ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ (UV VIS)

ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ (UV VIS)

Εισαγωγή Η απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας από ιόντα και μόρια αποτελεί τη βάση για ποιοτική ανίχνευση και για ποσοτικό προσδιορισμό των ενώσεων αυτών. Επιπλέον, μελέτες των φασμάτων απορρόφησης μας δίνουν τη δυνατότητα να βγάλουμε συμπεράσματα για τη δομή και τη σταθερότητα πολλών χημικών ενώσεων, έτσι ώστε να επιλέξουμε τις πλέον κατάλληλες συνθήκες και το βέλτιστο μήκος κύματος για να πραγματοποιήσουμε την ανάλυση.

Το λευκό φως Το λευκό φως είναι ηλεκτρομαγνητική ενέργεια που μεταφέρεται με τα «φωτόνια» ή «κβάντα ενέργειας» και έχει κυματική φύση. Δηλαδή το λευκό φως αποτελείται από πολλές ακτίνες, που κάθε μια μεταφέρει διαφορετικό ποσό ενέργειας και χαρακτηρίζεται από το δικό της μήκος κύματος.

Μετάδοση του φωτός Η φωτεινή ενέργεια μεταδίδεται με τη μορφή κυμάτων τα οποία έχουν ηλεκτρικές και μαγνητικές ιδιότητες. Παράδειγμα μετάδοσης του φωτός με τη μορφή επίπεδου πολωμένου κύματος Στο σχήμα αυτό το ηλεκτρικό πεδίο περιορίζεται στο επίπεδο xy και το μαγνητικό πεδίο περιορίζεται στο επίπεδο xz

Μετάδοση του φωτός Μήκος κύματος λ, είναι η απόσταση μετάδοσης δυο μέγιστων κατά την πορεία μετάδοσης της κύμανσης. Συχνότητα ν, είναι ο αριθμός των πλήρων κυμάνσεων ανά δευτερόλεπτο. (μονάδα μέτρησης s -1 ) Μια κύμανση το δευτερόλεπτο καλείται ένα Hertz (Hz).

Η ολική ενέργεια ενός μορίου Η ολική ενέργεια ενός μορίου E mol είναι το άθροισμα των επιμέρους ενεργειών που οφείλονται: σε ηλεκτρονικές διεγέρσεις E el, δονήσεις E vib, περιστροφή του μορίου E rot, δονήσεις γύρω από το σημείο Ο E z,p, ενέργεια μετατόπισης E tran και σε άλλες μορφές ενέργειας άλλης μορφής E o,t, σχέση E mol = E el + E vib + E rot + E z,p + E tran + E o,t

Η απορρόφηση ενός φωτονίου Η απορρόφηση ενός φωτονίου από ένα μόριο μπορεί να αυξήσει την ενέργεια του κατά διάφορους τρόπους. Όταν ένα φωτόνιο απορροφάται από ένα μόριο αυξάνει την ενέργειά του κατά μια ποσότητα ανάλογη με τη συχνότητα του φωτονίου και δίνεται από την εξίσωση: Ε Ε = hν Όπου Ε Ε = Αύξηση της ενέργειας του μορίου σε ergs h = 6.62 x 10-27 erg s ή 6.62 x 10-34 j s (η σταθερά του Planck) ν = Η συχνότητα του φωτονίου, s -1

Η απορρόφηση ενός φωτονίου Η συχνότητα ν συνδέεται με το μήκος κύματος λ του φωτονίου με τη σχέση: ν = c όπου c είναι η ταχύτητα μετάδοσης του φωτός 3 x 10 10 cm/s Η συχνότητα συχνά δίνεται σε μονάδες μήκους κύματος, Kaysers vτα οποία ορίζονται ως: v 1 όπου λ μετριέται σε cm Έτσι η εξίσωση της ενέργειας μπορεί να γραφεί ως: E hc hcv

Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα

Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα

Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα του λευκού φωτός Το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα του λευκού φωτός διακρίνεται: στην υπεριώδη περιοχή, που περιλαμβάνει τις ακτινοβολίες με μήκη κύματος από 100-380 nm ή υπεριώδη ακτινοβολία (UV = Ultra Violet), που μεταφέρει υψηλά ποσά ενέργειας στην ορατή περιοχή (Vis= Visible), με ακτινοβολίες μήκους κύματος από 380-780 nm, που περιλαμβάνει τις έγχρωμες ακτίνες που ερεθίζουν το μάτι μας (ορατές), Στην υπέρυθρη περιοχή με ακτινοβολίες μήκους κύματος 780-1000 nm, δηλαδή με υπέρυθρες ακτίνες (IR= Infra Red) που μεταφέρουν χαμηλά ποσά ενέργειας

Η φασματοφωτομετρία βασίζεται στη χρήση φωτός για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης χημικών ενώσεων ή στοιχείων που βρίσκονται με τη μορφή διαλύματος. Τα μόρια διαφόρων ενώσεων (ηλεκτρόνια σθένουςμεταπτώσεις e εξωτερικών στιβάδων) έχουν την δυνατότητα να απορροφούν φωτόνια και να μεταπίπτουν στη διεγερμένη κατάσταση με ταυτόχρονη αύξηση της ενέργειας. Το μόριο έχει τη δυνατότητα να εκπέμπει φωτόνια τα οποία έχει απορροφήσει και να μεταπίπτει στη χαμηλότερη ενεργειακή κατάσταση, η οποία ονομάζεται βασική κατάσταση

Η απορρόφηση φωτονίων αυξάνει την ενέργεια των μορίων, ενώ η εκπομπή ενέργειας μειώνει την ενέργεια των μορίων

Po P Πηγή Μονοχρωμάτορας Δείγμα Ανιχνευτής Ακτινοβολίας Ακτινοβολίας b Σχηματικό διάγραμμα φασματοφωτομετρικής διάταξης Η οπτική δέσμη παράγεται από μία φωτεινή πηγή, περνάει από έναν μονοχρωμάτορα, ο οποίος μπορεί να είναι πρίσμα, ένα διάφραγμα ή ένα φίλτρο, οπότε επιλέγεται το βέλτιστο μήκος κύματος. Στη συνέχεια η οπτική δέσμη με το βέλτιστο μήκος κύματος ισχύος Po περνάει μέσα από το δείγμα, το οποίο βρίσκεται μέσα σε μία κυψελίδα μήκους b και εξέρχεται από την άλλη πλευρά με ισχύ P, διότι μέρος της ακτινοβολίας απορροφάται από το δείγμα (P<Po). Το φως ενός μήκους κύματος λέγεται ότι είναι μονοχρωματικό.

Οργανολογία Τα φασματοφωτόμετρα περιέχουν τις εξής βασικές δομικές μονάδες: 1. Πηγή ακτινοβολίας σταθερής ισχύος 2. Επιλογέα μήκους κύματος για την απομόνωση της επιθυμητής ακτινοβολίας 3. Κυψελίδα για την τοποθέτηση δείγματος 4. Ανιχνευτή ακτινοβολίας, που μετατρέπει το οπτικό σήμα σε ηλεκτρικό 5. Σύστημα μέτρησης που αποτελείται από ενισχυτή σήματος και όργανο ανάγνωσης

Οργανολογία

Οι πηγές ακτινοβολίας οι οποίες χρησιμοποιούνται στη φασματοφωτομετρία πρέπει να πληρούν τις παρακάτω προϋποθέσεις : 1. Να έχουν σταθερή ένταση ακτινοβολίας 2. Να έχουν μεγάλη ένταση ακτινοβολίας 3. Η ένταση της ακτινοβολίας να είναι ανεξάρτητη από το μήκος κύματος 4. Η ακτινοβολία που παράγεται να καλύπτει όλο το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα

Οι οπτικές δέσμες Οι οπτικές δέσμες που παράγονται από τις διάφορες λυχνίες (δευτερίου & ξένου-υψηλής πίεσης- για το υπεριώδες, βολφραμίου & ξένου για το ορατό) περνούν μέσα από οπτικά συστήματα και αναλύονται ανάλογα με το μήκος κύματος. Τα συστήματα αυτά καλούνται μονοχρωμάτορες και διακρίνονται σε μονοχρωμάτορες πρίσματος και μονοχρωμάτορες φράγματος. Η οπτική δέσμη μετά από την έξοδό της από την κυψελίδα ρου δείγματος ανιχνεύεται από ειδικές διατάξεις οι οποίες καλούνται φωτοανιχνευτές. Οι ανιχνευτές είναι κατάλληλα συστήματα τα οποία μετατρέπουν το σήμα των φωτονίων της ακτινοβολίας σε ηλεκτρικό σήμα.

Η ένταση της φωτεινής δέσμης Η ένταση της φωτεινής δέσμης P (είναι η ενέργεια ανά δευτερόλεπτο ανά μονάδα επιφάνειας της δέσμης του φωτός) η οποία ανιχνεύεται είναι μικρότερη από την ένταση της δέσμης P o η οποία προσπίπτει στην κυψελίδα. Ο λόγος της εξερχόμενης έντασης ακτινοβολίας P προς την ένταση της προσπίπτουσας P o ορίζεται ως διαπερατότητα Τ (καθαρός αριθμός) και δίνεται από τη σχέση: T P P o Από τη σχέση αυτή προκύπτει ότι η αριθμητική τιμή της διαπερατότητας κυμαίνεται από 0 μέχρι 1. Η επί τοις εκατό διαπερατότητα (100 Τ) παίρνει τιμές από 0 έως 100.

Απορρόφηση, Α Ο δεκαδικός λογάριθμος του λόγου της έντασης της προσπίπτουσας ακτινοβολίας P o προς την εξερχόμενη P καλείται απορρόφηση Α (καθαρός αριθμός) και δίνεται από τη σχέση: Po A log logt P Όταν δεν έχουμε καθόλου απορρόφηση από το διάλυμα μας τότε P o = P και από την παραπάνω σχέση προκύπτει ότι Α=0. Αν το 90% του φωτός απορροφάται και το 10% διαπερνά το διάλυμα μας τότε P = P o /10 και έχουμε από την ίδια σχέση Α=1. Αν μόνο το 1% του φωτός διαπερνά το διάλυμα μας τότε P = P o /100 και προκύπτει από την ίδια σχέση Α=2. Η απορρόφηση πολλές φορές καλείται και οπτική πυκνότητα.

Νόμος των Lambert-Beer Ο λόγος για τον οποίο η απορρόφηση είναι τόσο σημαντική είναι γιατί είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση των μορίων του διαλύματος που απορροφούν ενέργεια από τη δέσμη του φωτός. Η απορρόφηση συμφωνά με το νόμο των Lambert- Beer δίνεται από τη σχέση: A bc όπου ε: ο συντελεστής μοριακής απορρόφησης ή εκπομπής (M -1 cm -1 ) b = το πάχος της κυψελίδας (cm) C = η συγκέντρωση του διαλύματος (mol L -1 ή Μ)

Νόμος των Lambert-Beer Η σχέση αυτή μπορεί να γραφεί και ως: A bc επειδή η απορρόφηση Α και ο συντελεστής ε εξαρτώνται από το μήκος κύματος της οπτικής δέσμης Όσο μεγαλύτερος είναι ο συντελεστής ε τόσο μεγαλύτερη είναι η απορρόφηση Α.

