυγκροτούνται και επανασυγκροτύνται κάπου αλλού για να αντιγραφεί η επόµενη συστάδα (Sadoni et al., 2004). Η νεοσυντιθέµενη χρωµατίνη παραµένει για κάποια ώρα (10-20 min) προσκολληµένη στην µήτρα (Pospelov et al., 1982) ενώ οι µπερδεµένες θηλιές του DNA χωρίζονται από τοποϊσοµεράσες που βρίσκονται στην πυρηνική µήτρα στη βάση των θηλιών (Iarovaia et al., 2004). Η τοποϊσοµεράση ΙΙ συνδέεται µε τα S/MARS (Berrios et al., 1985) και θεωρείται

16 συστατικό του πυρηνικού ικριώµατος (Earnshaw and Heck, 1985). Εποµένως το πυρηνικό ικρίωµα παίζει ένα διπλό ρόλο στη διαδικασία της αντιγραφής: από τη µία προσφέρει τη δοµική στήριξη για τον µηχανισµό της αντιγραφής και από την άλλη φέρνει σε κατάλληλη θέση τους παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την έναρξη, επιµήκυνση και τερµατισµό της. 1.1.6. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Μετά από εκχύλιση µε άλατα τα µεταγραφικά ενεργά γονίδια παραµένουν συνδεδεµένα µε τον πυρηνικό σκελετό (Gerdes et al., 1994). Στην πυρηνική µήτρα έχει αναφερθεί ότι προσδένεται η υπερφωσφορυλιωµένη µορφή της µεγαλύτερης υποµονάδας της RNA πολυµεράσης II µαζί µε µεταγραφικούς παράγοντες όπως οι ER (Estrogen receptor), NMP-2 (Nuclear Matrix protein-2), YY1 (Ying-Yang 1), AML-1 (Acute Myeloid Leukemia protein-1), Sp1 (Specificity protein 1), GATA-1, NF-1, RFP (van Wijnen et al., 1993, Merriman et al., 1995, Sun et al., 1994, Dworetzky et al., 1992, Isomura et al., 1992, Vassetzky et al., 1993), µε παράγοντες αναδιοργάνωσης της χρωµατίνης όπως η HAT A (Histone Acetyl-Transferase A) (Hendzel et al., 1994) και η ΗDAC 1 (Histone DeACetylase 1) (Li et al., 1996) και µε παράγοντες µατίσµατος (Mortillaro et al., 1996). Μάλιστα παρασκευές πυρηνικών σκελετών από ανώριµα ερυθροκύτταρα όρνιθας, διατηρούν το 80% της δραστικότητας ακετυλοτρανσφεράσης και απακετυλάσης και τα ένζυµα αυτά καταλύουν την αντιστρεπτή ακετυλίωση της χρωµατίνης που συνδέεται µε την µήτρα (Hendzel et al., 1994). Επιπλέον, έχουν αποδοθεί ρόλοι στα S/MARS ως ενισχυτές (enhancers) ή µονωτές (insulators) της µεταγραφής. Μελετώντας την µεταγραφή του γονιδίου της ανοσοσφαιρίνης µ, οι Fernandez et al., (2001), έδειξαν πως ο συνδυασµός ενός κλασσικού ενισχυτή και των ακολουθιών S/MARS συνιστά ένα LCR (Locus Control Region), δηλαδή µία περιοχή που είναι ικανή per se να καθορίζει αν η χρωµατίνη είναι ανοιχτή (ενεργή, υπερακετυλιωµένη) ή κλειστή (ανενεργή, ετεροχρωµατινική, µε την ιστόνη Η3 µεθυλιωµένη). Ακόµα, διαγονιδιακά ποντίκια στα οποία έχει προστεθεί το γονίδιο της Ιgk, χωρίς όµως τις S/MARS ακολουθίες, εµφανίζουν χαµηλή έκφραση της πρωτεΐνης (Blasquez et al., 1989). Τελος, πειράµατα προκειµένου να καθοριστούν οι ελάχιστες συνθήκες που απαιτούνται για να µπορέσει ένας πλασµιδιακός φορέας να πολλαπλασιαστεί εξωχρωµοσωµικά σε κύτταρα θηλαστικών, έδειξαν πως τοποθέτηση αλληλουχιών

17 S/MARS, σε γειτονία µε µία ενεργά µεταγραφική µονάδα, οδηγούν σε πολλαπλά αντίγραφα του φορέα, που συνδέονται µάλιστα µε το πυρηνικό ικρίωµα µέσω αλληλεπίδρασης µε την πρωτεΐνη SAF-A (Jenke et al., 2004). Σχήµα 1.12. Σχηµατική αναπαράσταση µιας µεταγραφικά ενεργής θηλιάς. Tα δοµικά S/MARS επιτρέπουν την δέσµευση της βάσης της θηλιάς στο πυρηνικό ικρίωµα. Σε γονίδιο της θηλιάς λαµβάνει χώρα αναδιάταξη της χρωµατίνης ώστε να επιτευχθεί η αλληλεπίδραση DNA-πρωτεϊνών που έχει ως αποτέλεσµα την έναρξη της µεταγραφής. 1.1.7. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΜΑΤΙΣΜΑ Σε παρασκευές πυρηνικής µήτρας έχουν βρεθεί πρώιµα και ώριµα mrna (Mariman et al., 1982) καθώς και παράγοντες µατίσµατος (Blencowe et al., 1994). Τα παρασκευάσµατα αυτά πυρηνικής µήτρας έχουν την ικανότητα να αποκόπτουν ιντρόνια in situ εάν τους προστεθεί ΑΤΡ (Blencowe et al., 1998).

18 Σχήµα 1.13. Μοντέλο που φανερώνει τη λειτουργική και χωρική σχέση µεταξύ των υποπυρηνικών εστιών µε τελικό αποτέλεσµα τη σύνθεση ώριµων µορίων RNA. H χρωµατίνη περνάει από την κλειστή στην ανοιχτή της µορφή µέσω των SWI/SNF συµπλόκων. Αυτό το άνοιγµα ευνοεί τη σύνδεση στο DNA παραγόντων µεταγραφής TF s και των υποδοχέων των στεροειδών ορµονών (SHR, Steroid Hormone Receptor), οι οποίοι στρατολογούν τις ακετυλο-τρανσφεράσες (HAT) για παραπέρα αναδιάταξη της χρωµατίνης. Στη συνέχεια επιστρατεύεται και η RNA πολυµεράση II µε αποτέλεσµα τη σύνθεση πρώιµου RNA. H δηµιουργία ώριµου RNA λαµβάνει χώρα σε εστίες πλούσιες στην πρωτεΐνη SC35. 1.1.8. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ, ΙΣΤΟΕΙ ΙΚΟΤΗΤΑ, ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ Οι περισσότερες πρωτεΐνες του πυρηνικού ικριώµατος είναι κοινές στα περισσότερα κύτταρα, ενώ κάποιες διαφέρουν µεταξύ κυττάρων ή ιστών. 25 από τις πιο άφθονες πρωτεΐνες είναι κοινές σε όλα τα κύτταρα και αποτελούν το 75% του συνόλου των πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας (Mattern et al., 1997). Παρ όλα αυτά κάθε κύτταρο και ιστός έχει και κάποιες ειδικές πρωτεΐνες που µπορούν να αποτελέσουν κατά κάποιο τρόπο το «αποτύπωµα» του (Getzenberg, 1994). Επιπλέον, έναρξη της διαδικασίας της µίτωσης ή της διαφοροποίησης έχει σαν αποτέλεσµα αλλαγή της πρωτεϊνικής σύστασης της πυρηνικής µήτρας (Dworetsky et al., 1990). Το ίδιο

19 αποτέλεσµα έχει και η προσθήκη εξωγενών παραγόντων, συµπεριλαµβανοµένων στεροειδών όπως η διυδροτεστοστερόνη (Barrack, 1993). Σύµφωνα µε την παραδοσιακή άποψη οργάνωσης του κυττάρου κατά τη διάρκεια της µίτωσης, η πυρηνική µήτρα αποσυγκροτείται κατά την πρόφαση για να επαναδηµιουργηθεί ξανά στην τελόφαση. Όµως τελευταίες θεωρίες υποστηρίζουν πως ένα µεγάλο µέρος του πυρηνικού ικριώµατος χρησιµεύει για να αποτελέσει τη βάση του µηχανισµού της µίτωσης (Mancini et al., 1996). Προς αυτήν την κατεύθυνση συνηγορεί η εύρεση πρωτεϊνών όπως η NuMA, τόσο στην πυρηνική µήτρα όσο και στην µιτωτική άτρακτο κατά την Μ φάση (He et al., 1995). Μία άλλη πρωτεΐνη ρυθµιστής του κυτταρικού κύκλου, η πρωτείνη Rb, δεσµεύεται σε πυρηνικά σωµάτια, στους πυρηνίσκους και στην πυρηνική λάµινα µόνο στην G 1 φάση (Mancini et al., 1994), στην οποία είναι υποφωσφορυλιωµένη. Αυτό που παρουσιάζει ενδιαφέρον είναι ότι υπερφωσφορυλιωµένη ή µεταλλαγµένη Rb, που απαντάται σε διάφορες µορφές καρκίνων, δεν δεσµεύεται στην πυρηνική µήτρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εντόπιση αυτή ίσως να είναι πολύ βασική για την σωστή λειτουργία της πρωτεΐνης (Mittnacht & Weinberg, 1991, Durfee et al., 1994). Άλλη µία πρωτεΐνη βασική για την µίτωση, η ακτίνη, βρίσκεται άφθονη στην πυρηνική µήτρα, είτε στον διάχυτο σκελετό µε την F µορφή της (Ocampo et al., 2005), είτε στα σωµάτια Cajal µε την G µορφή της (Gedge et al., 2005). Επιπλέον, µε βάση κυρίως µελέτες που έγιναν για την πρωτεΐνη SATB1, η οποία εκφράζεται µόνο σε Τ-λεµφοκύτταρα, δεσµεύεται σε αλληλουχίες S/MARS και είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση και τη σωστή λειτουργία των κυττάρων αυτών, διατυπώθηκε η υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες που δεσµεύονται στα S/MARS ίσως να δρουν και ως καθολικοί ρυθµιστές της κυτταρικής διαφοροποίησης (Alvarez et al., 2000). 1.1.9. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ Με δεδοµένο ότι η πυρηνική µήτρα διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην οργάνωση του γενετικού υλικού και την έκφραση των γονιδίων είναι πολύ πιθανόν τα διάφορα χαρακτηριστικά του καρκίνου όπως οι χρωµοσωµικές ανακατατάξεις καθώς και η γενική χρωµοσωµική αστάθεια να οφείλεται σε αλλαγή της σύστασης του πυρηνικού ικριώµατος. Εφόσον το πυρηνικό ικρίωµα θεωρείται υπεύθυνο για τη διατήρηση της σχηµατικής ακεραιότητας του πυρήνα είναι λογικό να συµπεράνουµε ότι αλλαγές στη

20 µορφή και τη σύσταση της πυρηνικής µήτρας οδηγούν σε αλλαγή του σχήµατος του πυρήνα, ένα από τα χαρακτηριστικά της νεοπλασίας. Ήδη επιστηµονικές µελέτες έχουν δείξει πως το προφίλ των πρωτεϊνών του πυρηνικού σκελετού διαφέρει µεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ηπατικών κυττάρων (Berezney et al., 1979) καθώς επίσης και πως οι διάφορες καρκινικές σειρές µπορεί να διακριθούν µε βάση τα προφίλ των πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας (Fey and Penman, 1998). Η παρατήρηση αυτή οδήγησε και στις πατέντες του ΜΙΤ 4,885,236 και 4,882,268 σύµφωνα µε τις οποίες πρωτεΐνες της πυρηνικής µήτρας χρησιµοποιούνται για τη διάγνωση του καρκίνου. Επιπλέον, µία πρωτεΐνη του πυρηνικού ικριώµατος, η PC-1/ nucleophosmin, η οποία συνδέεται µε RNA, εµφανίζεται αποκλειστικά σε καρκίνους του προστάτη (Partin et al.,1997) ενώ η πρωτεΐνη p114 εµφανίζεται µονάχα σε καρκίνους του µαστού (Yanasigawa et al., 1996). Τέλος, υπάρχει το ο έλεγχος για την ΝΜΡ22 (Matritech, Inc), το οποίο έχει εγκριθεί από τον FDA και χρησιµεύει σε συνδυασµό µε κυτταρολογικά και ενδοσκοπικά δεδοµένα για τον έλεγχο επανεµφάνισης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, έπειτα από θεραπεία (Soloway et al., 1996). 1.1.10. ΣHΜΑ ΕΝΤΟΠΙΣΗΣ ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ (NMTS, Nuclear Matrix Targeting Signal) Aλληλουχίες υπεύθυνες για την πρόσδεση στην πυρηνική µήτρα έχουν εντοπιστεί σε διάφορες πρωτεΐνες όπως υποδοχείς στεροειδών (Eggert et al., 1997, Oesterreich et al., 2000a), παράγοντες µεταγραφής, ιικές πρωτεΐνες και ορισµένες κινάσες. εν έχει εντοπιστεί συγκεκριµένη αµινοξική ακολουθία που να καθηλώνει µία πρωτεΐνη στον πυρηνικό σκελετό. ιαφορετικά NMTS συνδέονται σε διαφορετικές πρωτεΐνεςυποδοχείς καθώς και σε διαφορετικές περιοχές του πυρηνικού σκελετού. Τα µεγέθη των NMTS διαφέρουν από 28 αµινοξέα (Lhx3) µέχρι σχεδόν ολόκληρη την πρωτεΐνη (ZNF74). Επιπλέον, έχει βρεθεί πως τα NMTS άλλοτε συµπίπτουν µε τα NLS (Nuclear Localization Signals) (κινάση DYRK1), άλλοτε µε την περιοχή δέσµευσης στο DNA (υποδοχέας των γλυκοκορτικοειδών) και άλλοτε είναι εντελώς διαφορετικά (πρωτεΐνη AML1). Η δέσµευση στον πυρηνικό σκελετό µπορεί να είναι ρυθµιζόµενη και αντιστρεπτή. Έτσι, οι υποδοχείς των στεροειδών απαιτούν την παρουσία της

21 αντίστοιχης ορµόνης (Barrack & Coffey, 1980) ενώ η ισχύς της δέσµευσης του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών εξαρτάται από την απουσία ή την παρουσία ΑΤΡ (Tang & DeFranco, 1996). Η κινάση CKII δεσµεύεται στη τoποισοµεράση ΙΙ και στις RNA πολυµεράσες του πυρηνικού ικριώµατος ισχυρότερα παρουσία ανδρογόνων καθώς και παραγόντων ανάπτυξης (Guo et al., 1999). Τέλος, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη Rb δεσµεύεται στην πυρηνική µήτρα στην G 1 φάση όπου βρίσκεται στην υποφωσφορυλιωµένη της µορφή και όχι στην S φάση (Mancini et al., 1994). Σε ασθένειες όπως η οξεία µυελογενής λευχαιµία όπου το NMTS της πρωτεΐνης AML1 έχει µεταλλαχθεί, η κατανοµή της πάνω στην πυρηνική µήτρα µεταβάλλεται σηµανικά (McNeil et al., 1999). 1.2. ΠΡΩΤΕΪΝΗ p53 Η πρωτεΐνη p53 έχει χαρακτηριστεί ως «φύλακας του γενώµατος» λόγω της ικανότητας της να καταστέλλει καρκίνους. Αυτό που κάνει στην πραγµατικότητα είναι να ανταποκρίνεται στα διάφορα κυτταρικά στρες προκαλώντας διάφορες κυτταρικές αντιδράσεις, κυρίως µέσω της µεταγραφικής ενεργοποίησης ή απενεργοποίησης συγκεκριµένων γονιδίων. Ο µεταγραφικός αυτός έλεγχος είναι αποτέλεσµα είτε αλληλεπίδρασης της p53 µε διάφορα µόρια (συµπεριλαµβανοµένου και του εαυτού της-ολιγοµερισµός), είτε µετα- µεταφραστικής τροποποίησης του µορίου της (φωσφορυλίωση, Ο-γλυκοσυλίωση, ακετυλίωση, ουβικιτινυλίωση, σουµοϋλίωση), είτε µεταβολής στην υποκυτταρική της εντόπιση είτε τέλος µεταβολής των επιπέδων της p53 στο κύτταρο. Η ποσότητα της πρωτεΐνης p53 ανά πάσα χρονική στιγµή αποτελεί προϊόν µίας δυναµικής ισορροπίας ανάµεσα στους ρυθµούς σύνθεσης (που εξαρτώνται από τα επίπεδα µεταγραφής και µετάφρασης της, καθώς και την σταθερότητα του mrna της) και αποικοδόµησης της (που εξαρτάται κυρίως από την ουβικιτινυλίωση της µέσω της πρωτεΐνης mdm2). Η µελέτη του τρόπου δράσης της p53 περιπλέκεται σηµαντικά αν αναλογιστούµε ότι εµφανίζεται µε 12 διαφορετικά mrna και 9 διαφορετικές ισοµορφές. Ακόµα, έχουν βρεθεί και οι οµόλογες προς την p53, p63 και p73 πρωτεΐνες µε τις δικές της ισοµορφές της η καθεµία, οι οποίες εµφανίζουν δοµικές οµοιότητες µε την p53 και είτε συνεργάζονται µε την p53, είτε παρουσιάζουν τελείως διαφορετικές ιδιότητες και λειτουργίες από αυτή.

22 Συνεργάτες του p53 Κυτταρικά στρες Γενοτοξικότητα Θερµικό σοκ Υποξία Υπεροξία Κυτοκίνες Παράγοντες ανάπτυξης Μεταβολικές αλλαγές Αγκυροβόληση Κυτταρικές επαφές Ενεργοποιηµένα ογκογονίδια Ιοί Άλλα Pin-1, YB-1, Bcl, TGFβ, SuprMam 1/2, NEDD8, htert, HAT, p16, p14/p19, Clathrin, Ets-1, APPSs p53 p63/p73 Ισοµορφές του p53 Τροποποιητές του p53 ATM/ATR, MAP/p38K, HIPK2, C-abl, Aip4/Itch, CHK1/CHK2, mdm22/mdm-χ, UbcH5B/C, p300/cbp PUMA,NOXA,BAX µιτοχόνδρια cdc25c p21 Άλλα Απόπτωση ιακοπή κυτταρικού κύκλου Επιδιόρθωση DNA Ανασυνδυασµός DNA Γήρανση Σχήµα 1.14. Mονοπάτια µεταγωγής σήµατος που συµµετέχει η πρωτεΐνη p53. To διάγραµµα αυτό απαριθµεί τις κυριότερες πηγές κυτταρικού στρες (γενοτοξικότητα, θερµικό σοκ, υπεροξία, υποξία, κυτοκίνες, παράγοντες ανάπτυξης, µεταβολικές αλλαγές, ιική µόλυνση, ενεργοποιηµένα ογκογονίδια, επαφές µεταξύ κυττάρων, «αγκυροβόληση» των κυττάρων) που µπορούν να οδηγήσουν σε ανάλογες κυτταρικές αποκρίσεις (απόπτωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή κάποια άλλη) µέσω µιας σειράς τροποποιήσεων της πρωτεΐνης p53 (και των ισοµορφών της p63, p73).

23 Η πρωτεΐνη p53 αφού εισέλθει στον πυρήνα, ενεργοποιείται (µέσω µετα- µεταφραστικών τροποποιήσεων και αλληλεπιδράσεων µε άλλες πρωτεΐνες), καταλήγει στην υποπυρηνική περιοχή που πρέπει, ολιγοµερίζεται, δεσµεύεται πάνω σε εξειδικευµένες αλληλουχίες DNA µέσω της κεντρικής της περιοχής και στρατολογεί το βασικό µηχανισµό µεταγραφής µέσω της Ν-τελικής της περιοχής. Μεταλλαγµένα µόρια p53 διαφέρουν στην υποκυτταρική και υποπυρηνική τους κατανοµή, στην ανάγκη ή όχι ενεργοποίησης και ολιγοµερισµού τους, στις αλληλουχίες πάνω στις οποίες δεσµεύονται αλλά και στην αγχιστεία δέσµευσης στο DNA καθώς και στην αλληλεπίδραση µε µόρια του µηχανισµού µεταγραφής. Ο ολιγοµερισµός της p53 λαµβάνει χώρα µέσω της C-τελικής της περιοχής που σχηµατίζει ένα ζεύγος διµερών το οποίο δεσµεύεται µε µεγαλύτερη αγχιστεία στο DNA. Αποτυχία της πρωτεΐνης p53 να δράσει ογκοκαταστατικά οφείλεται κυρίως σε απενεργοποίηση της από ιικές πρωτεΐνες και σε µεταλλάξεις της (υπάρχουν βέβαια και οι περιπτώσεις που δεν ευθύνεται η ίδια η p53, αλλά κάποιο από τα µόρια µε τα οποία αλληλεπιδρά).

24 Επιδιόρθωση, αντιγραφή και ανασυνδυασµός DNA Ιικές πρωτεΐνες Αντιγόνο Υποµονάδα Μεταγραφή Σχήµα 1.15. Σχηµατική αναπαράσταση των πρωτεϊνών µε τις οποίες αλληλεπιδρά η p53. Στις πρωτείνες αυτές συµπεριλαµβάνονται ιικές πρωτεΐνες που απενεργοποιούν την p53, και κυτταρικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την p53 και εµπλέκονται στις διαδικασίες αντιγραφής, επιδιόρθωσης, ανασυνδυασµού και µεταγραφής του DNA. 1.2.1. ΟΜΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 Η p53 αποτελείται από µία Ν-τελική όξινη περιοχή (αµινοξέα 1-42), η οποία αλληλεπιδρά µε µέλη του µηχανισµού µεταγραφής. ίπλα της υπάρχει µία περιοχή πλούσια σε προλίνες (αµινοξέα 64-92) που περιέχει 5 επαναλήψεις PXXP (όπου Χ ένα τυχαίο αµινοξύ και Ρ προλίνη), η οποία θεωρείται απαραίτητη για την ενεργοποίηση του µηχανισµού της απόπτωσης. Ακολουθεί η κεντρική περιοχή (αµινοξέα 102-292) που δεσµεύεται σε συγκεκριµένες αλληλουχίες DNA και παρουσιάζει δράση 3-5 εξωνουκλεάσης. Πλησίον του C-τελικού άκρου (αµινοξέα 311-393), βρίσκεται η περιοχή ολιγοµερισµού της p53 (αµινοξέα 324-355), που είναι υπεύθυνη για τη δηµιουργία τετραµερών, τα οποία είναι αυτά που συνδέονται στο

25 DNA. Επιπλέον, περιέχει και σήµατα εξόδου από τον πυρήνα (NES, Nuclear Export Signal). Η C-τελική περιοχή τέλος, περιέχει εκτός από τα παραπάνω, σήµατα εισόδου στον πυρήνα (NLS, Nuclear Localization Signal) και έχει την ικανότητα να δεσµεύει ΑΤΡ, καθώς και µόρια RNA και DΝΑ µη συγκεκριµένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Αυτό που αναγνωρίζει είναι µάλλον περίεργες δοµές DNA. Ν-τελική περιοχή Κεντρική περιοχή C-τελική περιοχή Ενεργοποίηση της µεταγραφής έσµευση DNA συγκεκριµένης αλληλουχίας ράση 5-3 εξονουκλεάσης Τετραµερισµός Μη εξειδικευµένη δέσµευση RNA/DNA Ρύθµιση δέσµευσης DNA συγκεκριµένης αλληλουχίας έσµευση ATP Επανουσίωση DNA Σχήµα 1.16. Αναπαράσταση της δοµής της πρωτεΐνης p53. Στον άνθρωπο η p53 αποτελείται από 393 αµινοξέα. Με λατινικούς αριθµούς συµβολίζονται οι συντηρηµένες περιοχές στα θηλαστικά. Με γραµµές παρουσιάζονται οι µεταλλάξεις (όσο µεγαλύτερες οι γραµµές τόσο συχνότερες οι µεταλλάξεις), ενώ φαίνονται και οι θέσεις φωσφορυλίωσης από τις κινάσες dsdna-pk, CK-I, CDK, PK-C και CK-II. ιακρίνονται τα σήµατα εισόδου στον πυρήνα (NLS), η περιοχή τετραµερισµού (tetra) και η βασική περιοχή (basic). Από κάτω µε µπάρες συµβολίζονται οι περιοχές ενεργοποίησης της µεταγραφής, η κεντρική περιοχή µε την ικανότητα δέσµευσης DNA συγκεκριµένης αλληλουχίας και 3-5 εξονουκλεάσης και η C-τελική περιοχή µε την ικανότητα δέσµευσης DNA/RNA µη συγκεκριµένης αλληλουχίας αλλά και ρύθµισης της εξειδικευµένης δέσµευσης DNA. Τέλος σηµειώνονται οι περιοχές δέσµευσης ΑΤΡ και επανουσίωσης του DNA.

26 1.2.1. ΕΙΣΟ ΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ H πρωτεΐνη p53 εισέρχεται στον πυρήνα και εξέρχεται από αυτόν κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριµένα στους ινοβλάστες, η p53 συγκεντρώνεται στο κυτταρόπλασµα κατά τη διάρκεια της G 1 φάσης και εισέρχεται στον πυρήνα κατά τη µετάβαση στην S φάση. Λίγο µετά την είσοδο στην S φάση, η p53 επιστρέφει στο κυτταρόπλασµα. Σε NIH3T3 ποντικίσια εµβρυϊκά κύτταρα ινοβλάστη εξέρχεται πάλι στο κυτταρόπλασµα µετά το πέρας της Μ φάσης. Όταν όµως το κύτταρο υπόκειται σε κάποια µορφή στρες, απαιτείται η συσσώρευση της p53 στον πυρήνα ώστε να υπάρχει εκδήλωση των ανάλογων κυτταρικών αποκρίσεων. Η είσοδος στον πυρήνα καθίσταται δυνατή από τα 3 σήµατα εισόδου (NLS) που διαθέτει, στα οποία δεσµεύονται τα σύµπλοκα των importin a και β και επιτυγχάνουν την «προσάραξη» των µορίων p53 στα σύµπλοκα των πυρηνικών πόρων. Η έξοδος επιτυγχάνεται από τα δύο σήµατα εξόδου (NES), στα οποία δεσµεύεται η πρωτεΐνη exportin 1. Ολιγοµερισµός της p53 έχει ως αποτέλεσµα την κάλυψη των NES και των NLS µε αποτέλεσµα τη συσσώρευση της στον πυρήνα ή στο κυτταρόπλασµα αντίστοιχα (Stommel et al., 1999). H έξοδος της p53 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα υποβοηθείται από την πρωτεΐνη mdm2 (mouse double minute 2) µε δύο τρόπους. Πρώτον, µε δέσµευση και απευθείας µεταφορά της (Roth et al., 1998) και δεύτερον µέσω ουβικιτινυλίωσης της, που έχει ως συνέπεια την αποκάλυψη των NES και την έξοδο της στο κυτταρόπλασµα (Stommel et al., 1999). Η φωσφορυλίωση επίσης έχει δειχθεί πως καθορίζει την εντόπιση της p53 είτε ρυθµίζοντας την αλληλεπίδραση p53-mdm2 (Sakaguchi et al., 2000), είτε σταθεροποιώντας την δηµιουργία ολιγοµερών (Sakaguchi et al., 1997), είτε τέλος επηρεάζοντας την ενεργότητα των NLS (Bischoff et al., 1990) ή NES (Appella & Anderson, 2001). Υπάρχουν πρωτεΐνες που καθηλώνουν την p53 στο κυτταρόπλασµα όπως η vimentin (Klotzsche et al., 1998), η tubulin (Giannakakou et al., 2000), η Parc (p53 associated, Parkin-like cytoplasmic protein, Nikolaev et al., 2003), η hsp70 (heatshock protein 70, Wadhwa et al., 2002) και η Bcl-2 (Beham et al., 1997). Υπάρχουν επίσης πρωτεΐνες που βοηθούν έµµεσα την έξοδό της στο κυτταρόπλασµα όπως οι κινάσες PI3K (Phosphatidyl Inositol 3 Kinase) και Akt (Mayo & Donner, 2001) και οι ακετυλο-τρανσφεράσες CBP (CREB Binding Protein transcriptional coactivator) και

27 p300 (Grossman et al., 2003). Τέλος, υπάρχουν πρωτεΐνες όπως η cpkc (calcium dependent Protein Κinase C, Scotto et al., 1999), η p14arf (Xirodimas et al., 2001) και η κινάση τυροσίνης c-abl (Goldberg et al., 2002) που συµµετέχουν στην παραµονή της p53 στον πυρήνα. Α Πυρήνας Κυτταρόπλασµα Β Ε Ζ Γ Σχήµα 1.17. Σχηµατική αναπαράσταση των διαφόρων τρόπων εισόδου της p53 στον πυρήνα και εξόδου από αυτόν. (Α) Η πρωτεΐνη mdm2 µε τη βοήθεια της CRM1 (exportin1) µεταφέρει την p53 στο κυτταρόπλασµα. (Β) Η mdm2 ουβικιτινυλιώνει την p53 µε συνέπεια να αποκαλύπτεται το NES και η CRM1 να την οδηγεί στο κυτταρόπλασµα. (Γ) Η p53 µετατρέπεται σε µονοµερές από τετραµερές, µετά από αποφωσφορυλίωση της σερίνης 392 και οδηγείται στο κυτταρόπλασµα από την CRM1. ( ) Η p53 αποδεσµεύεται από πρωτεΐνες που καλύπτουν το NLS. (E) Αποφωσφορυλίωση της σερίνης 315 έχει ως συνέπεια να επιτραπεί η αλληλεπίδραση της p53 µε τις importin α και β και να εισέλθει έτσι στον πυρήνα. (Ζ) Η δηµιουργία του µονοµερούς µπορεί να βοηθήσει και την είσοδο στον πυρήνα.

28 1.2.2. ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 Όπως προαναφέραµε η p53 περιέχει πολλές θέσης φωσφορυλίωσης στα δύο άκρα του µορίου της και ακετυλίωσης κυρίως στο C-τελικό άκρο. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης είναι αποτέλεσµα δράσης πολλών κινασών ενώ η ακετυλίωση προϊόν των ακετυλοτρανσφερασών CBP/p300 και σε µικρότερο βαθµό της P/CAF (P300 and CBP Associated Factor, Appella & Anderson, 2001). Πολλές από αυτές τις τροποποιήσεις είναι αλληλοεξαρτώµενες (όπως συµβαίνει και στις ιστόνες) και επηρεάζουν τον ολιγοµερισµό της p53 ή την αλληλεπίδραση της µε διαφορα µόρια, µε αποτέλεσµα αλλαγές στην υποκυτταρική εντόπιση, στην σταθερότητα και τέλος στη δέσµευση της στο DNA και στην ικανότητα να επάγει την µεταγραφή. Περιοχές δέσµευσης του p53 στο DNA Γονίδια-στόχοι του p53 Σχήµα 1.18. Ενζυµικά σύµπλοκα που τροποποιούν την πρωτεΐνη p53. Σύµπλοκα κινασών/φωσφατασών καθορίζουν την φωσφορυλίωση της p53 (πράσινος και ροζ κύκλος) ενώ σύµπλοκα ακετυλο-τρανσφερασών/αποακετυλασών την ακετυλίωση της (γαλάζιος κύκλος). Επιπλέον, η αλληλεπίδραση µε την πρωτεΐνη PML3 καθορίζει τη σουµοϋλίωση της. Οι συνδυασµοί των τροποποιήσεων καθορίζουν τη δέσµευση της p53 στο DNA και την ενεργοποίηση της µεταγραφής των γονιδίων-στόχων.

29 εν έχει νόηµα να σταθεί κανείς σε κάθε µία τροποποίηση ξεχωριστά αλλά αξίζει κανείς να αναφερθεί ότι ο συνδυασµός αυτών των οµοιοπολικών τροποποιήσεων ίσως να καθορίζει την εκλεκτικότητα της δέσµευσης της p53 στις ρυθµιστικές περιοχές γονιδίων µε αποτέλεσµα διαφορετική κυτταρική απόκριση. Αξίζει τέλος µνείας η παρατήρηση ότι η ακετυλίωση της p53 από τα παραπάνω ένζυµα έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της δέσµευσης της p53 στο DNA in vitro (Liu et al., 1999). 1.2.3. ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΜΕΣΩ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 Η πρωτεΐνη p53, µετά τη δέσµευση της στο DNA, ενεργοποιεί την µεταγραφή γονιδίων µε δύο τρόπους: µε απευθείας αλληλεπίδραση µε παράγοντες του βασικού µεταγραφικού συµπλόκου όπως είναι οι TBP (TATA Binding Protein, Seto et al., 1992), TAF II 31 (TBP Associated Factor, Lu & Levine, 1995) και TFIIB (Transcription Factor ΙΙΒ, Liu et al., 1993) ή αλληλεπιδρώντας µε ένζυµα τροποποίησης της χρωµατινικής δοµής όπως η ακετυλο-τρανσφεράση CBP/p300 (Gu et al., 1997) και οι µεθυλο-τρανσφεράσες CARM1 (Co-Activator Arginine Methyltransferase 1) και PRMT1 (PRotein MethylTransferase, An et al., 2004). Αντίθετα, µε τον ρόλο της ως ενεργοποιητής της µεταγραφής, έχει βρεθεί πως έχει την ικανότητα να καταστέλλει τη µεταγραφή γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό όπως του c-fos ή του PCNA, κυρίως µέσω αλληλεπίδρασης της µε παράγοντες µεταγραφής όπως οι TAF II 40, TAF II 60 και ίσως ο ΤΒΡ (Cox & Lane, 1995). 1.2.4. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ άφορες ερευνητικές οµάδες έχουν αναφέρει εντόπιση της πρωτεΐνης p53 στην πυρηνική µήτρα. Πρώτη η οµάδα του Wolfgang Deppert είχε ανιχνεύσει σε κύτταρα ποντικού 3Τ3, τα οποία είχαν µετασχηµατιστεί από τον ιό SV40, p53 στην πυρηνική µήτρα, ένα µέρος της οποίας ήταν συµπλοκοποιηµένη µε το µεγάλο Τ αντιγόνο του SV40 (Staufenbiel & Deppert, 1983, Deppert & Haug, 1986). Πέντε χρόνια µετά µία άλλη ερευνητική οµάδα έδειξε πως σε εµβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ποντικού, τα οποία είχαν επιµολυνθεί µε τον παραπάνω ιό, το Τ αντιγόνο συνεντοπίζεται µε την

30 πρωτεΐνη p53 στον σκελετό του πυρηνικού ικριώµατος αλλά και στα PF s και IGC s (Puvion et al., 1988). Τα τελευταία χρόνια µία πληθώρα εργασιών ανέφεραν την παρουσία της p53 σε πυρηνικά σωµάτια (κυρίως στα PML και στον πυρηνίσκο). Στα σωµάτια PML η πρωτεΐνη εναποτίθεται ύστερα από ακτινοβόληση των κυττάρων µε υπεριώδες φως (Fogal et al., 2000), έκθεση σε γ-ακτινοβολία (Carbone et al., 2002) ή έκφραση ογκογονικού c-ras (Ferbeyre et al., 2000). Τα σωµάτια αυτά λειτουργούν ως µία «πλατφόρµα» µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων της p53 από µια σειρά ενζύµων, όπως ακετυλίωση από την CBP (Rodriguez et al., 1999), απακετυλίωση από την SIRT1 (Silent Information RegulaTor 1, Vaziri et al., 2001), φωσφορυλίωση από τις κινάσες HIPK2 (Homeodomain Interacting Protein Kinase-2, (Hofmann et al., 2002), ΑΤΜ (Ataxia Telagiectasia Mutated gene product) και Chk2 (Checkpoint kinase 2, Yang et al., 2002) και σουµοϋλίωση (Rodriguez et al., 1999). Επίσης εκεί αλληλεπιδρά και µε τις πρωτεΐνες PML και mdm2 δηµιουργώντας έτσι ένα τριµερές σύµπλοκο (p53-pml-mdm2) που εµποδίζει την ουβικιτινυλίωση της p53 (Kurki et al., 2003). Oι τροποποιήσεις αυτές έχουν ως αποτέλεσµα την σταθεροποίηση της p53 και την ενίσχυση της δραστικότητας της ως ενεργοποιητή της µεταγραφής. Ανάλογα µε τον συνδυασµό των τροποποιήσεων, ο οποίος εξαρτάται από τον τύπο των κυττάρων και το είδος του στρες στο οποίο υποβάλλονται τα κύτταρα, το τελικό αποτέλεσµα της µεταφοράς της p53 στα σωµάτια PML είναι είτε η απόπτωση (Fogal et al., 2000) είτε η γήρανση των κυττάρων (senescence, Bischof et al., 2002). Εναπόθεση της p53 λαµβάνει χώρα και στον πυρηνίσκο (Klibanov et al., 2001), την πυρηνική λάµινα (Yin et al., 1997) και τον διάχυτο σκελετό, µε τον οποίο η p53 συνδέεται είτε µέσω της περιοχής της που είναι πλούσια σε προλίνες και η δέσµευση αυτή φαίνεται να αυξάνει µετά από βλάβη του DNA (Jiang et al., 2001), είτε µέσω της C-τελικής περιοχής της στην F-ακτίνη (Okorokov et al., 2002). Από τα παραπάνω γίνεται φανερό ότι υπάρχει άµεση σχέση τροποποιήσεων, υποπυρηνικής εντόπισης και λειτουργικότητας όσον αφορά την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53. 1.2.5. ΜΙΘΡΑΜΥΚΙΝΗ Α ΚΑΙ 5-ΦΘΟΡΟΟΥΡΑΚΙΛΗ Η µιθραµυκίνη Α και η 5-φθοροουρακίλη αποτελούν δύο χηµειοθεραπευτικές ενώσεις µε διαφορετικούς µηχανισµούς κυτοτοξικότητας.

31 Η µιθραµυκίνη Α (mithramycin A, aureolic acid, mithracin ή plicamycin) είναι ένα πολυκετίδιο τύπου αυρεολικού οξέος που παράγεται από το βακτήριο του εδάφους Streptomyces argillaceus (Jayasuriya et al., 2002). Σχήµα 1.19. Ο στερεοχηµικός τύπος της µιθραµυκίνης και της 5-φθοροουρακίλης. Η µιθραµυκίνη χρησιµοποιείται κλινικά στις Ηνωµένες Πολιτείες για τη θεραπεία της ασθένειας του Paget στα οστά και του καρκίνου των όρχεων (Brown & Kennedy, 1965, Ryan et al., 1970, Elias & Evans, 1972, Hall et al., 1993, Majee et al., 1999, Remsing et al., 2003). Πρόκειται για ένα φάρµακο που δεσµεύεται στις περιοχές του DNA που είναι πλούσιες σε GC και εµποδίζει τη µεταγραφή γονιδίων που έχουν τέτοια µοτίβα στον προαγωγό τους (Miller et al., 1987, Ray et al., 1989, Blume et al., 1991, Snyder et al., 1991, Nehls et al., 1993, Aich & Dasgupta, 1995, Majee & Chakrabarti, 1995). Επίσης ενδέχεται να ρυθµίζει την µεθυλίωση των ιστονών (Ferrante et al., 2004).

32 Η 5-φθοροουρακίλη (5-FU), η οποία έχει αντικατεστηµένο το υδρογόνο της ουρακίλης στη θέση 5 µε φθόριο, δρα ως παράγοντας που προκαλεί βλάβες σε νουκλεϊκά οξέα µε το να ενσωµατώνεται στο DNA και στο RNA στη θέση της θυµίνης ή ουρακίλης κατά τη διάρκεια της αντιγραφής και της µεταγραφής αντίστοιχα ενώ παράλληλα εµποδίζει την παρασκευή θυµίνης, αναστέλλοντας το ένζυµο συνθάση του θυµιδιλικού (Longlet et al., 2003). Χρησιµοποιείται για τη θεραπεία ενός µεγάλου αριθµού καρκίνων, που περιλαµβάνει αυτούς του εντέρου, του µαστού, του αναπνευστικού και του γαστρεντερικού (Longley et al., 2003). Και οι δύο ενώσεις έχουν την ικανότητα να ενεργοποιούν την πρωτεΐνη p53 µε το να επάγουν τη φωσφορυλίωση της στη σερίνη 15. Σε αντίθεση όµως µε τη 5-FU, η µιθραµυκίνη Α εµποδίζει την ενεργοποίηση γονιδίων στόχων του p53 µε το να δεσµεύεται στις GC περιοχές των προαγωγών τους (Koutsodontis & Kardasis, 2004). 1.3. PROLIFERATION POTENTIAL PROTEIN-RELATED (P2P-R) Μια σειρά πειραµάτων έχουν λάβει χώρα κατά καιρούς ώστε να ταυτοποιηθούν πρωτεΐνες µε την ικανότητα να αλληλεπιδρούν και µε τις δύο κύριες ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες, p53 και Rb. Μία από τις λίγες πρωτεΐνες που ανακαλύφθηκε µε την ιδιότητα αυτή είναι η πρωτεΐνη P2P-R (Witte & Scott, 1997). 1.3.1. ΟΜΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R H πρωτεΐνη P2P-R αποτελείται από 1560 αµινοξέα και αποτελεί ένα από τα προϊόντα µεταγραφής του γονιδίου της RBBP6 (RetinoBlastoma Βinding Ρrotein 6). Έως τώρα έχουν κλωνοποιηθεί και µελετηθεί τέσσερα cdna που προέρχονται από το συγκεκριµένο γονίδιο. Η πλήρης πρωτεΐνη RBBP6 που περιέχει 1792 αµινοξέα (Pugh et al., 2006), η πρωτεΐνη RBQ-1 (RetinoBlastoma binding protein Q-1, Sakai et al., 1995), που αντιστοιχεί στα αµινοξέα 150-1146 της ανθρώπινης πρωτεΐνης, και η οποία κλωνοποιήθηκε µε βάση την ικανότητα της να δεσµεύει τη Rb, η πρωτεΐνη PACT (P53 Associated Cellular protein, Testis derived, Simons et al., 1997), που αντιστοιχεί στα αµινοξέα 207-1792, και η οποία κλωνοποιήθηκε µε βάση την ικανότητα της να δεσµεύει τη p53 και η P2P-R (Witte & Scott, 1997), που αντιστοιχεί στα αµινοξέα 233-1792, και η οποία χαρακτηρίστηκε µε βάση την αναγνώριση της

33 από δύο αντισώµατα ειδικά για hnrnp s. Επιπλέον, έχει αναφερθεί και µία µορφή που της λείπουν τα αµινοξέα 651-685, που αντιστοιχούν στο εξόνιο 16 του πλήρους γονιδίου (Sakai et al., 1995). Η πρωτεΐνη P2P-R είναι µια βασική πρωτεΐνη µε pi>9. Ξεκινώντας από το Ν- τελικό άκρο περιλαµβάνει ένα RING finger µοτίβο (αµινοξέα 57-107), µία περιοχή πλούσια σε προλίνες (αµινοξέα 362-411), µία περιοχή πλούσια σε διπεπτίδια αργινίνης-σερίνης (RS) (αµινοξέα 460-540), την περιοχή δέσµευσης στη Rb (αµινοξέα 735-908) και την περιοχή δέσµευσης στην p53 (αµινοξέα 1204-1314). Η C-τελική περιοχή του µορίου της µοιάζει µε την N-τελική των ιστονών και είναι πλούσια σε λυσίνες (αµινοξέα 1497-1550), οι οποίες είναι πολύ πιθανόν να ακετυλιώνονται. (57-107) (460-540) (1204-1314) 1 1560 A B Γ Ε Ζ (362-411) (735-908) (1497-1550) Σχήµα 1.20. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του µορίου της P2P-R. Στο σχήµα διακρίνονται το RING finger µοτίβο (Α), η περιοχή πλούσια σε προλίνες (Β), σε RS διπεπτίδια (Γ), η περιοχή δέσµευσης του Rb ( ), του p53 (Ε) και η περιοχή πλούσια σε λυσίνες (Ζ). 1.3.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R Η πρωτεΐνη P2P-R υπάρχει σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Στον άνθρωπο το γονίδιο της εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 16p12.2. Η οµόλογη πρωτεΐνη στη ζύµη, Mpe1p, αποτελεί µέρος του CPF (yeast Cleavage and Polyadenylation Factor) που είναι υπεύθυνο για την κοπή και την πολυαδενυλίωση των pre-mrna στον οργανισµό αυτό (Vo et al., 2001). Σε ανθρώπινα κύτταρα η P2P-R εντοπίζεται στα IGC s και στα PF s µαζί µε παράγοντες µατίσµατος µε τους οποίους και αλληλεπιδρά (Sm antigens) (Simons et al., 1997) και στον πυρηνίσκο (Gao et al., 2002), ενώ στην µίτωση στην περιφέρεια των χρωµοσωµάτων, όπου εµφανίζει και τη µέγιστη ανοσοδραστικότητα χωρίς αλλαγή όµως στα επίπεδα του mrna. Η αύξηση αυτή ίσως να οφείλεται σε αυξηµένα επίπεδα µετάφρασης ή σε κάποια τροποποίηση. Ως προς το πρώτο

34 συνηγορεί η παρατήρηση πως ο µεταφραστικός αναστολέας PUM2 έχει την ικανότητα να δεσµεύεται στην 3 UTR (UnTranslated Region) του mrna της P2P-R (Scott et al., 2005) ενώ ως προς το δεύτερο ότι φωσφορυλιώνεται από την µιτωτική κινάση cdc2 (Scott et al., 2003). 1.3.3. ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R Όπως και για τις υπόλοιπες Ρ2P s (Proliferation Potential proteins) η έκφρασή της P2P-R αναστέλλεται κατά το τελικό στάδιο της διαφοροποίησης των κυττάρων (Witte & Scott, 1997). Επίσης ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η παρουσία της Rb είναι απαραίτητη για το τελικό αυτό στάδιο της διαφοροποίησης (Schneider et al., 1994). Υπερέκφραση της P2P-R σε Saos2 κύτταρα έχει ως αποτέλεσµα τη διακοπή της διαδικασίας της µίτωσης στην προµετάφαση και απόπτωση των κυττάρων (Gao & Scott, 2002) ενώ σε ΜCF-7 κύτταρα ενισχύει την απόπτωση που επάγεται από την ουσία camptothecin (Gao & Scott, 2003). Από την άλλη η απουσία P2P-R έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή της απόπτωσης που επάγεται από υπεριώδη ακτινοβολία (Scott & Gao, 2002). Πρόσφατα βρέθηκε ότι η υπερέκφραση της συνδέεται µε υψηλούς ρυθµούς πολλαπλασιασµού καρκινικών κυττάρων οισοφάγου και χαµηλή αναλογία επιβίωσης σε ασθενείς µε καρκίνο του οισοφάγου. Επιπλέον, κυτοτοξικά Τ λεµφοκύτταρα εξειδικευµένα για πεπτίδια που προήλθαν από την πρωτεΐνη P2P-R έχουν την δυνατότητα να λύνουν καρκινικά κύτταρα οισοφάγου σε καλλιέργειες και να προκαλούν υποχώρηση του εν λόγω καρκίνου σε όγκους ποντικιών στους οποίους είχαν προηγουµένως µεταµοσχευθεί (Yoshitake et al., 2004). 1.4. ΚΙΝΑΣΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ (SERIΝΕ/ARGININE PROTEIN KINASES, SRPK s) Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελούν µια νέα οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών οι οποίες φωσφορυλιώνουν σερίνες επαναλαµβανόµενων ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης (RS). Οι κινάσες αυτές εµφανίζονται συντηρηµένες στην εξέλιξη και παίζουν σηµαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η ρύθµιση του µατίσµατος του mrna, η µεταφορά πρωτεϊνών στον πυρήνα, η ανάπτυξη

35 βλαστικών κυττάρων, η ανταλλαγή των ιστονών µε πρωταµίνες κατά τη διάρκεια της σπερµατογένεσης, η µεταφορά πολυαµινών µέσα στα κύτταρα και η οµοιόσταση ιόντων. 1.4.1. ΟΜΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ Οι κινάσες της οικογένειας αυτής στα θηλαστικά παρουσιάζουν πολύ µεγάλη οµολογία στη πρωτοταγή τους δοµή, στη δραστικότητα τους ως κινάσες, καθώς και στην εξειδίκευση τους ως προς τα υποστρώµατα. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που παρουσιάζεται σ όλα τα µέλη της οικογένειας των κινασών στα θηλαστικά είναι ότι οι περιοχές του µορίου τους που παρουσιάζουν τη δράση κινάσης διαχωρίζονται από µία ασυνήθιστα µεγάλη αλληλουχία αµινοξέων, γεγονός πολύ σπάνιο για κινάσες σερίνης/θρεονίνης όπως οι ίδιες, αλλά συνηθισµένο σε κινάσες τυροσίνης. Η µεγάλη αυτή συνδετική αλληλουχία αµινοξέων πιθανολογείται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στην εξειδίκευση τους ως κινάσες, αλλά κυρίως στην υποκυτταρική τους κατανοµή. Ακόµη ένα κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι περιέχουν στο µόριο τους δύο NLS, ένα στην Ν-τελική περιοχή (αµινοξέα 11-21) και ένα στο κέντρο του µορίου (αµινοξέα 267-277). Περιοχή κινάσης Περιοχή κινάσης 1 1 2 566 SRPK3 Περιοχή πλούσια σε σερίνες Συνδετική περιοχή SRPK1 1 73% 71% 848 SRPK2 1 Περιοχή πλούσια σε προλίνες 78% 78% 882 Σχήµα 1.21. Σχηµατική αναπαράσταση των SRPK ποντικού. Οι 3 κινάσες εµφανίζουν µεγάλη οµοιότητα στις περιοχές µε δράση κινάσης αλλά διαφέρουν στο Ν-τελικό άκρο και στη συνδετική περιοχή. Το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 είναι πλούσιο σε προλίνες ενώ της SRPK3 σε σερίνες.

36 Οι διαφορές ανάµεσα στα µέλη της οικογένειας που βρίσκονται στα θηλαστικά εντοπίζονται σε ορισµένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κάθε µορίου στην πρωτοταγή του δοµή. Έτσι στην περίπτωση της SRPK1a, η οποία αποτελεί το προϊόν διαφορετικού µατίσµατος του γονιδίου που κωδικοποιεί την SRPK1, η µόνη διαφορά έγκειται στην ύπαρξη µιας εµβόλιµης ακολουθίας από 171 αµινοξέα στο Ν-τελικό άκρο του µορίου αµέσως µετά τα τέσσερα πρώτα αµινοξέα. Η εµβόλιµη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σηµαντικό αριθµό από προλίνες, καθώς και δύο αλληλουχίες µε το µοτίβο LXXLL, το οποίο θεωρείται ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών µε πυρηνικούς υποδοχείς. Στην περίπτωση του µορίου της SRPK2 που αποτελεί προϊόν έκφρασης διαφορετικού γονιδίου από την SRPK1, οι διαφορές τους εντοπίζονται σε µικρές αλλαγές στην αµινοξική ακολουθία στην κεντρική και C-τελική τους περιοχή οι οποίες δεν παίζουν σηµαντικό ρόλο στη δραστικότητα και εξειδίκευση των δύο ενζύµων (πάνω από 90% οµολογία στις περιοχές κινάσης), ενώ αντίθετα το Ν-τελικό άκρο της SRPK2 περιέχει µία ακολουθία αµινοξέων πλούσια σε προλίνες. Το πλούσιο σε προλίνες Ν-τελικό άκρο της SRPK2 περιέχει την αµινοξική αλληλουχία PPLP η οποία και αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισµα πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε SH 3 - και WW-περιοχές άλλων πρωτεϊνών. Το N-τελικό άκρο της SRPK3 είναι πλούσιο σε σερίνες και διαφέρει από αυτό των άλλων µελών της οικογένειας. Σηµαντικές διαφορές εµφανίζει επίσης και η κεντρική συνδετική περιοχή που ενώνει τις περιοχές µε δραστικότητα κινάσης. Στις περιοχές κινάσης η αµινοξική οµολογία µε τις υπόλοιπες κινάσες της οικογένειας ξεπερνά το 70 %.

37 Σχήµα 1.22. Σχηµατική αναπαράσταση του εναλλακτικού τρόπου µατίσµατος της SRPK1a. (A) Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του γονιδίου των SRPK1/SRPK1α. Τα σκούρα κουτάκια συµβολίζουν τα εξόνια. Το εξόνιο 1 της SRPK1α αποτελείται από τα εξόνια 1a, 1b της SRPK1, καθώς και από το τµήµα των 513 bp που αποκόπτεται από την SRPK1 ως ιντρόνιο (B) Σύγκριση της αµινοξικής ακολουθίας που κωδικοποιείται από το εξόνιο 1 της SRPK1α µε την ακολουθία που κωδικοποιούν τα εξόνια 1a και 1b της SRPK1. (Γ) H νουκλεοτιδική αλληλουχία που περιβάλλει το τµήµα των 513 bp, που υπόκειται σε εναλλακτικό µάτισµα ( ) Οι 5 - και 3 - θέσεις µατίσµατος που βρίσκονται στα όρια µεταξύ των εξονίων 1a/1b και του τµήµατος των 513 bp. Το χαρακτηριστικό ότι οι SRPK φωσφορυλιώνουν πολλαπλές σερίνες στις RS περιοχές των υποστρωµάτων τους, επιβεβαιώνεται από την ύπαρξη µιας δοµής στην περιοχή δέσµευσης του υποστρώµατος η οποία αναγνωρίζει φωσφοσερίνες που βρίσκονται σε P-2 θέση από τη σερίνη που πρόκειται να φωσφορυλιωθεί. Έτσι η µετατόπιση της φωσφορυλιωµένης σερίνης στην P-2 θέση και η δέσµευση της γειτονικής σερίνης στην καταλυτική περιοχή του ενζύµου, προκαλεί τη διαδοχική

38 φωσφορυλίωση των σερινών του υποστρώµατος χωρίς να αποκολλάται το ένζυµο. Το µοντέλο όµως αυτό δεν εξηγεί την φωσφορυλίωση της πρώτης σερίνης του υποστρώµατος. Είναι πιθανό, in vivo το υπόστρωµα να φωσφορυλιώνεται αρχικά από µία άλλη κινάση πρωτεϊνών και ακολούθως οι SRPK να το αναγνωρίζουν και να φωσφορυλιώνουν και τις υπόλοιπες σερίνες, επιτυγχάνοντας κατ αυτό το τρόπο µία ιεραρχική φωσφορυλίωση των υποστρωµάτων. Μία άλλη πιθανότητα είναι η αρχική φωσφορυλίωση να γίνεται από τις ίδιες τις SRPK, αλλά µε πολύ µικρότερη αποτελεσµατικότητα. Σύµφωνα µε πρόσφατα δεδοµένα η κινάση συνδέεται µε τα RS υποστρώµατα µέσω µιας εµβόλιµης περιοχής MAP κινάσης (Ngo et al., 2005). Έτσι µετά την αρχική αυτή φωσφορυλίωση, η κινάση συνεχίζει τη φωσφορυλίωση και των υπολοίπων θέσεων του υποστρώµατος επιδεικνύοντας σηµαντικά υψηλότερη δραστικότητα (Nolen et al., 2001). Από πειράµατα φωσφορυλίωσης που έγιναν στoν παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2, χρησιµοποιώντας την κινάση SRPK1, βρέθηκε πως από τις 20 σερίνες της RS ακολουθίας µόνο οι µισές φωσφορυλιώνονται in vitro και οι θέσεις φωσφορυλίωσης είναι ανεξάρτητες από την ποσότητα του ΑΤΡ ή της κινάσης. Η ποσότητα της τελευταίας δεν επηρεάζει επίσης την ταχύτητα της φωσφορυλίωσης (Aubol et al., 2003). 1.4.2. ΕΞΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ H εξειδίκευση των SRPK εντοπίζεται στην ύπαρξη µιας επαναλαµβανόµενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες (RS motif) στα µόρια των υποστρωµάτων τους, στις σερίνες των οποίων γίνεται η µεταφορά της γ-φωσφορικής οµάδα του ΑΤΡ. Η ελάχιστη απαίτηση για να είναι δραστικές οι κινάσες αυτές είναι η ύπαρξη τριών τουλάχιστον τέτοιων διπεπτιδίων. Σε πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών που περιείχαν µόνο δύο επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια RS δεν ήταν δυνατή η φωσφορυλίωση τους (Papoutsopoulou et al., 1999). Ακόµα έχει αναφερθεί ότι η αντικατάσταση της αργινίνης στα υποστρώµατα από ένα άλλο βασικό αµινοξύ, όπως είναι η λυσίνη, έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια φωσφορυλίωσης των υποστρωµάτων από την SRPK1, αποδεικνύοντας έτσι ότι η παρουσία των αργινινών στις ακολουθίες διπεπτιδίων είναι απαραίτητη (Wang et al., 1998a). Επίσης, πειράµατα όπου χρησιµοποιήθηκαν ως υποστρώµατα το N-τελικό άκρο του LBR καθώς και µεταλλάγµατα του στα οποία είχαν εισαχθεί µε σηµειακές

39 µεταλλάξεις αλανίνη ή γλυκίνη στη θέση των σερινών, έδειξαν ότι όλες οι σερίνες των διπεπτιδίων είχαν τη δυνατότητα φωσφορυλίωσης χωρίς κάποια ιδιαίτερη προτίµηση στην φωσφορυλίωση κάποιας σερίνης από την πλευρά της κινάσης (Wang et al., 1998a). Επιπλέον, in vitro πειράµατα που έγιναν χρησιµοποιώντας τις SRPK1 και SRPK2 µε διάφορους παράγοντες µατίσµατος, έδειξαν ότι οι κινάσες προτιµούν να φωσφορυλιώνουν τις σερίνες των ακολουθιών διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης, όταν οι ακολουθίες αυτές είναι τοποθετηµένες ανάµεσα σε περιοχές πλούσιες σε βασικά αµινοξέα αργινίνης και ιστιδίνης αλλά όχι λυσίνης (Wang et al., 1998a). Τέλος, όσον αφορά τα κινητικά χαρακτηριστικά των κινασών αυτών, οι µελέτες που έγιναν χρησιµοποιώντας ως ενζυµική πηγή την SRPK1 και ως υπόστρωµα τον παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2 έδωσαν µια τιµή Κm 10 µμ για το ΑΤΡ, και µία πολύ µικρή τιµή Κm 0,07 µμ για τη φωσφορυλίωση του υποστρώµατος, η οποία δείχνει την πολύ µεγάλη αγχιστεία των κινασών αυτών για τα υποστρώµατα τους (Gui et al., 1994). 1.4.3. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ. Το γονίδιο της SRPK1 και κατ επέκταση της SRPK1a βρίσκεται στον άνθρωπο τοποθετηµένο στο χρωµόσωµα 6p21.2-p21.3, το γονίδιο της SRPK2 στο χρωµόσωµα 7q22-q31.1 και το γονίδιο της SRPK3 στο Χq28. Γονίδια που κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών σερίνης/αγρινίνης έχουν αναγνωριστεί σε άλλους οργανισµούς εκτός από τα θηλαστικά όπως είναι στη ζύµη (Sky1, S. cerevisiae και Dsk1, S. pompe), στη Drosophila (το οµόλογο της SRPK1), στο νηµατοειδές C. elegans (SPK-1) και στα φυτά (το οµόλογο της SRPK1, Arabidopsis thaliana). Τέλος ανακαλύφθηκε πρόσφατα η TcSRPK στα πρωτόζωα (Trypanososma cruzi). Και στους υπόλοιπους οργανισµούς, εκτός των θηλαστικών, οι περιοχές µε δραστικότητα κινάσης είναι συντηρηµένες, ενώ και σ αυτούς διαχωρίζονται µέσω µιας συνδετικής αλληλουχίας. Η κατανοµή των µελών της οικογένειας αυτής κινασών πρωτεϊνών στους διάφορους ιστούς παρουσιάζει σηµαντικές διαφορές, όπως προκύπτει από τα επίπεδα έκφρασης τους. Συγκεκριµένα η SRPK1 εκφράζεται σε µεγαλύτερο βαθµό στους όρχεις, έχοντας µικρότερα επίπεδα έκφρασης στους άλλους ιστούς όπως ο θύµος αδένας, το πάγκρεας, η καρδιά και ο σκελετικός µυς. Παρόµοια εικόνα εµφανίζει και

40 η έκφραση της SRPK1a, όµως στην περίπτωση αυτή τα συνολικά επίπεδα έκφρασης της στους διάφορους ιστούς είναι σηµαντικά µικρότερα. Η SRPK2 παρουσιάζει διαφορετική εικόνα, εκφραζόµενη σε µεγάλο βαθµό στον εγκέφαλο και τους όρχεις, µέτρια στην καρδιά και το σκελετικό µυ, ενώ παρουσιάζει χαµηλά επίπεδα έκφρασης στον πνεύµονα, το ήπαρ και το νεφρό. Τέλος η SRPK3 εκφράζεται ειδικά στον καρδιακό και σκελετικό µύ. Η υποκυτταρική κατανοµή των µελών της οικογένειας αυτής παρουσιάζει µια αινιγµατική συµπεριφορά. Αν και όλα τα, µέχρι τώρα, γνωστά υποστρώµατα τους είναι πυρηνικές πρωτεΐνες, οι SRPK µετά από µελέτες ανοσοφθορισµού σε καθηλωµένα κύτταρα παρουσιάζουν µία κυρίαρχη κυτταροπλασµατική εντόπιση, δίνοντας ταυτόχρονα ένα πολύ αδύνατο πυρηνικό σήµα (Nikolakaki et al., 2001, Wang et al., 1998a). Οι µελέτες που ακολούθησαν χρησιµοποιώντας την κινάση πρωτεϊνών Dsk1 της ζύµης S. pompe, αποκάλυψαν ότι η κυτταροπλασµατική εντόπιση της κινάσης είναι κυρίαρχη σε κύτταρα συγχρονισµένα στη µεσόφαση. Αντίθετα σε κύτταρα που βρίσκονται λίγο πριν την είσοδο τους στη µίτωση, η κινάση εµφανίζεται κυρίως στον πυρήνα, (Takeuchi & Yanagida, 1993). Η ίδια συµπεριφορά έχει αναφερθεί και για τις κινάσες SRPK1 και 2 (Ding et al., 2005). Πρόσφατα µάλιστα βρέθηκε πως η SRPK1 φωσφορυλιώνεται από την CK2 και η φωσφορυλίωση αυτή έχει ως αποτέλεσµα µία µικρή αύξηση της δραστικότητας της in vitro και πιθανά αλλαγή στην υποκυτταρική της κατανοµή (Mylonis & Giannakouros, 2003). Παράλληλα, στην περίπτωση της κινάσης Sky1p της ζύµης S. cerevisiae βρέθηκε ότι η µεγάλη ενδιάµεση ακολουθία που χωρίζει τις δραστικές περιοχές της κινάσης παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της υποκυτταρικής της εντόπισης. Χρησιµοποιώντας τόσο τη φυσιολογική, όσο και τη µορφή της κινάσης που της είχε αφαιρεθεί η εν λόγω ακολουθία, βρέθηκε ότι στα κύτταρα που έφεραν τη φυσιολογική µορφή το κυτταροπλασµατικό σήµα είναι έντονο σε αντίθεση µε τη µεταλλαγµένη µορφή η οποία εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρήνα. Μια υπόθεση είναι ότι το εµβόλιµο αυτό τµήµα περιέχει κάποιο σήµα εξόδου από τον πυρήνα (NES) ενώ µια άλλη πως παίζει το ρόλο µιας «κυτταροπλασµατικής άγκυρας» (Siebel et al., 1999). H ερευνητική οµάδα του Dr. X-D. Fu υποστηρίζει πως η είσοδος των SRPK1 και SRPK2 στον πυρήνα γίνεται µέσω αλληλεπίδρασης µε τα υποστρώµατα τους ανάλογα µε την κατάσταση φωσφορυλίωσης τους (Lai et al.,

41 2000, Ding et al., 2005). H υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι υπερέκφραση του παράγοντα µατίσµατος ASF/SF2 αύξησε την πυρηνική εντόπιση της κινάσης (Ngo et al., 2005). H έξοδος πάλι θεωρείται ότι γίνεται πάλι µέσω των υποφωσφορυλιωµένων RS υποστρωµάτων τα οποία συνδέονται µε µατισµένα µόρια mrna (Huang et al., 2004). Επιπλέον, έγινε φανερό ότι η δραστικότητα κινάσης είναι απαραίτητη για την είσοδο της κινάσης στον πυρήνα αλλά όχι για την έξοδό της (Ding et al., 2005). Στον πυρήνα οι κινάσες εντοπίζονται κατά κύριο λόγο σε χώρους αποθήκευσης ή δράσης των παραγόντων µατίσµατος που αποτελούν τα IGC s και PF s αντίστοιχα (Ding et al., 2005). 1.4.5. ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ ΠΙΘΑΝΟΣ ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗΣ Παράγοντες µατίσµατος του RNA (SR splicing factors) Τα πιο καλά µελετηµένα υποστρώµατα της οικογένειας των κινασών αυτών αποτελούν οι SR παράγοντες µατίσµατος, µε πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγµα τον ASF/SF2. Μέλη αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών αποτελούν ακόµα οι SC35, SRp20, SRp40, SRp55 και SRp75. Άλλες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στη διαδικασία µατίσµατος και που περιέχουν στο µόριο τους το χαρακτηριστικό µοτίβο των επαναλαµβανόµενων διπεπτιδίων (αν και ο όρος SR πρωτεΐνες χρησιµοποιείται για τις έξι προαναφερθείσες), είναι πολυπεπτίδια που σχετίζονται µε τις snrnp s όπως οι πρωτεΐνες U1 70K και U2AF. Κοινό χαρακτηριστικό των SR πρωτεϊνών, είναι ότι στο Ν-τελικό τους άκρο περιέχουν 2 περιοχές αναγνώρισης του RNA (RNA Recognition Motif, RRM), ενώ το C-τελικό τους άκρο είναι πλούσιο σε RS διπεπτίδια. Οι περιοχές αυτές των παραγόντων εµπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις µε άλλους παράγοντες µατίσµατος και εκτός από τη συγκρότηση του σωµατιδίου µατίσµατος θεωρούνται σηµαντικές και στην περίπτωση εναλλακτικού µατίσµατος των mrna, µε το να ρυθµίζουν την επιλογή της θέσης που θα γίνει το µάτισµα (Manley & Tacke, 1996, Valcarcel & Green, 1996). Ένας από τους ρόλους της φωσφορυλίωσης είναι η αποσύνδεση των παραγόντων µατίσµατος από τις θέσεις αποθήκευσης τους στον πυρήνα (IGC s), όπου βρίσκονται συγκεντρωµένοι σε µεγάλα ανενεργά σύµπλοκα. Έτσι έχοντας αποκτήσει την «ελεύθερη» δραστική µορφή τους, είναι δυνατή η µεταφορά τους σε

42 ενεργές περιοχές µεταγραφής στο νουκλεόπλασµα (PF s), όπου και συµµετέχουν στην καταλυτική διαδικασία παραλαβής του ώριµου mrna (Gui et al., 1994, Kuroyanagi et al., 1998, Yeakley et al., 1999). Επίσης, η φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος από την οικογένεια των SR κινασών πρωτεϊνών, επάγει τις µεταξύ τους αλληλεπιδράσεις ώστε αυτοί να συγκροτήσουν ένα πλήρως λειτουργικό σύµπλοκο κατά τα αρχικά στάδια της διαδικασίας µατίσµατος του mrna (Gui et al., 1994, Yue et al., 2000). Σ αυτή την ικανότητα των κινασών να προάγουν τη συγκρότηση του εν λόγω συµπλόκου, συνηγορούν τα εξής δεδοµένα: Με µη φωσφορυλιωµένους παράγοντες µατίσµατος ή µε την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων φωσφατασών πρωτεϊνών, το σύµπλοκο δεν συγκροτείται και το µάτισµα του mrna αναστέλλεται στο αρχικό του στάδιο (Cao et al., 1997). Η κατάσταση αυτή είναι αναστρέψιµη µε προσθήκη αναστολέων φωσφατασών πρωτεϊνών και φωσφορυλίωση των SR παραγόντων µατίσµατος. Αφού όµως ολοκληρωθεί η διαδικασία συγκρότησης του συµπλόκου, είναι απαραίτητη η αποφωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος ώστε το σωµατίδιο µατίσµατος να προχωρήσει στην καταλυτική του διαδικασία (Cao et al., 1997). Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι η παρουσία µεγάλων συγκεντρώσεων SRPK1 και η απουσία φωσφατασών, µετά τη συγκρότηση του συµπλόκου, οδηγούν στην αναστολή του µατίσµατος του mrna (Cao et al., 1997). Αντίθετα η επίδραση φωσφατασών στο στάδιο αυτό επαναφέρει τη λειτουργικότητα του συµπλόκου στα φυσιολογικά επίπεδα. Στη θεώρηση αυτή συνηγορεί και το γεγονός ότι αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης ICP27 του HSV-1 (Herpes Simplex Virus) µε την SRPK-1 έχει ως αποτέλεσµα την ανώµαλη φωσφορυλίωση των παραγόντων µατίσµατος και την ανικανότητα δηµιουργίας λειτουργικού συµπλόκου µατίσµατος (Sciabica et al., 2003). Τέλος, σύµφωνα µε πρόσφατες αναφορές η φωσφορυλίωση των SR πρωτεϊνών από το κυτταροπλασµατικό κλάσµα των κινασών, βοηθά σηµαντικά στη µετακίνηση τους στον πυρήνα αλλά ρυθµίζει και την ενδοπυρηνική εντόπιση τους στις διάφορες λειτουργικές ή αποθηκευτικές περιοχές του πυρήνα (Yeakley et al., 1999). Στο σηµείο αυτό πρέπει να σηµειωθεί ότι στη ζύµη η κινάση Sky1p φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Npl3p, η οποία εµπλέκεται στη δέσµευση και µεταφορά του RNA. Μέσω της φωσφορυλίωσης αυτής ρυθµίζεται η είσοδος της

43 πρωτεΐνης στον πυρήνα, επάγοντας την αλληλεπίδραση της Npl3p µε τον πυρηνικό υποδοχέα Mtr10p (Gilbert et al., 2001). Υποδοχέας της λαµίνης Β (LBR) O υποδοχέας της λαµίνης Β περιέχει µία ακολουθία διπεπτιδίων αργινίνης/σερίνης στο Ν-τελικό του άκρο που φωσφορυλιώνονται από την SRPK1 (Nikolakaki et al., 1996, Mylonis et al., 2004) και η φωσφορυλίωση αυτή θεωρείται ότι συνεισφέρει στη δέσµευση του LBR στη χρωµατίνη κατά τη διάρκεια της S φάσης (Τakano et al., 2004) Πρωταµίνη P1 Ένα άλλο υπόστρωµα των κινασών πρωτεϊνών σερίνης/αργινίνης αποτελεί η πρωταµίνη P1. Οι πρωταµίνες αποτελούν πολύ βασικά, χαµηλού µοριακού βάρους πολυπεπτίδια µε ισοηλεκτρικό σηµείο µεγαλύτερο του 11 και το ήµιση της ακολουθίας τους αποτελείται από αργινίνες. Περιέχουν RS διπεπτίδια τα οποία αποτελούν στόχο φωσφορυλίωσης των SRPK (Papoutsopoulou et al., 1999). Ο ρόλος των πρωταµινών είναι η αντικατάσταση των ιστονών κατά τη διάρκεια της σπερµατογένεσης µε αποτέλεσµα να προκύπτει χρωµατίνη µε πολύ υψηλό βαθµό συµπύκνωσης (Oliva & Dixon, 1991). Κατά τα αρχικά στάδια της σπερµατογένεσης οι πρωταµίνες φωσφορυλιώνονται στοιχειοµετρικά, ενώ αργότερα στα ώριµα σπερµατοζωάρια αποφωσφορυλιώνονται στο µεγαλύτερο µέρος τους (Oliva & Dixon, 1991, Chirat et al., 1993). H φωσφορυλίωση της P1 πρωταµίνης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της µε τον υποδοχέα της λαµίνης Β (LBR) στον πυρηνικό φάκελο (Mylonis et al., 2004). εδοµένου δε ότι η αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταµίνες γίνεται στην πυρηνική περιφέρεια, η φωσφορυλίωση της P1 πρωταµίνης και η συνεπακόλουθη εντόπιση της στην πυρηνική περιφέρεια, µάλλον συνεισφέρει στη διαδικασία αντικατάστασης.

44 1.4.5.1. ΙΑΦΟΡΕΣ ΑΛΛΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕΡΙΝΗΣ/ΑΡΓΙΝΙΝΗΣ Το οµόλογο της SRPK1 στη ζύµη, η Sky1p, εµπλέκεται στη ρύθµιση της µεταφοράς πολυαµινών στο κύτταρο καθώς και στην οµοιόσταση ιόντων (Omri & Kahana, 2001). Μεταλλαγµένα κύτταρα ζύµης στα οποία έγινε απαλοιφή του γονιδίου Sky1 ανέπτυξαν µεγάλη ανθεκτικότητα σε τοξικές συγκεντρώσεις σπερµίνης. Αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος των κυττάρων χάθηκε µε επιµόλυνση µε το γονίδιο της Sky1p, ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο µετά από επιµόλυνση τους, µε ένα µεταλλαγµένο γονίδιο που εκφράζει µια µη λειτουργική µορφή της κινάσης. Επιπρόσθετα, φυσιολογικά κύτταρα που υπερέκφραζαν την Sky1p έδειξαν αυξηµένη ευαισθησία στη σπερµίνη. H απαλοιφή του γονιδίου Sky1 στα κύτταρα της ζύµης είχε επίσης ως αποτέλεσµα µειωµένη πρόσληψη σπερµιδίνης και πουτρεσκίνης. Τα κύτταρα αυτά εµφάνισαν ακόµα και µία µεγάλη ανθεκτικότητα σε ιόντα λιθίου και νατρίου (Omri & Kahana, 2001). Από την άλλη, η SPK-1, στο νηµατοειδές C. elegans παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των γεννητικών κυττάρων (Kuroyanagi et al., 2000). Η SPK-1 δεσµεύεται και φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη CeSF2 in vitro (Kuroyanagi et al., 2000). Επίσης βρέθηκε ότι η κινάση και το υπόστρωµα της εκφράζονται κυρίως σε γεννητικά κύτταρα του νηµατοειδούς και παίζουν σηµαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια του εµβρυϊκού σταδίου του C. elegans (Kuroyanagi et al., 2000). Τέλος η SRPK1 έχει αποµονωθεί και ως σύµπλοκο µε την τοποϊσοµεράση ΙΙα, δύο ΑΤΡάσες ελικάσες, δύο παράγοντες µατίσµατος πρώιµων mrna και µια ΗΜG πρωτεΐνη. Το σύµπλοκο αυτό θεωρήθηκε µερικώς υπεύθυνο για τον διαχωρισµό των αδελφών χρωµατίδων (Lee et al., 2004). 1.4.6. SRPK ΚΑΙ ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ H χρωµοσωµική µετατόπιση t(6;17) (p21.31;q11.2) που είναι υπεύθυνη για µία πληθώρα ανωµαλιών έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση των επιπέδων της SRPK1 περίπου στο διπλάσιο (Mansouri et al., 2005). Αυξηµένη έκφραση της SRPK1 σε αιµοποιητικά βλαστικά κύτταρα, σχετίζεται µε την εµφάνιση της p210bcr/abl,

45 µιας ογκοπρωτεΐνης που είναι προϊόν σύντηξης δύο φυσιολογικών πρωτεϊνών και η οποία θεωρείται υπεύθυνη για την χρόνια µυελογενή λευχαιµία (Salesse et al., 2004). Επιπλέον, τα επίπεδα της SRPK1 είναι υψηλά στην οξεία ATL (Adult T-cell Leukemia), µια αύξηση που όµως δεν οφείλεται σε αύξηση στα επίπεδα του mrna. Η παραπάνω παρατήρηση και το γεγονός ότι είναι ανοσογενής, την καθιστούν έναν από τους υποψήφιους στόχους για την ανοσοθεραπεία της ATL (Hishizawa et al., 2005). Τέλος, εγκεφαλική ισχαιµία έχει ως αποτέλεσµα µείωση των επιπέδων της SRPK1 στα βασικά γάγγλια και µετατόπισή της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα (Erdo et al., 2003). Αύξηση των επιπέδων έκφρασης της SRPK2 σχετίζεται µε την επαγόµενη διαφοροποίηση των HL-60 λευχαιµικών κυττάρων από το ρετινοϊκό οξύ, την βροµοδεοξυουριδίνη και το µεσαίο Τ αντιγόνο του µεταλλαγµένου ιού του πολυόµατος (Yen et al., 2004). Τόσο η SΡPK2 όσο και η SRPK1 έχουν την ικανότητα να δεσµεύουν την κεντρική πρωτεΐνη του ιού της ηπατίτιδας Β και να αναστέλλουν την αντιγραφή του ιού µέσω µιας οδού που είναι ανεξάρτητη της φωσφορυλίωσης (Zheng et al., 2005). H SRPK3 βρίσκεται υπό τον µεταγραφικό έλεγχο της πρωτεΐνης MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2), ενός µεταγραφικού παράγοντα που παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη των µυών. Ποντίκια, από τα οποία έχει αφαιρεθεί το γονίδιο της SRPK3, εµφανίζουν µία καινούργια µορφή µυοπάθειας ενώ τρανσγενετικά ποντίκια που την υπερεκφράζουν εµφανίζουν σοβαρό εκφυλισµό των µυϊκών ινών και πεθαίνουν είτε στην F0 είτε στην F1 γενιά (Nakagawa et al., 2006). 1.5. SCAFFOLD ATTACHMENT FACTOR-B (SAF-B) (ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΠΡΟΣ ΕΣΗΣ ΙΚΡΙΩΜΑΤΟΣ) 1.5.1. ΟΜΗ ΤΩΝ SAF-B H πρωτεΐνη SAF-B1 αποτελείται από δύο βασικές περιοχές τις οποίες ενώνει µία όξινη περιοχή. Το τελικό ισοηλεκτρικό της σηµείο είναι 8,8. Έχει µορφή κυρίως α- έλικας αλλά περιέχει και κάποια β-ελάσµατα ενώ το C-τελικό άκρο έχει µία ευέλικτη δοµή. Επίσης περιέχει δύο σήµατα πυρηνικής εντόπισης (NLS). Ξεκινώντας από το

46 Ν-τελικό άκρο η πρωτεΐνη περιέχει µια περιοχή δέσµευσης DNA (SAF-Box, αµινοξέα 35-67, µια περιοχή δέσµευσης RNA (RNA Recognition Motif, αµινοξέα 406-484), µία περιοχή πλούσια σε αργινίνες και γλουταµιvικό οξύ (RE περιοχή, αµινοξέα 625-705) και µία περιοχή πλούσια σε γλυκίνες κοντά στο C-τελικό άκρο (αµινοξέα 785-899). Το τµήµα µεταξύ των αµινοξέων 599-614 περιλαµβάνει το σήµα πυρηνικής εντόπισης της πρωτεΐνης. Κουτί SAF RRM NLS RE G % Οµοιότητα Λειτουργική περιοχή µε µεγάλη αµινοξική οµοιότητα Περιοχή µε µεγάλη αµινοξική οµοιότητα (µε άγνωστη λειτουργία) Σχήµα 1.23. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής των πρωτεϊνών SAF-B1 και SAF-B2. Οι δύο πρωτεΐνες µοιράζονται τις ίδιες περιοχές (ένα SAF-Box, ένα RRΜ και τις περιοχές πλούσιες σε RE και G). Οι περιοχές µε γνωστή λειτουργικότητα παρουσιάζονται µε ανοιχτό γκρι χρώµα ενώ αυτές µε άγνωστη λειτουργικοτητα µε σκούρο γκρι. Οι αριθµοί µεταξύ των αναπαραστάσεων των δύο πρωτεϊνών συµβολίζουν την οµοιότητα σε επίπεδο αµινοξέων των αντίστοιχων περιοχών, ενώ οι αριθµοί κάτω από τον SAF-B2 φανερώνουν την θέση των συγκεκριµένων περιοχών στο µόριο του. Η πρωτεΐνη SAF-B2 παρουσιάζει 74% αµινοξική οµοιότητα µε την SAF-B1 και περιέχει τις ίδιες λειτουργικές περιοχές µε την SAF-B1 εκτός από ένα σήµα εξόδου από τον πυρήνα που υπάρχει στο µόριο της. 1.5.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ SAF-B1 ΚΑΙ SAF-B2 Τα γονίδια των SAF-B1 και 2 βρίσκονται στο χρωµόσωµα 19p13 µε αντίθετη κατεύθυνση, υπό τον έλεγχο ενός κοινού προαγωγού, πλούσιου σε περιοχές δέσµευσης του µεταγραφικού παράγοντα Sp1. Γονίδια των SAF-B1 και 2 βρέθηκαν και σε άλλους οργανισµούς όπως στο ποντίκι, στο γουρούνι και στο ταύρο, ενώ παρόµοια γονίδια έχουν βρεθεί στη Drosophila και στο νηµατοσκώληκα C. Elegans. εν έχουν βρεθεί στη ζύµη, στα φυτά, στα πρωτόζωα ή στα βακτήρια. Οι πρωτεΐνες SAF-B1 και 2 απαντούνται σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές σειρές και κυρίως σε

47 αυτές του µαστού. Σε κανονικούς ιστούς έχουν ανιχνευθεί κυρίως στην καρδιά, τον εγκέφαλο, τους πνεύµονες, τον πλακούντα, το συκώτι, το σκελετικό µύ, τα νεφρά και το πάγκρεας. Γενικά υπάρχει συνεντοπισµός των δύο πρωτεϊνών που ίσως να οφείλεται στην ύπαρξη κοινού προαγωγού. Χρωµόσωµα 19p13 Εξώνιο 1 Εξώνιο 2 Κεντροµερές Τελοµερές Εξώνιο 2 Εξώνιο 1 Σχήµα 1.24. Χρωµοσωµική διάταξη των SAFB1 και SAFB2 στο 19p13. Τα πρώτα εξόνια των SAFB1 και SAFB2 χωρίζονται από µία περιοχή 490 bp που λειτουργεί ως δικατευθυντήριος προαγωγός. Η µεταγραφή του SAF-B1 λαµβάνει χώρα µε κατεύθυνση από το τελοµερές προς το κεντοµερές ενώ του SAF-B2 κατά την άλλη κατεύθυνση. Η πρωτεΐνη SAF-B1 όπως υποδηλώνει και το όνοµα της βρίσκεται άφθονη σε παρασκευές πυρηνικής µήτρας. Την βρίσκουµε κυρίως σε περιχρωµατινικά νηµάτια (PF s, Chiodi et al., 2000) όπου συνυπάρχει µε τον παράγοντα µατίσµατος SC35, SR πρωτεΐνες, την RNA πολυµεράση ΙΙ, καθώς και µε διάφορες ισοµορφές της πρωτεΐνης hnrnp D, µε τις οποίες και αλληλεπιδρά (Nayler et al., 1998, Arao et al., 2000). Μετά από heat shock συσσωρεύεται σε σωµάτια τα οποία ονοµάζονται σωµάτια HAP και τα οποία περιέχουν κάποιο RNA (όχι όµως polya + RNA), την πρωτεΐνη hnrnp M (Chiodi et al., 2000), τον παράγοντα µατίσµατος Sam68 (Hatrmann et al., 1999) και τον παράγοντα HSF1 (Heat Shock Factor 1) (Weighardt et al., 1999). Ενδιαφέρον είναι ότι στα σωµάτια αυτά δεν έχει βρεθεί καµιά από τις πρωτεΐνες µε τις οποίες συνεντοπιζόταν η πρωτεΐνη SAF-B1 προηγουµένως στα PF s. Σε ένα ενδιάµεσο στάδιο εντοπίζεται στον πυρηνικό φάκελο. Αυτό ενδέχεται να συµβαίνει γιατί o SAF-B1 συνοδεύει τα mrna µέχρι τους πυρηνικούς πόρους, οι οποίοι κλείνουν έπειτα από heat shock µε συνέπεια να συγκεντρώνεται εκεί πριν αποθηκευτεί στα σωµάτια HAP (Weighardt et al., 1999). Η εµφάνιση των σωµατίων αυτών έχει συσχετιστεί και µε τον καρκινικό µετασχηµατισµό των κυττάρων. H συνολική

48 ποσότητα του SAF-B1 µετά το heat shock παραµένει σταθερή (Weighardt et al., 1999). Ο SAF-B2 συνεντοπίζεται µε τον SAF-B1 στον πυρήνα, ενώ στο κυτταρόπλασµα συνεντοπίζεται µερικώς µε την πρωτεΐνη vinexin β σε προσφυτικές εστίες ή σε κάποια σηµεία της περιφέρειας του κυττάρου (Townson et al., 2003). 1.5.3. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ SAF-B1 ΚΑΙ SAF-B2 Η πρωτεΐνη SAF-B1 κλωνοποιήθηκε από HeLa κύτταρα, µε βάση την ικανότητα της να δεσµεύεται στα S/MARS (Renz & Fackelmayer, 1996). Αργότερα, κλωνοποιήθηκε και από ένα δεύτερο εργαστήριο από MCF-7 καρκινικά κύτταρα µαστού µε βάση την ικανότητα της να δεσµεύεται στον προαγωγό της πρωτεΐνης hsp27 (heat shock protein 27), o οποίος ίσως να συνιστά και αυτός ένα S/MAR (Οesterreich et al., 1997). Μέσω των RE διπεπτιδίων και της C-τελικής περιοχής της αλληλεπιδρά µε τα RS διπεπτίδια των παραγόντων µατίσµατος ASF/SF-2, SRp30c, U2AF35 και SRp55 (Nayler et al., 1998), SRrp86 (Li et al., 2003) και Sam68 (Townson et al., 2004). Παράλληλα αλληλεπιδρά και µε άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται µε το RNA όπως οι hnrnp A1, U, K, I, C1/C2 και Α2 κυρίως µέσω των RE διππτιδίων που διαθέτει (Weighardt et al., 1999), καθώς και µε κάποιες ισοµορφές της hnrnp D (Arao et al., 2000). Με την µέθοδο των δύο υβριδίων βρέθηκε ότι η C-τελική περιοχή της αλληλεπιδρά, σε πυρήνες LLC-PK1 καρκινικών κυττάρων µαστού, µε την πρωτεΐνη ΖΟ-2, µία πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια MAGUK (Membrane Associated Guanylate Kinase Homologue) (Traweger et al., 2002). Το περίεργο είναι ότι η πρωτεΐνη ΖΟ-2 συµµετέχει στη δηµιουργία ενδοθηλιακών και επιθηλιακών διακυτταρικών συνάψεων, και είναι παντελώς άγνωστος ο ρόλος της στον πυρήνα. Η πρωτεΐνη SAF-B1 έχει ακόµα την ικανότητα να δεσµεύεται σε παράγοντες του γενικού µεταγραφικού συµπλόκου όπως οι htra2-beta1 και TAF II 68 καθώς και στο C-τελικό άκρο της RNA πολυµεράσης ΙΙ (Nayler et al., 1998), Σε ορισµένα είδη κυττάρων συγκατακρηµνίζεται µε την τοποισοµεράση ΙΙ (Adachi et al., 1989), την ιστόνη H1 (Izaurralde et al., 1989) και τον παράγοντα SAF-A (Fackelmayer et al., 1994). Πρόσφατα βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά και µε την DBD (DNA Binding Domain) και την hinge περιοχή του πυρηνικού υποδοχέα ER (Estrogen Receptor) µέσω της

49 κεντρικής περιοχής της (αµινοξέα 426-600) και η δέσµευση αυτή ενισχύεται in vivo παρουσία του αντιοιστρογόνου Tamoxifen (Townson et al., 2004). Η πρωτεΐνη SAF-B2 δηµιουργεί σύµπλοκο µε την SΑF-B1 µέσω των C- τελικών τους περιοχών, ενώ αλληλεπιδρά επιλεκτικά µε τις πρωτεΐνες vinexin α και β οι οποίες εµπλέκονται στην οργάνωση του κυτταροσκελετού (Townson et al., 2003). 1.5.4. ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ SAF-B1 ΚΑΙ SAF-B2 Έκφραση µικρών ποσοτήτων SAF-B1 έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της µεταγραφικής ενεργότητας του υποδοχέα των οιστρογόνων (ER) παρουσία Tamoxifen (Oesterreich et al., 2000a). Υπερέκφραση όµως του SAF-B1 µειώνει την δραστικότητα του ER, τόσο όταν έχει δεσµευµένo τον φυσιολογικό του συνδέτη, την οιστραδιόλη, αλλά κυρίως όταν είναι δεσµευµένος µε έναν ανταγωνιστή όπως το Tamoxifen (Oesterreich et al., 2000a). Αν και αλληλεπιδρά και µε την DBD (DNA Binding Domain) περιοχή του ER, η ανασταλτική της δράση δεν έγκειται σε παρεµπόδιση δέσµευσης του ΕR στα ERE (Estrogen Response element) (Oesterreich et al., 2000a). Βρέθηκε πως ο αναστολέας των απακετυλασών (HDAC) Trichostatin, µειώνει την αναστολή της µεταγραφής που επάγει ο SAF-B (Oesterreich et al., 2000b). Στη συνέχεια, πειράµατα µε διαφορετικούς υποδοχείς και αναστολείς της δράσης των HDAC έδειξαν πως ο SAF-B1 στρατολογεί διαφορετικούς συγκαταστολείς της µεταγραφής, ανάλογα µε το κυτταρικό περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται (Debril et al., 2005). Στους συγκαταστολείς αυτούς συγκαταλέγονται η CHD1 (ChromoDomain protein 1), µια πρωτεΐνη που δεσµεύεται σε S/MARS και συνανοσοκατακρηµνίζεται µαζί µε δραστικότητα απακετυλάσης, (Tai et al., 2003) και η πρωτεΐνη N-CoR (Nuclear receptor-corepressor, Jiang et al., 2005). H αναστολή οφείλεται κατά ένα µεγάλο µέρος και στην αλληλεπίδραση της SAF-B1 µε τον γενικό µεταγραφικό παράγοντα TAF II 68 (Townson et al., 2004) και λαµβάνει χώρα µόνο παρουσία S/MARS (Nayler et al., 1998). Η ανασταλτική ικανότητα της πρωτεΐνης SAF-B1 εντοπίζεται µάλλον στο C-τελικό άκρο της δεδοµένου ότι απαλοιφή αυτού του τµήµατος οδηγεί σε αύξηση της µεταγραφικής ικανότητας του ΕR (Townson et al., 2004). Εκτός από τον ER, αναστέλλει την µεταγραφή που επάγεται από ένα µεγάλο αριθµό πυρηνικών υποδοχέων, όπως οι PR (Progesterone Receptor) (Αrao et al.,

50 2000), PPARα, PPARβ και PPARγ (Peroxisome Proliferetor Activated Receptor), FXR α (Farsenoid X Receptor), ROR α1 (Retinoic acid receptor-related Orphan Receptor), VDR (Vitamin D Receptor), SF-1 (Steroidogenic factor), LHR-1 (Luteinizing Hormone Receptor) ανεξάρτητα από την παρουσία συνδέτη (Debril et al., 2005). Αναστέλλει ακόµα την µεταγραφή του ογκογονιδίου c-jun (Debril et al., 2005), καθώς και του γονιδίου της πρωτεΐνης hsp27 (Oesterreich et al., 1997). γεγονός που υποδηλώνει πως δρα ως γενικός συγκαταστολέας της µεταγραφής. Μία άλλη ενδιαφέρουσα αλληλεπίδραση είναι αυτή µε την πρωτεΐνη ΒΙCP22 του ιού BHV-1 (Bovine HerpesVirus-1), όπου και σ αυτήν την περίπτωση δρα ως αναστολέας της µεταγραφής, σε ιικούς προαγωγούς όµως στη συγκεκριµένη περίπτωση (Saydam et al., 2005). H κινάση CLK2 φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη SAF-B1 ρυθµίζοντας πιθανά έτσι τη δραστικότητά της (Nayler et al., 1998). Η πρωτεΐνη SAF-B2 αναστέλλει και αυτή τη µεταγραφή µέσω του ER και οι δύο πρωτεΐνες µαζί εµφανίζουν συνεργιστική ικανότητα αναστολής. Τέλος η υπερέκφραση των SAF-B1 και SAF-B2 επηρεάζει την επιλογή της θέσης µατίσµατος (Nayler et al., 1998).