Χρωμοφόρα Το μέρος του μορίου το οποίο είναι υπεύθυνο για την απορρόφηση του φωτός καλείται χρωμοφόρο και είναι συνήθως διάφορες ομάδες (π.χ. ομάδες με διπλούς και τριπλούς δεσμούς, όπως >C=C<, C C, C Ν, >C=O, Ν=Ν κ.λ.π., απορροφούν σε μικρά μήκη κύματος της UV περιοχής.) Κάθε ένωση η οποία απορροφά στην ορατή περιοχή- ορατό φως (370 nm- 800 nm) εμφανίζεται έγχρωμη όταν τη διαπερνά ή ανακλάται από αυτή λευκό φως. Η κάθε ουσία απορροφά σε συγκεκριμένα μήκη κύματος, ενώ οι οφθαλμοί μας ανιχνεύουν φωτεινή ενέργεια, η οποία δεν απορροφάται. Το χρώμα που παρατηρείται είναι το συμπληρωματικό του χρώματος που απορροφάται. π.χ. το μπλε της βρωμοφαινόλης έχει ένα μέγιστο απορρόφησης στα 614 nm, οπότε το παρατηρούμενο χρώμα είναι.

Οδηγός χρωμάτων της Ορατής περιοχής του Φάσματος Μήκος κύματος (nm) Χρώμα που απορροφάται Χρώμα που παρατηρείται 380-420 Ιώδες Κιτρινοπράσινο 420-440 Ιώδες-Κυανό Κίτρινο 440-470 Κυανό Πορτοκαλί 470-500 Κυανοπράσινο Ερυθρό 500-520 Πράσινο Πορφυρό 520-550 Κιτρινοπράσινο Ιώδες 550-580 Κίτρινο Ιώδες-Κυανό 580-620 Πορτοκαλί Κυανό 620-680 Ερυθρό Κυανοπράσινο 680-780 Πορφυρό Πράσινο

Αρχές και εφαρμογές ποσοτικής φασματοφωτομετρίας Ο νόμος του Beer ισχύει με τις εξής προϋποθέσεις α) ο μόνος μηχανισμός αλληλεπίδρασης μεταξύ διαλυμένης ουσίας και ακτινοβολίας είναι η απορρόφηση β) η ακτινοβολία που πέφτει στο δείγμα είναι μονοχρωματική γ) το δείγμα βρίσκεται σε κυψελίδα με ομοιόμορφη διατομή δ) τα σωματίδια που απορροφούν δρουν ξεχωριστά το ένα από το άλλο και άσχετα προς τον αριθμό και το είδος τους. Α ολ = Α 1 + Α 2 + + Α n

Αποκλίσεις από το νόμο του Beer Ο νόμος του Beer μας λέει ότι η απορρόφηση είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση των μορίων που απορροφούν. Η σχέση αυτή δίνει πάρα πολύ καλά αποτελέσματα σε αραιά διαλύματα με συγκέντρωση 0.01 Μ για τις περισσότερες ενώσεις. Αποκλίσεις σε υψηλότερες συγκεντρώσεις μπορούν να οδηγήσουν σε σημαντικές αλλαγές στην απορρόφηση ή στις ιδιότητες του πυκνού διαλύματος.

Αποκλίσεις από το νόμο του Beer

Αποκλίσεις από το νόμο του Beer Τα διαλύματα τα οποία έχουν υψηλές συγκεντρώσεις παρουσιάζουν σημαντικές αποκλίσεις από το νόμο του Beer εξαιτίας της αλληλοεπιδράσεως των μορίων. Όταν ένα μόριο του διαλύματος αλληλοεπιδρά με ένα άλλο οι ηλεκτρικές ιδιότητες των μορίων, συμπεριλαμβανομένης και της απορρόφησης του φωτός, μεταβάλλονται. Το αποτέλεσμα είναι η εξάρτηση της απορρόφησης από τη συγκέντρωση να μην είναι ευθεία γραμμή. Αυτό το φαινόμενο συμβαίνει οπωσδήποτε στην ακραία περίπτωση όπου το διάλυμά μας καθίσταται υπέρκορο.