51 έσµευση του ERα και ρύθµιση της µεταγραφής που επάγεται από αυτόν Αλληλεπίδραση µε πρωτεΐνες επεξεργασίας του RNA Μη γενωµική δράση πυρηνικών υποδοχέων έσµευση S/MARS Οργάνωση χρωµατίνης έσµευση RNA Εναλλακτικό µάτισµα Επεξεργασία RNA SAFB2 SAFB1/ SAFB2 Κυτταρική επαφή Κυτταροσκελετός Απόκριση σε στρες Ρύθµιση της µεταγραφής Αλληλεπίδραση µε ZO-2 Εντόπιση των SNBs Ρύθµιση του προαγωγού του hsp27 Αλληλεπίδραση µε vinexin Συνεντόπιση µε τον HSF1 έσµευση του ERα και ρύθµιση της µεταγραφής που επάγεται από αυτόν Κυτταρόπλασµα Πυρήνας Σχήµα 1.25. Περίληψη των διαδικασιών στις οποίες εµπλέκονται οι πρωτεΐνες SAFB1 και SAFB2 και οι πιθανές αλληλεπιδράσεις τους. Οι διαδικασίες και οι αλληλεπιδράσεις που δείχνονται σχηµατικά επεξηγούνται αναλυτικά στο κείµενο.

52 Πειράµατα απαλοιφής του γονιδίου του SAF-B1 σε ποντίκια είχαν ως αποτέλεσµα αυξηµένους θανάτους πριν και µετά τη γέννηση, νανισµό και ελάττωση των σεξουαλικών και αναπαραγωγικών λειτουργιών των πειραµατόζωων. Αυτές οι ανωµαλίες ίσως να οφείλονται σε αλλαγές που παρατηρούνται στα επίπεδα των φυλετικών ορµονών και του IGF1 (Insulin Growth Factor 1) ή/και στη διαφορετική αντίδραση στις ορµόνες που προκύπτει από την απώλεια αναστολής της µεταγραφής των υποδοχέων των ορµονών (Ivanova et al., 2005). Τέλος σε αντιστοιχία µε την πρωτεΐνη P2P-R τα επίπεδα της πρωτεΐνης SAF-B1 µειώνονται κατά τη διαφοροποίηση των αδιποκυττάρων (Debril et al., 2005). 1.5.5. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΚΑΙ SAF-B1 H πρωτεΐνη hsp27, στον προαγωγό της οποίας δεσµεύεται ο SAF-B1, ενισχύει την κυτταρική ανάπτυξη και την αντίσταση σε φάρµακα σε καρκινικές σειρές µαστού και αποτελεί αρνητικό δείκτη πρόγνωσης (Oesterreich et al., 1993). Καρκινικά κύτταρα µαστού στα οποία υπερεκφράζεται ο SAF-B1 πεθαίνουν σε ένα µεγάλο ποσοστό, ενώ αυτά που επιζούν «καθηλώνουν» τον SAF-B1 στο κυτταρόπλασµα. Αυτά τα κύτταρα εµφανίζουν πολλαπλούς πυρήνες ενώ το ποσοστό κυττάρων που βρίσκεται στην S φάση εµφανίζεται µειωµένο. Επιπλέον, διακόπτεται ο κυτταρικός κύκλος στην G 2 /M φάση. Όλα τα παραπάνω λαµβάνουν χώρα ανεξάρτητα από την παρουσία ή απουσία λειτουργικού ER (Τοwnson et al., 2000). Υψηλά επίπεδα SAF-B1 έχουν συσχετιστεί µε την ανευπλοϊδία σε καρκίνους µαστού (Townson et al., 2000). Ακόµα, απώλεια ετεροζυγωτίας στο χρωµόσωµα 19p13.3 έχει συνδεθεί µε πολλές µορφές καρκίνου του µαστού (Oesterreich, 2003). Προσθήκη cis-platin σε MCF-7 κύτταρα µαστού, η οποία διακόπτει τις διαδικασίες της µεταγραφής και αντιγραφής του γενετικού υλικού, µε αποτέλεσµα την µείωση της ανάπτυξης σε µικρές δόσεις και κυτταρικό θάνατο σε µεγαλύτερες, οδηγεί σε δηµιουργία συµπλόκου που περλαµβάνει τα S/MARS, τον SAF-B1, τον ER, την hnrnp K και την HDAC1 (Samuel et al., 1998).

53 1.6. ΥΠΟ ΟΧΕΑΣ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Α (ESTROGEN RECEPTOR ALPHA-ERα) O υποδοχέας των οιστρογόνων α (καθώς και ο β) ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων των στεροειδών (οιστρογόνων, ανδρογόνων, µεταλλοκορτικοειδών, γλυκοκορτικοειδών και προγεστινών) που µε την σειρά τους ανήκουν στην ευρύτερη οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων (στεροειδών, θυρεοειδούς ορµόνης, βιταµινών Α και D, των ορφανών υποδοχέων (ως ορφανοί θεωρούνται οι υποδοχείς που οι συνδέτες τους ή δεν έχουν βρεθεί ακόµα ή δεν υπάρχουν) και των εικοσανοειδών). Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι µεταγραφικοί παράγοντες που ρυθµίζουν την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και την οµοιόσταση των κυττάρων. Τόσο ο ERα όσο και ο συνδέτης του οιστραδιόλη (E2) θεωρούνται απαραίτητοι παράγοτες για την επιβίωση, τη διαφοροποίηση καθώς και για την ανάπτυξη των γενετικών κυττάρων και τη γονιµότητα. Ποντίκια στα οποία έχει γίνει απαλοιφή του γονιδίου του ERα παρουσιάζουν µειωµένες αναπαραγωγικές λειτουργίες. Τόσο τα αρσενικά όσο και τα θηλυκά ποντίκια είναι στείρα (Korach et al., 1996, Lubahn et al., 1993). Επιπλέον, ο υποδοχέας αυτός είναι απαραίτητος για την µορφογένεση των µαστών (Korach et al., 1996). Εκφράζεται επίσης στους οστεοβλάστες και οστεοκλάστες, στον καρδιακό ιστό και σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου, γι αυτό και η εµµηνόπαυση έχει συνδεθεί µε ασθένειες σε αυτούς τους ιστούς όπως η οστεοπόρωση, η σχιζοφρένεια, η ασθένεια του Parkinson και η καρδιαγγειακή νόσος. Αποτελεί ένα πολύ σηµαντικό µόριο για τα 2/3 των περιπτώσεων καρκίνων του µαστού και αποτελεί θεραπευτικό στόχο σε αυτές τις µορφές καρκίνου µε τη χρήση φαρµάκων όπως το Tamoxifen. 1.6.1. ΟΜΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Α. Το γονίδιο του ERα βρίσκεται στο χρωµόσωµα 6q25.1 Αποτελείται από 8 εξόνια που εκτείνονται σε ένα µήκος 140 Κbp. Με εξαίρεση το 5 άκρο υπάρχει µεγάλη οµολογία ανάµεσα στους οργανισµούς. Το ανθρώπινο γονίδιο έχει τουλάχιστον 7 διαφορετικούς προαγωγούς που οδηγούν σε µετάγραφα µε διαφορετικά 5 UTR. Σε διάφορους ιστούς, ή διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης ή σε περιπτώσεις καρκινικών ιστών χρησιµοποιούνται διαφορετικοί προαγωγοί και πολλές φορές αυτό

54 έχει ως αποτέλεσµα τη σύνθεση εναλλακτικά µατισµένων µορφών. Μεταλλάξεις στην περιοχή των προαγωγών του ERα έχουν επίδραση και στην έκφραση του. Έτσι σε όλους τους θετικούς στον υποδοχέα καρκίνους του µαστού υπάρχει ένας ενισχυτής στη θέση 3778 µε 3744 που είναι συνεχώς ενεργός (Tang et al., 1997). Επιπλέον, µεθυλίωση του προαγωγού του υποδοχέα έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια έκφρασης του, φαινόµενο που παρατηρείται στους καρκίνους του µαστού που χαρακτηρίζονται αρνητικοί στην έκφραση του υποδοχέα (Iwase et al., 1999). Η πρωτεΐνη του ERα, όπως και όλοι οι πυρηνικοί υποδοχείς, αποτελείται από την Ν-τελική Α/Β περιοχή (αµινοξέα 1-180), που συµπεριλαµβάνει την ανεξάρτητη από τη δέσµευση συνδέτη περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής (AF-1) και περιέχει δύο δακτύλους ψευδαργύρου. H σερίνη 118 αποτελεί στόχο φωσφορυλίωσης κινασών του µονοπατιού της ΜΑΡΚ (Kato et al., 1995), φανερώνοντας µία σύζευξη των σηµάτων που προέρχονται από παράγοντες ανάπτυξης και από στεροειδείς ορµόνες. Ακολουθεί η C περιοχή (αµινοξέα 180-263) που περιλαµβάνει την περιοχή δέσµευσης στο DNA (DBD-DNA Binding Domain). Αµέσως µετά βρίσκεται η D (hinge) περιοχή (αµινοξέα 263-302) και ακολουθεί η Ε περιοχή (αµινοξέα 302-553), που περιέχει την περιοχή δέσµευσης της ορµόνης (HBD-Hormone Binding Domain), των µοριακών συνοδών (hsp90, hsp70 και hsp56 kda), τη δεύτερη περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής (AF-2) και την περιοχή ολιγοµερισµού. H δράση της AF-2 εξαρτάται από την δέσµευση της ορµόνης στην ΗΒD και οι δύο αυτές περιοχές µερικώς αλληλεπικαλύπτονται. Η HBD αποτελείται από α-έλικες και η τελευταία α- έλικα συγκροτεί την AF-2. έσµευση της ορµόνης έχει σαν αποτέλεσµα αλλαγή της δοµής της AF-2, µε αποτέλεσµα την αλληλεπίδραση της µε διαφορετικές πρωτεΐνες σε σχέση µε τον ελεύθερο υποδοχέα. Επιπλέον, οι διάφοροι αγωνιστές ή ανταγωνιστές των οιστρογόνων (όπως το Tamoxifen) δεσµεύονται στην HBD, προκαλώντας διαφορετικές αλλαγές στη διαµόρφωση, µε συνέπεια την αλληλεπίδραση µε διαφορετικούς παράγοντες απ ότι στην περίπτωση της οιστραδιόλης. ιµερισµός του υποδοχέα µετά την δέσµευση της ορµόνης σταθεροποιεί την δέσµευση του στο DNA. Κάποια αντιοιστρογόνα όπως το ICI 182,780 εµποδίζουν τον διµερισµό και συνεπώς και τη δέσµευση του υποδοχέα στις αλληλουχίες απόκρισης στα οιστρογόνα (ERE, Fawell et al., 1990). Η τελευταία περιοχή F (αµινοξέα 553-595) είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση του

55 υποδοχέα µε τον µεταγραφικό παράγοντα Sp1 και ενεργοποίηση της µεταγραφής µέσω συνδυασµού των δύο παραγόντων (Sp1/ER α, Kim et al., 2003). Νουκλεοτίδια Αµινοξέα AF-1 AF-2 AF-2a Περιοχή δέσµευσης του DNA Περιοχή δέσµευσης του συνδέτη Ενδιάµεση περιοχή NLS Σχήµα 1.26. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του γονιδίου και της πρωτεΐνης ERα. (Α) οµή του γονιδίου του ERα. Ξεκινώντας από αριστερά διακρίνει κανείς τους εναλλακτικούς προαγωγείς. Η σκιασµένη περιοχή αντιστοιχεί στην κωδικεύουσα περιοχή όπου διακρίνει κανείς το εναρκτήριο κωδικόνιο (ATG) καθώς και το κωδικόνιο τερµατισµού (TAG). (B) Οι διάφορες περιοχές των πυρηνικών υποδοχέων. Πάνω από το σχήµα βλέπουµε τα νουκλεοτίδια που αντιστοιχούν στα όρια των περιοχών αν λάβουµε ως +1 την αρχή του προαγωγού Α, ενώ από κάτω τα αντίστοιχα αµινοξέα. Οι διάφορες λειτουργικές περιοχές παρατίθενται από κάτω µε µπάρες (βλ. αναλυτικά κείµενο). 1.6.2. EN ΟΚΥΤΤΑΡΙΚH ΕΝΤΌΠΙΣΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟI ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ERα O υποδοχέας αυτός έχει την ικανότητα να µετακινείται µεταξύ κυτταροπλάσµατος και διαλυτού πυρηνοπλάσµατος, κυρίως όµως εντοπίζεται στο πυρηνόπλασµα. Η οιστραδιόλη (Ε2) µετά τη διάχυση της µέσα στο κύτταρο, δεσµεύεται από τον υποδοχέα της. Η δέσµευση αυτή προκαλεί µία αλλοστερική αλλαγή στη δοµή του υποδοχέα, που τον οδηγεί σε αποσυµπλοκοποίηση του από τις πρωτεΐνες θερµικού σοκ (heat shock proteins) που λειτουργούν ως µοριακοί συνοδοί του ERα (Beato & Klug, 2000). Η αλλαγή αυτή έχει σαν αποτέλεσµα τον οµο- ή ετεροδιµερισµό της πρωτεΐνης (µε τον ER β) και τη δέσµευση της σε συγκεκριµένες περιοχές του DNA

56 που περιέχουν τις αληλουχίες απόκρισης του, γνωστές ως ERE (Estrogen Response Elements, Petterson et al., 1997). Οι αλληλουχίες ERE βρίσκονται στους προαγωγούς γονίδιων των οποίων η µεταγραφή επάγεται από τον ERα. Ο ERα µπορεί να δεσµεύεται και σε ατελείς ERE, ειδικά όταν υπάρχουν πλευρικές αλληλουχίες που να ευνοούν µια τέτοια δέσµευση. Αφού δεσµευτεί στις αλληλουχίες ERE ο υποδοχέας, ενεργοποιεί την µεταγραφή µίας πληθώρας γονιδίων που κωδικοποιούν υποδοχείς άλλων ορµονών (PR-Progesterone Receptor και RAR-Retinoic Acid Receptor, Kastner et al., 1990, Rishi et al., 1995), παράγοντες ανάπτυξης και υποδοχείς τους όπως ο TGF-α (Transforming Growth Factor), ο IGF-I (Insulin Growth Factor) και ο EGFR (Epidermal Growth Factor receptor, Valverius et al., 1989), ογκοπρωτεΐνες όπως οι c-myc (Rochefort, 1995), c-fos και c-jun (Weisz et al., 1990) και κυκλίνες όπως οι Α, Β1, D1 και Ε (Bucklet et al., 1993). Παράλληλα µε την ενεργοποίηση, ο ERα έχει την ικανότητα να αναστέλλει την µεταγραφή γονιδίων είτε µόνος του (του Rb για παράδειγµα, Gottardis et al., 1995) είτε σε συνεργασία µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες (όπως ο AP-1, Jakacka et al., 2001). Πρόσφατες έρευνες µάλιστα σε διάφορες σειρές καρκίνων µαστού έδειξαν πως η προσθήκη οιστραδιόλης έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή ενός αριθµού γονιδίων περίπου ίσου µε αυτά που επάγονται (Charpentier et al., 2000). Ανάµεσα στις µη-γενοµικές δράσεις του ERα, συγκαταλέγονται η ενεργοποίηση της συνθάσης του NO, η ενεργοποίηση του σηµατοδοτικού µονοπατιού της MAPΚ κινάσης και η αύξηση των ενδοκυττάριων συγκεντρώσεων ασβεστίου µέσω αλληλεπίδρασης µε κανάλια ιόντων (Balthazart et al., 2001, Sutter- Dub, 2002), φαινόµενα που λαµβάνουν χώρα όλα στο κυτταρόπλασµα. Στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη CHO (Chinese Hamster Ovary) κυττάρων βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε G πρωτεΐνες, προκαλώντας µε αυτόν τον τρόπο ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C και της αδενυλ-κυκλάσης (Razandi et al., 1999).

57 Σχήµα 1.27. Αναπαράσταση των διαφορετικών µηχανισµών δράσης των οιστρογόνων. Οι στόχοι των οιστρογόνων (estrogen) εντοπίζονται σε 3 διαφορετικούς κυτταρικούς χώρους. Στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη τα οιστρογόνα αλληλεπιδρούν αφ ενός µε κανάλια ιόντων (ion channel), ρυθµίζοντας την µετακίνηση των ιόντων και αφ ετέρου µε µεµβρανικούς υποδοχείς (membrane receptors), ενεργοποιώντας διάφορες κινάσες (kinases) µέσω κάποιων µεταγωγέων σήµατος (intracellular messenger). Το ίδιο αποτέλεσµα έχει και η αλληλεπίδραση των οιστρογόνων µε τους υποδοχείς τους στο κυτταρόπλασµα. Ένας σηµαντικός στόχος αυτών των σηµατοδοτικών µονοπατιών είναι η ενεργοποίηση του ειδικού µεταγραφικού παράγοντα CREB (camp Response Element Binding protein), που προσδένεται στις αλληλουχίες απόκρισης στο camp. Τέλος, υπάρχει η κλασσική αλληλεπίδραση στον πυρήνα µε αποτέλεσµα τον διµερισµό του υποδοχέα και την ενεργοποίηση της µεταγραφής των γονιδίων-στόχων (target genes) µέσω της δέσµευσης του συµπλόκου ορµόνης-υποδοχέα στις ERE αλληλουχίες. 1.6.3. ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΕΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΑΤΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΟΥ ER α Οι περιοχές AF-1 και AF-2 µπορούν να δεσµεύουν την πρωτεΐνη ΤΒΡ (Sadovsky et al., 1995). Επιπλέον, η AF-1 δεσµεύει τον TAF II 30 (Jack et al., 1994) ενώ η AF-2 τον TFIIB (Ing et al., 1992). Παρόλο που οι παράγοντες αυτοί είναι απαραίτητοι για την έναρξη της µεταγραφής από µόνοι τους δεν είναι ικανοί να την επιτελέσουν. Χρειάζεται η στρατολόγηση και κάποιων άλλων παραγόντων που ονοµάζονται συνενεργοποιητές. Οι συνενεργοποιητές στην περίπτωση της µεταγραφής που

58 επάγεται από τον ERα ανήκουν σε 4 κατηγορίες: στην οικογένεια του SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator 1) µε σηµαντικότερα µέλη τις πρωτεΐνες SRC-1 (Onate et al., 1995) και p/cip (Voegel et al., 1996), την οικογένεια της CBP, µε µέλη τις πρωτεΐνες CBP (Kamel et al., 1996) και p300 (Chakravarti et al., 1996), που έχουν δράση ακετυλο-τρανσφεράσης, την οικογένεια των SWI/SNF πρωτεϊνών, που έχουν δράση ελικάσης και «ξεδιπλώνουν» την χρωµατίνη. Η τέταρτη κατηγορία περιλαµβάνει διάφορες πρωτεΐνες µε την πρωτεΐνη CARM1 (Chen et al., 1999) να έχει κεντρικό ρόλο. Η πρωτεΐνη CARM1 εµφανίζει δράση µεθυλο-τρανσφεράσης ιστονών, µεθυλιώνοντας όµως αργινίνες. Για τις SRC-1 και CARM1 θα αναφέρουµε πιο πολλά στη συνέχεια. Ως συγκαταστολείς των πυρηνικών υποδοχέων ορίζονται οι παράγοντες που αλληλεπιδρούν µε τους υποδοχείς και µειώνουν το ρυθµό µεταγραφής των γονιδίωνστόχων. Οι δύο κυριότεροι στην περίπτωση του ERα είναι οι πρωτεΐνες NCoR (Chen & Evans, 1995) και SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid receptor, Ordentlich et al., 1999). Οι συγκαταστολείς αλληλεπιδρούν κυρίως µε την AF-2 περιοχή όµως έχει αναφερθεί αλληλεπίδραση και µε τις υπόλοιπες περιοχές του µορίου εκτός της F (Brzozowski et al., 1997). Κατά τη δέσµευση αντιοιστρογόνων στον υποδοχέα η α-έλικα της AF-2 περιοχής λαµβάνει τέτοια διαµόρφωση έτσι ώστε να εµποδίζεται η δέσµευση συνενεργοποιητών και να ευνοείται η δέσµευση των συγκαταστολέων. Ετσι, η αναστολή της µεταγραφής που προκαλεί το tamoxifen αποδίδεται στην στρατολόγηση του συγκαταστολέα NCoR που προκαλεί αποδέσµευση του συνενεργοποιητή SRC-1 (Shang et al., 2000). O τρόπος δράσης των συγκαταστολέων διαφέρει. Περιλαµβάνει, αναλόγως την περίπτωση, αναδιάταξη της χρωµατίνης, αλληλεπίδραση µε το βασικό µηχανισµό µεταγραφής, συναγωνισµό µε τους συνενεργοποιητές για τη δέσµευση στον υποδοχέα, παρεµπόδιση του διµερισµού του υποδοχέα, ελάττωση της σταθερότητας του µορίου του υποδοχέα και αποµάκρυνση του υποδοχέα από την περιοχή δράσης του. Γενικά οι συγκαταστολείς λειτουργούν ως βάση για τη δηµιουργία ενός πολυπρωτεϊνικού συµπλόκου µε ανασταλτική δράση. Είναι υπεύθυνοι για τη δράση των αντιοιστρογόνων, αλλά και για τον έλεγχο του µεγέθους της απόκρισης στα οιστρογόνα.

59 Αναδιάταξη της χρωµατίνης που εξαρτάται από ATP Ακετυλίωση και µεθυλίωση των ιστονών Μεθυλίωση των ιστονών Στρατολόγηση RNA πολυµεράσης II Σύµπλοκα υποδοχέα και συνενργοποιητών Αναδιάταξη της χρωµατίνης Συγκρότηση του γενικού µεταγραφικού συµπλόκου Μεταγραφή Σχήµα 1.28. Σχηµατική αναπαράσταση της δηµιουργίας συµπλόκων υποδοχέασυνενεργοποιητών µε αποτέλεσµα την αναδιάταξη της χρωµατίνης, την επιστράτευση των γενικών µεταγραφικών παραγόντων και τελικά την µεταγραφή. Τα σύµπλοκα συνενεργοποιητών περιλαµβάνουν το σύµπλοκο BRG/Brm (Brahma Related Gene/Brahma), που ανήκει στην οικογένεια των SWI/SNF συµπλόκων αναδιάταξης της χρωµατίνης µε υδρόλυση ΑΤP, το σύµπλοκο της πρωτεΐνης SRC που αποτελείται από ακετυλο- και µεθυλο-τρανσφεράσες ιστονών, το σύµπλοκο της πρωτεΐνης ΑSC-2 (Activating Signal Cointegrator-2) που αποτελείται κυρίως από µεθυλοτρανσφεράσες ιστονών (histone methylation) και το σύµπλοκο της πρωτεΐνης TRAP (ΤR Associated Protein) που είναι υπεύθυνο για τη στρατολόγηση της RNA πολυµεράσης ΙΙ. Η=Ορµόνη, NR=Πυρηνικός υποδοχέας, Αc=Ακετυλίωση, Me=Μεθυλίωση.

60 Ε) Καθήλωση του ER στο κυτταρόπλασµα Πυρήνας Β) Ρύθµιση του βασικού µηχανισµού µεταγραφής Α) Αναδιάταξη της χρωµατίνης Κυτταρόπλασµα Γ) Συναγωνισµός µε συνενεργοποιητές ) Επεξεργασία RNA Z) Παρεµπόδιση του διµερισµού του ER ή της δέσµεσης του στο DNA Σχήµα 1.29. Σχηµατική αναπαράσταση των µηχανισµών δράσης των συγκαταστολέων του ERα. Οι συγκαταστολείς του ERα δρουν: (A) «στρατολογώντας» απακετυλάσες των ιστονών µε αποτέλεσµα την αναδιάταξη της χρωµατίνης, (Β) επιδρώντας ανασταλτικά στο βασικό µηχανισµό µεταγραφής, (Γ) παρεµποδίζοντας τη δέσµευση συνενεργοποιητών στον υποδοχέα, ( ) εµποδίζοντας τη διαδικασία ωρίµανσης του πρώιµου RNΑ, (Ε) καθηλώνοντας τον υποδοχέα στο κυτταρόπλασµα και (Ζ) εµποδίζοντας τον διµερισµό του υποδοχέα και τη δέσµευση του στο DNA. CoR=συγκαταστολέας, CoA=συνενεργοποιητής, NURD=NUcleosome RemoDelling Complex, BTM=Basal Transcription Machinery. 1.6.4. XHMIKOI ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ERα Το πιο δηµοφιλές φάρµακο για τη θεραπεία µορφών καρκίνου του µαστού, που έχουν χαρακτηριστεί ως θετικοί στον ERα, είναι το Tamoxifen. Ανήκει στη οικογένεια των τριφαινυλαιθυλενίων και εκτός της αντιοιστρογονικής του δράσης, λειτουργεί µερικώς και ως αγωνιστής (Harper & Walpole, 1967). Έτσι επιτρέπει το διµερισµό του ERα και τη δέσµευση του στις αλληλουχίες ERE, αλλά διακόπτει την

61 ενεργοποίηση της µεταγραφής από την AF-2 περιοχή, παρεµποδίζοντας τη στρατολόγηση του SRC-1 συνενεργοποιητή. υστυχώς, αυξάνει τον κίνδυνο για εµφάνιση καρκίνου του ενδοµητρίου, θροµβώσεων και κατάθλιψης (Robinson et al., 1996) αλλά διατηρεί κάποια από τα ευεργετικά αποτελέσµατα των οιστρογόνων όσον αφορά τη δράση στα οστά (Love et al., 1992). Μία άλλη ένωση, που µοιάζει δοµικά µε το Tamoxifen, είναι το Raloxifene, που χρησιµοποιείται για την πρόληψη της οστεοπόρωσης. Παρουσιάζει ευεργετική επίδραση στα οστά (Jordan et al., 1987) χωρίς όµως παρενέργειες στην µήτρα (Black et al., 1994). Ενδέχεται να χρησιµοποιηθεί µελλοντικά για τον καρκίνο του µαστού. Το αντιοιστρογόνο ICI 182,780 δοκιµάζεται σε ασθενείς που έχει αποτύχει η θεραπεία µε Tamoxifen. ρα αποτρεπτικά στη δηµιουργία ενεργού µεταγραφικού συµπλόκου του ERα και πέρα των ογκοκατασταλτικών του ιδιοτήτων δεν εµφανίζει παρενέργειες (Jones, 2002). Σε περιπτώσεις απώλειας της ευαισθησίας στο Tamoxifen χρησιµοποιούνται και αναστολείς των αρωµατασών ώστε να µειωθούν τα επίπεδα των οιστρογόνων. Σχήµα 1.30. Συντακτικός τύπος των διαφόρων συνδετών του ERα. Οι ενώσεις ICI 182,780 και RU 58 668 αποτελούν ανταγωνιστές της οιστραδιόλης (17 β estradiol) ενώ το 4-ΟΗ Tamoxifen µερικό αγωνιστή της (4-OH Tamoxifen είναι το µεταβολικά ενεργό παράγωγο του Tamoxifen).

62 1.6.5. ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ ΚΑΙ ERα έσµευση οιστραδιόλης στον υποδοχέα έχει ως αποτέλεσµα καθήλωση του υποδοχέα στην πυρηνική µήτρα, 10-20 min έπειτα από την προσθήκη της ορµόνης, όπου και συνεντοπίζεται µε τον συνενεργοποιητή SRC-1 (Stenoien et al., 2000). Συνεντοπίζεται επίσης, εκτός από τον SRC-1, και µε την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 και µε µέλη του SWI/SNF συµπλόκου (Μatsuda et al., 2002). Επιπλέον, υπάρχει µερικός συνεντοπισµός µε την ενεργή, φωσφορυλιωµένη µορφή της RNA πολυµεράσης ΙΙ, σε σηµεία του ικριώµατος που παρατηρείται µεταγραφή. (Stenoien et al., 2000). Προσθήκη ανταγωνιστή όπως ο ICI 182,780 έχει και πάλι ως αποτέλεσµα την «καθήλωση» του υποδοχέα στον πυρηνικό σκελετό χωρίς όµως να παρατηρείται σ αυτήν την περίπτωση συνεντόπιση µε τον SRC-1 (Stenoien et al., 2000). Οι κυτοκερατίνες 8, 18 και 19 έχουν αναγνωριστεί ως κάποια από τα δοµικά στοιχεία της πυρηνικής µήτρας στα οποία καθηλώνεται ο ΕRα. Τα επίπεδα των συγκεκριµένων κυτοκερατινών αυξάνουν µε την προσθήκη οιστραδιόλης, γεγονός που συνηγορεί µε την ύπαρξη µιας δυναµικής µορφής της πυρηνικής µήτρας (Spencer et al., 1998). Ο ΕRα συνδέεται µε την πυρηνική µήτρα πιθανόν µέσω της περιοχής που κωδικοποιείται από το εξόνιο 4 (hinge περιοχή) γιατί µεταλλάγµατα της πρωτεΐνης, από τα οποία έχει αφαιρεθεί αυτή η περιοχή, χάνουν την ικανότητα να δεσµευτούν στην πυρηνική µήτρα (Pasqualini et al., 2004). Τέλος, έχει αναφερθεί και µερική εντόπιση του υποδοχέα στον πυρηνίσκο σε καρκινικά κύτταρα µαστού (Hou et al., 1996). 1.7. SRC-1 (Steroid Receptor coactivator-1) Η παρατήρηση πως η υπερέκφραση ενός πυρηνικού υποδοχέα µπορεί να αναστέλλει την µεταγραφική ενεργοποίηση που προκαλεί ένας άλλος, χωρίς να υπάρχει άµεση αλληλεπίδραση µεταξύ τους ή δέσµευση σε κοινές περιοχές στο DNA, οδήγησαν τους ερευνητές στην ανακάλυψη των συνενεργοποιητών. Ο SRC-1 ανήκει στους συνενεργοποιητές µίας πληθώρας πυρηνικών υποδοχέων όπως οι ER, PR (Progesterone Receptor), TR (Thyroid Receptor), RXR (Retinoid X Receptοr), GR (Glycocorticoid Receptor) και PPAR. Όπως ήδη αναφέρθηκε, αλληλεπιδρά µε την AF-2 περιοχή τους και αυξάνει την µεταγραφική ενεργοποίηση που προκαλεί ο

63 υποδοχέας. Επιπλέον, στις περιπτώσεις των AR (Androgen Receptor, Alen et al., 1999) και ΕR (Webb et al., 1998) αλληλεπιδρά και µε την AF-1 περιοχή τους. Έχει βρεθεί πως αλληλεπιδρά µε γενικούς παράγοντες µεταγραφής όπως ο ΤΒΡ και ο TF II Β και βοηθά στη ευκολότερη συγκρότηση του γενικού µεταγραφικού συµπλόκου. Παράλληλα, αυξάνει την µεταγραφική ενεργοποίηση που προκαλούν διάφοροι µεταγραφικοί παράγοντες συµπεριλαµβανοµένου του p53, αλληλεπιδρώντας µαζί τους (Lee et al., 1999). Από πειράµατα σε ποντικούς βρέθηκε ότι απαλοιφή του γονιδίου έχει ως αποτέλεσµα την µειωµένη απόκριση του οργανισµού στις στεροειδείς (Xu et al., 1998) και θυρεοειδείς ορµόνες (Weiss et al., 1999). 1.7.1. ΟΜΗ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ SRC-1 Το µόριο του SRC-1 περιέχει στην Ν-τελική περιοχή τα bhlh-pas µοτίβα (basic Helix-Loop-Helix-Per/ARNT/SIM interaction surface), που είναι υπεύθυνα για αλληλεπίδραση του µε άλλες πρωτεΐνες, στην κεντρική περιοχή τρεις LΧΧLL ακολουθίες (όπου L λευκίνη και Χ τυχαίο αµινοξύ), που θεωρούνται υπεύθυνες για την δέσµευση µιας πρωτεΐνης σε πυρηνικούς υποδοχείς και στην C-τελική περιοχή ακόµα τρεις LXXLL ακολουθίες στις οποίες δεσµεύονται άλλοι παράγοντες που βρίσκονται στρατολογηµένοι στα σύµπλοκα των πυρηνικών υποδοχέων, όπως οι ακετυλοτρανσφεράσες P/CAF και CBP/p300. Η C-τελική περιοχή εµφανίζει µία ασθενή δράση ακετυλοτρανσφεράσης ενώ στην περιοχή αυτή υπάρχει ακόµα και µία περιοχή πλούσια σε γλουταµίνες, που είναι µερικώς υπεύθυνη για τη δέσµευση µεθυλοτρανσφερασών όπως η CARM1. Η C-τελική περιοχή του SRC-1 θεωρείται υπεύθυνη για την ενεργοποίηση της µεταγραφής. Για τη δέσµευση του σε διάφορους πυρηνικούς υποδοχείς επιστρατεύονται διαφορετικές LΧΧLL ακολουθίες της κεντρικής περιοχής (π.χ. για τον ERα χρειάζεται η ακολουθία ii, McInerney et al., 1998) ενώ φαίνεται να διαδραµατίζουν κάποιο ρυθµιστικό ρόλο και οι αλληλουχίες αµινοξέων που πλαισιώνουν αυτές τις ακολουθίες (Chang et al., 1999). Ο SRC-1 αλληλεπιδρά άµεσα µε την AF-2 περιοχή των υποδοχέων ή έµµεσα µε την AF-1 περιοχή τους. Αυτή η επαφή έχει τα εξής αποτελέσµατα: αρχικά την γειτνίαση των προϋπαρχόντων συµπλόκων του SRC-1 και των ακετυλο-(cbp/p300, P/CAF) και µεθυλοτρανσφερασών (CARM1, PRMT1) των ιστονών µε τον υποδοχέα (Shang et al., 2000) και στη συνέχεια την επιστράτευση των συµπλόκων SWI/SNF

64 και TRAP (Huang et al., 2003) που προκαλούν αναδιάταξη της χρωµατίνης, µε υδρόλυση ΑΤΡ. Έτσι επιτυγχάνεται η συνδυασµένη τροποποίηση των ιστονών (απευθείας µέσω της ασθενούς δράσης ακετυλοτρανσφεράσης που εµφανίζει η C- τελική περιοχή του SRC-1 και έµµεσα µέσω των ακετυλο- και µεθυλοτρανσφερασών που στρατολογήθηκαν), η αναδιάταξη της χρωµατίνης και η αλληλεπίδραση του συµπλόκου του υποδοχέα µε το γενικό µεταγραφικό σύµπλοκο. Σχήµα 1.31. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του SRC-1. Στο σχήµα φαίνονται οι περιοχές αλληλεπίδρασης µε τους πυρηνικούς υποδοχείς (RID) και µε τους συνενεργοποιητές P/CAF, CBP, CARM1 (οι τελευταίες συµπίπτουν µερικώς µε τις περιοχές µε ενδογενή δράση ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών (HAT) και ενεργοποίησης της µεταγραφής (AD)). ιακρίνονται και τα µοτίβα bhlh- PAS, καθώς και η περιοχή πλούσια σε γλουταµίνες (Q-rich). 1.7.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΟΥ ΣΥΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ SRC-1 Το γονίδιο του συνενεργοποιητή SRC-1 εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 2p23. To mrna του έχει ανιχνευθεί στον εγκέφαλο, τον πνεύµονα, το σκελετικό µυ, τα νεφρά, το στοµάχι, το σπλήνα, τους όρχεις, την καρδιά, το πάγκρεας, το συκώτι, τα επινεφρίδια και το θυρεοειδή αδένα. Η πρωτεΐνη SRC-1 βρίσκεται διάχυτη στο νουκλεόπλασµα ή εντοπισµένη στα PML σωµάτια (Rivera et al., 2003). Όπως προναφέραµε µετά τη δέσµευση του συνεντοπίζεται µε τον ERα στην πυρηνική µήτρα. 1.8. PGC-1α (PPAR γ Coactivator 1α) Ο λιπώδης ιστός (Brown Adipose Tissue, ΒΑΤ) θεωρείται µερικά υπεύθυνος για το φαινόµενο της προσαρµοστικής θερµογένεσης, της αλλαγής δηλαδή στην έκλυση θερµότητας από τον οργανισµό ως αντίδραση στην εξωτερική θερµοκρασία, στην

65 διατροφική κατάσταση και στις µολύνσεις. Για τη διαφοροποίηση των πρόδροµων κυττάρων και τη δηµιουργία του συγκεκριµένου ιστού, καθώς και για την έκφραση των θερµογονικών γονιδίων σε αυτόν, είναι απαραίτητοι διάφοροι πυρηνικοί υποδοχείς, πιο σηµαντικός από τους οποίους θεωρείται ο PPARγ. O PGC-1α κλωνοποιήθηκε µε βάση την ικανότητα του να αλληλεπιδρά µε τον υποδοχέα PPARγ και να δρα ως συνενεργοποιητής της µεταγραφής που επάγεται από αυτόν (Puigserver et al., 1998). 1.8.1. ΟΜΗ ΤΟΥ PGC-1 α Ο PGC-1 α έχει συντηρηµένο το Ν- και το C-τελικό άκρο του από το βάτραχο µέχρι τα θηλαστικά. Στο Ν-τελικό άκρο του υπάρχει η περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής, που περιλαµβάνει και µια LXXLL ακολουθία. Ακολουθεί µία περιοχή πλούσια σε λυσίνες (αµινοξέα 214-250) και µία σε προλίνες (αµινοξέα 250-330), η οποία ταυτίζεται µερικά µε την περιοχή που ευθύνεται για την αναστολή της µεταγραφής (αµινοξέα 170-350). Στο C-τελικό άκρο του βρίσκεται µία περιοχή πλούσια σε διπεπτίδια αργινίνης/σερίνης (RS διπεπτίδια, 565-631) και µία αλληλουχία αναγνώρισης RNA (RNA Recognition Motif, RRM, αµινοξέα 677-757).

66 L1 Περιοχές δέσµευσης υποδοχέα NLS Περιοχή πλούσια σε προλίνες Κεντρική περιοχή RS διπεπτίδια Πιθανή περιοχή διµερισµού Σχήµα 1.32. Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής του PGC-1α. Το Ν-τελικό άκρο διαθέτει την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής (AD) που περιλαµβάνει 3 περιοχές πλούσιες σε λευκίνες (L1, NR box 2 και 3) από τις οποίες οι δύο τελευταίες είναι απαραίτητες για την αλληλεπίδραση µε τους πυρηνικούς υποδοχείς. Η περιοχή πλούσια σε προλίνες και το σήµα πυρηνικής εντόπισης (NLS) αλληλεπικαλύπτονται µε την περιοχή αναστολής της µεταγραφής (inhibitory). Στο C-τελικό άκρο υπάρχουν οι δύο περιοχές µε τα RS διπεπτίδια, µια πιθανή περιοχή διµερισµού και µία αλληλουχία αναγνώρισης RNA (RRM). Επιπλέον, στο σχήµα φαίνονται και οι γνωστές αλληλεπιδράσεις του PGC- 1a µε άλλες πρωτεΐνες. 1.8.2. EΝΤΟΠΙΣΗ ΤΟΥ PGC-1α Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου του PGC-1α είναι υψηλά σε ιστούς µε µεγάλες ενεργειακές απαιτήσεις και πλούσιους σε µιτοχόνδρια, όπως η καρδιά, ο σκελετικός µυς, ο λιπώδης ιστός, τα νεφρά, το συκώτι και ο εγκέφαλος. Στο λιπώδη ιστό επάγει την αποσυζευγµένη από την οξειδωτική φωσφορυλίωση αναπνοή για την παραγωγή θερµότητας, στην καρδιά την συζευγµένη για τη σύνθεση ΑΤΡ, ενώ στον µυ επάγει και τις δύο διεργασίες. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης αυξάνονται ανάλογα µε τις µεταβολικές απαιτήσεις του κάθε ιστού. Π.χ. στο λιπώδη ιστό και στον µυ

67 αυξάνονται ύστερα από έκθεση του οργανισµού στο κρύο, στην καρδιά κατά τη νηστεία και στον µυ ύστερα από έντονη σωµατική άσκηση (Puigserver et al., 1998, Wu et al., 1999, Lehman et al., 2000). Η πρωτεΐνη PGC-1α οδηγείται στον πυρήνα µέσω των δύο σηµάτων πυρηνικής εντόπισης (NLS) που περιέχει στο µόριο της. Η κατανοµή της όµως στον πυρήνα δεν είναι οµοιογενής αλλά συνεντοπίζεται σε συγκεκριµένες θέσεις µαζί µε παράγοντες µατίσµατος όπως οι SRp75, SRp40, SRp55 και SC35, γεγονός που φανερώνει τη συµµετοχή του PGC-1α στη διαδικασία του µατίσµατος. Έχει δειχτεί ότι µπορεί να ρυθµίζει το µάτισµα των γονιδίων που προηγουµένως έχει ενεργοποιήσει την µεταγραφή τους (Monsalve et al., 2000). Παράγοντες επεξεργασίας Προαγωγός Σχήµα 1.33: Σχηµατική αναπαράσταση του τρόπου µε τον οποίο ο συνενεργοποιητής PGC-1 επηρεάζει την σύνθεση του RNA και το µάτισµα του. Ο PGC-1 στρατολογείται πριν την έναρξη (preinitiation) µαζί µε άλλους παράγοντες από τους πυρηνικούς υποδοχείς (NR) που δεσµεύονται στις αλληλουχίες απόκρισης τους (HRE) έπειτα από τη σύνδεση τους µε την ορµόνη. Στην έναρξη της µεταγραφής (initiation) το C-τελικό άκρο της RNA πολυµεράσης ΙΙ (CTD) φωσφορυλιώνεται ενώ κατά τη διάρκεια της επιµήκυνσης (elongation) υπερφωσφορυλιώνεται και αλληλεπιδρά µε τους παράγοντες µατίσµατος του RNA (processing factors). O PGC-1 διευκολύνει αυτήν την αλληλεπίδραση και είτε παραµένει συνδεδεµένος στο σύµπλοκο επιµήκυνσης δρώντας και ο ίδιος σαν παράγοντας µατίσµατος του RNA (περίπτωση 1) είτε παραµένει προσκολληµένος στον υποδοχέα για επανάληψη της διαδικασίας (περίπτωση 2).

68 1.8.3. AΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΟΥ PGC-1α O PGC-1α αλληλεπιδρά µέσω της LXXLL ακολουθίας του µε την AF-2 περιοχή διαφόρων πυρηνικών υποδοχέων, στους οποίους συµπεριλαµάνονται οι ERα (Tcherepanova et al., 2000), PPARα (Vega et al., 2000), RXRα (Delerive et al., 2001) και GR (Knutti et al., 2000). Ακόµα αποτελεί το βασικό συνενεργοποιητή του HNF- 4α (Hepatic Nuclear Factor-4a) υποδοχέα χωρίς µάλιστα την προσθήκη εξωγενούς συνδέτη, σε αντίθεση µε τους προηγούµενους υποδοχείς (Yoon et al., 2001). Στην περίπτωση του HNF-4α, εκτός από την AF-2 περιοχή και η συνδετική (hinge) περιοχή του υποδοχέα κρίνεται απαραίτητη για την αλληλεπίδραση αυτή (Iordanidou et al., 2005). Αναλόγως των σηµατοδοτικών µονοπατιών που είναι ενεργά σε µια δεδοµένη χρονική στιγµή, ο PGC-1α µπορεί να αλληλεπιδρά µε διαφορετικούς υποδοχείς στον ίδιο ιστό. Π.χ. στο λιπώδη ιστό αλληλεπιδρά µε τον PPARγ ύστερα από αυξηµένη θερµιδική πρόσληψη (Vidal-Puig et al., 1996), ενώ µε τον υποδοχέα της θυροειδούς ορµόνης (Thyroid Receptor, TR) έπειτα από έκθεση του οργανισµού σε χαµηλές θερµοκρασίες (Branco et al., 1999). O τρόπος µε τον οποίο ενισχύει την µεταγραφή είναι εκλεκτικός, γεγονός που προκύπτει από το ότι δεν ενεργοποιεί την µεταγραφή όλων των γονιδίων-στόχων του PPARγ (Wu et al., 1999). Βρίσκεται σε σύµπλοκο µε την φωσφορυλιωµένη µορφή της RNA πολυµεράσης ΙΙ καθώς και µε άλλους παράγοντες που λαµβάνουν µέρος στη διαδικασία επιµήκυνσης της µεταγραφής όπως οι κυκλίνες και η cdk9 κινάση (Μonsalve et al., 2000). Υπεύθυνη για αυτές τις αλληλεπιδράσεις θεωρείται η C-τελική περιοχή του PGC-1α που περιέχει την αλληλουχία αναγνώρισης RNA (RNA Recognition Motif, RRM) και τα RS διπεπτίδια. Επίσης διαθέτει την ικανότητα να αλληλεπιδρά µε άλλους συνενεργοποιητές όπως είναι o SRC-1 και ο CBP/p300 (Puigserver et al., 1999). Για να συνδεθούν όµως οι συνενεργοποιητές στο Ν-τελικό άκρο του πρέπει πρώτα να έχει αλληλεπιδράσει µε τους αντίστοιχους µεταγραφικούς παράγοντες (Puigserver et al., 1999). Αυτό σηµαίνει ότι ο PGC-1α βρίσκεται σε µια αδρανή κατάσταση και µόλις συνδεθεί µε τον µεταγραφικό παράγοντα αλλάζει η δοµή του, γίνεται ενεργός και «στρατολογεί» τους άλλους συνενεργοποιητές.

69 1.9. CARM1 (Co-Activator Arginine Methyltransferase 1) H CARM1 εµφανίζει δραστικότητα µεθυλοτρανσφεράσης και αποτελεί ένα συνενεργοποιητή της µεταγραφής που επάγεται από τις στεροειδείς ορµόνες. ρα τροποποιώντας τις ιστόνες και αλλάζοντας µε αυτόν τον τρόπο τη δοµή της χρωµατίνης, κάνοντας την έτσι πιο προσβάσιµη σε παράγοντες µεταγραφής. Κυρίως µεθυλιώνει την ιστόνη Η3 στις αργινίνες 17 και 26. Η µεθυλίωση αυτή έχει παρατηρηθεί τόσο in vitro (Chen et al., 1999), όσο και in vivo (Ma et al., 2001) και λαµβάνει χώρα στους προαγωγείς που περιέχουν στοιχεία απόκρισης σε στεροειδείς ορµόνες (Ma et al., 2001). Εκτός από συνενεργοποιητής των υποδοχέων των στεροειδών πρόσφατα έχει αναφερθεί και ως συνενεργοποιητής του NF-κΒ (Miao et al., 2006) καθώς και του p53 (An et al., 2004) 1.10. HNF-4α (Hepatic Nulear Factor-4α) Ο HNF-4α ανήκει στην κατηγορία των ορφανών πυρηνικών υποδοχέων. Είναι ένας µεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, ελέγχοντας τη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων και τη διατήρηση του φαινοτύπου τους. O καθοριστικός ρόλος του HNF-4α στη ρύθµιση της ηπατικής διαφοροποίησης επιβεβαιώθηκε µε πειράµατα απαλοιφής του γονιδίου του σε ενήλικα ηπατικά κύτταρα (Hayhurst et al., 2001). Τα κύτταρα αυτά εµφανίζουν µειωµένες ποσότητες απολιποπρωτεϊνών και MTP (Microsomal triglyceride Transfer Protein) µε αποτέλεσµα να εµφανίζουν διαταραχές στην έκκριση των VLDL (Very Low Density Lipoproteins) και την οµοιόσταση των χολικών οξέων, καθώς και αυξηµένα επίπεδα χοληστερόλης. Προσπάθεια επαναδιαφοροποίησης αποδιαφοροποιηµένων κυττάρων ηπατώµατος, έπειτα από µόνιµη επιµόλυνση µε το cdna του HNF-4α, οδηγεί στην απόκτηση της µορφολογίας φυσιολογικών ηπατικών κυττάρων µε επανέκφραση ορισµένων ηπατικών πρωτεϊνών-δεικτών (Späth & Weiss, 1997).

70 1.10.1. ΟΜΗ ΤΟΥ HNF-4α Η πρωτεΐνη του HNF-4 περιέχει τις ίδιες περιοχές όπως και οι υπόλοιποι πυρηνικοί υποδοχείς (βλ. Σχήµα 26). Έτσι η Ν-τελική Α/Β περιοχή συµπεριλαµβάνει την ανεξάρτητη από τη δέσµευση συνδέτη περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής (AF- 1), η C περιοχή περιλαµβάνει την περιοχή δέσµευσης στο DNA (DBD-DNA Binding Domain) και το σήµα πυρηνικής εντόπισης (NLS), η D είναι η συνδετική (hinge) περιοχή, που όµως στην περίπτωση του HNF-4 επηρεάζει την µεταγραφική ικανότητα της AF-2, η Ε περιοχή περιλαµβάνει την περιοχή δέσµευσης του συνδέτη (Ligand Binding Doman, LBD) και τη δεύτερη περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής (AF-2), ενώ η F περιοχή έχει την ικανότητα να αναστέλλει τη δράση της AF-2, µάλλον µέσω αλληλεπίδρασης µε τον παράγοντα SMRT (Ruse et al., 2002). Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι εξωγενής συνδέτης δεν έχει βρεθεί µέχρι σήµερα για τον HNF-4, γι αυτό και συγκαταλέγεται στους ορφανούς υποδοχείς. 1.10.2. ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΚΑΙ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΤΟΥ HNF-4α To γονίδιο του HNF-4 έχει βρεθεί στον άνθρωπο, τον ποντικό, το βάτραχο και σε αρκετά έντοµα. Τα γονίδια αυτά παρουσιάζουν οµολογία τόσο στην περιοχή δέσµευσης στο DNA (DBD) όσο και στην περιοχή δέσµευσης του συνδέτη (LBD), γεγονός που σηµαίνει ότι αν υπάρχει συνδέτης θα πρέπει είναι καλά συντηρηµένος. Στον άνθρωπο εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ, αλλά και στα νεφρά, και στο πάγκρεας, ενώ στα ασπόνδυλα στα οµόλογα όργανα (Sladek et al., 1990, Taraviras et al., 1994, Miquerol et al., 1994). Το γονίδιο του HNF-4 στον άνθρωπο αποτελείται από 12 εξόνια, έχει µέγεθος 30 Kbp και εµφανίζει 7 ισοµορφές. Όλες οι ισοµορφές που έχουν εξεταστεί ως τώρα εµφανίζουν ικανότητα διµερισµού και πρόσδεσης στο DNA. Χρήση genistein, του γενικού αναστολέα των κινασών τυροσίνης, έχει ως αποτέλεσµα τη µετατροπή της υποπυρηνικής κατανοµής του υποδοχέα, από στοχευµένη σε συγκεκριµένες περιοχές σε διάχυτη µε ταυτόχρονη ελάττωση της µεταγραφικής ενεργοποίησης των γονιδίων στόχων (Kristaki et al., 1995) Ο HNF-4α αλληλεπιδρά µε τους συνενεργοποιητές της οικογένειας των SRC- 1, CBP/p300 και TRAP (Yoshida et al., 1997, Wang et al., 1998b, Green et al., 1998,

71 Dell & Hatzopoulou-Cladaras, 1999, Sladek et al., 1999, Lee et al., 2000, Malik et al., 2002). Eπιπλέον αλληλεπιδρά µε τον PGC-1α για τη ρύθµιση έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται µε την γλυκονεογένεση (Yoon et al., 2001). Με την AF-1 περιοχή του υποδοχέα συνδέονται η πρωτεΐνη CBP καθώς και οι γενικοί µεταγραφικοί παράγοντες TFIIHp62, TFIIB, TBP, TAF II 31 και TAF II 80 (Green et al., 1998, Dell & Hatzopoulou-Cladaras, 1999, Kistanova et al., 2001) ενώ ο κύριος όγκος των συνενεργοποιητών αλληλεπιδρά µε την AF-2 περιοχή του υποδοχέα µέσω της ακολουθίας LXXLL που περιέχουν στο µόριο τους. 1.10.3. ΡΑΣΗ ΤΟΥ HNF-4α O HNF-4α προσδένεται στο DNA αποκλειστικά ως οµοδιµερές σε ευθείες επαναλήψεις 5 -AGGTCA-3 (Jiang et al., 1995). εν έχουν βρεθεί άλλοι υποδοχείς µε τους οποίους να ετεροδιµερίζεται. Παρόλο όµως που δεν ετεροδιµερίζεται, µοιράζεται τις αλληλουχίες απόκρισης του µε άλλους υποδοχείς, όπως ο RXRα, o RAR, o PPAR (Jiang et al., 1995) και οι ορφανοί υποδοχείς COUP-TFI και COUP- TFΙΙ (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter-Transcription Factor I/II, Kimura et al., 1993). Οι τελευταίοι φαίνεται πως αναστέλλουν την έκφραση των γονιδίων στόχων του HNF-4, µέσω ανταγωνισµού για την ίδια θέση πρόσδεσης (Kristaki & Talianidis, 1997, Ladias et al., 1992). Επιπλέον, βρέθηκε ότι ο HNF-4α αλληλεπιδρά µέσω της AF-2 περιοχής του και µε ένα άλλον ορφανό υποδοχέα, τον SHP (Small Heterodimer Partner). O SHP δεν προσδένεται στο DNA και αναστέλλει τη µεταγραφική ενεργοποίηση του HNF-4α είτε άµεσα, µέσω της περιοχής µεταγραφικής καταστολής που διαθέτει στην F περιοχή του, είτε έµµεσα µέσω ανταγωνισµού για τους συνενεργοποιητές (Lee et al., 2000). Τα περισσότερα από τα γονίδια που αποτελούν στόχο του HNF-4α εκφράζονται στο ήπαρ, αν και υπάρχουν µερικές εξαιρέσεις, όπως για παράδειγµα η ερυθροποιητίνη, που εκφράζεται κυρίως στους νεφρούς και σε µικρότερο βαθµό στο ήπαρ. Μια κατηγορία γονιδίων-στόχων είναι αυτά που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εµπλέκονται στη µεταφορά θρεπτικών στοιχείων, όπως χοληστερόλης και λιπιδίων από τις απολιποπρωτεΐνες (Ladias et al., 1992, Kardassis et al., 1997, 1998, Metzger et al., 1998, Mietus-Snyder et al., 1992), σιδήρου από την τρανσφερίνη (Schaeffer et al., 1993) και θυρεοειδούς ορµόνης Τ 4 από την τρανσθυρετίνη (Sladek et al., 1990).

72 Μια δεύτερη κατηγορία γονιδίων-στόχων κωδικοποιούν πρωτεΐνες που παίζουν σηµαντικό ρόλο σε µεταβολικά µονοπάτια, όπως ο µεταβολισµός της γλυκόζης (Hall et al., 1992, Diaz-Guerra et al., 1993, Gregori et al., 1998), των λιπιδίων και των στεροειδών (Chen et al., 1994b) και των αµινοξέων (Nitsch et al., 1993, Kimura et al., 1993). Μια τρίτη οµάδα γονιδίων κωδικοποιεί πηκτικούς και αντιπηκτικούς παράγοντες του αίµατος. Ο HNF-4α ρυθµίζει τη µεταγραφή γονιδίων τα προϊόντα των οποίων είναι υπεύθυνα για την πήξη του αίµατος και εξαρτώνται από τη βιταµίνη Κ είτε άµεσα (Stauffer et al., 1998) είτε έµµεσα µέσω του HNF-1 και της προθροµβίνης (Zakin et al., 1994). Το γεγονός ότι µπορεί να ρυθµίζει η µεταγραφή γονιδίων µε αντίθετες λειτουργίες, όπως είναι τα γονίδια των πηκτικών και αντιπηκτικών παραγότων, µπορεί να εξηγηθεί είτε µέσω της εναλλακτικής φωσφορυλίωσης του (Kristaki et al., 1995) είτε µέσω της αλληλεπίδρασης του µε διαφορετικούς συµπαράγοντες (McKenna et al., 1999). Επιπλέον, σε συνεργασία µε τον µεταγραφικό παράγοντα HIF-1 παίζει ρόλο στην ρύθµιση της µεταγραφή του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης για την αποφυγή υποξίας (Tsuchiya et al., 2002, Galson et al., 1995), ενώ τόσο απευθείας (Chen et al., 1994b) όσο και έµµεσα, σε συνεργασία µε τον PXR (Pregnane X Receptor), ρυθµίζει την έκφραση των κυτοχρωµάτων της οικογένειας P450, που ελέγχουν µε την σειρά τους, τον µεταβολισµό των ξενοβιοτικών (Kliewer et al., 1998). Τέλος, ελέγχει και τη µεταγραφή ορισµένων γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εκκρίνονται στον ορό από το ήπαρ όπως η α 1 -αντιτρυψίνη ή παράγοντες που συµµετέχουν στην άµυνα του οργανισµού όπως ο παράγοντας Bf, ο οποίος συµµετέχει στην ενεργοποίηση του συµπληρώµατος (Sladek & Seidel, 2001). 1.10.4. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΚΑΙ HNF-4 α Μεταλλάξεις στις αλληλουχίες απόκρισης των υποκινητών των γονιδίων-στόχων του HNF-4α µπορούν να προκαλέσουν σοβαρές ασθένειες. Μία από αυτές είναι η αιµορροφιλία, που οφείλεται σε µεταλλάξεις στον υποκινητή του παράγοντα πήξης ΙΧ (Naka & Brownlee, 1996) ή στον υποκινητή του παράγοντα VII (Arbini et al., 1997).

73 Μεταλλάξεις στο ίδιο το γονίδιο του υποδοχέα έχουν συνδεθεί µε νόσους όπως η άτυπη µορφή διαβήτη τύπου ΙΙ, γνωστή ως νεανικός διαβήτης MODY-1 (Maturity Onset Diabetes of the Young). Τα συµπτώµατα της ασθένειας αυτής εµφανίζονται πριν από το 25ο έτος της ηλικίας. Οι ασθενείς παρουσιάζουν κανονική λειτουργία στο ήπαρ και τα νεφρά όµως εµφανίζουν δυσλειτουργία στα β- παγκρεατικά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά υπό κανονικές συνθήκες εκκρίνουν ινσουλίνη, για να απορροφήσει ο οργανισµός την γλυκόζη που βρίσκεται στο αίµα. Ο µηχανισµός αυτός δεν λειτουργεί στους συγκεκριµένους ασθενείς, µε συνέπεια να µην εκκρίνεται ινσουλίνη και να εµφανίζονται τα συµπτώµατα του διαβήτη (Yamagata et al., 1996, Stoffel & Duncan, 1997).

74 ΣΚΟΠΟΣ Οι SR πρωτεϊνικές κινάσες (SRPK s), που αποτελούν και το αντικείµενο µελέτης της ερευνητικής µας οµάδας, φωσφορυλιώνουν σερίνες σε επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια αργινίνης σερίνης (RS). Αν και όλες οι SRPK s περιέχουν στο µόριό τους δύο αλληλουχίες πυρηνικής εντόπισης (Nuclear Localization Signals, NLS), εντοπίζονται τόσο στο κυτταρόπλασµα όσο και στον πυρήνα των κυττάρων, χωρίς να έχει ακόµα αποσαφηνιστεί ο µηχανισµός που ρυθµίζει την υποκυτταρική τους εντόπιση. Υπάρχει ένας µεγάλος αριθµός πρωτεϊνών, µε διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες και διαφορετική κυτταρική εντόπιση που περιέχουν στο µόριό τους τουλάχιστον τρία επαναλαµβανόµενα RS διπεπτίδα και άρα αποτελούν πιθανά υποστρώµατα των SRPK s. Στο εργαστήριο µας κλωνοποιήθηκε µία ισοµορφή της SRPK1, η SRPK1a, η οποία αποτελεί προϊόν εναλλακτικού µατίσµατος του ίδιου γονιδίου και περιέχει σε σχέση µε την SRPK1 µία εµβόλιµη ακολουθία από 171 αµινοξέα στο Ν-τελικό άκρο του µορίου της (Nikolakaki et al., 2001). Η εµβόλιµη αυτή ακολουθία περιέχει έναν σηµαντικό αριθµό από προλίνες, καθώς και το µοτίβο LXXLL, το οποίο έχει θεωρηθεί ότι διευκολύνει την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών µε πυρηνικούς υποδοχείς. Λόγω της πρόσθετης αυτής αλληλουχίας αµινοξέων, η SRPK1a φαίνεται να έχει τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης µε διαφορετικές πρωτεΐνες από ότι η SRPK1. Προκειµένου να κατανοήσουµε καλύτερα το βιολογικό ρόλο της SRPK1a και να διαπιστώσουµε σε ποια µονοπάτια µεταφοράς σήµατος συµµετέχει, καθώς και την πιθανή αλληλεπίδρασή της, µέσω του LXXLL µοτίβου της, µε µεταγραφικά σύµπλοκα πυρηνικών υποδοχέων προσπαθήσαµε να βρούµε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν εξειδικευµένα µε την SRPK1a. Στα πλαίσια αυτής της διατριβής βρέθηκε ότι η SRPK1a επάγει τη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων καθώς και από τον HNF-4α που θεωρείται ορφανός πυρηνικός υποδοχέας. Η προσπάθεια εύρεσης του µοριακού µηχανισµού µέσω του οποίου επιτυγχάνεται η επαγωγή της µεταγραφής µας οδήγησε σε µία ενδελεχή µελέτη του ρόλου της πυρηνικής µήτρας στην οργάνωση µεγάλων µεταγραφικών συµπλόκων που συγκροτούνται τόσο από ενεργοποιητές όσο και από καταστολείς της µεταγραφής και τα οποία σύµπλοκα ελέγχουν την µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. Αντίθετα, στην περίπτωση του HNF- 4α δεν φαίνεται να συγκροτείται κάποιο ανάλογο µεταγραφικό σύµπλοκο το οποίο να

75 προσδένεται στην πυρηνική µήτρα. Η µελέτη για τον µηχανισµό επαγωγής της µεταγραφής που εξαρτάται από τον HNF-4α µας οδήγησε στη διαλεύκανση του καθοριστικού ρόλου που παίζει στην µεταγραφή η RS αλληλουχία του PGC-1, που αποτελεί και τον κυριότερο συνενεργοποιητή του HNF-4α, αλλά και στην σκέψη ότι πιθανόν και άλλα πρωτεϊνικά µόρια τα οποία φέρουν RS αλληλουχίες και αποτελούν υποστρώµατα της SRPK1a να εµπλέκονται στον µηχανισµό ενεργοποίησης της µεταγραφής.

76 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1. ΧHΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Όλα τα χηµικά αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προµηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, MI, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι µεµβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) Τα ισότοπα γ- 32 Ρ ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol και 14 C- χλωραµφαινικόλη 4 mci/mmol ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK. Οι πλάκες T.L.C. ήταν του τύπου Silica Gel IB2 Baker-flex της εταιρίας Mallinckrodt Baker Inc. (Phillipsburg, NJ, USA). Τα ακτινογραφικά φιλµ που χρησιµοποιήθηκαν για τις αυτοραδιογραφίες ήταν του τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρίας Kodak και τα υλικά εµφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλµ ήταν αντίστοιχα: X-Ray developer και X-Ray fixer της ίδιας εταιρίας. 2.2 ΥΛΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Για τον καθαρισµό των πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST), χρησιµοποιήθηκε υλικό χρωµατογραφίας αγχιστείας (σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης), της εταιρείας Amersham-Pharmacia Biotech Ltd. (Buckinghamshire, UK) ενώ για τις ανοσοκατακρηµνίσεις protein A ή G σεφαρόζη της ίδιας εταιρίας. 2.3. ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Tα ένζυµα µοριακής βιολογίας που χρησιµοποιήθηκαν ήταν της εταιρίας New England BioLabs Inc. (Beverly, MA, USA) και της Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan).

77 H δεοξυριβονουκλεάση 200 U/µl ήταν της εταιρίας Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA), ενώ η ριβονουκλεάση Α 1000 U/ml ήταν της εταιρίας Sigma-Aldrich. Η πολυµεράση που χρησιµοποιήθηκε στις διάφορες αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυµεράσης (PCR) ήταν της εταιρίας Finnzymes OY (Espoo, Finland). Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Για την ανάπτυξη των ευκαρυωτικών κυττάρων χρησιµοποιήθηκε το θρεπτικό υγρό DMEM ή IMEM, ορός από µοσχάρι, (FBS) και αντιβιοτικό πενικιλίνης-στρεπτοµυκίνης, από την εταιρεία Invitrogen Life Technologies. Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) σε βακτήρια χρησιµοποιήθηκαν οι πλασµιδιακοί φορείς pgex- 2T, pgex-4t-1 και pgex-4t-3/ha της εταιρίας Amersham-Pharmacia Biotech. Ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t χρησιµοποιήθηκε για την έκφραση της πρωτεΐνης p53, του C-τελικού τµήµατος της πρωτεΐνης SAF-B1 από αρουραίο, που περιέχεται ανάµεσα στα αµινοξέα 582 έως 875 (SAF-B-PC) και της πρωτεΐνης PGC-1 από την οποία όµως λείπουν τα αµινοξέα 565-626 που περιλαµβάνουν την περιοχή που είναι πλούσια σε RS διπεπτίδια (PGC-1- RS). Ο πλασµιδιακός φορέας pgex-4t-1 χρησιµοποιήθηκε για την έκφραση του τµήµατος της πρωτεΐνης P2P-R που περιέχεται ανάµεσα στα αµινοξέα 442-585 (P2P-R(442-585)), ενώ ο πλασµιδιακός φορέας pgex-4t-3/ha για την έκφραση της πρωτεΐνης PGC-1. Για την έκφραση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα χρησιµοποιήθηκαν οι φορείς κλωνοποίησης pflag-cmv-2 (Sigma-Aldrich) για την έκφραση των SRPK1 και SRPK1a, pcmv-flag TM -24 (Sigma-Aldrich) για την έκφραση της πρωτεΐνης P2P-R και των διαφόρων επιµέρους τµηµάτων της, pegfp-c2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA) για την έκφραση της πρωτεΐνης SAF-B-PC, pcdnai (Invitrogen Life Technologies) για την έκφραση ολόκληρης της πρωτεΐνης SAF-B1, pcdna3/ha (Invitrogen Life Technologies) για την έκφραση της πρωτεΐνης PGC-1 και pcdna3-neomyc (Invitrogen Life Technologies) για την έκφραση της πρωτεΐνης PGC-1- RS. Tα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν τα ακόλουθα: anti-p2p-r (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), anti-saf-b1 (Αbcam Inc., Cambridge, MA, USA), anti-src-1 (Upstate Biotecnology, Lake Placid, NY, USA),

78 anti-erα (H-184) (Santa Cruz Biotechnology), anti HNF-4α (Santa Cruz Biotechnology), anti-carm1 (Upstate Biotecnology), anti-flag M5 (Sigma- Aldrich), anti-p53 DO-1 (Santa Cruz Biotechnology), anti-gfp (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), anti-srpk1 (πολυκλωνικό, αναγνωρίζει και τις δύο ισοµορφές, αναπτύχθηκε απέναντι σε GST-SRPK1) και anti-srpk1a (πολυκλωνικό, αναγνωρίζει την εµβόλιµη ακολουθία των 171 αµινοξέων στο Ν-τελικό άκρο της κινάσης, ανοσοκατακρηµνίζει εξειδικευµένα την SRPK1a και όχι την SRPK1). Τα δύο αντισώµατα απέναντι στις SRPK1/SRPK1a είχαν αναπτυχθεί παλιότερα στο εργαστήριο µας από την Επίκουρο Καθηγήτρια Ε. Νικολακάκη και τον µεταπτυχιακό φοιτητή Ι. Σανίδα στα πλαίσια της διπλωµατικής του εργασίας. Τα δεύτερα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν rabbit anti-mouse και goat anti-rabbit της εταιρείας Chemicon International Inc. (Temecula, CA USA) για την αναγνώριση των µονοκλωνικών και πολυκλωνικών αντισωµάτων αντίστοιχα. Το rabbit anti-goat αντίσωµα για την ανοσοανίχνευση του HNF-4α είναι της εταιρίας Santa Cruz Biotechnology. Η κλωνοποίηση των SRPK1/SRPK1a στον πλασµιδιακό φορέα pflag- CMV-2 έγινε από την Επίκουρο Καθηγήτρια Ελένη Νικολακάκη. Το γονίδιο της πρωτεΐνης p53 µας δόθηκε κλωνοποιηµένο στον φορέα pcdna3/ha από τον Αναπληρωτή Καθηγητή. Καρδάση (Ιατρικό Τµήµα, Πανεπιστήµιο Κρήτης). Το γονίδιο της πρωτεΐνης PGC-1 µας δόθηκε κλωνοποιηµένο στους φορείς pgex-4t- 3/HA και pcdna3/ha από την Καθηγήτρια Μ. Χατζοπουλου (Τµήµα Βιολογίας Α.Π.Θ.) Το γονίδιο της πρωτεΐνης P2P-R µας δόθηκε κλωνοποιηµένο στον φορέα pcmv-flag TM -24 από τον Dr. R. Scott (University of Tennessee, Health Science Center). Το γονίδιο της πρωτεΐνης SAF-B1 κλωνοποιηµένο στον φορέα pcdnai, καθώς και το τµήµα που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 582-875 (SAF-B-PC) κλωνοποιηµένο στους φορείς pgex-2t και pegfp-c2 µας δόθηκε από την Dr. S. Oesterreich (Baylor College of Medicine) και την Επίκουρη Καθηγήτρια Ε. Γεωργάτσου (Ιατρικό Τµήµα, Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας). Οι µετρήσεις µεταγραφικής ενεργότητας χρησιµοποιώντας την ακετυλοτρανσφεράση της χλωραµφαινικόλης (CAT assays) πραγµατοποιήθηκαν στο εργαστήριο της Μ. Χατζοπούλου, ενώ αντίστοιχες δοκιµασίες µε τη χρήση λουσιφεράσης στο εργαστήριο του Dr. Scott. Τα πειράµατα µε το σύστηµα δύο

79 υβριδίων στη ζύµη πραγµατοποιήθηκαν από την Ε. Γεωργάτσου και την Ε. Νικολακάκη. 2.4. ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Για τα πειράµατα χρησιµοποιήθηκαν οι κυτταρικές καρκινικές σειρές 293T, HeLa, HepG2 και MCF-7. Τα 293Τ (επιθήλιο νεφρού επιµολυσµένο µε τον αδενοϊό 5DΝΑ), HeLa (αδενοκαρκίνωµα σε επιθήλιο µήτρας) και MCF-7 (αδενοκαρκίνωµα σε επιθήλιο µαστού) κύτταρα δηµιουργούν µία µονοστοιβάδα στην επιφάνεια του τριβλίου ενώ τα HepG2 (ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα) κύτταρα, αποικίες στις οποίες έχουµε ανάπτυξη των κυττάρων κάθετα προς την επιφάνεια του τριβλίου. Χρησιµοποιήθηκαν τα στελέχη E. coli TOP-10 (Invitrogen Life Technologies) για τον πολλαπλασιασµό του DNA, JM109 (Promega Corporation, Madison, WI, USA) για τον πολλαπλασιασµό του DNA ύστερα από TA κλωνοποίηση, XL1/B (Stratagene, La Jolla, CA, USA) για την υπερέκφραση των πρωτεϊνών p53 και SAF- B-PC, BL21 (DE3) (Invitrogen Life Technologies) για την υπερέκφραση των πρωτεϊνών P2P-R(442-585) και PGC-1 και TOP-10F (Invitrogen Life Technologies) για την υπερέκφραση της πρωτεΐνης PGC-1- RS. 2.5. ΚΑΛΛΙΕΡΓΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Τα κύτταρα µεγαλώνουν σε επωαστήρες σε θερµοκρασία 37 ο C και σε ατµόσφαιρα 5% σε CO 2, µέσα σε τριβλία που περιέχουν 10 ml DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)/10% v/v FCS (Fetal Calf Serum-Εµβρυϊκός ορός βοδιού) και µίγµα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη µυκήτων και µικροβίων (Invitrogen Life Technologies). Ειδικά η ανάπτυξη των MCF-7 κυττάρων έγινε σε 10 ml IMEM (Ιmproved MEM), 10 mm Hepes ph 7,4, 1 µg/ml fibronectin (Invitrogen Life Technologies) ιχνοστοιχεία (trace elements, Biofluids, Rockville, USA) και 1 µg/ml transferrin (Invitrogen Life Technologies). Στα κύτταρα HepG2 προστέθηκαν τα φάρµακα 5-FU και µιθραµυκίνη για 36 h σε τελικές συγκεντρώσεις 50 µg/ml και 200 nm αντίστοιχα (µας

80 παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον. Καρδάση) ενώ στα MCF-7 οιστραδιόλη ή Tamoxifen για 24-48 h σε συγκέντρωση 5x10-8 M (Sigma-Aldrich). Η υποκυτταρική κλασµάτωση έλαβε χώρα σύµφωνα µε την µέθοδο που περιγράφεται από τους Spector et al., (1998) και Jiang et al., (2001). Αφού αφαιρέθηκε επιµελώς το θρεπτικό υγρό από τα τριβλία, στη συνέχεια τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 1 ml ισότονου διαλύµατος PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), µε τη βοήθεια σπάτουλας (cell lifter). Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και στη συνέχεια αιωρήθηκαν σε 100 µl διαλύµατος Α (20 mm Hepes-KOH ph 7,5, 100 mm KCl, 5% σουκρόζη, 1 mm DTT). Μετά την αιώρηση προστέθηκε σε αυτά ίσος όγκος διαλύµατος Α στο οποίο όµως είχε προστεθεί 0,8% (v/v) από το µη ιονικό απορρυπαντικό NP-40 (τελική περιεκτικότητα σε ΝΡ-40 0,4%) και τα κύτταρα παρέµειναν για 10 min στους 4 ο C. Η προσθήκη του απορρυπαντικού έγινε προκειµένου να σπάσουν οι κυττροπλασµατικές µεµβράνες των κυττάρων χωρίς να σπάσουν όµως οι πυρηνικές. Στη συνέχεια το αιώρηµα φυγοκεντρήθηκε για 10 min στα 5000 g και το υπερκείµενο αποτέλεσε το κλάσµα του κυτταροπλάσµατος ενώ το ίζηµα επιστοιβάχθηκε σε µαξιλάρι σουκρόζης (διάλυµα A αλλά µε 0,8 Μ σουκρόζη αντί για 5%) και φυγοκεντρήθηκε για 10 min στα 5000 g για να πάρουµε καθαρούς πυρήνες. Οι πυρήνες πλύθηκαν µε PBS και εκχυλίστηκαν για 5 min στους 4 ο C µε 100 µl διαλύµατος EB (10mM PIPES ph 6,8, 250 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2 και 1 mm αναστολέα πρωτεασών PMSF). Η εκχύλιση αυτή είχε ως αποτέλεσµα το σπάσιµο της πυρηνικής µεµβράνης και την αποµάκρυνση των διαλυτών στοιχείων του πυρήνα. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 5 min στα 5000 g. Το υπερκείµενο αποτέλεσε το κλάσµα του διαλυτού νουκλεοπλάσµατος ενώ το ίζηµα αιωρήθηκε σε 100 µl διαλύµατος DB (10 mm PIPES ph 6,8, 50 mm NaCl, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2, 0,5% µη ιονικού απορρυπαντικού Triton X-100 και 1 mm αναστολέα πρωτεασών PMSF). Στο αιώρηµα αυτό προστέθηκαν 0,5 µl DNAse και επωάστηκε για 1 h στους 32 ο C, για την αποµάκρυνση των πρωτεϊνών που βρίσκονται συνδεδεµένες µε την χρωµατίνη. Το υπερκείµενο που προέκυψε µετά από φυγοκέντρηση για 5 min στα 5000 g αποτέλεσε το κλάσµα της DNAse (που περιέχει και τις ιστόνες) ενώ το ίζηµα πλύθηκε µια φορά µε το διάλυµα DB και αιωρήθηκε σε 100 µl του ίδιου διαλύµατος για να αποτελέσει το κλάσµα της πυρηνικής µήτρας.

81 2.6. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΡΑΣΗΣ TΩΝ SRPK ΜΕ ΙΝ VITRO ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΤΟΥΣ Η ανίχνευση της ύπαρξης δράσης SRPK στηρίζεται στην επώαση µικρών ποσοτήτων των κυτταρικών εκχυλισµάτων µε ένα κατάλληλο υπόστρωµα. Στα πειράµατά µας χρησιµοποιήθηκε ως υπόστρωµα το τµήµα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λάµίνης Β (LBR) που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 62 και 92, εκφρασµένο ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST στα Ε. coli (GST-62-92). Το τµήµα αυτό περιέχει στο µόριο του έξι επαναλαµβανόµενα RS διπεπτίδια, οι σερίνες των οποίων φωσφορυλιώνονται από τις SRPK1/SRPK1a. Ως δότης φωσφορικών χρησιµοποιήθηκε το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ. Το µίγµα επώασης επίσης περιλαµβάνει 25 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 10 mm MgCl 2, 80 mm NaCl, 0.6 µci [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ και 25 µμ ψυχρό ΑΤΡ. Ο τελικός όγκος επώασης είναι 25 µl και ρυθµίζεται µε την προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ddη 2 Ο. Τα δείγµατα επωάζονται για 30 min σε θερµοκρασία 30 C. Μετά το τέλος της επώασης προστίθενται 50 mm DTT και διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων που χρησιµοποιείται στην SDS ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται. Ακολουθεί βαφή της πηκτής µε τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και αποχρωµατισµός της. Στη συνέχεια γίνεται ξήρανση της πηκτής, αυτοραδιογραφία και κοπή των ζωνών της πηκτής που αντιστοιχούν στο µοριακό βάρος του υποστρώµατος σε συµφωνία και µε τις ζώνες που εµφανίζονται στο film της αυτοραδιογραφίας. Ακολουθεί η µέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή 1500 TR (Packard) κατά Cherenkov. Κατ αυτό τον τρόπο ανιχνεύεται η επιθυµητή δραστικότητα κινάσης πρωτεϊνών καθώς και η έκταση της ενσωµάτωσης της ραδιενέργειας από το [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ στα αντίστοιχα υποστρώµατα. 2.7. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΈΣ ΠΟΛΥ- ΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ (PAGE) Ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών ενός δείγµατος πραγµατοποιείται καθώς οι πρωτεΐνες, ως φορτισµένα µόρια, κινούνται διαµέσου των πόρων ενός πηκτώµατος υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα των πρωτεϊνών στο πήκτωµα εξαρτάται από τη διαφορά δυναµικού του ηλεκτρικού πεδίου (Ε) και το φορτίο της πρωτεΐνης σύµφωνα µε την εξίσωση:

82 v = E * q / f όπου ο παράγοντας της εξίσωσης f εκφράζει την εξάρτηση από τη µάζα και το σχήµα της πρωτεΐνης καθώς και το ιξώδες του πηκτώµατος µέσα στο οποίο κινείται η πρωτεΐνη. Ο σχηµατισµός των πηκτών πολυακρυλαµιδίου βασίζεται στον πολυµερισµό του ακρυλαµιδίου (CH 2 =CH-CO-NH 2 ) και του Ν,Ν µεθυλενοδισακρυλαµιδίου ή bisακρυλαµιδίου (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH-CH 2 ) που συνδέει τις αλυσίδες του πρώτου. Με τον τρόπο αυτό δηµιουργείται ένα πολυµερές πλέγµα που διαθέτει πόρους που το µέγεθος τους εξαρτάται από το βαθµό πολυµερισµού ανάλογα και µε τη συγκέντρωση των µονοµερών στο διάλυµα. Η δηµιουργία του πλέγµατος γίνεται µέσω του µηχανισµού των ελευθέρων ριζών µε την προσθήκη του υπερθειϊκού αµµωνίου (NH 4 ) 2 S 2 O 8 για την έναρξη του µηχανισµού και του φωτοχηµικού καταλύτη τετραµεθυλοαιθυλενοδιαµίνη (TEMED) για τη διάδοση του. Το σχήµα των πηκτωµάτων πολυακρυλαµιδίου µπορεί να είναι είτε κυλινδρικό είτε επίπεδο, ανάλογα µε τη συσκευή στην οποία θα πραγµατοποιηθεί ο πολυµερισµός. Η ηλεκτροφόρηση µπορεί να είναι συνεχής ή ασυνεχής. Στη συνεχή ηλεκτροφόρηση χρησιµοποιείται το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα για την πηκτή και για τα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στην ασυνεχή χρησιµοποιούνται δύο διαφορετικά πηκτώµατα, το πήκτωµα επιστοίβαξης που είναι υπεύθυνο για τη συµπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγµατος σε µια πολύ λεπτή στοιβάδα, και το πήκτωµα διαχωρισµού που είναι υπεύθυνο για το διαχωρισµό των πρωτεϊνών σε λεπτές ζώνες κατά την κίνηση τους µέσα σ αυτό. Τα διαλύµατα από τα οποία παρασκευάζονται τα δύο πηκτώµατα είναι διαφορετικά ως προς το ph και τη σύσταση τους. Επίσης το ρυθµιστικό διάλυµα των δοχείων ηλεκτροφόρησης είναι διαφορετικό από τα δύο προηγούµενα. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου µπορεί να γίνει απουσία ή παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων όπως το απορρυπαντικό SDS (µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου). Απουσία τέτοιων παραγόντων (µη µετουσιωτικές συνθήκες) οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαµορφώσεις τους, ενώ παρουσία τους (ηλεκτροφόρηση κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες) αποδιατάσσονται και λαµβάνουν τυχαία διαµόρφωση.

83 2.8. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΥΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ (SDS-PAGE) Σύµφωνα µε την τεχνική αυτή επιτυγχάνεται ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών µε βάση το µοριακό τους βάρος. Στην ηλεκτροφόρηση αυτή χρησιµοποιείται ως αποδιατακτικό µέσο το µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου (SDS). Το SDS εκτός του ότι αποδιατάσει τις πρωτεΐνες δεσµεύεται πάνω σ αυτές µέσω υδρόφοβων δεσµών, ανεξάρτητα της ιονικής ισχύος, σε εντελώς καθορισµένα ποσά κατά βάρος (1.4 gr SDS/gr πρωτεΐνης). Τα σύµπλοκα που σχηµατίζονται από την αλληλεπίδραση µε το SDS είναι επιµήκη, µε σαφή και καθορισµένη δοµή και φέρουν καθαρό αρνητικό φορτίο. Επειδή το φορτίο ανά µονάδα µάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναµικές ιδιότητες είναι συνάρτηση µόνο του µοριακού βάρους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων είναι µοναδική συνάρτηση του µοριακού βάρους. Το σύστηµα που χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων κατά τη διάρκεια της εργασίας αποτελείται από το πήκτωµα διαχωρισµού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm και το πήκτωµα επιστοίβαξης όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm πριν εισχωρήσουν στο πήκτωµα διαχωρισµού. Οι θέσεις εισαγωγής του δείγµατος δηµιουργούνται µε τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής µήτρας η οποία αφαιρείται µετά τον πολυµερισµό του πηκτώµατος επιστοίβαξης. Η σύσταση των επιµέρους στοιχείων του συστήµατος είναι οι εξής: ιάλυµα δοχείων ηλεκτροφόρησης: 25 mm Tris 0.19 M γλυκίνη 0.1% SDS ph 8.9 Πήκτωµα επιστοίβαξης: 5% ακρυλαµίδιο 0.25% bis-ακρυλαµίδιο 0.5% SDS 0.125 Μ Tris-Cl ph 6.8 για τον πολυµερισµό 0.08% APS 0.04% TEMED

84 Πήκτωµα διαχωρισµού: 12% ακρυλαµίδιο 0.62% bis-ακρυλαµίδιο 0.5% SDS 0.375 Μ Tris-Cl ph 8.9 για τον πολυµερισµό 0.08% APS 0.04% TEMED Τα δείγµατα πριν εισαχθούν στο πήκτωµα επιστοίβαξης διαλύονται στο διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων το οποίο αποτελείται από: 0.0625 Μ Tris-Cl ph 6.8 2% SDS 1% v/v β-msh 10% γλυκερόλη 0.02% κυανού της βρωµοφαινόλης Το παραπάνω διάλυµα παρασκευάζεται συνήθως έξι φορές πυκνότερο (6x), έτσι ώστε να προστίθεται 5 µl του διαλύµατος αυτού σε 25 µl του µίγµατος επώασης. Τα δείγµατα θερµαίνονται για 3 min στους 100 C, ώστε οι πρωτεΐνες να αποδιαταχθούν πλήρως και να διευκολυνθεί η δηµιουργία συµπλόκων SDSπρωτεΐνης. Η β-µερκαπτοαιθανόλη που χρησιµοποιείται, ανάγει τους τυχόν δισουλφιδικούς δεσµούς που υπάρχουν, ώστε να διαχωριστούν οι πρωτεΐνες στις υποµονάδες τους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται κάτω από σταθερή ένταση ρεύµατος 30 ma έως τη στιγµή που ο δείκτης εξέρχεται από την πηκτή. 2.9. ΒΑΦΗ ΜΕ COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 Για να βαφούν οι πρωτεϊνικές ζώνες, η πηκτή εµβαπτίζεται σε διάλυµα που περιέχει 0.1% Coomasie Brilliant Blue R-250, 10% οξικό οξύ, 50% µεθανόλη, όπου και ανακινείται για διάστηµα 1 h. Στο διάλυµα αυτό γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ο αποχρωµατισµός της πηκτής γίνεται µε ανακίνηση σε διάλυµα 10% οξικό οξύ, 10% µεθανόλη.

85 2.10. ΑΥΤΟΡΑ ΙΟΓΡΑΦΙΑ Η τεχνική βασίζεται στην ικανότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεµπόµενη ακτινοβολία του ισοτόπου που χρησιµοποιείται για την επισήµανση των διάφορων µορίων. Στην περίπτωση των πηκτωµάτων που έχουν στερεωθεί, το πήκτωµα ανακινείται για 30 min σε νερό ώστε να ξεπλυθεί και εν συνεχεία ξηραίνεται σε χαρτί Whatman 3MM (Whatman International Ltd. Kent, England) υπό την παρουσία κενού σε ειδική συσκευή. Η έκθεση του film γίνεται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάµους. Μία πρώτη εκτίµηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται µας δίνει η µέτρηση των κρούσεων της πηκτής σε συσκευή Geiger series 900 (Mini Instruments, Essex, UK). Η εµφάνιση και στερέωση του film γίνεται µε εµβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα. 2.11. ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΠΗΚΤΗ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ (WESTERN BLOT) Η ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών από πηκτή πολυακρυλαµιδίου σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης, βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, που βρίσκονται υπό τη µορφή συµπλόκου µε το SDS και είναι αρνητικά φορτισµένες, από την πηκτή προς τη µεµβράνη κατά την εφαρµογή διαφοράς δυναµικού και στον εγκλωβισµό τους στο πλέγµα της µεµβράνης. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης η µεµβράνη και η πηκτή µεταφέρονται σε ρυθµιστικό διάλυµα µεταφοράς (Transfer Buffer) το οποίο αποτελείται από: 12.5 mm Tris-Βορικό ph 8.5, 0.02% SDS και 0.5 mm DTT. Η τοποθέτηση της στη συσκευή ηλεκτροµεταφοράς γίνεται ανάµεσα σε 3 χαρτιά Whatman 3MM µε τη µεµβράνη προσανατολισµένη στο θετικό πόλο και την πηκτή στον αρνητικό. Η επαφή µεταξύ της πηκτής και της µεµβράνης πρέπει να είναι άµεση και χωρίς την παρεµβολή φυσαλίδων που παρεµποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύµατος. Η συσκευή που χρησιµοποιήθηκε ήταν το µοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter της εταιρίας Hoeffer. Η µεταφορά γίνεται για 1-1.5 h κάτω από σταθερή ένταση ρεύµατος (45-130 ma ανάλογα µε το µέγεθος της πηκτής και των πρωτεϊνών που πρόκειται να µεταφερθούν).