Αποκλίσεις από το νόμο του Beer Οι ηλεκτρικές ιδιότητες διαφόρων μορίων μεταβάλλονται ουσιαστικά με την αλλαγή του διαλύτη. Έτσι λοιπόν τα μόρια τα οποία δεν απορροφούν σε ένα διάλυμα είναι δυνατόν να απορροφούν αν αλλάξουμε διαλύτη. Η φυσική αλληλοεπίδραση δυο διαλυμένων ενώσεων, όπως είναι μια κατάσταση χημικής ισορροπίας, επιδρά στην απορρόφηση του φωτός. Το απλούστερο παράδειγμα στην περίπτωση αυτή είναι αυτό των ασθενών ηλεκτρολυτών, π.χ. τα ασθενή οξέα.

Αποκλίσεις από το νόμο του Beer Ένας άλλος παράγοντας ο οποίος επιδρά στην απόκλιση από το νόμο του Beer είναι ο τρόπος με τον οποίο χρησιμοποιούνται οι διάφορες κυψελίδες. Συχνά 2 ή περισσότερες κυψελίδες χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα, μια για το διάλυμα αναφοράς και μια ή περισσότερες για τα διαλύματα που πρόκειται να αναλυθούν. Έτσι λοιπόν κάθε μεταβολή στην κυψελίδα όπως: αλλαγή του πάχους, αλλαγή του σχήματος, κηλίδες επάνω στην επιφάνεια του γυαλιού, λερωμένες κυψελίδες ή κυψελίδες χαραγμένες, μπορεί να προκαλέσουν διάφορα προβλήματα στη μέτρηση της απορρόφησης του φωτός.

Αποφυγή σφαλμάτων κατά τη χρησιμοποίηση των κυψελίδων Για να αποφύγουμε τα σφάλματα κατά τη χρησιμοποίηση των κυψελίδων στη φασματοφωτομετρία θα πρέπει: 1. Η κυψελίδα να γεμίζει, έτσι ώστε η οπτική δέσμη του φωτός να περνά μέσα από το διάλυμα που πρόκειται να μετρηθεί και όχι πάνω από την επιφάνειά του. 2. Η κυψελίδα θα πρέπει πάντοτε να πλένεται μερικές φορές με το διάλυμα που πρόκειται να μετρηθεί. 3. Οι σταγόνες του διαλύματος ή οι βρομιές που βρίσκονται στο εσωτερικό της κυψελίδας πρέπει να απομακρύνονται με ειδικό χαρτί. Επίσης, πρέπει να απομακρύνονται και οι φυσαλίδες του αέρα από την εσωτερική επιφάνεια της κυψελίδας.

Αποφυγή σφαλμάτων κατά τη χρησιμοποίηση των κυψελίδων Για να αποφύγουμε τα σφάλματα κατά τη χρησιμοποίηση των κυψελίδων στη φασματοφωτομετρία θα πρέπει: 4. Κατά την εισαγωγή της κυψελίδας στον υποδοχέα του οργάνου θα πρέπει: α. Να τοποθετείται στην πορεία της οπτικής διαδρομής κατά τη σωστή φορά χωρίς να υπάρχουν αποτυπώματα από τα δάκτυλα ή διάφορες χαραγές. β. Μετά την τοποθέτηση της κυψελίδας στον υποδοχέα, θα πρέπει η οπτική διαδρομή να ευθυγραμμίζεται και στη συνέχεια η κυψελίδα να απομακρύνεται από το όργανο κατά τον ανάστροφο τρόπο.

Αποφυγή σφαλμάτων κατά τη χρησιμοποίηση των κυψελίδων Για να αποφύγουμε τα σφάλματα κατά τη χρησιμοποίηση των κυψελίδων στη φασματοφωτομετρία θα πρέπει: 5. Όταν χρησιμοποιούμε ταυτόχρονα 2 κυψελίδες, η μια θα πρέπει πάντα να χρησιμοποιείται για το διάλυμα αναφοράς και η άλλη για τα διάφορα δείγματα τα οποία πρόκειται να μετρηθούν, αρχίζοντας από τα αραιότερα διαλύματα των δειγμάτων και προχωρώντας στα πυκνότερα. Αν πρόκειται να αναλυθούν σειρές δειγμάτων θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι ίδιες κυψελίδες για την ίδια σειρά δειγμάτων και να μην αλλάζουν.