86 2.12. ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ Η ανοσοανίχνευση είναι µια τεχνική που επιτρέπει τον εντοπισµό µιας καθηλωµένης σε µεµβράνη πρωτεΐνης µε τη βοήθεια αντισώµατος. Η τεχνική βασίζεται στο ότι όταν η καθηλωµένη πρωτεΐνη-αντιγόνο αλληλεπιδράσει µε το αντίσωµα, η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται µε τη βοήθεια ενός δευτέρου αντισώµατος το οποίο εκτός ότι είναι ικανό να αναγνωρίσει και να δεσµευθεί µε τις ανοσοσφαιρίνες IgG του αρχικού, περιέχει στο µόριο του συζευγµένο κάποιο ένζυµο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας µε εξωγενώς προστιθέµενο υπόστρωµα δίνει χαρακτηριστική χρωµοαντίδραση καταδεικνύοντας έτσι τη ζώνη του αντιγόνου. Κατά τη διάρκεια της εργασίας η τεχνική εφαρµόσθηκε για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών P2P-R, SAF-B1, SRPK1, SRPK1a, p53, ERα, SRC-1, CARM1. Το δεύτερο αντίσωµα απέναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού είναι συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση. Επίσης, στις περιπτώσεις που χρησιµοποιήθηκαν εκχυλίσµατα παροδικά επιµολυσµένων κυττάρων µε πρωτεΐνες σύντηξης που περιέχουν την ακολουθία FLAG, χρησιµοποιήθηκε µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την αµινοξική ακολουθία Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp- Asp-Lys (FLAG). Αυτό όπως και τα υπόλοιπα µονοκλωνικά αντισώµατα ανιχνεύονται µε τη χρωµοαντίδραση αλκαλικής φωσφατάσης του δευτέρου αντισώµατος το οποίο δεσµεύεται στις ανοσοσφαιρίνες IgG ποντικού. Η διαδικασία που εφαρµόζεται, είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Αρχικά η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης µετά το τέλος της ηλεκτροµεταφοράς εµβαπτίζεται υπό ανάδευση για 1 h σε διάλυµα κορεσµού που αποτελείται από 1% ζελατίνη σε PBS (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), ώστε να κορεστεί η µεµβράνη από τη ζελατίνη και να αποφύγουµε τις µη εξειδικευµένες αλληλεπιδράσεις της µεµβράνης µε το αντίσωµα. Κατόπιν η µεµβράνη επωάζεται µε το αντίστοιχο αντίσωµα που έχει αραιωθεί κατάλληλα σε 10 ml διαλύµατος κορεσµού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 h στους 4 C. Ακολουθούν τρεις πλύσεις των 10 min στη µεµβράνη µε διάλυµα PBS που περιέχει 0.04% Tween-20 και επώαση της µεµβράνης για 1 h υπό ανάδευση σε θερµοκρασία περιβάλλοντος µε το δεύτερο αντίσωµα (αραίωση 1 : 2000) σε διάλυµα κορεσµού. Αφού η µεµβράνη υποστεί 2 πλύσεις των 10 min µε PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωµοαντίδραση µε την αλκαλική φωσφατάση έως ότου εµφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωµοαντίδραση επιτυγχάνεται µε την

87 προσθήκη 30 µl BCIP (Bromochloroindolyl phosphate) και 30 µl NBT (Nitro Blue Tetrazolium) σε 10ml διαλύµατος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-Cl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Η µεµβράνη αφού πλυθεί 2 φορές µε ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο µέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3. Εναλλακτικά το δεύτερο αντίσωµα µπορεί να είναι συζευγµένο µε υπεροξειδάση η οποία καταλύει τη φωτογόνο αντίδραση οξείδωσης της λουµινόλης. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύονται µε τη βοήθεια κατάλληλου υποστρώµατος και της µεθόδου της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (Enhanced ChemiLuminescence-ECL). Η διαδικασία που ακολουθείται είναι παρόµοια µε την παραπάνω µε τη διαφορά ότι το διάλυµα κορεσµού αποτελείται από 5% σκόνη γάλακτος χωρίς λιπαρά, 0,5 % BSA (Bovine Serum Albumin fraction V) και 0,1% Tween-20 σε PBS. Η ανίχνευση µε τη µέθοδο της χηµειοφωταύγειας γίνεται σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή (Amersham Pharmacia Biotechnology). Στη µεµβράνη τοποθετείται φιλµ και αποτυπώνεται το σήµα. Η µέθοδος αυτή χρησιµοποιήθηκε για την ανίχνευση του HNF-4α µε αντίσωµα κατσίκας (Santa Cruz) και µε δεύτερο αντίσωµα anti-goat-hrp (Santa Cruz). 2.13. ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα της πρωτεΐνης Α (Protein A) του µικροοργανισµού staphylococcus aureus να δεσµεύεται στις ανοσοσφαιρίνες. Χρησιµοποιώντας την ιδιότητα αυτή, τα αντισώµατα που έχουν δεσµεύσει το αντιγόνο τους από ένα πρωτεϊνικό εκχύλισµα δεσµεύονται στη συνέχεια στην πρωτεΐνη Α η οποία είναι καθηλωµένη σε ένα αδρανές υλικό. Στην περίπτωση που χρησιµοποιούνται µονοκλωνικά αντισώµατα όπως είναι το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ακολουθία FLAG σε πρωτεΐνες σύντηξης, η στήλη που χρησιµοποιείται είναι πρωτεΐνη G-σεφαρόζη. Σύµφωνα µε την τεχνική, η επώαση πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος µε συγκεκριµένο αντίσωµα σε κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα, θα έχει ως αποτέλεσµα την αναγνώριση του αντιγόνου από το αντίσωµα και τη συµπλοκοποίηση του. Η προσθήκη του παραπάνω µίγµατος σε στήλη σεφαρόζης-πρωτεΐνης Α, εξισορροπηµένης στο ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα, θα έχει ως αποτέλεσµα τη δέσµευση

88 του συµπλόκου αντισώµατος-αντιγόνου στα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α και την παραλαβή του από το εκχύλισµα. Έτσι µε τον τρόπο αυτό επιτυγχάνουµε τον εξειδικευµένο διαχωρισµό/καθαρισµό της φυσιολογικής µορφής µιας πρωτεΐνης µέσα από ένα µίγµα πρωτεϊνών. Επίσης είναι δυνατόν κάτω από κατάλληλα διαµορφωµένες συνθήκες εφαρµογής της τεχνικής, να συγκαθαριστούν και πρωτεΐνες οι οποίες δεσµεύονται ισχυρά πάνω στην πρωτεΐνη-στόχο (υποστρώµατα, ρυθµιστές, κ.α.), προσφέροντας µια γενική εικόνα των αλληλεπιδράσεων στο φυσιολογικό περιβάλλον της πρωτεΐνης. Τα σφαιρίδια εξισορροπούνται, µε 3 πλύσεις των 10 min η καθεµία, σε ρυθµιστικό διάλυµα 50 mm Tris-ΗCl ph 7.5, 1% Triton X-100, 0.1 M NaCl και παραλαµβάνονται µετά από σύντοµη φυγοκέντρηση, µε αποµάκρυνση του ρυθµιστικού διαλύµατος. Παράλληλα κατάλληλος όγκος από τα κυτταρικά εκχυλίσµατα (ανάλογα µε το πείραµα) επωάζονται µε 5-10 µl αντιορού, υπό ανακίνηση για χρονικό διάστηµα 3 h στους 4 C ώστε να αλληλεπιδράσουν τα αντισώµατα µε τις αντίστοιχες πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν. Μετά το πέρας της διαδικασίας µεταφέρονται στους σωλήνες µε την καθηλωµένη πρωτεΐνη-α (ή -G στη περίπτωση των µονοκλωνικών αντισωµάτων) στα σφαιρίδια. Η δέσµευση του αντισώµατος στα σφαιρίδια διαρκεί 12-16 h και ακολουθούν 3 πλύσεις των 10 min µε το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα, ώστε να αποφευχθούν οι τυχόν ασθενείς αλληλεπιδράσεις µε πρωτεΐνες των εκχυλισµάτων. Όταν µελετήθηκαν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας (P2P-R και SAF-B1) οι αρχικές πλύσεις έγιναν µε διάλυµα RIPA Rescue (10 mm Naphosphate ph 7,2, 20 mm NaCl, 1 mm NaF, 5 mm β-glycerolphosphate, 2 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 µg/ml aprotinine). Στη περίπτωση αυτή η λύση των κυττάρων έγινε µε διάλυµα RIPA (1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 0,1 % SDS, 150 mm NaCl, 10 mm Na-phosphate ph 7,2, 2 mm EDTA, 50 mm NaF, 5 mm β-glycerolphosphate, 4 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 µg/ml aprotinine) και τα εκχυλίσµατα αραιώθηκαν 5 φορές µε το διάλυµα RIPA Rescue πριν έρθουν σε επαφή µε τα αντισώµατα. Τέλος ακολουθησαν 3 πλύσεις των 10 min στους 4 ο C µε το διάλυµα HNTG (50 mm HEPES ph 7,5, 150 mm NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mm EDTA, 100 mm NaF, 10% glycerol, 2 mm sodium orthovanadate, 1mM PMSF, 20 µg/ml aprotinine). Στα σφαιρίδια µε τις ανοσοκατακρηµνισµένες πρωτεΐνες είτε γίνονται πειράµατα ελέγχου της δραστικότητας των κινασών µε την προσθήκη των

89 υποστρωµάτων τους και ραδιενεργού [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, είτε ανοσοανίχνευση για να ανιχνεύσουµε τις πρωτεΐνες που κατακρηµνίστηκαν. Πριν τα δείγµατα αναλυθούν σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου προστίθεται διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων και ακολούθως θερµαίνονται στους 100 C για 3 min ώστε να διασπαστούν τα σύµπλοκα αντιγόνου-αντισώµατος. 2.14. ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ (PULLDOWN ASSAYS) Τα πειράµατα συγκατακρήµνισης συνιστούν µία µέθοδο, η οποία επιτρέπει τη διερεύνηση της δυνατότητας των διαφόρων πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν µεταξύ τους, Μας δίδει επίσης και µία πρώτη εκτίµηση για το πόσο ισχυρή είναι η αλληλεπίδραση αυτή. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στη δυνατότητα καθήλωσης διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης (π.χ µε GST) στα σφαιρίδια των αντίστοιχης στήλης χρωµατογραφίας (γλουταθειόνη-σεφαρόζη) µε την οποία παρουσιάζει αγχιστεία. Η καθηλωµένη πρωτεΐνη µπορεί να δεσµεύσει άλλες πρωτεΐνες οι οποίες είτε βρίσκονται σε καθαρή µορφή, είτε περιέχονται σε συνολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα και µε τις οποίες παρουσιάζει αγχιστεία. Η διαδικασία γίνεται παρουσία σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων ή/και απορρυπαντικών ώστε να αποφεύγονται τυχαίες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα εκχυλίσµατα, και οι οποίες µπορούν να οδηγήσουν σε εσφαλµένα συµπεράσµατα. Στην παρούσα εργασία ως µέσο καθήλωσης χρησιµοποιήθηκε, κατά κύριο λόγο, η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης για τη δέσµευση πρωτεϊνών που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης. Στα πειράµατα αναφοράς έγινε δέσµευση καθαρής GST στα σφαιρίδια. Η διαδικασία που ακολουθείται σε κάθε περίπτωση είναι σε γενικές γραµµές η ακόλουθη: Αρχικά τα σφαιρίδια της στήλης εξισορροπούνται µε τρεις διαδοχικές πλύσεις διάρκειας 10 min η κάθε µία, στους 4 C, σε ρυθµιστικό διάλυµα PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, 1% Triton X-100). Η δέσµευση της πρωτεΐνης σύντηξης µε την GST (ή της καθαρής GST) στα σφαιρίδια της στήλης γίνεται παρουσία του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος, υπό ανακίνηση, στους 4 C για 1 h. Το υπερκείµενο της στήλης αποµακρύνεται µετά από φυγοκέντρηση στα 12000 g και τα σφαιρίδια της στήλης πλένονται 2 φορές µε το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα για 10 min στους 4 C. Στη συνέχεια µία συγκεκριµένη ποσότητα από τις πρωτεΐνες των οποίων

90 η αλληλεπίδραση πρόκειται να ελεγχθεί αραιώνεται σε PBST και επωάζεται µε τα σφαιρίδια της στήλης, όπου είναι καθηλωµένη η GST-πρωτεΐνη, υπό ανακίνηση για 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου. Μετά από φυγοκέντρηση στα 12000 g και αποµάκρυνση του υπερκειµένου, ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων των 10 min η κάθε µία, στους 4 C, στο ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα. Στη περίπτωση ασθενικών αλληλεπιδράσεων (π.χ. p53-srpk1a) αντί για PBST χρησιµοποιήθηκε ένα διάλυµα 25 mm Tris-Cl ph 7,5 και 75 mm NaCl. Όταν µελετήθηκαν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας (P2P-R και SAF-B1) για την εξισορρόπηση της στήλης και τη διαδικασία δέσµευσης χρησιµοποιήθηκε το ρυθµιστικό διάλυµα RIPA Rescue (βλ. αναλυτικά παράγραφο 2.13.), ενώ µετά τη δέσµευση ακολούθησαν 3 πλύσεις των σφαιριδίων (10 min η κάθε µία στους 4 ο C) µε το διάλυµα HNTG (βλ. παράγραφο 2.13.). Ακολούθως, αποµακρύνεται όλο το υγρό από τα σφαιρίδια της στήλης και επαναιωρούνται σε 25 µl νερού. Αφού προστεθεί 1.5 µl DTT 1 M και 5 µl από το διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων, τα δείγµατα θερµαίνονται για 3 min στους 90 C και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών γίνεται µε δύο τρόπους. Όταν πρόκειται για υπερεκφρασµένες πρωτεΐνες µετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή βάφεται µε τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250 και οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύονται µε τη χρώση. Όταν πρόκειται για πρωτεΐνες, από εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων µετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί ανοσοαποτύπωση σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοανίχνευση µε το αντίστοιχο αντίσωµα της πρωτεΐνης στόχου. Σε ορισµένες περιπτώσεις, όπου η GST-πρωτεΐνη αποτελεί υπόστρωµα των SRPKs, γίνεται έλεγχος της δυνατότητας της να φωσφορυλιωθεί εφόσον έχει δεσµευθεί στο µόριο της η αντίστοιχη κινάση. Στην περίπτωση αυτή µετά τις πλύσεις, στα σφαιρίδια προστίθεται το διάλυµα όπου ελέγχεται η δραστικότητα των SRPK (assay buffer, βλ. παράγραφο 2.6) και γίνεται ραδιενεργός επισήµανση της GST-πρωτεΐνης µε [γ- 32 P] ATP. Η ύπαρξη ή µη ραδιενεργού ζώνης πάνω στο φιλµ αυτοραδιογραφίας µαρτυρά την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης σύντηξης µε την κινάση και τη δυνατότητα φωσφορυλίωσης της.

91 2.15. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΠΟ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Η ηλεκτροφόρηση συγκεκριµένων τµηµάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης και η αποµόνωσή τους απ αυτές αποτελεί έναν απλό και αποδοτικό τρόπο διαχωρισµού και καθαρισµού τους. Η µέθοδος βασίζεται στην παρασκευή πηκτών αγαρόζης µε τήξη της αγαρόζης σε κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα έως ότου σχηµατιστεί ένα διαυγές διάλυµα. Με τη ψύξη του διαλύµατος σχηµατίζεται ένα πλέγµα που η πυκνότητα του εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Με εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου τα τµήµατα του DNA, που είναι αρνητικά φορτισµένα σε ουδέτερο ph, µετακινούνται προς την άνοδο. Η ταχύτητα µετακίνησης των τµηµάτων DNA εξαρτάται από ορισµένους παράγοντες. (1) Το µέγεθος των τµηµάτων του DNA. Η ταχύτητα µετακίνησης των τµηµάτων DNA στην πηκτή είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθµου του αριθµού των βάσεων τους. (2) Η συγκέντρωση της αγαρόζης. Ένα συγκεκριµένο τµήµα DNA µετακινείται µε διαφορετικές ταχύτητες σε πηκτές µε διαφορετική συγκέντρωση αγαρόζης. (3) Η διαµόρφωση των τµηµάτων DNA. Υπερελικωµένα, κυκλικά και γραµµικά τµήµατα DNA ίδιου µοριακού βάρους κινούνται µε διαφορετικές ταχύτητες κατά µήκος της πηκτής. (4) Το δυναµικό που εφαρµόζεται στα άκρα της πηκτής. (5) Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος της ηλεκτροφόρησης. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιούνται πηκτές µε συγκέντρωση 1% αγαρόζης, σε ρυθµιστικό διάλυµα TAE (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA ph 8.0), παρουσία και βρωµιούχου αιθιδίου σε συγκέντρωση 0.5 µg/ml. Το βρωµιούχο αιθίδιο παρεµβάλλεται ανάµεσα στις βάσεις του DNA. Η ιδιότητα του να απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία και να την επανεκπέµπει στο κόκκινο ορατό φάσµα χρησιµοποιείται για να ανιχνευθούν τα τµήµατα του DNA πάνω στην πηκτή. Το διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων αποτελείται από 5% γλυκερόλη, 0.42% µπλε της βρωµοφαινόλης, 0.42% κυανούν του ξυλενίου ενώ η χρησιµοποιούµενη συσκευή ηλεκτροφόρησης είναι της εταιρείας International Biotechnologies, Inc.

92 Για την αποµόνωση των διαχωρισθέντων τµηµάτων του DNA από την αγαρόζη χρησιµοποιούνται τα αντιδραστήρια και το πρωτόκολλο που παρέχονται από το Qiaex Gel Extraction Kit της εταιρίας Qiagen. Η αποµόνωση τµηµάτων DNA σύµφωνα µε τη µέθοδο αυτή βασίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται από ειδικά σφαιρίδια στήλης, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων, ενώ οι προσµίξεις διέρχονται από τη στήλη. Το τµήµα του DNA που µας ενδιαφέρει αποκόπτεται από την πηκτή αγαρόζης και τοποθετείται σε σωλήνα µικροφυγοκέντρησης (eppendorff). Εκεί προστίθεται το διάλυµα διαλυτοποίησης της αγαρόζης (3 Μ NaI, 4 M NaClO 4, 19 mm Tris-ΗCl, 0.1% Na 2 SO 3 ph 7.0) σε αναλογία 300 µl/100 mg πηκτής. Ακολουθεί θέρµανση για 10 min στους 50 C µε περιοδική ανάδευση ώστε να διαλυτοποιηθεί η πηκτή. Η παραλαβή του DNA γίνεται µε προσθήκη κατάλληλου όγκου σφαιριδίων στήλης Qiaex και θέρµανση στους 50 C για 10 min, αναδεύοντας περιοδικά ώστε τα σφαιρίδια να καλύπτουν όλο τον όγκο του διαλύµατος. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του διαλύµατος για 30 sec στα 12000 g και απόχυση του υπερκείµενου. Tα σφαιρίδια ξεπλένονται δύο φορές µε διάλυµα πλύσης QX2 (8 M NaClO 4, 10 mm Tris-ΗCl ph 7.0) και δύο φορές µε αιθανολικό διάλυµα QX3 (100 mm NaCl, 10 mm Tris-ΗCl, 1 mm EDTA ph 7.5), ώστε να αποµακρυνθούν οι τυχόν προσµίξεις. Στη συνέχεια αφήνονται να στεγνώσουν για 2 min και το DNA εκλούεται µε προσθήκη 20 µl Η 2 Ο ή ΤΕ (10 mm Tris-Cl, 1mM EDTA ph 8.0). Μικρή ποσότητα από το έκλουσµα (2-4 µl) ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης για να διαπιστωθεί κατ εκτίµηση η ποσότητα του DNA που αποµονώθηκε. 2.16. ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA Η αρχή του φωτοµετρικού προσδιορισµού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύµατα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριµιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσµατος, έτσι, τα διαλύµατα νουκλεϊκών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, µε µέγιστο στα 260 nm. Η διαδικασία που ακολουθείται για τον ποσοτικό προσδιορισµό των δειγµάτων του DNA είναι η εξής: Μια µικρή ποσότητα του προς ανάλυση δείγµατος, (1-10 µl), αραιώνεται µε αποστειρωµένο νερό, (600-1000 µl). Κατόπιν, µετράται η απορρόφηση στα 260 και 280 nm. Είναι γνωστό (Sambrook et al., 1989), ότι µια µονάδα οπτικής πυκνότητας, (OD), στα 260 nm, αντιστοιχεί σε 50 µg/ml διαλύµατος DNA και 40

93 µg/ml διαλύµατος RNA. Με βάση τις δυο αυτές σχέσεις, προσδιορίζεται η ποσότητα του DNA στο άγνωστο δείγµα. Επίσης, από το λόγο των οπτικών πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm, (OD 260 /OD 280 ), µπορεί να εκτιµηθεί ο βαθµός καθαρότητας των δειγµάτων DNA και RNA, αφού είναι διεθνώς παραδεκτό ότι δείγµατα υψηλής καθαρότητας, έχουν λόγο OD 260 /OD 280, περίπου 2. 2.17. ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Η τεχνική αυτή χρησιµοποιείται για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού, προκειµένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασµιδιακούς φορείς. Η αρχή της µεθόδου στηρίζεται στη χρήση µιας θερµοάντοχης DNA πολυµεράσης, η οποία χρησιµοποιεί µονόκλωνο DNA ως εκµαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συµπληρωµατικού κλώνου. Προκειµένου να δράσει η πολυµεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός µικρού τµήµατος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία και καθορίζουν τα άκρα της ακολουθίας που επιθυµούµε να πολλαπλασιάσουµε. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο µόριο του DNA αποδιατάσσεται µε θέρµανση σε 90 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δηµιουργούνται δυο µονόκλωνες αλυσίδες και το τµήµα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί για τα επόµενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταµατούν όλες οι ενζυµικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγµα, η επιµήκυνση της νεοσυντιθέµενης αλυσίδας. Στάδιο 2 ο :Υβριδισµός Η θερµοκρασία στο στάδιο αυτό µειώνεται στους 50-75 ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται µε το εκµαγείο συµπληρωµατικά, µε δεσµούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερµοκρασίας υβριδισµού είναι πολύ σηµαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το µήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγµένη θερµοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να µην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα.

94 Στάδιο 3 ο : Πολυµερισµός Στο στάδιο αυτό η DNA πολυµεράση χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο την µονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ οµάδα, συνθέτει τη συµπληρωµατική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέµενες αλυσίδες επιµηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυµητό τµήµα του DNA. Η διάρκεια του πολυµερισµού εξαρτάται από το µήκος της πολλαπλασιαζόµενης ακολουθίας. Η πολυµεράση που χρησιµοποιείται είναι θερµοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερµοκρασίες των προηγούµενων σταδίων. Ο κύκλος αυτός επαναλαµβάνεται 20-30 φορές και παράγονται 2n µόρια DNA, όπου n είναι ο αριθµός των διεξαγόµενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το µίγµα της αντίδρασης παραµένει στους 72 C για 5 min, ώστε να συνεχιστεί ο πολυµερισµός (Innis et al., 1990). Τα συστατικά του µίγµατος της αντίδρασης φαίνονται στον πιο κάτω πίνακα. DNA εκµαγείο 10-20 ng Εκκινητής νοηµατικός (sense) 20 pmol Εκκινητής αντινοηµατικός (antisense) 20 pmol Μίγµα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 3.5 mm Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 10 x 5 µl Πολυµεράση (Taq) 1 µl H 2 0 Έως 50 µl 2.18. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ DNA ΣΕ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥΣ ΦΟΡΕΙΣ Η κλωνοποίηση DNA σε πλασµιδιακούς φορείς βασίζεται στην ικανότητα του πλασµιδιακού DNA να διασπάται σε συγκεκριµένες θέσεις µετά από πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού και να συνδέεται µε το ξένο τµήµα DNA που έχει υποστεί την ίδια κατεργασία. Τα πλασµίδια είναι µικρά, κυκλικά, δίκλωνα µόρια DNA που µπορούν να αναπτύσσονται ηµι-αυτόνοµα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε αντιβιοτικά. Το πλασµιδιακό DNA καθώς και το

95 ξένο τµήµα DNA που έχουν κατεργαστεί µε τα ίδια ένζυµα περιορισµού µπορούν να επανακυκλοποιηθούν συνδεόµενα οµοιοπολικά στα άκρα τους µε τη δηµιουργία φωσφοδιεστερικού δεσµού που καταλύει µία λιγάση. Το ανασυνδιασµένο πλασµίδιο µπορεί να µεταφερθεί σε κύτταρα και να αναπτυχθεί παρουσία αντιβιοτικών επιτρέποντας την επιλογή τους σε σχέση µε τα κύτταρα που δεν περιέχουν το πλασµίδιο (Sambrook et al., 1989). Οι πλασµιδιακοί φορείς που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι pgex-2t, pgex-4t-1, pgex-4t-3, pcmv-flag-2, pcmv-flag TM -24, pcdnai, pegfp-c2 και pcdna3-noemyc. Ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t έχει µέγεθος γύρω στα 4900 bp και περιέχει στο µόριο του έναν tac προαγωγό για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιηµένου γονιδίου, το γονίδιο laq I q που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αµπικιλλίνη και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST). Η περιοχή κλωνοποίησης του πλασµιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει θέσεις για τη διάσπαση του πλασµιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού BamHI, SmaI και EcoRI που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή των γονιδίων των p53 (BamHI-EcoRI) και PGC-1 που του λείπει η περιοχή µε τα RS διπεπτίδια (PGC-1- RS, BamHI-SmaI). Οι πλασµιδιακοί φορείς pgex-4t-1 και pgex-4t-3/ηα έχουν τα ίδια χαρακτηριστικά µε τον pgex-2t. Ο pgex-4t-3/ηα επιτρέπει την έκφραση της πρωτεΐνης ως πρωτεΐνη σύντηξης µε την GST και την αιµαγλουτινίνη. Στο φορέα pgex-4t-1 η περιοχή κλωνοποίησης του πλασµιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει θέσεις για τη διάσπαση του πλασµιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού EcoRI και SalI που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή του κοµµατιού του P2P-R που κωδικοποιεί τα αµινοξέα 442-585 (P2P- R(442-585)). Ο φορέας κλωνοποίησης pcmv-flag-2 επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο Ν-τελικό τους άκρο µε την ακολουθία Met-FLAG (Met-Asp-Tyr-Lys- Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για την παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε το κλωνοποιηµένο τµήµα DNA. Η µεταγραφή των τµηµάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθµιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus. Είναι ανθεκτικός στην αµπικιλλίνη.

96 Ο φορέας κλωνοποίησης pcmv-flag TM -24 επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο Ν-τελικό τους άκρο µε 3 φορές την ακολουθία FLAG και στο C- τελικό τους άκρο µε ένα πεπτίδιο που προέρχεται από την πρωτεΐνη c-myc (Clu-Glu- Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu). Έχει τα ίδια χαρακτηριστικά µε τον pflag- CMV-2. Περιέχει θέσεις για την πέψη του από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού EcoRV, EcoRI και XbaI που χρησιµοποιήθηκαν για την εισαγωγή του N-τελικού τµήµατος του P2P-R (P2P-R(1-760), EcoRV-XbaI) καθώς και των C-τελικών τµηµάτων του (P2P-R(761-1560), P2P-R(1156-1560) και P2P-R(1314-1560), EcoRI- XbaI). Οι πλασµιδιακοί φορείς pcdna3-neomyc και pcdna3/ηα έχουν µέγεθος 5400 ζεύγη βάσεων και επιτρέπουν την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών, ως πρωτεΐνες σύντηξης µε την ακολουθία του c- Myc επιτόπου στο C-τελικό τους άκρο, ο πρώτος και µε την αιµαγλουτινίνη στο N- τελικό άκρο και το c-myc επίτοπο στο C-τελικό άκρο, ο δεύτερος. Ο φορείς αυτοί είναι κατάλληλοι για µόνιµη, καθώς και για παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε το κλωνοποιηµένο τµήµα DNA. Η µεταγραφή των τµηµάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθµιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV). Παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη, ενώ περιέχουν και γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στη νεοµυκίνη, έτσι ώστε να είναι δυνατή η επιλογή των κυττάρων στα οποία έχει γίνει η εισαγωγή του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου. Η πέψη του pcdna3-neomyc για την εισαγωγή του PGC-1- RS έγινε χρησιµοποιώντας τα ένζυµα περιορισµού XhoI και XbaI. Ο πλασµιδιακός φορέας pcdnai έχει µέγεθος 4200 bp και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών. Η µεταγραφή των τµηµάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθµιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV). Παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη. Ο πλασµιδιακός φορέας pegfp-c2 έχει µέγεθος 4700 bp και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών, ως πρωτεΐνες σύντηξης στο N-τελικό τους άκρο µε την πρωτεΐνη EGFP. H EGFP αποτελεί µια παραλλαγή της GFP (Green Fluorescent Protein) και εκπέµπει κόκκινη ακτινοβολία αντί για πράσινη. Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για µόνιµη, καθώς και για παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε το κλωνοποιηµένο τµήµα

97 DNA. Η µεταγραφή των τµηµάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθµιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV). Παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη, ενώ περιέχει και γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στη νεοµυκίνη, έτσι ώστε να είναι δυνατή η επιλογή των κυττάρων στα οποία έχει γίνει η εισαγωγή του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου. Όταν γίνεται πέψη πλασµιδιακών φορέων µε δύο ενδονουκλεάσες περιορισµού τότε γίνεται ταυτόχρονη επώαση όταν τα ένζυµα είναι συµβατά από πλευράς ρυθµιστικού διαλυµατος επώασης, ενώ σε αντίθετη περίπτωση πραγµατοποιείται διαδοχική επώαση. Στην περίπτωση αυτή πραγµατοποιείται επώαση πρώτα µε το ένα ένζυµο, ακολουθεί καθαρισµός από την πηκτή αγαρόζης και µετά επώαση µε το δεύτερο ένζυµο. Ένα πλεονέκτηµα της διαδοχικής πέψης είναι η επιβεβαίωση ότι µετά την πέψη µε το πρώτο ένζυµο, το πλασµίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραµµικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο µορφές του πλασµιδίου. Οι πληροφορίες για το κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα κάθε ενδονουκλεάσης περιορισµού δίνονται αναλυτικά στον κατάλογο της εταιρείας NEBioLabs ή της Takara, στο αντίστοιχο κεφάλαιο. Η ποσότητα των ενζύµων που χρησιµοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει µη εξειδικευµένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύµων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο µίγµα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης κυµαίνεται από 15 min έως 2 h. Για τµήµατα DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται µεγάλος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυµα περιορισµού είναι πολύ κοντά στα άκρα, µε αποτέλεσµα να δυσχεραίνεται η πέψη. Η αντίδραση λιγάσης πραγµατοποιείται µε την προσθήκη στο µίγµα αντίδρασης του τµήµατος DNA και του φορέα σε αναλογία 7:1, 1.5 µl Τ4 DNA λιγάσης (400000 U/ml, BioLabs), 2 µl 10x ρυθµιστικού διαλύµατος Τ4 DNA λιγάσης (500 mm Tris-Cl, 100 mm MgCl 2, 100 mm DTT, 10 mm ATP, 25 µg/ml BSA ph 7.5) και απιονισµένο νερό µέχρι τελικού όγκου 20 µl. Το µίγµα επωάζεται για 12-16 h σε θερµοκρασία 15 C και ακολουθεί µετασχηµατισµός των κατάλληλων σε κάθε περίπτωση κυττάρων E. coli. Η πιο πάνω αντίδραση της λιγάσης πραγµατοποιείται και απουσία του τµήµατος DNA που πρόκειται να ενσωµατωθεί στο πλασµίδιο, προκειµένου να ελεγχθεί το ποσοστό επανακυκλοποίησης του πλασµιδιακού φορέα, χωρίς την

98 παρεµβολή του ξένου DNA. Αν παρατηρηθεί µεγάλο τέτοιο ποσοστό, κρίνεται σκόπιµο να γίνει αποφωσφορυλίωση του πλασµιδίου πριν αυτό χρησιµοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Στη συγκεκριµένη εργασία, η φωσφατάση που χρησιµοποιήθηκε ήταν της εταιρείας Roche. Η αντίδραση αποφωσφορυλίωσης γίνεται για 30 min στους 37 ο C ως εξής: DNA πλασµιδιακού φορέα : 100 ng Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφατάσης 10x : 2 ή 3 µl SAP : 1 µl H 2 O : µέχρι τα 20 ή 30 µl Μετά το τέλος της επώασης, ακολουθεί απενεργοποίηση του ενζύµου στους 65 ο C για 15 min. Τελικά, το πλασµίδιο καθαρίζεται και µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Η στρατηγική για τη σύνθεση κάθε ανασυνδυασµένου πλασµιδίου περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο 2.26. 2.19. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΑ Μερικές φορές είναι απαραίτητο πριν από µια δύσκολη αντίδραση λιγάσης (π.χ. µε δύο ενθέµατα) να είναι κανείς σίγουρος ότι τα άκρα των ενθεµάτων είναι τελείως κοµµένα. Για να γίνει αυτό, τα ενθέµατα κλωνοποιούνται πρώτα σ ένα άλλο πλασµιδιακό φορέα και ακολουθεί αποµόνωση τους µετά από πέψη µε τις κατάλληλες ενδονουκλεάσες περιορισµού. Ο φορέας που χρησιµοποιήθηκε στην εργασία αυτή είναι ο pgem-t Easy (Promega). Το χαρακτηριστικό του φορέα αυτού είναι ότι έχει µία προεξέχουσα θυµίνη και στα δύο 3 άκρα του. Τα προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης της Taq πολυµεράσης έχουν από την άλλη µία προεξέχουσα αδενίνη στα 3 άκρα τους, συµπληρωµατική ως προς την προεξέχουσα θυµίνη του φορέα. Η αντίδραση έχει ως εξής: 2x Rapid Ligation Buffer : 5 µl pgem-t Easy (50ng) : 1 µl Προϊόν PCR : 3 µl T4 DNA Ligase (3 Weiss units/µl) : 1 µl

99 2.20. ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΤΥΦΛΩΝ ΑΚΡΩΝ (FILL-1N) Μερικές φορές έπειτα από κοπή µε µία ενδονουκλεάση περιορισµού που αφήνει συµπληρωµατικά άκρα είναι αναγκαία η δηµιουργία τυφλού άκρου για να γίνει µια κλωνοποίηση. Αυτό πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια της Τ4 DNA πολυµεράσης, η οποία καταλύει την µεταφορά συµπληρωµατικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων προς το προεξέχον άκρο του DNA. Η αντίδραση έχει ως εξής: BSA 0,01% DNA εκµαγείο Μίγµα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 10-20 ng 0,17 mm Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 10 x 1 µl Τ4 DNA Πολυµεράση (2-5 U/µl) 1 µl H 2 0 Έως τα 10µl Πριν προστεθεί η πολυµεράση το µίγµα θερµαίνεται στους 70 ο C για 5 min και στη συνέχεια ψύχεται απότοµα στον πάγο για 1 min. Στη συνέχεια προστίθεται η πολυµεράση και το µίγµα αφήνεται για 5 min στους 37 ο C. 2.21. ΚΑΛΛΙΕΡΓΙΕΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3), JM109, TOP-10 και TOP-10F, αναπτύσσονται σε θρεπτικό υπόστρωµα L.B., (Luria- Bertani) (Sambrook J. et al., 1989), του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: Θρεπτικό υλικό L.B. Εκχύλισµα ζύµης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 1.0 % w/v NaCl 1.0 % w/v Η ρύθµιση της οξύτητας γίνεται µε τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση µιας Atm, για 30 min. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, µε έντονη ανάδευση, χρησιµοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο.

100 Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων TOP-10 και TOP-10F γίνεται σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση φαίνεται παρακάτω: Θρεπτικό υλικό TYM Εκχύλισµα ζύµης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 2.0 % w/v NaCl 0.1 M MgSO 4 10 mm 2.22. ΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΠΙ ΕΚΤΙΚΩΝ ΣΕ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ (COMPETENT CELLS) Η τεχνική αυτή έχει ως στόχο να επάγει την επιδεκτικότητα των βακτηριακών κυττάρων να προσλάβουν τον πλασµιδιακό φορέα που περιέχει κλωνοποιηµένο το ξένο τµήµα DNA. Η µέθοδος αυτή βασίζεται στην παρατήρηση ότι βακτήρια κατεργασµένα µε διαλύµατα CaCl 2 στους 4 ο C και µε ακόλουθη θέρµανση λίγων min µπορούν να προσλάβουν DNA, το οποίο προέρχεται από διάφορες πηγές. Πολλές παραλλαγές της βασικής τεχνικής έχουν περιγραφεί και µία από αυτές χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Σύµφωνα µ αυτή 2 ml θρεπτικού υλικού L.B. (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1%) εµβολιάζονται µε βακτηριακά κύτταρα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού (15 µg/ml τετρακυκλίνη ή 20 µg/ml στρεπτοµυκίνη). Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για 12-16 h στους 37 C υπό ανακίνηση. Με 1 ml από την καλλιέργεια αυτή εµβολιάζουµε 50 ml θρεπτικού υγρού L.B. το οποίο περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό ανάλογα µε το είδος των κυττάρων που χρησιµοποιούµε. Ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C µέχρις ότου αυτή παρουσιάσει απορρόφηση Α 260 = 0.5-0.6. Η καλλιέργεια ψύχεται στον πάγο για 10 min και τα κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση για 20 min στα 3000 g, στους 4 C. Τα κύτταρα αιωρούνται σε 16 ml (που αντιστοιχούν στο 1/3 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας) ρυθµιστικού διαλύµατος που αποτελείται από 100 mm KCl, 50 mm CaCl 2, 10% γλυκερόλη και 100 mm οξικού καλίου ph 7.5 και το αιώρηµα αφήνται στον πάγο για 10 min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 20 min στα 3000 g και τα κύτταρα αιωρούνται σε 4 ml του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος (1/12.5 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Το αιώρηµα που προκύπτει µοιράζεται σε κλάσµατα των

101 200 µl και εµβαπτίζεται σε λουτρό που αποτελείται από ξηρό πάγο/αιθανόλη για µικρό χρονικό διάστηµα. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα µπορούν να διατηρηθούν στους 70 C για αρκετά µεγάλο χρονικό διάστηµα. 2.23. ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ε. COLI Ο µετασχηµατισµός κυττάρων E. coli µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο γίνεται µε τη χρήση 2 διαφορετικών τεχνικών ανάλογα µε το αν χρησιµοποιούνται κύτταρα XL1/B, BL21(DE3), TOP-10, TOP-10F ή JM109. Στην περίπτωση χρήσης βακτηριακών κυττάρων XL1/B, TOP-10F και BL21 (DE3) το αιώρηµα των επιδεκτικών βακτηρίων (200 µl) στο οποίο έχουν προστεθεί λίγα µl από το DNA που θέλουµε να εισάγουµε, αφήνεται στον πάγο για 60 min και ακολουθεί επώαση για 2 min στους 37 C. Τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα απλώνονται στην επιφάνεια τριβλίου µε θρεπτικό υλικό L.B.-άγαρ που περιέχει 100 µg/ml αµπικιλλίνη. Στην περίπτωση που χρησιµοποιούνται κύτταρα TOP-10 ή JM109 µετά την προσθήκη του DNA αφήνονται στον πάγο για 30 min και υπόκεινται σε θερµικό σοκ για 2 min στους 42 C. Ακολουθεί η προσθήκη 500 µl υγρού θρεπτικού υλικού L.B. και επώαση στους 37 C για 20 min. Μετά από φυγοκέντρηση για 1 min στα 5000 g αφαιρείται το µεγαλύτερο µέρος του υπερκειµένου και γίνεται αιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων µε το υπερκείµενο που εναποµένει. Το αιώρηµα απλώνεται µε τον ίδιο τρόπο στα τριβλία. Τα τριβλία επωάζονται στους 37 C για 12-16 h ώστε να πολλαπλασιαστούν τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα που περιέχουν τους ανασυνδιασµένους, µε το ξένο DNA, πλασµιδιακούς φορείς. Η επιλογή των µετασχηµατισµένων βακτηριακών κυττάρων γίνεται παρουσία της αµπικιλλίνης διότι οι ανασυνδυασµένοι πλασµιδιακοί φορείς περιέχουν το γονίδιο αντίστασης στο αντιβιοτικό αυτό. Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια των τριβλίων συλλέγονται η καθεµία χωριστά και αναπτύσσονται εκ νέου σε υγρό θρεπτικό µέσο L.B./αµπικιλλίνης ώστε είτε να αποµονώσουµε το πλασµιδιακό DNA, είτε να προχωρήσουµε σε έκφραση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης.

102 2.24. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ DNA ΜΕ ΑΛΚΑΛΙΚΗ ΛΥΣΗ Η αποµόνωση και ο καθαρισµός του πλασµιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα περιλαµβάνει τρία στάδια: την ανάπτυξη της µεταµορφωµένης βακτηριακής καλλιέργειας, τη συλλογή και λύση των κυττάρων και το καθαρισµό του πλασµιδιακού DNA. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας γίνεται µε επώαση των βακτηρίων στους 37 C για 16 h σε υγρό θρεπτικό µέσο L.B., παρουσία του αντιβιοτικού αµπικιλλίνη (100 µg/ml). Η συλλογή των βακτηριακών κυττάρων γίνεται µε φυγοκέντρηση στα 4000 g για 10 min και ακολουθεί η αλκαλική λύση τους σύµφωνα µε τα εξής: Το ίζηµα των κυττάρων αιωρείται σε 200 µl διαλύµατος GTE (50 mm γλυκόζη, 25 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) και στο αιώρηµα προστίθεται ο διπλάσιος όγκος (400 µl) διαλύµατος 0.2 Ν NaOH, 1% SDS. Το µίγµα οµογενοποιείται µε απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 min σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Ακολουθεί προσθήκη 300 µl ψυχρού διαλύµατος 3 Μ οξικού καλίου και φυγοκέντρηση στα 12000 g για 5 min. Στο υπερκείµενο που παραλαµβάνεται γίνεται κατακρήµνιση του DNA µε την προσθήκη 0.7 όγκου ισοπροπανόλης και παραµονή στους -20 C για 30 min. Το ίζηµα που προκύπτει, αιωρείται σε 100 µl διαλύµατος ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) παρουσία RNase A (20 µg/ml) και το διάλυµα επωάζεται στους 37 C για 20 min. Το DNA εκχυλίζεται µε την προσθήκη 1 όγκου φαινόλης/χλωροφορµίου/ισοαµυλικής αλκοόλης σε αναλογία 25:24:1. Στην υδατική στοιβάδα που αποµονώνεται µετά από φυγοκέντρηση στα 12000 g για 5 min, γίνεται κατακρήµνιση του DNA µε την προσθήκη 2.5 όγκων απόλυτης αιθανόλης παρουσία οξικού αµµωνίου. Το DNA διαλύεται τελικά σε 20 µl αποστειρωµένου ddh 2 O και φυλάσσεται στους -20 C µέχρι τη χρησιµοποίηση του. 2.25. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ DNA ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΤΟ KIT QIAGEN-TIP 500 Για την αποµόνωση και καθαρισµό πλασµιδιακού DNA µε το kit Qiagen-tip 500 ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο: Βακτηριακή καλλιέργεια 500 ml L.B. που περιέχει αµπικιλλίνη (100 µg/ml) αφήνεται να αναπτυχθεί για 16 h στους 37 C και τα κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση στα 5000 g για 10 min. Το ίζηµα που αποµένει µετά από την απόχυση του υπερκειµένου αιωρείται σε 10 ml διαλύµατος Ρ1

103 (50 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0) στο οποίο έχουµε προσθέσει 100 µg/ml RNase A και στη συνέχεια προστίθεται 10 ml διαλύµατος Ρ2 (200 mm NaOH, 1% SDS) µε απαλή ανάδευση ώστε να καταστεί οµογενές. Μετά από παραµονή 5 min σε θερµοκρασία περιβάλλοντος προστίθενται 10 ml ψυχρού διαλύµατος P3 (3 M οξικό κάλιο ph 5.5) και µετά από απαλή ανακίνηση αφήνεται για 20 min στους 4 C. Η φυγοκέντρηση που ακολουθεί διαρκεί 30 min στα 10000 g ενώ συγχρόνως γίνεται και η εξισορρόπηση της στήλης tip 500 µε 10 ml διαλύµατος QBT (750 mm NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, 0.15% Triton X-100, ph 7.0). Το υπερκείµενο της φυγοκέντρησης αφού αποµακρυνθεί µε προσοχή από το σωλήνα φυγοκέντρησης ώστε να µην παραληφθεί συγχρόνως και το κολλώδες ίζηµα, διαβιβάζεται από τη στήλη tip 500. Μετά τη διέλευση του υπερκειµένου από τη στήλη, γίνεται πλύση της στήλης, δύο φορές, µε 30 ml διαλύµατος QC (1.0 M NaCl, 50 mm MOPS, 15% αιθανόλη, ph 7.0), ώστε να αποµακρυνθούν τυχόν προσµίξεις από την προηγούµενη κατεργασία. Η έκλουση του DNA γίνεται µε τη διέλευση διαλύµατος QF (1.25 Μ NaCl, 50 mm Tris-ΗCl, 15% αιθανόλη, ph 8.5). Αφού συλλεχθεί το σύνολο του παραπάνω διαλύµατος γίνεται κατακρήµνιση του DNA προσθέτοντας 0.7 όγκους ισοπροπανόλης και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 10000 g για 30 min. Μετά από προσεκτική απόχυση του υπερκειµένου γίνεται µια σύντοµη πλύση µε 5 ml 70% αιθανόλη και το ίζηµα που παραλαµβάνεται µετά από νέα φυγοκέντρηση στα 10000 g διαλύεται σε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΕ (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0). Η περιεκτικότητα του διαλύµατος σε DNA προσδιορίζεται µε µέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm και το παρασκεύασµα φυλάσσεται στους -20 C. 2.26. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΤΩΝ ΑΝΑΣΥΝ ΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΛΑΣΜΙ ΙΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΣΤΗN ΠΑΡΟΥΣΑ ΕΡΓΑΣΙΑ pgex-2t-p53 To γονίδιο του p53 µας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Αναπληρωτή Καθηγητή. Καρδάση (Ιατρικό Τµήµα, Πανεπιστήµιο Κρήτης), κλωνοποιηµένο στον πλασµιδιακό φορέα pcdna3/ha. Για την έκφραση του ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST έγινε αποµόνωση του γονιδίου από τον πλασµιδιακό φορέα pcdna3/ha µετά από πέψη µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού EcoRI και BamHI. Η αποµόνωση του ενθέµατος έγινε µε εκχύλιση µετά από ηλεκτροφόρηση του σε πηκτή αγαρόζης. Ακολούθησε κλωνοποίηση στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t που είχε προηγουµένως κοπεί µε

104 τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισµού. Η αντίδραση της κοπής έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής αναφέρονται παρακάτω: EcoR I (20 U/µl) : 5 U BamH I (20 U/µl) : 5 U pgex-2t/p53 : 10 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10 x είναι : 500 mm NaCl, 1 M Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 0,25% Triton X-100. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού EcoRI. pgex-4t-1-p2p-r(442-585) Το τµήµα της πρωτεΐνης P2P-R που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 442 έως 585 κλωνοποιήθηκε στον πλασµιδιακό φορέα pgex-4t-1 ώστε να εκφραστεί ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε περιλαµβάνει την κοπή του γονιδίου (που µας παραχωρήθηκε από τον Dr. Scott στο φορέα pcmv- FLAG TM -24) και του πλασµιδιακού φορέα µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού EcoRI και SalI, καθαρισµός των επιθυµητών τµηµάτων DNA µε εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης και αντίδραση λιγάσης. Η αντίδραση της κοπής έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής αναφέρονται παρακάτω: EcoRI (20 U/µl) : 5 U SalI (20 U/µl) : 5 U pgex-4t-1/ P2P-R : 10 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι: 500 mm NaCl, 1 M Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 0,25% Triton X-100. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού EcoRI. pcdna3-neomyc-pgc-1- RS Για να αποκοπεί η περιοχή πλούσια σε RS διπεπτίδια (νουκλεοτίδια 1695-1877) από το γονίδιο του PGC-1 ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία. Για τον πολλαπλασιασµό του τµήµατος από την αρχή του γονιδίου µέχρι την αρχή της RS

105 περιοχής (νουκλεοτίδια 1-1694) πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5' CATTCTCGAGCAATGGCGTGGGA CATGTGCAAC 3' (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού XhoI) και ως αντινοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5' TCCCCCGAGCATCCTTT GGGGTCTTTGAGAAAA 3' (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού AvaI). Οι συνθήκες της PCR ήταν οι ακόλουθες: Θερµ. Χρόνος Θερµ. αποδιάταξ αποδιάταξη Υβριδισµού ης ς 94 ο C 40 sec 63/61/59 ο C Χρόνος Υβριδισµού 30/30/30 sec Θερµ. πολυµερισµ ού Χρόνος πολυµερισµ ού Κύκλοι 72 ο C 100 sec 10/10/ 10 Για τον πολλαπλασιασµό του τµήµατος από το τέλος της RS περιοχής έως το τέλος του γονιδίου (νουκλεοτίδια 1878-2393) πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5' TCCCTCGGGCCCTACAGCCGTCG GCCCAGG 3' (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού ΑvaI) και ως αντινοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5' GCTCTAGACCTGCGCAAGC TTCTCTGAGCTTC3' (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού XbaI). Οι συνθήκες της PCR ήταν οι ακόλουθες: Θερµ. αποδιάταξ ης Χρόνος αποδιάταξη ς Θερµ. Υβριδισµού 94 ο C 40 sec 61/59/57 ο C Χρόνος Υβριδισµού 30/30/30 sec Θερµ. πολυµερισµ ού Χρόνος πολυµερισµ ού Κύκλοι 72 ο C 50 sec 10/10/ 10 Τα δύο προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν και στη συνέχεια αποµονώθηκαν µε εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης. Ακολούθησε ΤΑ κλωνοποίηση στον πλασµιδιακό φορέα pgemteasy, µετασχηµατισµός JM109 Ecoli κυττάρων και επιλογή των θετικών κλώνων. Το πρώτο ένθεµα αποµονώθηκε από τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pgemteasy µετά από σταδιακή πέψη µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού XhoI, και AvaI. Οι δύο αντιδράσεις πέψης έγιναν στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: Xho I (20 U/µl) : 5 U PGC-1(1-1694) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl H 2 O : έως 20 µl

106 Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι: 1000 mm NaCl, 500 mm Tris- HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Ava I (20 U/µl) : 5 U PGC-1-(1-1694) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl H 2 O : έως 20µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι: 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Το δεύτερο τµήµα DNA αποµονώθηκε από τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pgemteasy µετά από διαδοχική πέψη µε τις ενδονουκλεαάσες περιορισµού XbaI και AvaI. Οι δύο αντιδράσεις πέψης έγιναν στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: XbaI (20 U/µl) : 5 U Ava I (20 U/µl) : 5 U PGC-(1878-2393) : 5 µg PGC-(1878-2393) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl H 2 O : έως 20 µl H 2 O : έως 20 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x και στις δύο περιπτώσεις είναι: 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Τα δύο προϊόντα κοπής αποµονώθηκαν µε εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης. Στη συνέχεια ο πλασµιδιακός φορέας pcdna3-neomyc κόπηκε µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού XbaI και XhoI. Η αντίδραση της κοπής έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής αναφέρονται παρακάτω: XhoI (20 U/µl) : 5 U XbaI (20 U/µl) : 5 U pcdna3-neomyc : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x και στις δύο περιπτώσεις είναι: 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού XbaI. Ο γραµµικός πλασµιδιακός φορέας αποµονώθηκε µε εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε τριπλή αντίδραση λιγάσης µεταξύ του pcdna3-

107 neomyc που είχε υποστεί πέψη και των δύο τµηµάτων DNA που αποµονώθηκαν από τους pgemteasy, µετασχηµατισµός Top10 E. coli κυττάρων, αποµόνωση των θετικών κλώνων και παρασκευή DNA σε µεγάλη κλίµακα. pgex-2t-pgc-1- RS Χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο τον pcdna3-neomyc-pgc- RS πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5' CGCGGATCCATGGCGTGGGACATGTGCAAC 3' (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού BamHI) και ως αντινοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5' CCCGGAATTCCCTGCGCAAGCTTCTCTGAG 3'. Οι συνθήκες της PCR ήταν οι ακόλουθες: Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Κύκλοι αποδιάταξ αποδιάταξη Υβριδισµού Υβριδισµού πολυµερισµ πολυµερισµ ης ς ού ού 94 ο C 40 sec 57 ο C 30 sec 72 ο C 100 sec 30 Το προϊόν της PCR ηλεκτροφορήθηκε και στη συνέχεια αποµονώθηκε µε εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης. Ακολούθησε ΤΑ κλωνοποίηση στον πλασµιδιακό φορέα pgemteasy. Στη συνέχεια κόπηκε το 3 άκρο του ενθέµατος µε το ένζυµο περιορισµού SpeI (που βρίσκεται στη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης του πλασµιδιακού φορέα). Η αντίδραση της κοπής έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: Spe I (20 U/µl) : 5 U PGC-1- RS : 10 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι : 500 mμ ΝaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.9, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Το DNA της παραπάνω αντίδρασης καθαρίστηκε µε φαινόλη, κατακρηµνίστηκε και επαναιωρήθηκε σε 12 µl νερού. Ακολούθησε κατεργασία µε τη Τ4 DNA πολυµεράση (έγιναν δύο ξεχωριστές αντιδράσεις) στους 37 ο C για 5 min προκειµένου να δηµιουργηθεί τυφλό άκρο, σύµφωνα µε την παρακάτω διαδικασία: Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι : 660 mμ AcOK, 330 mm Trisacetate ph 7.9, 100 mm (AcO) 2 Mg, 5 mm DTT.

108 BSA (0,1%) 1 µl DNA εκµαγείο 3 µg (6 µl) Μίγµα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps 1.7 mm) 1 µl Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 10 x 1 µl Τ4 DNA Πολυµεράση (2-5 U/µl) 1 µl Τελικός όγκος 10 µl Μετά το πέρας της αντίδρασης ακολούθησε καθαρισµός και κοπή του 5 άκρου του ενθέµατος µε την ενδονουκλεάση περιορισµού BamHI. Η αντίδραση της πέψης έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι εξής: BamH I (20 U/µl) : 5 U PGC-1- RS : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι : 1.5 Μ ΝaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.9, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t κόπηκε αρχικά µε την ενδονουκλεάση SmaI ακολούθησε καθαρισµός και στη συνέχεια πέψη µε την BamHI. Οι δύο αντιδράσεις πέψης έγιναν στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: Sma I (20 U/µl) : 5 U BamH I (20 U/µl) : 5U pgex-2t : 5 µg pgex-2t : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl H 2 O : έως 20 µl H 2 O : έως 20 µl Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x στην περίπτωση πέψης µε την Sma I είναι: 660 mm AcOK, 330 mm Tris-acetate ph 7,9, 100 mm (AcO) 2 Mg, 5 mm DTT, ενώ στην περίπτωση πέψης µε την BamH I είναι: 1.5 Μ ΝaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.9, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Ακολούθησε αντίδραση λιγάσης, µετασχηµατισµός TOP10F E. coli κυττάρων, εύρεση των θετικών κλώνων και αποµόνωση DNA σε µεγάλη κλίµακα.

109 pcmv-flag TM -24-P2P-R(1-760) Για τον πολλαπλασιασµό του τµήµατος του γονιδίου P2P-R που κωδικοποιεί την περιοχή µεταξύ των αµινοξέων 1 έως 760 πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 TATGATGGAAGTGAAAGATCCTAAC 3 και αντινοηµατικό το ολιγονουκλεοτίδιο 5 GCTCTAGATGGCTCATCCCT AACAGGTGTTGC 3, που περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλάση περιορισµού XbaI. Οι συνθήκες της PCR ήταν οι εξής: Θερµ. αποδιάταξ ης Χρόνος αποδιάταξη ς Θερµ. Υβριδισµού Χρόνος Υβριδισµού Θερµ. πολυµερισµ ού Χρόνος πολυµερισµ ού 94 ο C 40 sec 57 ο C 30 sec 72 ο C 90 sec 30 Κύκλοι Το προϊόν της αντίδρασης αποµονώθηκε µε εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης, και ακολούθησε πέψη µε την ενδονουκλεάση περιορισµού XbaI. Η αντίδραση της κοπής έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: XbaI (20 U/µl) : 5 U P2P-R(1-760) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2 µl H 2 O : έως 20 µl To 10x ρυθµιστικό διάλυµα περιέχει: 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Στη συνέχεια έγινε αποµόνωση του ενθέµατος σε πηκτή αγαρόζης. Ο φορέας pcmv-flag TM -24 κόπηκε µε τα ένζυµα EcoRV και XbaI. Η αντίδραση της πέψης έγινε στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι εξής: EcoRV (20 U/µl) : 5U XbaI (20 U/µl) : 5U PCMV-FLAG TM -24 : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : µέχρι 30 µl

110 To 10x ρυθµιστικό διάλυµα περιέχει 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10mM DTT. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού XbaI. Ακολούθησε αντίδραση λιγάσης, µετασχηµατισµός TOP10F E. coli κυττάρων, εύρεση των θετικών κλώνων και αποµόνωση DNA σε µεγάλη κλίµακα. pcmv-flag TM -24-P2P-R(761-1560) Για τον πολλαπλασιασµό του τµήµατος του γονιδίου P2P-R που κωδικοποιεί την περιοχή µεταξύ των αµινοξέων 1 έως 760 πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 CGGAATTCAATGGACGCAGA ATCGATCACTTTC 3 (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού EcoRI) και ως αντινοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 - GCTCTAGACACAGTGACAGATCTCACTTTTTG 3 (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού XbaI). Οι συνθήκες της PCR ήταν οι εξής: Θερµ. αποδιάταξ ης Χρόνος αποδιάταξη ς Θερµ. Υβριδισµού Χρόνος Υβριδισµού Θερµ. πολυµερισµ ού Χρόνος πολυµερισµ ού Κύκλοι 94 ο C 40 sec 59/57 ο C 30/30 sec 72 ο C 90 sec 15/15 O φορέας pcmv-flag TM -24 και το προϊόν της PCR κόπηκαν µε τα ένζυµα EcoRI και XbaI. Οι δύο αντιδράσεις πέψης έγιναν στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: EcoRI (20 U/µl) : 5 U XbaI (20 U/µl) : 5U pcmv-flag TM -24/P2P-R(761-1560) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Το ρυθµιστικό διάλυµα 10x περιέχει 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10mM DTT. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού XbaI. Τα προϊόντα των δύο αντιδράσεων έτρεξαν σε πηκτή αγαρόζης και οι DNA ζώνες που αντιστοιχούσαν στα σωστά µοριακά βάρη αποµονώθηκαν, καθαρίστηκαν και στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε αντίδραση λιγάσης µεταξύ του πλασµιδιακού φορέα και

111 του ενθέµατος. Ακολούθησε µετασχηµατισµός TOP10F E. coli κυττάρων, εύρεση των θετικών κλώνων και αποµόνωση DNA σε µεγάλη κλίµακα. pcmv-flag TM -24-P2P-R(1156-1560) Για τον πολλαπλασιασµό του τµήµατος του γονιδίου P2P-R που κωδικοποιεί την περιοχή µεταξύ των αµινοξέων 1 έως 760 πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 CGGAATTCGCAGCACGAGC TCAGGAGCTCAAAG 3 (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού EcoRI) και ως αντινοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 GCTCTAGACACAGTGACAGATCTCACTTTTTG 3 (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού XbaI). Οι συνθήκες της PCR ήταν οι εξής: Θερµ. αποδιάταξ ης Χρόνος αποδιάταξη ς Θερµ. Υβριδισµού Χρόνος Υβριδισµού Θερµ. πολυµερισµ ού Χρόνος πολυµερισµ ού 94 ο C 40 sec 57 ο C 30 sec 72 ο C 70 sec 30 Κύκλοι O φορέας pcmv-flag TM -24 και το προϊόν της PCR κόπηκαν µε τα ένζυµα EcoRI και XbaI. Οι δύο αντιδράσεις πέψης έγιναν στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: EcoRI (20 U/µl) : 5 U XbaI (20 U/µl) : 5 U pcmv-flag TM -24/P2P-R(1156-1560) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Το ρυθµιστικό διάλυµα 10x περιέχει 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού XbaI. Ακολούθησε αποµόνωση του πλασµιδιακού φορέα και του ενθέµατος P2P-R(1156-1560) από πηκτή αγαρόζης αντίδραση λιγάσης, µετασχηµατισµός TOP10F E. coli κυττάρων, εύρεση των θετικών κλώνων και αποµόνωση DNA σε µεγάλη κλίµακα.

112 pcmv-flag TM -24-P2P-R(1314-1560) Για τον πολλαπλασιασµό του τµήµατος του γονιδίου P2P-R που κωδικοποιεί την περιοχή µεταξύ των αµινοξέων 1 έως 760 πραγµατοποιήθηκε PCR χρησιµοποιώντας ως νοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 - CGGAATTCTCATAAAGCCC CCTACGAAACTAAA -3 (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού EcoRI) και ως αντινοηµατικό εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο 5 - GCTCTAGACACAGTGACAGATCTCACTTTTTG-3 (περιέχει θέση κοπής για την ενδονουκλεάση περιορισµού XbaI). Οι συνθήκες της PCR ήταν οι εξής: Θερµ. αποδιάταξ ης Χρόνος αποδιάταξη ς Θερµ. Υβριδισµού Χρόνος Υβριδισµού Θερµ. πολυµερισµ ού Χρόνος πολυµερισµ ού Κύκλοι 94 ο C 40 sec 59/57 ο C 30/30 sec 72 ο C 90 sec 15/15 O φορέας pcmv-flag TM -24 και το προϊόν της PCR κόπηκαν µε τα ένζυµα EcoRI και XbaI. Οι δύο αντιδράσεις πέψης έγιναν στους 37 ο C για 1 h. Οι συνθήκες κοπής ήταν οι ακόλουθες: EcoRI (20 U/µl) : 5U XbaI (20 U/µl) : 5 U pcmv-flag TM -24/P2P-R(1314-1560) : 5 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 3 µl H 2 O : έως 30 µl Το ρυθµιστικό διάλυµα 10x περιέχει 500 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 10mM DTT. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού XbaI. Ακολούθησε αποµόνωση του πλασµιδιακού φορέα και του ενθέµατος P2P-R(1314-1560) από πηκτή αγαρόζης αντίδραση λιγάσης, µετασχηµατισµός TOP10F E. coli κυττάρων, εύρεση των θετικών κλώνων και αποµόνωση DNA σε µεγάλη κλίµακα.

113 2.27. ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΥΝΤΗΞΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗ ΤΗΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GST) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την έκφραση των πρωτεϊνών σε βακτηριακά κύτταρα µε υψηλή απόδοση και τον εύκολο διαχωρισµό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισµα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν κλωνοποιούνται σε πλασµιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο µόριο τους κατάλληλους προαγωγούς που επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης µ αυτήν. Ο καθαρισµός της πρωτεΐνης σύντηξης γίνεται µε στήλη αγχιστείας που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωµένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Έτσι ο διαχωρισµός της πρωτεΐνης από το εκχύλισµα γίνεται δυνατός χάρη στην αλληλεπίδραση της GST µε τη γλουταθειόνη, µε αποτέλεσµα την καθήλωση της στους κόκκους της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης γίνεται µε την προσθήκη διαλύµατος γλουταθειόνης σε περίσσεια. Η διαδικασία αυτή έκλουσης εκτός του ότι επιτρέπει την εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, έχει το πλεονέκτηµα να γίνεται σε πολύ ήπιες συνθήκες χωρίς να υπάρχει κίνδυνος αλλαγών στη δοµή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης. Συγκεκριµένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν µε τον τρόπο αυτό είναι ο p53, o PGC-1- RS, o PGC-1, o P2P-R(442-585) και o SAF-B-PC (το τµήµα του SAF-B1 που περικλείεται από τα αµινοξέα 582 έως 875). Ο πλασµιδιακοί φορείς στούς οποίους είναι κλωνοποιηµένα τα παραπάνω γονίδια είναι οι pgex-2t, pgex-4t-3 και pgex-4t-1 αντίστοιχα, που φέρουν το γονίδιο της GST. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή σε όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα (XL1/B- BL21(DE3)-TOP-10F) που έχουν µεταµορφωθεί µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα απλώνονται σε τριβλία µε θρεπτικό υλικό L.B./άγαρ που περιέχει 100 µg/ml αµπικιλλίνη και επωάζονται για 16 h στους 37 C. Με επιλογή µιας αποικίας από το τριβλίο, εµβολιάζονται 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού L.B. (100 µg/ml αµπικιλλίνη) και το αιώρηµα επωάζεται υπό ανάδευση για 16 h στους 37 C. Από την καλλιέργεια που προκύπτει αφαιρούνται 10 ml µε τα οποία εµβολιάζονται 500 ml θρεπτικού υλικού L.B. που περιέχουν 100 µg/ml αµπικιλλίνη. Η καλλιέργεια επωάζεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C µέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήµατος των κυττάρων γίνει ίση µε Α 590 =0.6-0.7. Τη δεδοµένη χρονική στιγµή γίνεται προσθήκη 5 mm IPTG που ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε

114 σχέση µε τις άλλες βακτηριακές πρωτεΐνες, καθώς και ελάττωση της θερµοκρασίας επώασης στους 28 C ώστε να περιοριστούν τυχόν δράσεις πρωτεολυτικών ενζύµων. Η επώαση συνεχίζεται για 1,5 h (P2P-R(442-585), 2 h (p53), 3 h (SAF-B-PC) ή 4 h (PGC-1 και PGC-1- RS) και τα κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση στις 4000 για 15 min. Μετά την απόχυση του υπερκειµένου το ίζηµα των κυττάρων αιωρείται σε 8 ml διαλύµατος PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, 1% Triton X-100, 0.1% β-µερκαπταιθανόλη, 1 mm PMSF). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων υποβάλλοντας το αιώρηµα σε υπέρηχους (UP5OH sonicator) για 5 χρονικά διαστήµατα των 20 δευτερολέπτων, µεσολαβώντας κάθε φορά, µία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρµανση. Το αιώρηµα φυγοκεντρείται για 20 min στα 8500 g και λαµβάνεται το υπερκείµενο πρωτεϊνικό εκχύλισµα. Το εκχύλισµα αυτό αναµιγνύεται µε το αιώρηµα των κόκκων της στήλης και αναδεύεται για 30 min σε θερµοκρασία 4 C, ώστε να δεσµευτεί η πρωτεΐνη σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 min στα 3000 g και αφού αποµακρυνθεί το υπερκείµενο, η στήλη πλένεται 3 φορές µε διάλυµα PBST για 10 min στους 4 C υπό ανάδευση. Στους κόκκους της στήλης που λαµβάνονται µετά από φυγοκέντρηση στα 3000 g για 2 min, γίνονται 2 συνεχόµενες εκλούσεις των 5 min η κάθε µία µε διάλυµα που περιέχει 10 mm γλουταθειόνη και 50 mm Tris-Cl ph 8.0. Τα εκλούσµατα που περιέχουν την πρωτεΐνη σύνηξης λαµβάνονται µε φυγοκέντρηση στα 3000 g για 2 min και στη συνέχεια φυλάσσονται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης µετά από κάθε χρήση αναγεννάται µε τρείς διαδοχικές πλύσεις (30 min η κάθε πλύση) σε όξινο (0.1 M CH 3 COONa, 0.5 M NaCl, ph 4.5) και βασικό (0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-Cl, ph 8.5) διάλυµα, στους 4 C. Στη συνέχεια η στήλη εξισορροπείται και φυλάσσεται σε διάλυµα PBST. 2.28. ΠΑΡΟ ΙΚΗ ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Η µέθοδος αυτή χρησιµοποιείται για την εισαγωγή πλασµιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών και την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων ως πρωτεΐνες σύντηξης µε χαρακτηριστικές αλληλουχίες που είναι εύκολα ανιχνεύσιµες. Η παροδική επιµόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή µίξη του πλασµιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυµα CaCl 2 µε ρυθµιστικό διάλυµα HEPES που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσµα της ανάµιξης είναι η δηµιουργία

115 κατακρηµνισµάτων DNA µε φωσφορικό ασβέστιο. Το κατακρηµνίσµατα αυτά διαπερνούν την κυτταροπλασµατική µεµβράνη πιθανώς µε ενδοκύττωση. Η µέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις µεταβολές του ph (βέλτιστο ph 6.9-7.2) καθώς και στην καθαρότητα του DNA (τα εµπορικά kit καθαρισµού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρµογή της µεθόδου). Τα χαρακτηριστικά της µεθόδου είναι η εντόπιση του κλωνοποιηµένου πλασµιδιακού φορέα εκτός του γενώµατος των κυττάρων, καθώς και η ανίχνευση και παραµονή του προϊόντος του κλωνοποιηµένου γονιδίου για χρονικό διάστηµα 1-4 ηµερών. Επίσης σε κάθε κυτταρική διαίρεση µόνο τα µισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασµιδιακού DNA µε το οποίο είχαν επιµολυνθεί. Σχήµα 2.1. Σχηµατική αναπαράσταση της παροδικής επιµόλυνσης κυττάρων Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν τα ανθρώπινα 293Τ για υπερέκφραση πρωτεϊνών. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιµόλυνση πρέπει να καταλαµβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλίου. Το διάλυµα του DNA µε το CaCl 2 (250 mm CaCl 2, 20 µg/ml πλασµιδιακού DNA, από τα οποία τα 10 µg/ml περιλαµβάνουν το δραστικό κλάσµα του DNA που φέρει το κλωνοποιηµένο γονίδιο) προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθµιστικού διαλύµατος HEPES-φωσφορικών (136

116 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na 2 HPO 4 ph 7.1), το µίγµα αναδεύεται απαλά και αφήνεται για 20-30 min, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήµνιση του DNA µε το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως αποµακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1 ml του αιωρήµατος DNAφωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τριβλίο της καλλιέργειας. Τα τριβλία αφήνονται για 20 min µε παροδική ανακίνηση κάθε 10 min. Στο τριβλίο προστίθενται 4 ml DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)/10% v/v FCS (Fetal Calf Serum- Εµβρυϊκός ορός βοδιού) µε 5 µl χλωροκίνη (0.1 M) η οποία αναστέλλει τα ένζυµα που διασπούν το DNA, καθώς και µίγµα αντιβιοτικών που αναστέλλει την ανάπτυξη µυκήτων και µικροβίων. Τα τριβλία αφήνονται για επώαση στους 37 C παρουσία CO 2. Μετά το πέρας 4 h τα 5 ml του υγρού όπου έγινε η επιµόλυνση αφαιρούνται και προστίθενται εκ νέου 10 ml από το θρεπτικό υγρό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί µε επώαση στους 37 C σε ατµόσφαιρα CO 2 για 24 h και ακολουθεί ακόµη ένας κύκλος αφαίρεσης-προσθήκης θρεπτικού µέσου και επώασης για άλλες 24 h. Με τη συµπλήρωση συνολικά 48 h από τη στιγµή της επιµόλυνσης τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό µέσο ανάπτυξης. Ακολούθως προσθέτουµε 200 µl στο τριβλίο των 100 mm από το ρυθµιστικό διάλυµα λύσης των κυττάρων (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7.5, 150 mm NaCl, 10 µg/ml απροτινίνη και 1 mm PMSF) και τα κύτταρα αφαιρούνται από την επιφάνεια του τριβλίου µε τη βοήθεια σπάτουλας. Όταν πρόκειται να µελετηθούν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας (P2P-R και SAF-B1) τα κύτταρα λύνονται σε διάλυµα RIPA (1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 0,1 % SDS, 150 mm NaCl, 10 mm Na-phosphate ph 7,2, 2 mm EDTA, 50 mm NaF, 5 mm b-glycerolphosphate, 4 mm sodium orthovanadate, 1mM DTT, 1mM PMSF, 20 µg/ml aprotinine). Τα κύτταρα αφήνονται σε αιώρηση για 30 min στους 4 C στο διάλυµα λύσης και κατόπιν διαβιβάζονται συνεχόµενα µέσα από σύριγγα πολύ στενής διαµέτρου, ώστε να διαρρηχθούν εντελώς οι κυτταρικές µεµβράνες αλλά και το χρωµοσωµκό DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 12000 g για 15 min στους 4 C και συλλογή του υπερκειµένου. Το κυτταρικό εκχύλισµα φυλάσσεται στους 70 C και η ανίχνευση της παραγόµενης πρωτεΐνης γίνεται µε ηλεκτροφόρηση 10 µl από το εκχύλισµα, κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου και ανοσοανίχνευση µε το κατάλληλο αντίσωµα.

117 Στα πειράµατα µελέτης της µεταγραφής στα HepG2 και MCF-7 κύτταρα χρησιµοποιήθηκε µία κάπως τροποποιηµένη διαδικασία η οποία περιγράφεται αναλυτικά στη παράγραφο 2.30. 2.29. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑ ΑΣ (T.L.C.) Η χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας επιτρέπει το διαχωρισµό µικρών µορίων (αµινοξέα, πεπτίδια, νουκλεοτίδια κ.α.) ενός µίγµατος ουσιών, τα οποία αναλύονται καθώς κινούνται µε διαφορετική ταχύτητα µέσα στη λεπτή στοιβάδα που δηµιουργούν οι κόκκοι ενός προσροφητικού µέσου (κυτταρίνη, αλουµίνα, διοξείδιο του πυριτίου) το οποίο διαβρέχεται από έναν κινούµενο διαλύτη. Η διαφορά στην ταχύτητα που παρουσιάζουν τα µόρια οφείλεται στη διαφορετική κατανοµή τους µεταξύ της στατικής και της κινούµενης φάσης λόγω των διαφορών τους στο µέγεθος και στην πολικότητα τους (ως στατική φάση θεωρείται το νερό προσροφηµένο στο µέσο, ενώ ως κινούµενη φάση οι υπόλοιποι διαλύτες). Ο λόγος της απόστασης που διανύει κάθε συστατικό προς την απόσταση που διανύει ο διαλύτης συµβολίζεται Rf και αποτελεί σταθερή παράµετρο κάθε ουσίας που χρωµατογραφείται σε σταθερές συνθήκες. Κατά τη διάρκεια της εργασίας η µέθοδος χρησιµοποιήθηκε για τη µελέτη της µεταγραφικής ενεργότητας µε τη δοκιµασία της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραµφαινικόλης (CAT assay). Το προσροφητικό µέσο που χρησιµοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις ήταν πλάκες επικαλυµµένες µε πυρίτιο (Silica Gel IB2 Bakerflex). 2.30. AΝΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ 2.30.1 ΟΚΙΜΑΣΊΑ β-γαλακτοσι ΑΣΗΣ (β-gal ASSAY) Κατά τη διάρκεια της παροδικής επιµόλυνσης προστίθεται το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcmv β-gal, στο οποίο η έκφραση του γονιδίου της β-γαλακτοσιδάσης βρίσκεται υπό τον έλεγχο του προαγωγού του κυτταροµεγαλοϊού CMV. Ο προσδιορισµός της δραστικότητας της β-γαλακτοσιδάσης στα κυτταρικά εκχυλίσµατα χρησιµοποιείται ως εσωτερικός µάρτυρας στα πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης, µε σκοπό την εξοµάλυνση των διαφορών που παρατηρούνται µεταξύ των κυττάρων ως

118 προς την ικανότητα επιµόλυνσης. Πρόκειται για µία χρωµοφόρο αντίδραση που χρησιµοποιεί ως υπόστρωµα το ONPG (Ο-Nitrophenyl-β-D-GalactoPyranoside), το οποίο διασπάται από το ένζυµο της β-γαλακτοσιδάσης. Η ένταση του χρώµατος προσδιορίζει και την ποσότητα του ενζύµου στο κυτταρικό εκχύλισµα (Edlund et al., 1985). Η ποσότητα της β-γαλακτοσιδάσης χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό της απόδοσης της επιµόλυνσης και συνυπολογίζεται για την εξοµάλυνση της σχετικής δραστικότητας CAT (relative CAT activity) ή luciferase (relative luciferase units). Η ενζυµική αντίδραση πραγµατοποιείται σε όγκο 100 µl και περιλαµβάνει: 22 µl ONPG (4 mg/ml), 1 µl Mg-buffer (1 M KCl, 10 mm MgCl 2, 5 M β- mercaptoethanol), 57 µl 0,1 M Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4, ph 7,3, 10 µl 0,25 M Tris-HCl ph 7,8 και 10 µl κυτταρικού εκχυλίσµατος. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 20 min. Στη συνέχεια προστίθενται 40 µl 1 M Na 2 CO 3 για διακοπή της αντίδρασης. Τα 100 µl µεταφέρονται σε δισκία 96 οπών και οι µετρήσεις γίνονται στα 410 nm σε φασµατοφωτόµετρο τύπου ELISA (microplate Autoreader EL311, Bio-Tek instruments). Στη φωτοµέτρηση χρησιµοποιείται ως τυφλό ένα δείγµα το οποίο δεν περιέχει κυτταρικό εκχύλισµα. Οι αντιδράσεις γίνονται δύο φορές για κάθε δείγµα. 2.30.2 ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΧΛΩΡΑΜΦΑΙΝΙΚΟΛΗΣ (CAT ASSAY) Στα πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης η δραστικότητα του ενζύµου CAT (Chloramphenicol AcetylTransferase- Ακετυλοτρανσφεράση της χλωραµφαινικόλης) χρησιµοποιείται ως µέτρο ένδειξης της ενεργότητας του υποκινητή, ο οποίος είναι κλωνοποιηµένος ανοδικά του γονιδίου αναφοράς CAT. Στον υποκινητή προσδένεται ο ενδογενής µεταγραφικός παράγοντας HNF-4α, ενεργοποιώντας τη µεταγραφή του γονιδίου αναφοράς, οπότε ο βαθµός έκφρασης του ενζύµου CAT αναλογεί στην µεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α. Η µέθοδος στηρίζεται στο γεγονός ότι το ένζυµο CAT καταλύει τη µεταφορά ακετυλοµάδων από το ακέτυλο-συνένζυµο Α (Acetyl-CoA) στη χλωραµφαινικόλη. Στα πειράµατα χρησιµοποιείται ραδιενεργά επισηµασµένη χλωραµφαινικόλη ( 14 C-χλωραµφαινικόλη) και η ακετυλιωµένη µορφή διαχωρίζεται από την µη ακετυλιωµένη µε χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας (Gorman et al., 1982). Η πειραµατική διαδικασία έχει ως εξής: µια µέρα πριν την επιµόλυνση απλώνονται 2,5x10 5 κύτταρα HepG2 και 24 h µετά τα κύτταρα συνεπιµολύνονται µε

119 3 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς CAT, 1 µg pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση και ανάλογα µε το πείραµα πλασµίδια που εκφράζουν τα γονίδια PGC-1, PGC-1- RS, SRPK1a και SAF-B1. Γίνεται αντικατάσταση του θρεπτικού υγρού 8-16 h µετά την επιµόλυνση και 36 h µετά τα κύτταρα συλλέγονται. Τα κύτταρα ξεπλένονται 2 φορές µε PBS και στη συνέχεια ξύνονται από την επιφάνεια του τριβλίου µε η βοήθεια cell scraper και 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος TEN (40 mm Tris-ΗCl ph 7,4, 1 mm EDTA ph 8, 150 mm NaCl). Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 6000 g για 2 min και επαναιώρηση του ιζήµατος σε 100 µl 0,25 M Tris-ΗCl ph 7,8. Για την πλήρη λύση των κυττάρων το ίζηµα ψύχεται και αποψύχεται 3 φορές (5 min στο υγρό άζωτο και 5 min στους 37 o C). Στη συνέχεια τα λυµένα κύτταρα φυγοκεντρούνται στα 12000 g για 5 min και το υπερκείµενο φυλάσσεται στους 20 o C (Manley et al., 1980). H ενζυµική αντίδραση πραγµατοποιείται σε όγκο 150 µl και περιλαµβάνει: 70 µl 1 M Tris-ΗCl ph 7,8, 0,3 µci 14 C-χλωραµφαινικόλη (ICN Pharmaceuticals Ltd, UK), 20 µl 4 mm Acetyl-CoA (Amersham Pharmacia Biotech) και το υπόλοιπο του όγκου συµπληρώνεται µε ένα µείγµα αποτελούµενο από το κυτταρικό εκχύλισµα και 0,25 Μ Tris-ΗCl ph 7,8, σε διαφορετικές ποσότητες ανάλογα µε την απόδοση της επιµόλυνσης για κάθε δείγµα. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 1,5 h και στη συνέχεια προστίθενται 200 µl οξικού αιθυλεστέρα (ethyl acetate). Τα δείγµατα αναµιγνύονται και ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 13000 g για 30 sec για να διαχωριστεί η οργανική από την υδατική φάση. Η οργανική φάση περιέχει την ακετυλιωµένη χλωραµφαινικόλη και µεταφέρεται σε νέους σωλήνες για λυοφίλιση για 45 min. Στη συνέχεια προστίθενται 15 µl οξικού αιθυλεστέρα και τα δείγµατα επιστοιβάζονται σε T.L.C πλάκα επικαλυµµένη µε πυρίτιο (Silica Gel IB2 Bakerflex). Ακολουθεί χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας η οποία πραγµατοποιείται σε 200 ml διαλύµατος χλωροφορµίου/µεθανόλης σε αναλογία 19:1. Στη συνέχεια, η T.L.C. πλάκα µεταφέρεται σε κασέτα αυτοραδιογραφίας, τοποθετείται φιλµ (Kodak X- OMAT S) και η ανάλυση του αποτυπώµατος του φιλµ γίνεται µε ηλεκτρονικό σαρωτή (phosphorimager). Στο φιλµ αποτυπώνονται 4 σήµατα πάνω από το σηµείο φόρτωσης των δειγµάτων (origin) που από κάτω προς τα πάνω είναι: η µη ακετυλιωµένη χλωραµφαινικόλη, ακολουθούν οι δύο µορφές της ακετυλιωµένης χλωραµφαινικόλης και τέλος όταν η µεταγραφική ενεργότητα είναι έντονη, η διακετυλιωµένη µορφή της χλωραµφαινικόλης. Τα αριθµητικά δεδοµένα που

120 περιλαµβάνονται στα διαγράµµατα εκφράζονται ως µέσος όρος ± τυπικό σφάλµα τριών ανεξαρτήτων πειραµάτων. 2.30.3. ΟΚΙΜΑΣΙΑ ΛΟΥΣΙΦΕΡΑΣΗΣ Σε πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης η δράση του ενζύµου λουσιφεράση χρησιµοποιείται επίσης ως µέτρο ένδειξης της ενεργότητας του υποκινητή, ο οποίος είναι κλωνοποιηµένος ανοδικά του γονιδίου αναφοράς που κωδικοποιεί τη λουσιφεράση. Στον υποκινητή προσδένεται ο µεταγραφικός παράγοντας ER ενεργοποιώντας την µεταγραφή του γονιδίου αναφοράς, οπότε ο βαθµός έκφρασης της λουσιφεράσης αναλογεί στην µεταγραφική ενεργότητα του ER. Η µέθοδος στηρίζεται στο γεγονός ότι το ένζυµο λουσιφεράση καταλύει την αντίδραση της λουσιφερίνης µε ΑΤΡ και Ο 2 για να µας δώσει οξυλουσιφερίνη, πυροφωσφορικά, ΑΜΡ, CO 2 και φωτεινή ακτινοβολία στα 420 nm η οποία µετριέται µε ένα φωτόµετρο που ονοµάζεται λουµινόµετρο (GloMax TM 20/20 Luminometer, Promega). Η πειραµατική διαδικασία έχει ως εξής: µια µέρα πριν την επιµόλυνση απλώνονται 8x10 5 κύτταρα και 24 h µετά τα κύτταρα συνεπιµολύνονται µε 1 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς, 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 2 µg πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και ανάλογα µε το πείραµα πλασµίδια που εκφράζουν SRPK1a, SAF-B1, P2P-R ή τµήµατα του P2P-R. To θρεπτικό υλικό αντικαθίσταται 24 h µετά την επιµόλυνση και προστίθεται οιστραδιόλη σε συγκέντρωση 10-9 Μ. Τα κύτταρα συλλέγονται 48 h µετά την επιµόλυνση, πλένονται µε PBS και λύνονται όπως αναφέρθηκε προηγουµένως στην παράγραφο 2.30.2. Η δραστικότητα λουσιφεράσης µετριέται χρησιµοποιώντας το ανάλογο kit της Promega. Τα αριθµητικά δεδοµένα που περιλαµβάνονται στα διαγράµµατα εκφράζονται ως µέσος όρος τριών ανεξαρτήτων πειραµάτων. 2.31. ΛΥΟΦΙΛΙΣΗ Η συµπύκνωση πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων µπορεί να γίνει χρησιµοποιώντας λυοφίλιση. Η λυοφίληση γίνεται µε πάγωµα του δείγµατος στους -20 C και στη συνέχεια εξάχνωση του ύδατος σε κατάλληλη συσκευή.

121 2.32. ΣΥΣΤΗΜΑ ΥΟ ΥΒΡΙ ΙΩΝ Η τεχνική των δύο υβριδίων βασίζεται στην αρχή ότι κάθε µεταγραφικός παράγοντας περιέχει δύο περιοχές: µία περιοχή δέσµευσης στο DNA και µια περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής. Στο σύστηµα της ζύµης έχει εισαχθεί ένα γονίδιο αναφοράς του οποίου η έκφραση προσδίδει κάποιο φαινότυπο στα κύτταρα της ζύµης (όπως αντίσταση σε αντιβιοτικά ή επιβίωση σε περιβάλλον έλλειψης απαραίτητων αµινοξέων) και βρίσκεται υπό τον έλεγχο του προαναφερθέντα µεταγραφικού παράγοντα. Για να διαπιστώσουµε αν δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν συνδέουµε το τµήµα του γονιδίου του µεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή δέσµευσης στο DNA, στο γονίδιο που κωδικοποιεί την πρώτη πρωτεΐνη και το τµήµα του γονιδίου του µεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής, στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη δεύτερη πρωτεΐνη. Με τον τρόπο αυτό και εφ όσον οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν ο µεταγραφικός παράγοντας επανασυγκροτείται και γίνεται ενεργός, οπότε έχουµε έκφραση του γονιδίου αναφοράς και εµφάνιση του φαινοτύπου. Επιπλέον, το ποσοστό της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς αποτελεί µέτρο της αγχιστείας µεταξύ των δύο πρωτεϊνών. Αν τώρα στο τµήµα του γονιδίου του µεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή δέσµευσης στο DNA συνδέσουµε το γονίδιο της πρωτεΐνης που µας ενδιαφέρει και στο τµήµα του γονιδίου του µεταγραφικού παράγοντα, που κωδικοποιεί την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής, ένα πλήθος από άλλα γονίδια, τα προϊόντα των οποίων θέλουµε να δούµε αν αλληλεπιδρούν µε την πρωτεΐνη που µας ενδιαφέρει, έχουµε ένα εύχρηστο εργαλείο εύρεσης αλληλεπιδράσεων που ονοµάζεται σύστηµα των δύο υβριδίων. Στην περίπτωση µας το Ν-τελικό τµήµα της SRPK1a µεγέθους 528 bp πολλαπλασιάστηκε µε PCR (νοηµατικός εκκινητής: 5 -CTGGAATTCATGGAGCGG AAAGGTGAGCGGGG-3, αντινοηµατικός εκκινητής: 5 -CTAGAAGCTTCACTG CAGGAGAGAGGGATGG-3 ), κόπηκε µε την ενδονουκλεάση περιορισµού BamHI, και κλωνοποιήθηκε σε BamHI και SmaI θέσεις του πλασµιδιακού φορέα pgbt9 (Clontech) σε ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο µε την περιοχή δέσµευσης του DNA του µεταγραφικού παράγοντα GAL4. Στη συνέχεια τo στέλεχος pj69-4a του S. cerevisiae (MATa trp1-901 leu2-3, 112 ura3-52, his3-200 gal4 gal80 LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2::gal7-lacz) (James et al., 1996) συνεπιµολύνθηκε µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pgbt9-srpk1a και ένα ισοµοριακό µίγµα των

122 Ε9.5 και Ε10.5 εµβρυϊκών cdna βιβλιοθηκών από ποντίκι, ως γονίδια σύντηξης µε την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής του GAL4 µεταγραφικού παράγοντα κλωνοποιηµένα στον πλασµιδιακό φορέα pvp16 (Hollenberg et al., 1995). Οι θετικοί κλώνοι µεγάλωσαν σε SC (Synthetic Complete) θρεπτικό µέσο από το οποίο απουσίαζε η τρυπτοφάνη, η λευκίνη και η ιστιδίνη ενώ περιείχε 11,25 µμ Ade και 3 mm AT (3-Amino Triazole) (Rose et al., 1990). Στη συνέχεια αποµονώθηκε το ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό DNA των θετικών κλώνων και έγινε εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδίων που περιείχαν. Για να ελεγθεί και να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων οι θετικοί κλώνοι ελέγθηκαν µε ανάλογη διαδικασία για την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν µε την SRPK1 που επίσης είχε κλωνοποιηθεί στον πλασµιδιακό φορέα pgbt9. Οι κλωνοποιήσεις και η εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδίων των θετικών κλώνων έγιναν από την Ε. Νικολακάκη, ενώ τα πειράµατα αλληεπίδρασης µε το σύστηµα των δύο υβριδίων από την Ε. Γεωργάτσου.

123 3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. ΜΕΛΕΤΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΤΟΥ ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΥΟ ΥΒΡΙ ΙΩΝ ΣΤΗ ΖΥΜΗ Είναι γνωστό ότι η εξειδίκευση των διαφόρων µονοπατιών µεταφοράς σήµατος (signal transduction pathways) στηρίζεται στις εξειδικευµένες αλληλεπιδράσεις των συστατικών που τα απαρτίζουν. Προκειµένου λοιπόν να κατανήσουµε καλύτερα το βιολογικό ρόλο της SRPK1a και να διαπιστώσουµε σε ποια µονοπάτια µεταφοράς σήµατος συµµετέχει, προσπαθήσαµε να βρούµε πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν εξειδικευµένα µε την SRPK1a, χρησιµοποιώντας το σύστηµα των δύο υβριδίων στη ζύµη. Για τον σκοπό αυτό χρησιµοποιήσαµε ως δόλωµα (bait) τo επιπλέον τµήµα των 171 αµινοξέων της SRPK1a (SRPK1a(1-175)), το οποίο και δεν υπάρχει στην SRPK1. Το τµήµα αυτό κλωνοποιήθηκε στον πλασµιδιακό φορέα pgbt9, σε ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο µε την περιοχή δέσµευσης του DNA του µεταγραφικού παράγοντα GAL4. Στη συνέχεια τo στέλεχος pj69-4a του S. cerevisiae συνεπιµολύνθηκε µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pgbt9-srpk1a(1-175) και ένα ισοµοριακό µίγµα Ε9.5 και Ε10.5 εµβρυϊκών cdna βιβλιοθηκών από ποντίκι, των οποίων τα γονίδια είχαν κλωνοποιηθεί στον πλασµιδιακό φορέα pvp16, µε τέτοιο τρόπο ώστε να εκφράζουν πρωτεΐνες σύντηξης µε την περιοχή ενεργοποίησης της µεταγραφής του GAL4 µεταγραφικού παράγοντα. Μετά από έλεγχο ~8 10 6 ανασυνδυασµένων κλώνων αποµονώθηκαν περίπου 20 κλώνοι οι οποίοι µεγάλωσαν στο θρεπτικό µέσο επιλογής και οι οποίοι έδωσαν µετρήσιµη δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης. Τρεις από τους κλώνους που έδωσαν την ισχυρότερη αλληλεπίδραση, µετά από εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τους και έρευνα στη βάση δεδοµένων BLAST, ταυτοποιήθηκαν ως διάφορα τµήµατα του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη SAF-B1, µία πρωτεΐνη συνδεδεµένη µε την πυρηνική µήτρα (EMBL data bank accession number ΑF056324). Με βάση τις αλληλουχίες του γονιδίου SAF-B1 που αποµονώθηκαν µε το σύστηµα των δύο υβριδίων, προκύπτει ότι το C-τελικό τµήµα της πρωτεΐνης, που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 585-720, είναι αρκετό για την αλληλεπίδραση µε την N-τελική περιοχή της SRPK1a. Η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται να είναι εξειδικευµένη δεδοµένου ότι και οι τρεις κλώνοι που αποµονώθηκαν έδειξαν µια πολύ ασθενή αλληλεπίδραση µε την SRPK1 (βλ. και σχήµα 3.1).