Οι κυψελίδες Οι κυψελίδες από απλό γυαλί είναι κατάλληλες για φασματοφωτομετρία ορατού (400 780nm) αλλά όχι για υπεριώδους (190-400nm) καθώς το γυαλί απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία (χρησιμοποιούνται κυψελίδες από χαλαζία= κρυσταλλικό πυρίτιο-διοξείδιο του πυριτίου). Οι συνηθισμένες κυψελίδες έχουν πάχος 1 cm και πωλούνται σε ζεύγη, ένα για το δείγμα και ένα για το λευκό (αναφορά). Τα φασματοφωτόμετρα εμφανίζουν μεγαλύτερη ακρίβεια στα ενδιάμεσα επίπεδα απορρόφησης (Α 0,4-0,9). Εάν διαπερνά το δείγμα πολύ λίγο φως (υψηλή απορρόφηση), η ένταση είναι δύσκολο να μετρηθεί. Εάν περνά πολύ φως (χαμηλή απορρόφηση) είναι δύσκολο να διαφοροποιηθεί η απορρόφηση του δείγματος από εκείνη του λευκού. Είναι επιθυμητό να ρυθμίζεται η συγκέντρωση του δείγματος έτσι ώστε η απορρόφηση να βρίσκεται σε ενδιάμεσες τιμές.

Εφαρμογές φασματοσκοπίας Υπεριώδους- Ορατού (UV-Vis) Εφαρμογές: 1. Προσδιορισμό της δομής μιας ένωσης 2. Ποιοτικό προσδιορισμό μιας ένωσης 3. Ποσοτική ανάλυση ενός συστατικού ένωσης ή μίγματος συστατικών. 4. Προσδιορισμό της νοθείας κ.α.

Φάσμα Απορροφήσεως Απεικόνιση Α ή Τ συναρτήσει μήκους κύματος λ Χρησιμοποιείται για: Τη διαπίστωση υπάρξεως χαρακτηριστικών ομάδων Τη διευκρίνηση δομής της ουσίας Την ταυτοποίηση της ουσίας (σύγκριση με φάσμα προτύπου ουσίας) Τα φάσματα UV δεν χαρακτηρίζουν συνολικά το μόριο αλλά δίνουν πληροφορίες για ορισμένες ομάδες (χρωμοφόρες) που απορροφούν ακτινοβολία) Χαρακτηριστικά φάσματος λ μεγ (μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης) και ε μεγ Από την Α μπορεί να προσδιορισθεί η συγκέντρωση της ουσίας (Α = ε b C)

Φάσματα Απορρόφησης Ακόρεστη αλδεΰδη (E)-3-(4-(dimethylamino)phenyl)acrylaldehyde

Υπολογισμός συγκέντρωσης Θεωρητικά δυνατός ο υπολογισμός C από τις σχέσεις: C = A / (εb) = A / (ab) = A / (A 1% 1cm b) Οι τιμές των σταθερών αναλογίας από τη βιβλιογραφία. Στην πράξη χρησιμοποιείται καμπύλη αναφοράς A ως προς C (διάγραμμα νόμου Beer) προτύπων με τις ίδιες ακριβώς συνθήκες μέτρησης με τα άγνωστα. Η κλίση της καμπύλης αναφοράς ισούται με εb ή αb Από την κλίση της καμπύλης αναφοράς και με γνωστό το b = 1,000 μπορούν να υπολογισθούν οι σταθερές αναλογίας ε, α Η μέτρηση απορροφήσεως γίνεται στο λ μεγ Επίτευξη μέγιστης ευαισθησίας Ελαχιστοποίηση μεταβολής απορρόφησης λόγω μικρών μεταβολών του μήκους κύματος (ύπαρξη πλατό)

Καμπύλη αναφοράς