124 Σχήµα 3.1. Η SRPK1a αλληλεπιδρά εξειδικευµένα µε την πρωτεΐνη SAF-B1 στη ζύµη. Το στέλεχος pj69-4a του S. Cerevisiae συνεπιµολύνθηκε µε Α) pgbt9-srpk1a(1-175) και pvp16, B) pgbt9-srpk1a(1-175) και pvp16-saf-b1, C) pgbt9 και pvp16-saf-b1, D) pgbt9-srpk1 και pvp16, E) pgbt9-srpk1 και pvp16-saf-b1 και F) pgbt9 και pvp16. Τα στελέχη απλώθηκαν µε την ίδια σειρά στα τριβλία που περιείχαν SC µείον Trp, Leu, Ade και His και 3 mm AT (αριστερά) ή SC µείον Trp, Leu, Ade και His και 100 mm AT (δεξιά). Ο κλώνος του SAF-B1 που χρησιµοποιήθηκε κωδικοποιεί το τµήµα της πρωτεΐνης που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 585 και 720 της πρωτεΐνης SAF-B1 από αρουραίο (SAF-B-PC). 3.2. IN VITRO KAI IN VIVO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ SAF-B1 ΜΕ ΤΗΝ SRPK1a Για να επιβεβαιωθούν οι αλληλεπιδράσεις που βρέθηκαν στη ζύµη αρχικά προσπαθήσαµε να δείξουµε ότι η SRPK1a, αλλά όχι η SRPK1, συνδέονται µε την πρωτεΐνη SAF-B1 in vitro. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν δοκιµασίες συγκατακρήµνισης. Συγκεκριµένα, το τµήµα της πρωτεΐνης SAF-B1 που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 582 και 875 εκφρασµένο στα βακτήρια ως πρωτεΐνη σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST-SAF-B-PC) καθηλώθηκε σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και στη συνέχεια επωάστηκε µε κυτταρικά εκχυλίσµατα 293Τ κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε τον pcmv-2 πλασµιδιακό φορέα και υπερέκφραζαν είτε FLAG-SRPK1a είτε FLAG-SRPK1. Ως δοκιµασία αναφοράς (control) παρόµοια εκχυλίσµατα επωάστηκαν µε καθαρή GST πρωτεΐνη. Τα σύµπλοκα που αποµονώθηκαν µε τα σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE και οι δεσµευµένες SRPK1a ή SRPK1 ανιχνεύθηκαν έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western µε το Μ5 µονοκλωνικό

125 αντίσωµα, που αναγνωρίζει το FLAG επίτοπο. Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.2.Α η SRPK1a αλληλεπιδρά ισχυρά µε το C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης SAF-B1, ενώ αντίθετα η αλληλεπίδραση της SRPK1 είναι ασθενής. Η εξειδικευµένη αλληλεπίδραση µεταξύ SRPK1a και SAF-B1 καταδείχθηκε επίσης in vivo µε πειράµατα συνανοσοκατακρήµνισης (σχήµα 3.2.Β.) Για το λόγο αυτό 293Τ κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε πλασµιδιακούς φορείς που εκφράζουν FLAG-SRPK1a ή FLAG-SRPK1 και GFP-SAF-B-PC. Τα σύµπλοκα µεταξύ SAF-B1 και των SRPK ανοσοκατακρηµνίστηκαν µε το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι στην GFP πρωτεΐνη και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και οι FLAG-SRPK1a και FLAG-SRPK1 ανιχνεύθηκαν µε το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει το FLAG επίτοπο. Όπως φαίνεται και στο σχήµα 3.2.Β, όταν τα κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε FLAG-SRPK1a και GFP-SAF-B-PC, µία ζώνη µε φαινόµενη µοριακή µάζα 92 kda που αντιστοιχεί στην FLAG-SRPK1a ανιχνεύθηκε στο ανοσοκατακρήµνισµα µε αντι-gfp αντίσωµα (σχήµα 3.2.Β., διαδροµή 3), υποδεικνύοντας µία σταθερή αλληλεπίδραση µεταξύ SAF-B1 and SRPK1a. Όταν τα κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε FLAG-SRPK1 και GFP-SAF-B-PC δεν ανιχνεύθηκε ανάλογη ζώνη (σχήµα 3.2.Β., διαδροµή 2), ενώ όταν τα κύτταρα επιµολύνθηκαν µόνο µε FLAG-SRPK1a η ζώνη των 92 kda δεν εµφανίστηκε στο ανοσοκατακρήµνισµα (σχήµα 3.2.Β., διαδροµή 1), αποκλείοντας έτσι την πιθανότητα της απ ευθείας ανοσοκατακρήµνισης της SRPK1a από το αντίσωµα απέναντι στην GFP.

126 Σχήµα 3.2. Αλληλεπίδραση µεταξύ SRPK1a και SAF-B1 in vitro και in vivo σε κύτταρα θηλαστικών. (Α) GST-SAF-B-PC ή αντίστοιχα GST µόνη της, ως αρνητικό control, επωάστηκαν µε κυτταρικά εκχυλίσµατα από 293T κύτταρα που είχαν συνεπιµολυνθεί µε τον pcmv-2 πλασµιδιακό φορέα και υπερέκφραζαν είτε FLAG-SRPK1a είτε FLAG-SRPK1. Τα σύµπλοκα αποµονώθηκαν µε συγκατακρήµνιση σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS- PAGE. Οι δεσµευµένες SRPK1a ή SRPK1 ανιχνεύθηκαν έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western µε το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του FLAG επιτόπου. Σε κάθε δοκιµασία χρησιµοποιήθηκε ποσότητα εκχυλίσµατος, ίση µε 3 φορές αυτής που φαίνεται στις διαδροµές 1 και 4. (Β) 293Τ κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε πλασµίδια που υπερέκφραζαν FLAG-SRPK1a ή SRPK1 και GFP-SAF-B-PC.

127 Τα σύµπλοκα µεταξύ SAF-B1 και SRPKs ανοσοκατακρηµνίστηκαν µε µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι στην GFP πρωτεΐνη και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και οι FLAG-SRPK1a και FLAG-SRPK1 ανιχνεύθηκαν µε το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του FLAG επιτόπου. Σε όλες τις δοκιµασίες χρησιµοποιήθηκε ίδια ποσότητα κυτταρικού εκχυλίσµατος. 3.3. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣH ΤΟΥ ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗ p53 ΣTΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΥΟ ΥΒΡΙ ΙΩΝ ΣΤΗ ΖΥΜΗ ύο από από τους κλώνους που έδωσαν επίσης αλληλεπίδραση µε τo επιπλέον τµήµα των 171 αµινοξέων της SRPK1a µετά από εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τους και έρευνα στη βάση δεδοµένων BLAST, ταυτοποιήθηκαν ως διάφορα τµήµατα του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p53 (EMBL data bank accession number AF161020.1). Η αλληλεπίδραση µεταξύ SRPK1a και p53 είναι ασθενέστερη από την αλληλεπίδραση µεταξύ SRPK1a και SAF-B1. Και αυτή η αλληλεπίδραση φαίνεται να είναι εξειδικευµένη, δεδοµένου ότι και οι δύο κλώνοι που αποµονώθηκαν έδειξαν µια πολύ ασθενή αλληλεπίδραση µε την SRPK1 (βλ. και σχήµα 3.3). 50 mm AT 5 mm AT Σχήµα 3.3. Η SRPK1a αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη p53 στη ζύµη. Το στέλεχος pj69-4a του S. Cerevisiae συνεπιµολύνθηκε µε A) pgbt9-srpk1a(1-175) και pvp16-p53, B) pgbt9 και pvp16- p53, C) pgbt9-srpk1 και pvp16, D) pgbt9-srpk1 και pvp16-p53, E) pgbt9 και pvp16 και F) pgbt9-srpk1a(1-175) και pvp16. Τα στελέχη απλώθηκαν µε την ίδια σειρά στα τριβλία που

128 περιείχαν SC µείον Trp, Leu, Ade και His και 50 mm AT (αριστερά) ή SC µείον Trp, Leu, Ade και His και 5 mm AT (δεξιά). 3.4. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ p53 ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ To γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p53 µας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Αναπληρωτή Καθηγητή. Καρδάση (Τµήµα Ιατρικης, Πανεπιστήµιο Κρήτης), κλωνοποιηµένο στον πλασµιδιακό φορέα pcdna3/ha. Για την έκφραση της πρωτεΐνης p53, ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST έγινε κοπή του γονιδίου από τον πλασµιδιακό φορέα pcdna3/ha µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού EcoRI και BamHI και καθαρισµός του ενθέµατος ύστερα από ηλεκτροφόρηση του σε πήκτωµα αγαρόζης. Ακολούθησε κλωνοποίηση στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t που είχε κοπεί µε τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες περιορισµού και υπερέκφραση της πρωτεΐνης σε βακτήρια E. coli XL1/B. 1 2 5090 4072 3054 2036 1636 1000 Σχήµα 3.4. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης του προϊόντος κοπής του ανασυνδυασµένου πλασµιδιακού φορέα pgex-2t-p53 από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού BamHI και ΕcoRI. Η κοπή µας δίνει δύο ζώνες (διαδροµή 1), µία 4900 bp (πλασµιδιακός φορέας) και µία 1179 bp (ένθεµα). Στη διαδροµή 2 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας. Ο µετασχηµατισµός των βακτηριακών κυττάρων µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα έγινε σύµφωνα µε τη µέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.23. Η ανάπτυξη της βακτηριακής καλλιέργειας, η έκφραση και ο καθαρισµός της

129 πρωτεΐνης p53 ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST ακολούθησε το γενικό σχήµα που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.27. Η επαγωγή της έκφρασης στους 28 ο C µε 0.2 mm IPTG έγινε για χρονικό διάστηµα 1.5-2 ωρών γιατί επαγωγή για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα είχε ως αποτέλεσµα την εκτεταµένη πρωτεόλυση της πρωτεΐνης. Από τα εκλούσµατα της στήλης σεφαρόζης-γλουταθειόνης παραλαµβάνονται 10 µl τα οποία αφού αραιωθούν σε τελικό όγκο 25 µl µε H 2 O, ηλεκτροφορούνται κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. Η επιτυχής έκφραση της πρωτεΐνης ταυτοποιείται µετά από βαφή της πηκτής µε χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250. 97 1 2 68 43 Σχήµα 3.5. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της πρωτεΐνης p53 ως πρωτεΐνη σύντηξης µε την GST. Στη διαδροµή 1 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας, ενώ στη διαδροµή 2 10 µl εκλουσµένης GST-p53. Η βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε µε Coomassie Brilliant Blue R-250. Η πρωτεΐνη σύντηξης εµφανίζεται στην πηκτή µε µοριακή µάζα ~82 kda, ενώ η ζώνη λίγο κάτω από τα 68 kda αντιπροσωπεύει προϊόν πρωτεόλυσης της GST-p53. 3.5. IΝ VITRO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ SRPK1a ΚΑΙ p53 Προκειµένου να επιβεβαιώσουµε ότι η SRPK1a αλληλεπιδρά εξιδεικευµένα µε την πρωτεΐνη p53 χρησιµοποιήθηκαν δοκιµασίες συγκατακρήµνισης. Σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης καθηλώθηκαν ~4 µg από την πρωτεΐνη σύντηξης GST-p53 και ανάλογη ποσότητα καθαρής GST. Ο έλεγχος της αλληλεπίδρασης των SRPK1a και SRPK1 µε τις καθηλωµένες πρωτεΐνες έγινε µε προσθήκη σε κάθε περίπτωση στα σφαιρίδια της στήλης 60 µl από κυτταρικό εκχύλισµα 293Τ κυττάρων, όπου είχαν υπερεκφραστεί οι δύο κινάσες ως πρωτεΐνες σύντηξης µε την FLAG ακολουθία. Η

130 επώαση των καθηλωµένων GST-p53 και GST µε τα κυτταρικά εκχυλίσµατα έγινε σε 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος 25 mm Hepes ph 7,5, 75 mm NaCl. Μετά από συνεχή ανάδευση για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου και τρεις πλύσεις µε το ρυθµιστικό διάλυµα δέσµευσης οι πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Οι δεσµευµένες SRPK1a και SRPK1 ανιχνεύθηκαν έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει το FLAG επίτοπο. Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.6, η SRPK1a δεσµεύεται στην πρωτεΐνη σύντηξης GST-p53 ενώ δεν δεσµεύεται σε καθαρή GST. εν παρατηρήθηκε ανάλογη αλληλεπίδραση της SRPK1. Σηµειώνεται, ότι όταν έγινε ανάλογο πείραµα χρησιµοποιώντας PBST (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4, 1% Triton X-100), ως ρυθµιστικό διάλυµα δέσµευσης, δεν ανιχνεύθηκε δέµευση της SRPK1a στην GST-p53, γεγονός που επιβεβαιώνει την ασθενικότητα της αλληλεπίδρασης, όπως είχε παρατηρηθεί και στο σύστηµα των δύο υβριδίων, στη ζύµη. 4-123 -81 Σχήµα 3.6. In vitro δέσµευση της SRPK1a στην πρωτεΐνη GST-p53. Ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στην FLAG ακολουθία της FLAG-SRPK1a, υπερεκφρασµένης σε κύτταρα 293Τ που συγκατακρηµνίστηκε µε την πρωτεΐνη σύντηξης GST-p53 (διαδροµή 1) αλλά όχι µε την καθαρή GST (διαδροµή 2). Στη τρίτη διαδροµή έτρεξαν 20 µl (1/3 του όγκου που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα συγκατακρήµνισης) κυτταρικού εκχυίσµατος 293Τ κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η FLAG-SRPK1a, ενώ στη διαδροµή 4 έτρεξαν µάρτυρες µοριακής µάζας. 3.6. ΠΡΩΤΕΪΝΗ P2P-R H πρωτεΐνη p53 παρ ότι αλληλεπιδρά µε την SRPK1a δεν αποτελεί υπόστρωµά της δεδοµένου ότι δεν περιέχει στο µόριο της επαναλαµβανόµενα διπεπτίδια σερίνης/αργινίνης. Πράγµατι, όλες οι προσπάθειες in vitro φωσφορυλίωσης της GST-

131 p53 από ανοσοκατακρηµνισµένη FLAG-SRPK1a ήταν ανεπιτυχείς (αποτέλεσµα που δεν δείχνεται). Για τον λόγο αυτό αποφασίσαµε να ανατρέξουµε στην βιβλιογραφία, αλλά και στις βάσεις δεδοµένων, για να διαπιστώσουµε αν υπάρχει κάποια πρωτεΐνη η οποία έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά µε την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 και ταυτόχρονα περιέχει στο µόριο της RS ακολουθίες. Η έρευνά µας µας οδήγησε στην πρωτεΐνη P2P-R (για περισσότερες πληροφορίες βλ. παράγραφο 1.3). 3.7. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ, ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΑΠΟ ΤΗΝ SRPK1a ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΤΙΣ RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ (P2P-R(442-585)) Το τµήµα της πρωτεΐνης P2P-R που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 442 έως 585 κόπηκε αρχικά µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού EcoRI και SalI από τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pcmv-flag TM -24 που περιείχε ολόκληρο το γονίδιο (µας παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Scott). Ακολούθησε αποµόνωση του ενθέµατος ύστερα από ηλεκτροφόρηση του σε πήκτωµα αγαρόζης και κλωνοποίηση στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t, που είχε κοπεί µε τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες περιορισµού (βλ. σχήµα 3.7). 1 2 5090 4072 3054 2036 1636 1000 506 396 Σχήµα 3.7. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης του προϊόντος κοπής του ανασυνδυασµένου πλασµιδιακού φορέα pgex-2t-p2p-r(442-585) από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού ΕcoRI και SalI. Η κοπή µας δίνει δύο ζώνες (διαδροµή 1), µία 4900 bp (πλασµιδιακός φορέας) και µία 429 bp (ένθεµα). Στη διαδροµή 2 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας.

132 To προϊόν κλωνοποίησης µετασχηµατίστηκε σε κύτταρα XL1/B και η πρωτεΐνη σύντηξης υπερεκφράστηκε σε βακτήρια E. coli XL1/B. Η επαγωγή της έκφρασης στους 28 ο C µε 0.2 mm IPTG έγινε για χρονικό διάστηµα 1.5-2 ωρών γιατί επαγωγή για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα είχε ως αποτέλεσµα την εκτεταµένη πρωτεόλυση της πρωτεΐνης. Από τα εκλούσµατα της στήλης σεφαρόζης-γλουταθειόνης 10 µl αραιώθηκαν σε τελικό όγκο 25 µl µε H 2 O, και ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. Σ ένα επόµενο βήµα έγινε έλεγχος της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης σύντηξης GST-P2P-R(442-585) από την SRPK1a. Για το σκοπό αυτό, έγινε παροδική επιµόλυνση 293Τ κυττάρων µε τον πλασµιδιακό φορέα pcmv-2, ο οποίος κωδικοποιούσε την FLAG-SRPK1a. Μετά την πάροδο 48 ωρών το κυτταρικό εκχύλισµα ανοσοκατακρηµνίστηκε µε το Μ5 anti-flag µονοκλωνικό αντίσωµα (βλ. και παράγραφο 2.13). Η ανοσοκατακρηµνισµένη κινάση επωάστηκε για 30 min στους 30 o C σε συνθήκες in vitro φωσφορυλίωσης µε την πρωτεΐνη GST-P2P-R(442-585). Η ραδιενεργά επισηµασµένη πρωτεΐνη σύντηξης αναλύθηκε µε SDS ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία. Σχήµα 3.8. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης GST-P2P-R(442-585) και φωσφορυλίωσή της από την FLAG-SRPK1a. Στη διαδροµή 1 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας, ενώ στη διαδροµή 2 10 µl GST-P2P-R(442-585). Η βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών έγινε µε Coomassie Brilliant Blue R-250. Η πρωτεΐνη σύντηξης εµφανίζεται στην πηκτή µε µοριακή µάζα ~33 kda, ενώ οι ζώνες χαµηλότερης µοριακής µάζας αντιπροσωπεύουν προϊόντα πρωτεόλυσης. Στη δεξιά εκόνα φαίνεται η φωσφορυλίωση της GST-P2P-R(442-585) από την FLAG-SRPK1a, η οποία είχε προηγουµένως ανοσοκατακρηµνιστεί µε το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα από παροδικά επιµολυσµένα κύτταρα 293Τ.

133 3.8. IΝ VITRO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΟ ΤΜΗΜΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΤΙΣ RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΕΣ (P2P-R(442-585)) Προκειµένου να διαπιστώσουµε αν η SRPK1a, εκτός από το να φωσφορυλιώνει, αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη σύντηξης GST-P2P-R(442-585) χρησιµοποιήσαµε πάλι δοκιµασίες συγκατακρήµνισης. Περίπου 4 µg GST-P2P-R(442-585) ή καθαρής GST καθηλώθηκαν σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκαν µε κυτταρικά εκχυλίσµατα 293Τ κυττάρων (60 µl σε κάθε περίπτωση), που είχαν επιµολυνθεί µε τον pcmv-2 πλασµιδιακό φορέα και υπερέκφραζαν την FLAG-SRPK1a. Η επώαση των καθηλωµένων GST-P2P-R(442-585) και GST µε τα κυτταρικά εκχυλίσµατα έγινε σε 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος PBST. Οι πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Η δεσµευµένη SRPK1a ανιχνεύθηκε έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει το FLAG επίτοπο. Σχήµα 3.9. In vitro αλληλεπίδραση GST-P2P-R(442-585) και SRPK1a. Ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στην FLAG ακολουθία της FLAG-SRPK1a, υπερεκφρασµένης σε κύτταρα 293Τ που συγκατακρηµνίστηκε µε την πρωτεΐνη σύντηξης GST-P2P-R(442-585) (διαδροµή 3) αλλά όχι µε την καθαρή GST (διαδροµή 2). Στην πρώτη διαδροµή έτρεξαν 20 µl (1/3 του όγκου που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα συγκατακρήµνισης) κυτταρικού εκχυλίσµατος 293Τ κυττάρων, στα οποία είχε υπερεκφραστεί η FLAG-SRPK1a.

134 3.9. IN VITRO ΚΑΙ ΙΝ VIVO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΜΕΤΑΞΥ P2P-R ΚΑΙ SAF-B Από τα έως τώρα αποτελέσµατά µας προκύπτει ότι η πρωτεΐνη P2P-R, η οποία έχει την ικανότητα να δεσµεύει την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53, αποτελεί υπόστρωµα αλλά και συνδέεται µε την κινάση SRPK1a. Λαµβάνοντας όµως υπ όψη ότι τόσο το σύστηµα των δύο υβριδίων στη ζύµη (σχήµα 3.1), όσο και in vitro δοκιµασίες συγκατακρήµνισης αλλά και in vivo δοκιµασίες συνανοσοκατακρήµνισης (σχήµα 3.2) δείχνουν ότι η SRPK1a συνδέεται µε την πρωτεΐνη SAF-B1, θελήσαµε να ελέγξουµε στη συνέχεια αν υπάρχει και απ ευθείας αλληλεπίδραση µεταξύ των πρωτεϊνών SAF-B1 και P2P-R. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν αρχικά δοκιµασίες συγκατακρήµνισης. Περίπου 4 µg GST-P2P-R(442-585) ή καθαρής GST καθηλώθηκαν σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκαν µε κυτταρικά εκχυλίσµατα 293Τ κυττάρων (60 µl σε κάθε περίπτωση), που είχαν επιµολυνθεί µε τον pcdnai πλασµιδιακό φορέα και υπερέκφραζαν τον SAF-B1. Τα σύµπλοκα που αποµονώθηκαν µε τα σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE και o δεσµευµένoς SAF-B1 ανιχνεύθηκε έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western µε κατάλληλο µονοκλωνικό αντίσωµα. Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.10.Α η πρωτεΐνη SAF-B1 αλληλεπιδρά µε την GST-P2P- R(442-585) αλλά όχι µε καθαρή GST. Η αλληλεπίδραση µεταξύ P2P-R και SAF-B1 καταδείχθηκε επίσης in vivo µε πειράµατα συνανοσοκατακρήµνισης (σχήµα 3.10.Β.). Στη συγκεκριµένη περίπτωση χρησιµοποιήθηκαν οι ενδογενείς πρωτεΐνες. 293Τ κύτταρα λύθηκαν µε ρυθµιστικό διάλυµα RIPA (1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 0,1 % SDS, 150 mm NaCl, 10 mm Na-phosphate ph 7,2, 2 mm EDTA, 50 mm NaF, 5 mm β-glycerophosphate, 4 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 µg/ml aprotinin) και τα εκχυλίσµατα αραιώθηκαν 5 φορές µε το διάλυµα RIPA Rescue (10 mm Naphosphate ph 7,2, 20 mm NaCl, 1 mm NaF, 5 mm β-glycerophosphate, 2 mm sodium orthovanadate, 1 mm DTT, 1 mm PMSF, 20 µg/ml aprotinine). Τα σύµπλοκα µεταξύ SAF-B1 και των SRPK ανοσοκατακρηµνίστηκαν µε το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι στην πρωτεΐνη SAF-B1 και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και η δεσµευµένη πρωτεΐνη P2P-R ανιχνεύθηκε µε το αντίστοιχο µονοκλωνικό αντίσωµα. Όπως φαίνεται και στο σχήµα 3.9.Β, η πρωτεΐνη P2P-R συνανοσοκατακρηµνίζεται µε τον SAF-B1. εν καταφέραµε να ανιχνεύσουµε την

135 πρωτεΐνη SAF-B1, όταν πραγµατοποιήθηκε αντίστροφη ανοσοκατακρήµνιση, χρησιµοποιώντας το αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης P2P-R. GST + A B GST-SR1 + SAF-B + + + 1 2 IP: a-saf-b 1 2 3 Blot: a-p2p-r Σχήµα 3.10. Αλληλεπίδραση µεταξύ P2P-R και SAF-B1 in vitro και in vivo σε κύτταρα θηλαστικών. (Α) GST-P2P-R(442-585) ή αντίστοιχα GST µόνη της, ως αρνητικό control, επωάστηκαν µε κυτταρικά εκχυλίσµατα από 293T κύτταρα cells που είχαν συνεπιµολυνθεί µε τον pcdnai πλασµιδιακό φορέα και υπερέκφραζαν την πρωτεΐνη SAF-B1. Τα σύµπλοκα αποµονώθηκαν µε συγκατακρήµνιση σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS- PAGE. Ο δεσµευµένος SAF-B1 ανιχνεύθηκε έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western µε κατάλληλο µονοκλωνικό αντίσωµα. Για τις δοκιµασίες συγκατακρήµνιση χρησιµοποιήθηκε ποσότητα εκχυλίσµατος, ίση µε 3 φορές αυτής που φαίνεται στη διαδροµή 1. (Β) Τα σύµπλοκα µεταξύ SAF-B1 και P2P-R συνανοσοκατακρηµνίστηκαν από 293Τ κύτταρα µε µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι στην πρωτεΐνη SAF-B1 και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και η πρωτεΐνη P2P-R ανιχνεύθηκε µε κατάλληλο µονοκλωνικό αντίσωµα (διαδροµή 2). εν παρατηρήθηκε ανίχνευση της πρωτεΐνης P2P-R όταν στην ανοσοκατακρήµνιση χρησιµοποιήθηκε σκέτη protein A-Sepharose, χωρίς να έχει δεσµευµένο αντίσωµα του SAF-B1 (διαδροµή 1). 3.10. ΣΥΝΕΝΤΟΠΙΣΗ P2P-R ΚΑΙ SAF-B1 ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ Η πρωτεΐνη SAF-B1 έχει βρεθεί να είναι συνδεδεµένη µε την πυρηνική µήτρα. Αφού λοιπόν βρέθηκε ότι οι πρωτεΐνες P2P-R και SAF-B1 αλληλεπιδρούν µεταξύ τους και συνανοσοκατακρηµνίζονται από κυτταρικά εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων, θελήσαµε στη συνέχεια να δούµε αν και η πρωτεΐνη P2P-R εντοπίζεται και αυτή στην πυρηνική µήτρα. Για το σκοπό αυτό, 293Τ (µε ή χωρίς υπερέκφραση εξωγενούς

136 SRPK1a), ΜCF-7 (παρουσία ή απουσία 5x10-8 Μ οιστραδιόλης) και HepG2 κύτταρα (πριν και µετά την προσθήκη µιθραµυκίνης και 5-φθοροουρακίλης) υποβλήθηκαν σε υποκυτταρική κλασµάτωση (βλ. αναλυτικά παράγραφο 2.5). Αποµονώθηκαν τέσσερα κλάσµατα: το κυτταρόπλασµα, το διαλυτό πυρηνόπλασµα το κλάσµα των πρωτεϊνών που εκχυλίστηκαν από την χρωµατίνη µετά από κατεργασία µε DNAse I και τέλος το κλάσµα της πυρηνικής µήτρας. Κύτταρα NP-40, 0.4%, 10 min, 4 o C Πυρήνες Κυτταροπλασµατικές Πρωτεΐνες Θειϊκό Αµµώνιο, 250 mm, 5 min, 4 o C Εκχυλισµένοι πυρήνες Πυρηνικές Πρωτεΐνες DNAse I, 100U, 1 h, 32 o C Πυρηνικό ικρίωµα Χρωµατινικές Πρωτεΐνες Σχήµα 3.11. Πρωτόκόλλο υποκυτταρικής κλασµάτωσης ευκαρυωτικών κυττάρων. Ποσότητες από τα διάφορα κλάσµατα, που να αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, ηλεκτροφορήθηκαν, υπέστησαν ανοσοαποτύπωση και ελέγχθηκαν για την ανίχνευση των P2P-R και SAF-B1 πρωτεϊνών µε τη βοήθεια των κατάλληλων µονοκλωνικών αντισωµάτων. Σε όλες τις περιπτώσεις οι δύο αυτές πρωτεΐνες βρέθηκαν να εντοπίζονται στο κλάσµα της πυρηνικής µήτρας, γεγονός που υποδηλώνει ότι αποτελούν σταθερά συστατικά αυτής.

137 cytosol nucleoplasm DNAseI NM P2P-R SAF-B lamins Σχήµα 3.12. Υποκυτταρική κατανοµή των πρωτεϊνών SAF-B1 και P2P-R σε MCF-7 κύτταρα. Αποµονώθηκαν τέσσερα κλάσµατα: το κυτταρόπλασµα, το διαλυτό πυρηνόπλασµα το κλάσµα των πρωτεϊνών που εκχυλίστηκαν από την χρωµατίνη µετά από κατεργασία µε DNAse I και το κλάσµα της πυρηνικής µήτρας. Ποσότητες από τα τέσσερα κλάσµατα (5-20 µl), που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες P2P-R και SAF-B1 ανιχνεύθηκαν µε κατάλληλα µονοκλωνικά αντισώµατα και βρέθηκαν να συνεντοπίζονται στο κλάσµα της πυρηνικής µήτρας. Η ορθότητα του πρωτοκόλλου διασφαλίζεται µε την ανίχνευση των λαµινών µόνο στο κλάσµα αυτό. Παρόµοια εικόνα παρατηρείται και στα 293Τ και HepG2 κύτταρα. 3.11. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ SAF-B1 ΑΝΑΣΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ TΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Παλιότερα πειράµατα είχαν δείξει ότι υπερέκφραση της πρωτεΐνης SAF-B1 µειώνει τη µεταγραφική ενεργότητα του υποδοχέα των οιστρογόνων (ERα), όταν αυτός έχει δεσµευµένo τον φυσιολογικό του συνδέτη, την οιστραδιόλη (Oesterreich et al., 2000). Σε πρώτη φάση θελήσαµε να επαναλάβουµε αυτά τα πειράµατα. Για το λόγο αυτό αρχικά χρησιµοποιήθηκαν HeLa κύτταρα, τα οποία πρακτικά δεν έχουν ενδογενή υποδοχέα των οιστρογόνων. Απλώθηκαν 8x10 5 κύτταρα και 24 h µετά

138 συνεπιµολύνθηκαν µε 1 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς (ο υποκινητής που περιέχει την αλληλουχία δέσµευσης του υποδοχέα των οιστρογόνων -ERE elements- είναι κλωνοποιηµένος ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης), 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 0-150 ng pcdnai που εκφράζει τον SAF-B1. To θρεπτικό υλικό αντικαταστάθηκε 24 h µετά την επιµόλυνση και προστέθηκε οιστραδιόλη σε συγκέντρωση 10-9 Μ. Η λύση των κυττάρων και η µέτρηση της δραστικότητας λουσιφεράσης έγιναν όπως περιγράφονται στις παραγράφους 2.30.2 και 2.30.3. Απουσία ERα, η προσθήκη οιστραδιόλης δεν είχε κάποιο σηµαντικό αποτέλεσµα, όπως επίσης και η προσθήκη του SAF-B1. Η επιµόλυνση των HeLa µε τον ERα είχε οδήγησε σε αύξηση της µεταγραφικής δραστικότητας περίπου κατά 6 φορές, όταν προστέθηκε οιστραδιόλη. Η συνέκφραση αυξανοµένων ποσοτήτων SAF- B1 (0-150 ng) είχε ως αποτέλεσµα την αυξανόµενη µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας του ERα (σχήµα 3.13). 25000 20000 RLU 15000 10000 5000 0 -E2 +E2 SAF-B1 (ng): 0 100 0 50 75 100 150 ERα (ng): 0 0 25 25 25 25 25 Σχήµα 3.13. Επίδραση της πρωτεΐνης SAF-B1 στη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. HeLa κύτταρα επιµολύνθηκαν µε 1 µg ERE-tk-luc (γονίδιο αναφοράς), 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 0-150 ng pcdnai που εκφράζει τον SAF-B1. Οι γαλάζιες µπάρες αντιστοιχούν σε επώαση απουσία οιστραδιόλης ενώ οι µωβ σε παρουσία 10-9 Μ οιστραδιόλης. Η πρώτη και η δεύτερη

139 στήλη δείχνουν την επίδραση της οιστραδιόλης και του SAF-B1 (100 ng) αντίστοιχα, στην µεταγραφή απουσία εξωγενούς ERα. RLU: σχετικές µονάδες δραστικότητας λουσιφεράσης. Παρόµοια πειράµατα έγιναν και µε MCF-7 κύτταρα µαστού, στα οποία τα επίπεδα του ενδογενούς ERα είναι υψηλά. Στην περίπτωση αυτή, τα κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε πλασµίδια που εκφράζουν το γονίδιο αναφοράς, τη β- γαλακτοσιδάση, και τον SAF-B1, ενώ δεν προστέθηκε εξωγενής ERα. Και στα κύτταρα αυτά η έκφραση αυξανοµένων ποσοτήτων SAF-B1 είχε ως αποτέλεσµα την αυξανόµενη µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας του ERα, παρουσία οιστραδιόλης (αποτέλεσµα που δεν δείχνεται). 3.12. Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ P2P-R ΑΝΑΣΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Όπως δείξαµε προηγουµένως η πρωτεΐνη P2P-R αλληλεπιδρά µε τον SAF-B1 (παρ. 3.9) και οι δύο πρωτεΐνες συνεντοπίζονται στην πυρηνική µήτρα (παρ. 3.10). Αφού ο SAF-B1 αναστέλλει την µεταγραφική ενεργότητα του υποδοχέα που εξαρτάται από τα οιστρογόνα υποθέσαµε ότι και η πρωτεΐνη P2P-R µπορεί να εµφανίζει µια ανάλογη ενεργότητα. Για το λόγο αυτό HeLa (ΕRα-) και MCF-7 (ERα+) κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε 1 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς, 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση και 0-200 ng pcmv-flag TM -24 που εκφράζει τον P2P-R. Στην περίπτωση των HeLa κυττάρων που δεν έχουν ενδογενή ERα προστέθηκαν και 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων. Οπως φαίνεται στο σχήµα 3.14 η επιµόλυνση των HeLa κυττάρων µε αυξανόµενες ποσότητες πλασµιδιακού φορέα που εκφράζει την πρωτεΐνη P2P-R (0-200 ng) είχε ως αποτέλεσµα την αυξανόµενη µείωση της µεταγραφικής ενεργότητας του ERα. Παρόµοια αναστολή παρατηρήθηκε και µε τα MCF-7 κύτταρα (αποτέλεσµα που δεν δείχνεται). Φαίνεται λοιπόν ότι οι πρωτεΐνες SAF-B1 και P2P- R αποτελούν µέρος ενός συµπλόκου που εντοπίζεται στην πυρηνική µήτρα και το οποίο λειτουργεί ανασταλτικά σην µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων.

140 18000 16000 14000 12000 RLU 10000 8000 6000 -E2 +E2 4000 2000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 P2P-R (ng): 0 100 0 50 75 100 150 200 ERα (ng): 0 0 25 25 25 25 25 25 Σχήµα 3.14. Επίδραση της πρωτεΐνης P2P-R στη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. HeLa κύτταρα επιµολύνθηκαν µε 1 µg ERE-tk-luc (γονίδιο αναφοράς), 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 0-200 ng pcmv-flag TM -24 που εκφράζει την πρωτεΐνη P2P-R. Οι γαλάζιες µπάρες αντιστοιχούν σε επώαση απουσία οιστραδιόλης ενώ οι µωβ σε παρουσία 10-9 Μ οιστραδιόλης. Η πρώτη και η δεύτερη στήλη δείχνουν την επίδραση της οιστραδιόλης και του P2P-R (100 ng) αντίστοιχα, στην µεταγραφή απουσία εξωγενούς ERα. RLU: σχετικές µονάδες δραστικότητας λουσιφεράσης. 3.13. ΕΥΡΕΣΗ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ P2P-R ΠΟΥ ΑΝΑΣΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Στη συνέχεια θελήσαµε να προσδιορίσουµε ποιο τµήµα της πρωτεΐνης P2P-R ευθύνεται για την ανασταλτική της δραστικότητα στη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. Για το λόγο αυτό τµήµατα του γονιδίου που κωδικοποιούν την περιοχή µεταξύ των αµινοξέων 1 έως 760 (P2P-R(1-760)), 761 έως 1560 (P2P-R(761-1560)), 1156 έως 1560 (P2P-R(1156-1560)) και 1314 έως

141 1560 (P2P-R(1314-1560)) κλωνοποιήθηκαν στον πλασµιδιακό φορέα pcmv- FLAG TM -24 και εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης µε το επίτοπο FLAG σε 293Τ κύτταρα (βλ. και παραγράφους 2.26 και 2.28). 1 1560 P2P-R 1 760 761 1560 1156 1560 1314 1560 Σχήµα 3.15. Σχηµατική αναπαράσταση των τµηµάτων της πρωτεΐνης P2P-R που εκφράστηκαν ως πρωτεΐνες σύντηξης µε το επίτοπο FLAG σε 293Τ κύτταρα. (A) 1 2 3 179 123 180 125 80 (B) 1 2 3 4 5 50 Σχήµα 3.16. Έκφραση τµηµάτων της πρωτεΐνης P2P-R ως πρωτεΐνες σύντηξης µε το επίτοπο FLAG σε ευκαρυωτικά κύτταρα. (Α) Ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στην FLAG ακολουθία της FLAG-P2P-R. A) Στη διαδροµή 1 έχουν τρέξει 20 µl κυτταρικού εκχυλίσµατος 293Τ κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε pcmv-flag TM -24-P2P-R ενώ στη διαδροµή 2, 10 µl κυτταρικού εκχυλίσµατος 293Τ κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε τον πλασµιδιακό φορέα µόνο. Στη διαδροµή 3 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας. (B) Ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στην FLAG ακολουθία των FLAG-P2P-R(1-760) (διαδροµή 2), FLAG-P2P-R(761-1560) (διαδροµή 3), FLAG-P2P-R(1156-1560) (διαδροµή 4) και FLAG-P2P-R(1314-1560) (διαδροµή 5). Σε

142 κάθε περίπωση έτρεξαν 20 µl κυτταρικού εκχυλίσµατος 293Τ κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε τον αντίστοιχο ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα. Στη διαδροµή 1 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας. Αφού διαπιστώσαµε ότι όλα τα τµήµατα της πρωτεΐνης P2P-R εκφράζονται ικανοποιητικά σε ευκαρυωτικά κύτταρα, σε ένα επόµενο βήµα θελήσαµε να µελετήσουµε την ικανότητά τους να προκαλούν αναστολή στη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. Για το λόγο αυτό HeLa (ΕR-) κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε 1 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς, 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 100 ng pcmv- FLAG TM -24 που εκφράζει καθένα από τα επιµέρους τµήµατα του P2P-R. 18000 16000 14000 12000 RLU 10000 8000 6000 4000 2000 0 -E2 +E2 P2P-R 100ng 100ng P2P-R(1-760) 100ng P2P-R(761-1560) 100ng P2P-R(1156-1560) 100ng P2P-R(1314-1560) 100ng ERα 25ng 25ng 25ng 25ng 25ng 25ng Σχήµα 3.17. Επίδραση των επιµέρους τµηµάτων της πρωτεΐνης P2P-R στη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. HeLa κύτταρα επιµολύνθηκαν µε 1 µg ERE-tk-luc (γονίδιο αναφοράς), 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 100 ng pcmv-flag TM -24 που εκφράζει είτε ολόκληρη

143 είτε τα επιµέρους τµήµατα της πρωτεΐνης P2P-R, όπως φαίνονται στον πίνακα κάτω από το σχήµα. Οι γαλάζιες µπάρες αντιστοιχούν σε επώαση απουσία οιστραδιόλης ενώ οι µωβ σε παρουσία 10-9 Μ οιστραδιόλης. Η πρώτη και η δεύτερη στήλη δείχνουν την επίδραση της οιστραδιόλης και ολόκληρου του P2P-R (100 ng) αντίστοιχα, στην µεταγραφή απουσία εξωγενούς ERα. RLU: σχετικές µονάδες δραστικότητας λουσιφεράσης. Οπως φαίνεται στο σχήµα 3.17 όλα τα τµήµατα του P2P-R, εκτός του Ν- τελικού του (1-760), αναστέλουν τη µεταγραφική δράση του ERα, περίπου στο ίδιο ποσοστό. Από το γεγονός αυτό προκύπτει ότι για την αναστολή πρέπει να ευθύνεται το C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης, που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 1314 έως 1560. Αξιοσηµείωτο είναι, ότι η απαλοιφή των RS διπεπτιδίων του P2P-R (εµπερέχονται στο Ν-τελικό άκρο του P2P-R) δεν έχει καµµία επίδραση στην ανασταλτική του ικανότητα. 3.14. IN VIVO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ P2P-R ΚΑΙ SAF-B ΜΕ ΤΟ ΣΥΠΛΟΚΟ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Είναι γνωστό ότι ο υποδοχέας των οιστρογόνων προκειµένου να γίνει µεταγραφικά ενεργός δηµιουργεί σύµπλοκα µε µια σειρά από συνενεργοποιητές (receptorcoactivator complexes) µε αποτέλεσµα την αναδιάταξη της χρωµατίνης και την επιστράτευση των γενικών µεταγραφικών παραγόντων (βλ. αναλυτικά παρ. 1.6.3). Μεταξύ των συνενεργοποιητών βασικό ρόλο παίζουν η πρωτεΐνη SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator 1) και η πρωτεΐνη CARM1 που εµφανίζει δράση µεθυλοτρανσφεράσης ιστονών, µεθυλιώνοντας όµως αργινίνες. Ανάλογα δηµιουργεί σύµπλοκα µε συγκαταστολείς τα οποία έχουν ως αποτέλεσµα τη µείωση του ρυθµού µεταγραφής των γονιδίων-στόχων (βλ. αναλυτικά παρ. 1.6.3). Ο κυριότερος συγκαταστολέας στην περίπτωση του ERα είναι η πρωτεΐνη NCoR. Ετσι, προσθήκη του φαρµάκου tamoxifen οδηγεί στη στρατολόγηση του συγκαταστολέα NCoR και αποδέσµευση του συνενεργοποιητή SRC-1. Θεωρήθηκε λοιπόν σκόπιµο να µελετηθεί αν το σύµπλοκο µεταξύ των πρωτεϊνών SAF-B1 και P2P-R στην πυρηνική µήτρα αποτελεί µέρος των µεταγραφικών συµπλόκων του ERα. Στα πλαίσια αυτά πραγµατοποιήθηκαν µια σειρά από ανοσοκατακρηµνίσεις σε MCF-7 κύτταρα στα οποία είχε προστεθεί 10-9 οιστραδιόλη, τα αποτελέσµατα των οποίων φαίνονται στο σήµα 3.18.

144 Anti- P2P-R Anti-SAF-B Anti-SRC-1 Anti-ER α Anti-CARM 1 P2P-R Western 250 kda SRC-1 Western NT NT 160 kda SAF-B Western NT NT 130 kda Σχήµα 3.18. Συνανοσοκατακρήµνιση διαφόρων πρωτεΐνών που συµµετέχουν στο µεταγραφικό σύµπλοκο του ERα. Τα διάφορα σύµπλοκα συνανοσοκατακρηµνίστηκαν από MCF-7 κύτταρα µε µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι στις πρωτεΐνες που φαίνονται στο πάνω µέρος του σχήµατος (κάθετα) και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και η ανίχνευση έγινε µε κατάλληλα µονοκλωνικά αντισώµατα που φαίνονται αριστερά στο σχήµα (οριζόντια). Ο P2P-R συνανοσοκατακρηµνίζει τον SRC-1, o SAF-B1 τον P2P-R και τον SRC-1, o SRC-1 τον P2P-R και τον SAF-B1, o ERα τον P2P-R και τον SAF-B1 και η CARM1 τον P2P-R. ΝΤ: Non-Tested. Τα αποτελέσµατα των συνανοσοκατακρηµνίσεων δείχνουν ότι ο P2P-R συνανοσοκατακρηµνίζει τον SRC-1, o SAF-B1 τον P2P-R και τον SRC-1, o SRC-1 τον P2P-R και τον SAF-B1, o ERα τον P2P-R και τον SAF-B1 (είναι γνωστό ότι ο ERα συνανοσοκατακρηµνίζει τον συνενεργοποιτή του SRC-1 (Onate et al., 1995), γι αυτό και δεν το ελέγξαµε) και τέλος η CARM1 τον P2P-R. Είναι γνωστό ότι η CARM1 συνανοσοκατακρηµνίζει τον SRC-1 (Chen et al., 1999), ενώ δεν καταφέραµε να δείξουµε ότι συνανοσοκατακρηµνίζει τον SAF-B1. εν καταφέραµε επίσης να ανιχνεύσουµε τον SAF-B1, όταν η ανοσοκατακρήµνιση έγινε µε µονοκλωνικό αντίσωµα απέναντι στον P2P-R. Τα αποτελέσµατα αυτά συνηγορούν υπέρ της άποψης ότι οι πρωτεΐνες SAF-B1 και P2P-R αποτελούν µέρος ενός

145 γενικότερου συµπλόκου του υποδοχέα των οιστρογόνων που ρυθµίζει τη µεταγραφή συγκεκριµένων γονιδίων-στόχων. 3.15. ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΟΙΣΤΡΑ ΙΟΛΗΣ Η TAMOXIFEN ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ ΜΕΡΟΥΣ ΤΟΥ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ ΣΤΗΝ ΠΥΡΗΝΙΚΗ ΜΗΤΡΑ Έχει αναφερθεί παλιότερα (Stenoien et al., 2000) ότι η δέσµευση οιστραδιόλης στον υποδοχέα έχει ως αποτέλεσµα καθήλωση του υποδοχέα στην πυρηνική µήτρα, 10-20 min έπειτα από την προσθήκη της ορµόνης. Επιπλέον, έχει βρεθεί µερικός συνεντοπισµός µε την ενεργή, φωσφορυλιωµένη µορφή της RNA πολυµεράσης ΙΙ, σε σηµεία του ικριώµατος που παρατηρείται µεταγραφή (Stenoien et al., 2000). Παράδοξα όµως, προσθήκη και ανταγωνιστή όπως ο ICI 182,780 είχε και πάλι ως αποτέλεσµα την «καθήλωση» του υποδοχέα στον πυρηνικό σκελετό χωρίς όµως να παρατηρείται σ αυτήν την περίπτωση καµία ενεργοποίηση της µεταγραφής των γονιδίων-στόχων (Stenoien et al., 2000). Σε MCF-7 κύτταρα προστέθηκαν 5x10-8 Μ οιστραδιόλης και 5x10-8 Μ tamoxifen και ύστερα από διάφορα χρονικά διαστήµατα που κυµάνθηκαν από 20 min έως 24 h τα κύτταρα αυτά καθώς και κύτταρα στα οποία απλά προστέθηκε DMSO (σε ποσότητα ίδια µε αύτή που είναι διαλυµένη η οιστραδιόλη ή το tamoxifen) υποβλήθηκαν σε υποκυτταρική κλασµάτωση. Αποµονώθηκαν τέσσερα κλάσµατα: το κυτταρόπλασµα, το διαλυτό πυρηνόπλασµα το κλάσµα των πρωτεϊνών που εκχυλίστηκαν από την χρωµατίνη µετά από κατεργασία µε DNAse I και τέλος το κλάσµα της πυρηνικής µήτρας. Ποσότητες από τα διάφορα κλάσµατα, που να αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, χρησιµοποιήθηκαν για να µελετηθεί η υποκυτταρική κατανοµή του υποδοχέα των οιστρογόνων (ERα), µε ανοσοαποτύπωση κατά Western µε τη βοήθεια κατάλληλου µονοκλωνικού αντισώµατος. Και στην περίπτωση της οιστραδιόλης (ενεργοποιητή της µεταγραφής) και στην περίπτωση του ανταγωνιστή tamoxifen (µερικού αναστολέα της µεταγραφής) παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων του υποδοχέα των οιστρογόνων στην πυρηνική µήτρα. Το ποσοστό αυτό δεν φάνηκε να διαφοροποιείται σηµαντικά ανάλογα µε τον χρόνο έκθεσης των κυττάρων σε οιστραδιόλη ή tamoxifen. Στα επόµενα δύο σχήµατα (σχήµατα 3.19 και 3.20) δείχνεται η καθήλωση µέρους του υποδοχέα στην πυρηνική

146 µήτρα µετα από έκθεση των MCF-7 κυττάρων σε 5x10-8 tamoxifen για 12 ώρες. Μ οιστραδιόλη ή Σχήµα 3.19. Αυξηση των επιπέδων του υποδοχέα των οιστρογόνων στο κλάσµα της πυρηνικής µήτρας µετά από έκθεση MCF-7 κυττάρων σε 5x10-8 Μ οιστραδιόλη για 12 h. Ποσότητες από τα κλάσµατα του κυτταροπλάσµατος, του νουκλεοπλάσµατος, της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Η κατανοµή του υποδοχέα των οιστρογόνων α (ERα) µελετήθηκε στα διάφορα κλάσµατα µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας κατάλληλο µονοκλωνικό αντίσωµα. Αριστερά: προσθήκη DMSO στα κύτταρα. εξιά: προσθήκη 5x10-8 Μ οιστραδιόλης. Ενώ ο ERα εµφανίζεται στο νουκλεόπλασµα στα control κύτταρα, µετά την προσθήκη οιστραδιόλης κατανέµεται τόσο στο κλάσµα του νουκλεοπλάσµατος, όσο και σε αυτό της πυρηνικής µήτρας. Και στις δύο περιπτώσεις χρησιµοποιήθηκε ο ίδιος αριθµός κυττάρων. Σχήµα 3.20. Αύξηση των επιπέδων του υποδοχέα των οιστρογόνων στο κλάσµα της πυρηνικής µήτρας µετά από έκθεση MCF-7 κυττάρων σε 5x10-8 Μ tamoxifen για 12 h. Ποσότητες από τα κλάσµατα του κυτταροπλάσµατος, του νουκλεοπλάσµατος, της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Η κατανοµή του υποδοχέα των οιστρογόνων α (ERα) µελετήθηκε στα διάφορα κλάσµατα µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας κατάλληλο µονοκλωνικό αντίσωµα. Αριστερά: προσθήκη DMSO στα κύτταρα. εξιά: προσθήκη 5x10-8 Μ tamoxifen. Ενώ ο ERα εµφανίζεται στο νουκλεόπλασµα στα control κύτταρα, µετά την προσθήκη tamoxifen κατανέµεται τόσο στο κλάσµα του νουκλεοπλάσµατος,

147 όσο και σε αυτό της πυρηνικής µήτρας. Και στις δύο περιπτώσεις χρησιµοποιήθηκε ο ίδιος αριθµός κυττάρων. εδοµένου ότι η πρωτεΐνη P2P-R δεσµεύει την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 θελήσαµε να µελετήσουµε και την κατανοµή της p53 µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, καθώς επίσης και την πιθανή συµµετοχή της στο σύµπλοκο του υποδοχέα των οιστρογόνων. εν ανιχνεύθηκε όµως καθόλου p53 στα εκχυλίσµατα των MCF-7 κυττάρων (χρησιµοποιώντας το DO-1 µονοκλωνικό αντίσωµα), γεγονός που πιθανότατα υποδηλώνει ότι τα κύτταρα αυτά έχουν πολύ χαµηλά επίπεδα p53. 3.16. ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ SRPK1/SRPK1a ΣΕ MCF-7 ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΟΙΣΤΡΑ ΙΟΛΗΣ Όπως δείξαµε προηγουµένως η SRPK1α αλληλεπιδρά µε τις πρωτεΐνες SAF-B1 και P2P-R, ενώ φωσφορυλιώνει την RS ακολουθία του P2P-R. Σε πρώτη φάση θελήσαµε να ελέγξουµε την κατανοµή της SRPK1α σε MCF-7 κύτταρα. Αυτό όµως δεν έγινε δυνατό µε ανοαποτύπωση κατά Western γιατί τα επίπεδα της ενδογενούς κινάσης στα κύτταρα αυτά είναι πολύ χαµηλά, µε αποτέλεσµα να µην είναι ανιχνεύσιµα µε το αντίσωµα. Για το λόγο αυτό τα διάφορα κλάσµατα της υποκυτταρικής κλασµάτωσης. ελέγχθηκαν όσον αφορά την ικανότητά τους να φωσφορυλιώνουν in vitro το τµήµα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λάµίνης Β (LBR) που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 62 και 92, εκφρασµένο ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST στα Ε. coli (GST- 62-92). Το τµήµα αυτό αποτελεί στην ουσία ένα πεπτίδιο που περιέχει τα επαναλαµβανόµενα RS διπεπτίδια του LBR και λειτουργεί ως ένα εξειδικευµένο υπόστρωµα των SRPK1/SRPK1a. Η ραδιενεργά επισηµασµένη πρωτεΐνη αναλύθηκε µε SDS-ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία. Ακολούθησε η µέτρηση των ραδιενεργών ζωνών σε σπινθηριστή 1500 TR (Packard) κατά Cherenkov. Όπως προκύπτει από το σχήµα 3.21 και τον πίνακα 3.1, δραστικότητα κινάσης ανιχνεύεται κατά κύριο λόγο στο κυτταρόπλασµα και κατά ένα µικρότερο ποσοστό στο πυρήνα. Από την πυρηνική δραστικότητα µόνο ένα ποσοστό 3,5% ανιχνεύεται στα κλάσµατα της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας (1,5 και 2,0% αντίστοιχα, βλ. πίνακα 3.1) Στη συνέχεια έγινε υποκυτταρική κλασµάτωση σε κύτταρα στα οποία είχε προστεθεί 5x10-8 Μ οιστραδιόλη για 12 h και έλεγχος της

148 δραστικότητας κινάσης στα κλάσµατα τα οποία προέκυψαν. Η προσθήκη της ορµόνης ενώ δεν είχε ουσιαστική επίδραση στα κυτταροπλασµατικά επίπεδα της δραστικότητας προκαλούσε µια επαναλήψιµη µεταβολή στην κατανοµή της δραστικότητας στα πυρηνικά κλάσµατα. Συγκεκριµένα, το ποσοστό στο διαλυτό πυρηνόπλασµα µειώθηκε από το 19.6 στο 12.8% ενώ αυξήθηκε σηµαντικά το ποσοστό που ανιχνεύθηκε στα κλάσµατα της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας (κατά 4,6 και 2,7 φορές αντίστοιχα, βλ. πίνακα 3.1). Σχήµα 3.21. Υποκυτταρική κατανοµή της δραστικότητας των SRPK1/SRPK1a σε MCF-7 κύτταρα. Η δράση ελέγθηκε µε την επώαση 1-3 µl από τα εκχυλίσµατα µαζί µε 2 µg GST-62-92 παρουσία 25 µμ [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, 10 mm MgCl 2 και 80 mm NaCl. Αριστερά φαίνεται η αυτοραδιογραφία ύστερα από δοκιµασία φωσφορυλίωσης στα υποκυτταρικά κλάσµατα MCF-7 κυττάρων χωρίς την προσθήκη οιστραδιόλης και δεξιά η αντίστοιχη αυτοραδιογραφία όταν στα κύτταρα είχε προστεθεί 5x10-8 Μ οιστραδιόλη. Και για τις δύο υποκυτταρικές κατανοµές χρησιµοποιήθηκε ο ίδιος αριθµός κυττάρων. DMSO Estradiol Cyt 76,9% 75,0% Nucl 19,6% 12,8% DNAseI 1,5% 6,9% N.M 2,0% 5,3% Πίνακας 3.1. Πίνακας που παρουσιάζει τα ποσοστά δραστικότητας των SRPK1/SRPK1a στα διάφορα υποκυτταρικά κλάσµατα MCF-7 κυττάρων απουσία ή παρουσία οιστραδιόλης. Οι τιµές είναι ο µέσος όρος µετρήσεων από 3 διαφορετικές κατανοµές.

149 3.17. ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΥΠΟ ΟΧΕΑ ΤΩΝ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Η µεταβολή στην ενδοπυρηνική κατανοµή των SRPK1/SRPK1a, σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι η SRPK1α αλληλεπιδρά τις πρωτεΐνες SAF-B1 και P2P-R αλλά και περιέχει στο µόριο της την ακολουθία LXXLL που έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά µε τα σύµπλοκα των πυρηνικών υποδοχέων (Torchia et al., 1997) µας οδήγησε να ελέγξουµε την επίδρασή της στη µεταγραφική ενεργότητα του υποδοχέα των οιστρογόνων. Για το λόγο αυτό HeLa (ΕR-) κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε 1 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς, 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 0-300 ng pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a. Οπως φαίνεται στο σχήµα 3.22 η επιµόλυνση των HeLa κυττάρων µε αυξανόµενες ποσότητες πλασµιδιακού φορέα που εκφράζει την πρωτεΐνη SRPK1a (0-300 ng) είχε ως αποτέλεσµα την αυξηση της µεταγραφικής ενεργότητας του ERα. Φαίνεται λοιπόν ότι ένα µέρος της κυτταρικής SRPK1a αποτελεί µέρος του µεταγραφικού συµπλόκου του υποδοχέα των οιστρογόνων, επιδρώντας θετικά στην µεταγραφή. 35000 30000 25000 RLU 20000 15000 -E2 +E2 10000 5000 0 1 2 3 4 5 6 7 SRPK1a (ng): 0 300 0 50 100 200 300 ERα (ng): 0 0 25 25 25 25 25

150 Σχήµα 3.22. Επίδραση της SRPK1a στη µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα των οιστρογόνων. HeLa κύτταρα επιµολύνθηκαν µε 1 µg ERE-tk-luc (γονίδιο αναφοράς), 100 ng pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση, 25 ng πλασµιδίου που εκφράζει τον υποδοχέα των οιστρογόνων και 0-300 ng pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a. Οι γαλάζιες µπάρες αντιστοιχούν σε επώαση απουσία οιστραδιόλης ενώ οι µωβ σε παρουσία 10-9 Μ οιστραδιόλης. Η πρώτη και η δεύτερη στήλη δείχνουν την επίδραση της οιστραδιόλης και της SRPK1a (100 ng) αντίστοιχα, στην µεταγραφή απουσία εξωγενούς ERα. RLU: σχετικές µονάδες δραστικότητας λουσιφεράσης. 3.18. ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΣΕ HepG2 ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΕΙ ΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΥΡΗΝΙΚΟ ΥΠΟ ΟΧΕΑ HNF-4 Από τα έως τώρα αποτελέσµατά µας προκύπτει ότι, τουλάχιστον στην περίπτωση του υποδοχέα των οιστρογόνων, συγκροτείται ένα µεγάλο µεταγραφικό σύµπλοκο στην πυρηνική µήτρα το οποίο ρυθµίζει είτε θετικά είτε αρνητικά τη µεταγραφική του ενεργότητα. Επεκτείνοντας την µελέτη µας, ξεκινήσαµε µια προσπάθεια µε την οµάδα της Καθηγήτριας Μ. Χατζοπούλου (Τµήµα Βιολογίας Α.Π.Θ.) για να δούµε αν ανάλογος µηχανισµός ρύθµισης ισχύει και στην περίπτωση του ορφανού πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α (Hepatic Nuclear Factor-4a), ο οποίος εκφράζεται στα ηπατικά κύτταρα. Καθοριστικό ρόλο για το ενδιαφέρον µας για τον HNF-4α έπαιξε το γεγονός ότι ο κυριότερος συνενεργοποιητής του είναι η πρωτεΐνη PGC-1 (PPAR γ Coactivator 1), που περιέχει έναν αρκετά µεγάλο αριθµό RS διπεπτιδίων στο µόριό του, και άρα αποτελεί ένα πιθανό υπόστρωµα για τις SRPK s. Επιπλέον, το γεγονός ότι ο HNF-4α αλληλεπιδρά και µε τον συνενεργοποιητή SRC-1 (βλ. παράγραφο 1.9.2.), ο οποίος, όπως δείξαµε στα MCF-7 κύτταρα, συνανοσοκατακρηµνίζεται µε τις πρωτεΐνες SAF-B και P2P-R, πιθανολογεί ότι οι δύο αυτές πρωτεΐνες της πυρηνικής µήτρας µπορεί να επιδρούν στη µεταγραφική ενεργότητα του HNF-4α. Αρχικά ελέγξαµε την επίδραση της SRPK1a στη µεταγραφική ενεργότητα του ενδογενούς HNF-4α σε HepG2 κύτταρα. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε 3 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς CAT (το οποίο πλασµίδιο έχει κλωνοποιηµένο και τα στοιχεία απόκρισης στον HNF-4α, ανοδικά του γονιδίου αναφοράς) 1 µg pcmv β-gal που εκφράζει τη β- γαλακτοσιδάση και 1-6 µg pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a. Όπως

151 φαίνεται στο σχήµα 3.23 αυξανόµενες συγκεντρώσεις SRPK1a προκαλούν αύξηση στα επίπεδα της µεταγραφής που επάγεται από τον HNF-4α. Το µέγιστο της αύξησης εµφανίζεται όταν επιµολύνθηκαν HepG2 κύτταρα µε 4-6 µg pflag-cmv-2- SRPK1a. Το ποσοστό της αύξησης στα διάφορα πειράµατα που έγιναν (παρ ότι χρησιµοποιήθηκαν ακριβώς οι ίδιες συνθήκες) κυµάνθηκε από 2,5-5 φορές (βλ. και παράγραφο 3.23). Α 1 2 3 4 5 Ακετυλοχλωραµφαινικόλη Ακετυλοχλωραµφαινικόλη Χλωραµφαινικόλη Β 600 Σχετική δραστικότητα CAT (%) 500 400 300 200 100 0 1 2 3 4 5 Σχήµα 3.23. Υπερέκφραση της SRPK1a προκαλεί ενεργοποίηση της µεταγραφής που εξαρτάται από τον HNF-4α σε HepG2 κύτταρα. (Α) Αυτοραδιογραφία έπειτα από δοκιµασία έκφρασης χλωραµφαινικόλης (CAT assay) σε HepG2 κύτταρα που είχαν συνεπιµολυνθεί µε 3 µg πλασµιδίου

152 που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς CAT, 1 µg pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση και 1 µg (διαδροµή 2), 2 µg (διαδροµή 3), 4 µg (διαδροµή 4) και 6 µg (διαδροµή 5) pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a. Στη διαδροµή 1 φαίνεται η έκφραση CAT που επάγεται από τον ενδογενή HNF-4α, χωρίς την προσθήκη εξωγενούς SRPK1a. (Β) Ποσοτικοποίηση των αποτελεµάτων της αυτοραδιογραφίας. Ως σχετική δραστικότητα CAT θεωρούµε το λόγο των κρούσεων διακετυλοχλωραµφαινικόλη + ακετυλοχλωραµφαινικόλη/χλωραµφαινικόλη. Ως 100% θεωρούµε το λόγο αυτό στη περίπτωση του ενδογενούς HNF-4α (control, διαδροµή 1). 3.19. ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ PGC-1- RS Λαµβάνοντας υπ όψη, αφ ενός ότι η SRPK1a ενεργοποιεί τη µεταγραφή που εξαρτάται από τον HNF-4α σε HepG2 κύτταρα και αφ ετέρου ότι ο βασικότερος συνενεργοποιητής του HNF-4α, που είναι ο PGC-1, περιέχει ένα σηµαντικό αριθµό από RS διπεπτίδια στο µόριο του, ήταν λογικό να υποθέσουµε ότι η φωσφορυλίωση της RS ακολουθίας µπορεί να ευθύνεται για την παρατηρούµενη ενεργοποίηση. Για να µελετήσουµε καλύτερα τη φωσφορυλίωση του PGC-1 από την SRPK1a, καθώς και το πιθανό ρόλο της φωσφορυλίωσης στην ενεργοποίηση της µεταγραφής, αποφασίσαµε να δηµιουργήσουµε ένα µετάλλαγµα του PGC-1 από το οποίο έχουν αφαιρεθεί τα RS διπεπτίδια. Η µεθοδολογία που ακολουθήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στο κεφάλαιο των υλικών και µεθόδων, στην παράγραφο 2.26. Το DNA, από το οποίο είχε αφαιρεθεί η αλληλουχία που κωδικοποιεί τα RS διπεπτίδια, κλωνοποιήθηκε στους πλασµιδιακούς φορείς pcdna3/neomyc και pgex-2t για έκφραση σε ευκαρυωτικά και βακτηριακά κύτταρα αντίστοιχα.

153 1 2 6108 5090 4072 3054 2036 1636 1000 506 Σχήµα 3.24. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης που δείχνει την κλωνοποίηση του PGC-1- RS στον πλασµιδιακό φορέα pcdna3/neomyc. Στη διαδροµή 1 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας, ενώ στη διαδροµή 2 το προϊόν κοπής του pcdna3/neomyc-pgc-1- RS από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού ΧhoI και ΧbaI που δίνει µία ζώνη 5400 bp (φορέας), µία 1219 και µία 988 bp, επιβεβαιώνοντας την ορθότητα της κλωνοποίησης, αφού το PGC-1- RS έχει µία θέση κοπής από την XbaI στη θέση 1219. 1 2 5090 4072 3054 2036 1636 1000 Σχήµα 3.25. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης που δείχνει την κλωνοποίηση του PGC-1- RS στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t. Στη διαδροµή 2 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας, ενώ στη διαδροµή 1 το προϊόν κοπής του pgex-2t-pgc-1- RS από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού SmaI αρχικά και BamHI στη συνέχεια, που δίνει µία ζώνη 4900 bp (φορέας) και µία 2207 bp (ένθεµα).

154 3.20. ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ PGC-1 ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΤΟΥ ΛΕΙΠΕΙ Η RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ (PGC-1- RS) Oι πρωτεΐνες σύντηξης GST-PGC-1 και GST-PGC-1- RS υπερεκφράστηκαν σε βακτήρια E. coli BL21 (DE3) και TOP-10F αντίστοιχα. Η επαγωγή της έκφρασης στους 28 ο C µε 0.2 mm IPTG έγινε για χρονικό διάστηµα 4 ωρών. Η επαγωγή έγινε για µεγάλο χρονικό διάστηµα, παρά τη σηµαντική πρωτεόλυση που παρατηρήθηκε (κυρίως της GST-PGC-1), λόγω του µεγάλου µεγέθους των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών. Από τα εκλούσµατα της στήλης σεφαρόζης-γλουταθειόνης 10 µl αραιώθηκαν σε τελικό όγκο 25 µl µε H 2 O, και ηλεκτροφορήθηκαν κάτω από µετουσιωτικές συνθήκες σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου. (A) 1 565 626 798 RS RSRSRSFSRHRSCSRSPYSRSRSRSPGSRSSSRS CYYYESSHYRHRTHRNSPLYVRSRSRS

155 (B) 1 2 3 225 150 100 Σχήµα 3.26. Έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα της πρωτεΐνης PGC-1 ως πρωτεΐνη σύντηξης µε την GST (GST-PGC-1) και του µεταλλάγµατος από το οποίο έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία (GST-PGC-1- RS). (Α) Σχηµατική αναπαράσταση των πρωτεϊνών σύντηξης GST-PGC-1 και GST- PGC-1- RS. Στο σχήµα απεικονίζεται η RS ακολουθία του PGC-1, η οποία έχει αφαιρεθεί από το µετάλλαγµα. (Β) Βαφή των πρωτεϊνικών ζωνών µε Coomassie Brilliant Blue R-250. Η πρωτεΐνη σύντηξης GST-PGC-1 (δαδροµή 2) εµφανίζεται στην πηκτή µε µοριακή µάζα ~140 kda, ενώ οι ζώνες µικρότερης µοριακής µάζας που εµφανίζονται αντιπροσωπεύουν προϊόντα πρωτεόλυσης. Η πρωτεΐνη σύντηξης GST-PGC-1- RS (διαδροµή 3) εµφανίζεται στην πηκτή µε µοριακή µάζα ~135 kda. Στη διαδροµή 1 έχουν τρέξει µάρτυρες µοριακής µάζας. 3.21. ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤOΥ PGC-1 ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΕΧΕΙ ΑΦΑΙΡΕΘΕΙ Η RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ ΑΠΟ ΤΙΣ SRPK1a ΚΑΙ SRPK1 Σ ένα επόµενο βήµα έγινε έλεγχος των FLAG-SRPK1a και FLAG-SRPK1 να φωσφορυλιώνουν τις πρωτεΐνες σύντηξης GST-PGC-1 και GST-PGC-1- RS. Για το σκοπό αυτό, έγινε παροδική επιµόλυνση 293Τ κυττάρων µε τον πλασµιδιακό φορέα pcmv-2, ο οποίος έκφραζε την FLAG-SRPK1a ή αντίστοιχα την FLAG-SRPK1. Μετά την πάροδο 48 ωρών τα κυτταρικά εκχύλισµα ανοσοκατακρηµνίστηκαν µε το Μ5 anti-flag µονοκλωνικό αντίσωµα (βλ. και παράγραφο 2.13). Οι ανοσοκατακρηµνισµένες κινάσες επωάστηκαν για 30 min στους 30 o C σε συνθήκες in vitro φωσφορυλίωσης µε τις πρωτεΐνες GST-PGC-1 και GST-PGC-1- RS. Οι

156 ραδιενεργά επισηµασµένες πρωτεΐνες σύντηξης αναλύθηκαν µε SDS ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία. Όπως φίνεται στο σχήµα 3.27 και οι δύο κινάσες φωσφορυλιώνουν τον PGC-1 (σε πολύ µεγαλύτερη έκταση όµως η SRPK1a). Επιπλέον, καµία από τις δύο κινάσες δεν φωσφορυλιώνει το µετάλλαγµα από το οποίο έχουν αφαιρεθεί τα RS διπεπτίδια. 1 2 3 4 Σχήµα 3.27. Φωσφορυλίωση του PGC-1 αλλά όχι του PGC-1- RS από την SRPK1a και λιγότερο από την SRPK1. Ποσότητες από κυτταρικά εκχυλίσµατα 293Τ κυττάρων που είχαν επιµολυνθεί µε την FLAG-SRPK1a ή την FLAG-SRPK1 ανοσοκατακρηµνίστηκαν µε το Μ5 anti- FLAG µονοκλωνικό αντίσωµα. Στις διαδροµές 1 και 2 φαίνεται το αποτύπωµα που αφήνει στην αυτοραδιογραφία η φωσφορυλίωση των GST-PGC-1 και GST-PGC-1- RS αντίστοιχα από την ανοσοκατακρηµνισµένη FLAG-SRPK1a, ενώ στις διαδροµές 3 και 4 το αποτύπωµα που αφήνει στην αυτοραδιογραφία η φωσφορυλίωση των GST-PGC-1 και GST-PGC-1- RS αντίστοιχα από την ανοσοκατακρηµνισµένη FLAG-SRPK1. 3.22. IΝ VITRO ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ SRPK1a ΜΕ ΤΗΝ RS ΑΚΟΛΟΥΘΙΑ ΤΟΥ PGC-1 Προκειµένου να διαπιστώσουµε αν οι SRPK1a και SRPK1, εκτός από το να φωσφορυλιώνουν, αλληλεπιδρούν µε την πρωτεΐνη σύντηξης GST-PGC-1 χρησιµοποιήσαµε δοκιµασίες συγκατακρήµνισης. Περίπου 4 µg GST-PGC-1 ή καθαρής GST καθηλώθηκαν σε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης και επωάστηκαν µε κυτταρικά εκχυλίσµατα 293Τ κυττάρων (60 µl σε κάθε περίπτωση), που είχαν επιµολυνθεί µε τον pcmv-2 πλασµιδιακό φορέα και υπερέκφραζαν την FLAG- SRPK1a ή την FLAG-SRPK1. Η επώαση των καθηλωµένων GST-PGC-1 και GST µε τα κυτταρικά εκχυλίσµατα έγινε σε 1 ml ρυθµιστικού διαλύµατος PBST. Οι πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες. Οι

157 δεσµευµένες SRPK1a και SRPK1 ανιχνεύθηκαν έπειτα από ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας το Μ5 µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει το FLAG επίτοπο. Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.28.Β, η SRPK1a δεσµεύεται στην RS ακολουθία του PGC-1. Συγκεκριµένα, παρατηρείται δέσµευση της SRPK1a στον GST-PGC-1, ενώ δε δεσµεύεται στον PGC-1- RS, από τον οποίο έχει αφαιρεθεί η RS ακολουθία, ή σε σκέτη GST. Αντίθετα, παρατηρείται µια ελάχιστη δέσµευση της SRPK1 στον GST-PGC-1 (σχήµα 3.28.Α). (A) 1 2 3 4 5 (B) 1 2 3 4 5 123 123 81 81 Σχήµα 3.28. In vitro δέσµευση της SRPK1a στην RS ακολουθία του PGC-1. Ανοσοανίχνευση µε το M5 µονοκλωνικό αντίσωµα των FLAG-SRPK1 (Α) και FLAG-SRPK1a (Β), υπερεκφρασµένων σε κύτταρα 293Τ, που συγκατακρηµνίστηκαν µε καθαρή GST (διαδροµή 3), GST-PGC-1 (διαδροµή 4) και GST-PGC-1- RS (διαδροµή 5). Στη δεύτερη διαδροµή έτρεξαν 5 µl (1/12 του όγκου που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα συγκατακρήµνισης) κυτταρικού εκχυλίσµατος 293Τ κυττάρων, όπου είχε υπερεκφραστεί η FLAG-SRPK1 (Α) ή η FLAG-SRPK1a (Β), ενώ στη πρώτη διαδροµή έτρεξαν µάρτυρες µοριακής µάζας. 3.23. Η ΠΛΟΥΣΙΑ ΣΕ RS ΙΠΕΠΤΙ ΙΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΤΟΥ PGC-1 ΕΙΝΑΙ ΜΕΡΙΚΏΣ ΥΠΕΥΘΥΝΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΑΓΩΓΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ HNF-4 Αφού διαπιστώσαµε ότι η RS ακολουθία του PGC-1 όχι µόνο φωσφορυλιώνεται αλλά και αλληλεπιδρά µε την SRPK1a και δεδοµένου ότι η SRPK1a, σε HepG2 κύτταρα, επάγει τη µεταγραφή που εξαρτάται από HNF-4α, σε ένα επόµενο βήµα θελήσαµε να µελετήσουµε το ρόλο της RS ακολουθίας στην ικανότητα του PGC-1 να λειτουργεί ως συνενεργοποιητής του HNF-4α. Για το λόγο HepG2 κύτταρα συνεπιµολύνθηκαν µε 3 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς CAT, 1 µg pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση και 0.2 µg πλασµιδιακού φορέα που εκφράζει τον PGC-1.

158 Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.29 η συνεπιµόλυνση των κυττάρων µε PGC- 1 επάγει σε µεγάλο βαθµό τη µεταγραφική ικανότητα του ενδογενούς HNF-4α (διαδροµή 2). Όταν όµως τα κύτταρα συνεπιµολυνθούν µε τον PGC-1- RS, που δεν περιέχει την RS ακολουθία (διαδροµή 3), τότε παρατηρείται µειωµένη επαγωγή της µεταγραφικής ικανότητας του ενδογενούς HNF-4α (περίπου στο 50%, βλ. σχήµα 3.29.Β), γεγονός που υποδηλώνει συµµετοχή της RS ακολουθίας στη διαδικασία της µεταγραφής. Στη συνέχεια θελήσαµε να δούµε αν η φωσφορυλίωση των RS διπεπτιδίων από την SRPK1a επηρέαζει την ικανότητα του PGC-1 να δρα ως συνενεργοποιητής. Στο συγκεκριµένο πείραµα, η προσθήκη εξωγενούς SRPK1a (διαδροµή 4) είχε ως αποτέλεσµα µια µικρότερη επαγωγή της µεταγραφής (2,5 φορές στο συγκεκριµένο πείραµα, έναντι 5 φορών στο πείραµα της παραγράφου 3.18). Η συνεπιµόλυνση των κυττάρων µε PGC-1 και SRPK1a (διαδροµή 5) δεν οδήγησε σε µεγαλύτερη επαγωγή της µεταγραφικής ικανότητα του ενδογενούς HNF-4α, απ αυτήν που παρατηρήθηκε όταν στα κύτταρα είχε προστεθεί µόνο εξωγενής PGC-1 (διαδροµή 2). Βέβαια, στην περίπτωση αυτή τα περιθώρια επαγωγής είναι µικρά, αφού η προσθήκη εξωγενούς PGC-1 οδηγεί στη µετατροπή του συνόλου σχεδόν της χλωραµφαινικόλης στην ακετυλιωµένη µορφή της. Α 1 2 3 4 5 6 Ακετυλοχλωραµφαινικόλη Ακετυλοχλωραµφαινικόλη Χλωραµφαινικόλη

159 Β Σχετική δραστικότητα CAT (%) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 control PGC-1 Σχήµα 3.29. Η RS ακολουθία του PGC-1 είναι µερικώς υπεύθυνη για την επαγωγή της µεταγραφής που εξαρτάται από τον HNF-4α, σε HepG2 κύτταρα. (Α) Αυτοραδιογραφία έπειτα από δοκιµασία έκφρασης χλωραµφαινικόλης (CAT assay) σε HepG2 κύτταρα που είχαν συνεπιµολυνθεί µε 3 µg πλασµιδίου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς CAT, 1 µg pcmv β-gal που εκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση και 0,2 µg pcdna3 που εκφράζει τον PGC-1 (διαδροµή 2), 0,2 µg pcdna3 που εκφράζει τον PGC-1- RS (διαδροµή 3), 4 µg pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a (διαδροµή 4), 0,2 µg pcdna3 που εκφράζει τον PGC-1 και 4 µg pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a (διαδροµή 5) και 0,2 µg pcdna3 που εκφράζει τον PGC-1- RS και 4 µg pflag-cmv-2 που εκφράζει την SRPK1a (διαδροµή 6). Στη διαδροµή 1 φαίνεται η έκφραση CAT που επάγεται από τον ενδογενή HNF-4α, χωρίς την προσθήκη εξωγενούς PGC-1 ή SRPK1a. (Β) Ποσοτικοποίηση των αποτελεµάτων της αυτοραδιογραφίας. Ως σχετική δραστικότητα CAT θεωρούµε το λόγο των κρούσεων διακετυλοχλωραµφαινικόλη + ακετυλοχλωραµφαινικόλη/χλωραµφαινικόλη. Ως 100% θεωρούµε το λόγο αυτό στη περίπτωση του ενδογενούς HNF-4α (control, διαδροµή 1). Το γεγονός όµως ότι η συνεπιµόλυνση των κυττάρων και µε SRPK1a ουσιαστικά δεν οδηγεί σε περαιτέρω µετατροπή της σε ακετυλιωµένη µορφή (συγκρίνετε διαδροµές

160 2 και 5), πιθανά να σηµαίνει ότι η φωσφορυλίωση δεν επηρεάζει τη λειτουργικότητα της RS ακολουθίας και ο µηχανισµός ενεργοποίησης της µεταγραφής από την SRPK1a δεν είναι µέσω του PGC-1. Την υπόθεση αυτή ενισχύει και η παρατήρηση πως συνεπιµόλυνση των HepG2 κυττάρων µε PGC-1- RS και SRPK1a (διαδροµή 6) οδήγησε σε διπλασιασµό περίπου της επαγωγής της µεταγραφικής ικανότητας του ενδογενούς HNF-4α, απ αυτήν που παρατηρήθηκε όταν στα κύτταρα είχε προστεθεί µόνο PGC-1- RS. 3.24. ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΟΥ HNF-4 ΜΕ ΤΗΝ SRPK1a. Όπως ήδη δείξαµε, η SRPK1a, σε HepG2 κύτταρα, επάγει τη µεταγραφή που εξαρτάται από τον HNF-4α. Η SRPK1α επίσης περιέχει στο µόριο της την ακολουθία LXXLL που έχει αναφερθεί ότι είναι το καθοριστικό µοτίβο για την αλληλεπίδραση µιας πρωτεΐνης µε τους πυρηνικούς υποδοχείς (Torchia et al., 1997). Σε ένα επόµενο βήµα, θελήσαµε λοιπόν να ελέγξουµε την πιθανή απ ευθείας αλληλεπίδρασή της µε τον τον HNF-4α. Για το λόγο αυτό έγιναν δοκιµασίες συνανοσοκατακρήµνισης, χρησιµοποιώντας τις ενδογενείς πρωτεΐνες των HepG2 κυττάρων. Τα πιθανά σύµπλοκα µεταξύ HNF-4α και SRPK1a ανοσοκατακρηµνίστηκαν µε το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι στον HNF-4α και αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης και έγινε προσπάθεια ανίχευσης της SRPK1a µε κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωµα. Με τη µέθοδο της ανοσοαποτύπωσης δεν ανιχνεύθηκε καθόλου SRPK1a στη µεµβράνη νιτροκυτταρίνης. (A) RKSQSSSSSPSRRSRSRSRSRSPGRPAKG R1 πεπτίδιο R2 πεπτίδιο R0 πεπτίδιο RKSQSSSSSPSRRSRSRS RSRSRSPGRPAKG SSPSRRSRSRSRSRSPGRPAKG

161 (B) 1 2 3 4 Σχήµα 3.30. Ο HNF-4a συνανοσοκατακρηµνίζει µια δραστικότητα κινάσης που αντιστοιχεί σε SRPK. (Α) Αλληλουχία των πεπτιδίων R1, R2 και R0. (Β) Αυτοραδιογραφία από δοκιµασία φωσφορυλίωσης στην οποία ως πηγή κινάσης χρησιµοποιήθηκε η δραστικότητα που συνανοσοκατακρηµνίστηκε µε τον HNF-4 από HepG2 κύτταρα. Τα ανοσοκατακρηµνίσµατα επωάστηκαν µε 2 µg GST-62-92, 25 µμ [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ και 10 mm MgCl 2 απουσία (διαδροµή 1) ή παρουσία 500 µμ R1 (διαδροµή 2), R2 (διαδροµή 3) και R0 (διαδροµή 4) πεπτιδίου αντίστοιχα. Για το λόγο αυτό αποφασίσαµε να επαναλάβουµε την ανοσοκατακακρήµνιση µε τις ίδιες συνθήκες αλλά αυτή τη φορά ελέγξαµε αν συγκακατακρηµνίζεται δραστικότητα κινάσης µε τον HNF-4α. Στις δοκιµασίες in vitro φωσφορυλίωσης που έγιναν στα ανοσοκατακρηµνίσµατα χρησιµοποιήσαµε ως υπόστρωµα το τµήµα του Ν-τελικού άκρου του υποδοχέα της λαµίνης Β (LBR) που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 62 και 92, εκφρασµένο ως πρωτεΐνη σύντηξης µε GST στα Ε. coli (GST-62-92). Το τµήµα αυτό, όπως ήδη αναφέραµε (βλ. και παρ. 3.16), αποτελεί ένα εξειδικευµένο υπόστρωµα των SRPK1/SRPK1a. Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.30.Β ο HNF-4α συνανοσοκατακρηµνίζει µια δραστικότητα κινάσης που φωσφορυλιώνει έντονα την πρωτεΐνη σύντηξης GST-62-92. Για να επιβεβαιώσουµε ότι πράγµατι η δραστικότητα κινάσης που συγκατακρηµνίστηκε αντιστοιχεί σε SRPK, η δοκιµασία φωσφορυλίωσης πραγµατοποιήθηκε απουσία ή παρουσία των πεπτιδίων R1, R2 και R0, σε συγκέντρωση 500 µμ. Τα πεπτίδια αυτά αντιστοιχούν σε επιµέρους τµήµατα της αλληλουχίας του Ν-τελικού άκρου του LBR, που περιέχεται µεταξύ των αµινοξέων 62 και 92, και περιλαµβάνουν το µεν R0 ολόκληρη την RS ακολουθία τα δε R1 και R2 το Ν- και C- τελικό τµήµα αυτής αντίστοιχα (βλ. σχηµατικά 3.30.Α). Είναι γνωστό από παλιότερες εγασίες (Papoutsopoulou et al., 1999) ότι το πεπτίδιο R0 αναστέλλει πλήρως τη δραστικότητα των SRPK s, το R2 σε ποσοστό πάνω από 80%, ενω το R1 προκαλεί µικρή αναστολή. Πράγµατι, ανάλογα επίπεδα αναστολής παρατηρήθηκαν και στη περίπτωση της δραστικότητας που συνανοσοκατακρηµνίστηκε µε τον HNF-4α.

162 3.25. ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΤΩΝ SRPK, p53 ΚΑΙ HNF-4α ΣΕ HepG2 ΚΥΤΤΑΡΑ. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΜΙΘΡΑΜΥΚΙΝΗΣ ΚΑΙ 5- ΦΘΟΡΟΟΥΡΑΚΙΛΗΣ. Στη συνέχεια θελήσαµε να ελέγξουµε την κατανοµή των SRPK1/SRPK1α σε HepG2 κύτταρα. Σε αντίθεση µε τα MCF-7 κύτταρα (βλ. πράγραφο 3.16), στη περίπτωση των HepG2 κυττάρων η µελέτη αυτή έγινε δυνατή µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, γιατί στα HepG2 κύτταρα τα επίπεδα της ενδογενούς κινάσης είναι ανιχνεύσιµα µε το αντίσωµα. Όπως προκύπτει από το σχήµα 3.30 η κινάση κατανέµεται και στα τέσσερα κλάσµατα που αποµονώθηκαν, µε τα επίπεδα της να είναι κάπως χαµηλότερα στο κλάσµα των πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας. Όταν όµως στα κύτταρα προστέθηκαν τα φάρµακα 5-φθοροουρακίλη (5-FU) και µιθραµυκίνη για 36 h, σε τελικές συγκεντρώσεις 50 µg/ml και 200 nm αντίστοιχα, τότε παρατηρήθηκε µια µεταβολή στην υποπυρηνική κατανοµή των SRPK s. Συγκεκριµένα, µειώθηκαν δραµατικά τα επίπεδα της κινάσης στο κλάσµα των πρωτεϊνών που εκχυλίζονται µε DNAse I καθώς και στο κλάσµα των πρωτεϊνών της πυρηνικής µήτρας (βλ. σχήµα 3.31). Σχήµα 3.31. Μεταβολή στην υποπυρηνική κατανοµή SRPK s, µετά από έκθεση HepG2 κυττάρων σε µιθραµυκίνη ή 5-φθοροουρακίλη για 36 h. Ποσότητες από τα κλάσµατα του κυτταροπλάσµατος, του νουκλεοπλάσµατος, της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Η κατανοµή των SRPK s µελετήθηκε στα διάφορα κλάσµατα µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωµα. Αριστερά: control HepG2 κύτταρα. εξιά: προσθήκη 50 µg/ml 5-FU (παρόµοια εικόνα έδωσε και η προσθήκη µιθραµυκίνης). Ενώ οι SRPK s εµφανίζονται και στα τέσσερα κλάσµατα στα control κύτταρα, µετά την προσθήκη 5-FU ή µιθραµυκίνης εξαφανίζονται από το κλάσµα της DNAseI ενώ παράλληλα ελαττώνονται τα επίπεδα τους και στο κλάσµα της πυρηνικής µήτρας.

163 Και η 5-φθοροουρακίλη και η µιθραµυκίνη έχει βρεθεί ότι προκαλούν σηµαντική απόπτωση στα HepG2 κύτταρα, επάγοντας την πρωτεΐνη p53 (Longley et al., 2003). Επαναλάβαµε λοιπόν την υποκυτταρική κατανοµή είτε απουσία είτε παρουσία των φαρµάκων 5-FU, µιθραµυκίνη) ελέγχοντας αυτή τη φορά, µε ανοαποτύπωση κατά Western, τα επίπεδα της πρωτεΐνης p53. Όπως φαίνεται στο σχήµα 3.32, παρατηρήθηκε µια σηµαντική αύξηση των επιπέδων της p53 στο κλάσµα του νουκλεοπλάσµατος αλλά κυρίως σε εκείνο της πυρηνικής µήτρας. Σχήµα 3.32. Μεταβολή στην έκφραση και κατανοµή της πρωτεΐνης p53, µετά από έκθεση HepG2 κυττάρων σε µιθραµυκίνη ή 5-φθοροουρακίλη για 36 h. Ποσότητες από τα κλάσµατα του κυτταροπλάσµατος, του νουκλεοπλάσµατος, της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Η κατανοµή της πρωτεΐνης p53 µελετήθηκε στα διάφορα κλάσµατα µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας το µονοκλωνικό αντίσωµα. DO-1. Αριστερά: control HepG2 κύτταρα. εξιά: προσθήκη 50 µg/ml 5-FU (παρόµοια εικόνα έδωσε και η προσθήκη µιθραµυκίνης). Προσθήκη των φαρµάκων είχε ως αποτέλεσµα την σηµαντική αύξηση της συγκέντρωσης της p53 στον πυρήνα και συγκεκριµένα στο νουκλεόπλασµα και στο κλάσµα των πρωτεϊνών που παραµένουν συνδεδεµένες µε την πυρηνική µήτρα. Με δεδοµένη τη µεταβολή στην κατανοµή των SRPK s και p53, ανάλογα µε την κατάσταση των κυττάρων, θελήσαµε να δούµε αν παρατηρείται και κάποια µεταβολή στην κατανοµή του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α, µετά από προσθήκη στα HepG2 κύτταρα 5-FU ή µιθραµυκίνης. Για το σκοπό αυτό έγινε εκ νέου υποκυτταρική κατανοµή (απουσία ή παρουσία 5-FU και µιθραµυκίνης) και έλεγχος των επιπέδων του HNF-4α, µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωµα. Ο HNF-4α κατανέµεται σχεδόν αποκλειστικά

164 στο κλάσµα του νουκλεοπλάσµατος, στα control κύτταρα, ενώ παρουσία των φαρµάκων παρατηρήθηκε µια πολύ µεγάλη µείωση των επιπέδων του. Στην περίπτωση αυτή, τα χαµηλά επίπεδα του HNF-4α σχεδόν ισοκατανέµονται µεταξύ του νουκλεοπλάσµατος και του κλάσµατος της πυρηνικής µήτρας. Σχήµα 3.33. Μεταβολή στην έκφραση και κατανοµή του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4α, µετά από έκθεση HepG2 κυττάρων σε µιθραµυκίνη ή 5-φθοροουρακίλη για 36 h. Ποσότητες από τα κλάσµατα του κυτταροπλάσµατος, του νουκλεοπλάσµατος, της DNAseI και της πυρηνικής µήτρας, που αντιστοιχούν στον ίδιο αριθµό κυττάρων, αναλύθηκαν σε πήκτωµα 10% SDS-PAGE. Η κατανοµή του HNF-4α µελετήθηκε στα διάφορα κλάσµατα µε ανοσοαποτύπωση κατά Western, χρησιµοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωµα. Αριστερά: control HepG2 κύτταρα. εξιά: προσθήκη 50 µg/ml 5- FU (παρόµοια εικόνα έδωσε και η προσθήκη µιθραµυκίνης). 3.26. Η ΥΠΕΡΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ SAF-B1 ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΣΤΑ HepG2 ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΙΚΡΗ ΕΛΑΤΤΩΣΗ ΣΤΑ ΕΠΙΠΕ Α ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΠΟΥ ΕΞΑΡΤΑΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΝ HNF-4α Από τα παραπάνω προκύπτει ότι, στα HepG2 κύτταρα, η µεταγραφή που εξαρτάται από τον υποδοχέα HNF-4α δεν φαίνεται να συνδέεται άµεσα µε την παρουσία του στο κλάσµα των πρωτεϊνών που είναι συνδεδεµένες µε το κλάσµα της πυρηνικής µήτρας. εν υπάρχει κάποια εξήγηση προς το παρόν για την µεταβολή της κατανοµής της κινάσης SRPK1a και της πρωτεΐνης p53 στα κύτταρα αυτά, παρουσία των κυτταροστατικών φαρµάκων 5-FU και µιθραµυκίνης, Αν και η µεταβολή αυτή δείχνει κάποια συσχέτιση της πυρηνικής µήτρας µε την µεταγραφική ενεργότητα των