ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ 9 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ 9 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Αργυρώ Σγουρού, Assistant Prof. Laboratory of Biology School of Science and Technology Hellenic Open University 2016-2017

Επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης Ο όρος «επιγενετικές τροποποιήσεις» περιγράφει τις (εν δυνάμει) αναστρέψιμες κληρονομήσιμες αλλαγές στη λειτουργία των γονιδίων, που εμφανίζονται χωρίς κάποια μεταβολή στην αλληλουχία του DNA ύναται να διατηρηθούν και να κληρονομηθούν κατά την κυτταρική διαίρεση και από γενιά σε γενιά Παραδείγματα επιγενετικής ρύθμισης γονιδίων: απενεργοποίηση του ενός Χ χρωμοσώματος στα θηλυκά άτομα, η έκφραση στους απογόνους είτε των πατρικής είτε των μητρικής προέλευσης γονιδίων που εξαρτώνται από την επιγενετική αποτύπωση, οι διαφορές σε φαινοτυπικά γνωρίσματα μεταξύ ομοζυγωτικών διδύμων κτλ.

Οι βασικοί Επιγενετικοί μηχανισμοί

Επιγενετικές τροποποιήσεις στις «ουρές» των ιστονών Η τροποποίηση των ουρών των ιστονών παράγει έναν «κώδικα ιστονών», ο οποίος αναγνωρίζεται από πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη γονιδιακή ρύθμιση Τόσο ο τύπος της τροποποίησης (μεθυλίωση, ακετυλίωση, φωσφορυλίωση κτλ) όσο και η θέση του τροποιημένου αμινοξέος, αλλά και ο συνδυασμός των διαφόρων τροποποιήσεων στα αμινοξέα των ιστονικών ουρών παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόδοση του κατάλληλου σήματος Ένας προφανής τρόπος επίδρασης των τροποποιήσεων των ουρών στην λειτουργία των ιστονών είναι ότι αλλάζοντας τα φορτία (π.χ η ακετυλίωση της λυσίνης εξουδετερώνει το θετικό της φορτίο), αλλάζει και η συγγένεια προς τον φορτισμένο σκελετό του DNA καθώς και η αλληλεπίδραση με τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες

Επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών πρωτεϊνών: Ακετυλίωση Μεταφορά ακετυλικής ομάδας σε αμινοξικό κατάλοιπο Λυσίνης ή Αργινίνης και δημιουργία ε-ν ακέτυλο-λυσίνης ή ε-ν-ακέτυλο-αργινίνης. Οι Histone AcetylTransferases (HATs) ακετυλιώνουν Λυσίνη/ Αργινίνη. Οι Histone Deacetylases (HDACs) αποακετυλιώνουν Λυσίνη/ Αργινίνη Γενικά, η ακετυλίωση των ιστονών ευνοεί την μεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων

Επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών πρωτεϊνών: Μεθυλίωση Τροποποίηση αμινοξικών καταλοίπων Λυσίνης ή Αργινίνης με προσθήκη ενός, δύο ή τριών μεθυλικών ομάδων Μεθυλιώσεις ιστονών σχετίζονται με ενεργοποίηση ή καταστολή της μεταγραφής, ανάλογα με το αμινοξικό κατάλοιπο της ουράς και την ιστόνη στην οποία προστίθενται Οι Histone Methyltransferases (HMTs) μεθυλιώνουν αμινοξικά κατάλοιπα Ιστονών Οι Histone Demethylases (HDMs) απομεθυλιώνουν αμινοξικά κατάλοιπα Ιστονών

Επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών πρωτεϊνών: Κώδικας Ιστονών

Επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών πρωτεϊνών: Μεθυλίωση Η προσθήκη μιας μεθυλομάδας στα Η3-Κ4 και Η3-Κ9 σχετίζεται με ενίσχυση της μεταγραφικής δραστηριότητας Η περαιτέρω μεθυλίωση της Η3-Κ9 (με δύο ή και τρεις μεθυλομάδες) σχετίζεται με το σχηματισμό ετεροχρωματίνης με τη συμμετοχή και της HP1 (heterochromatin protein 1)

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Προσθήκη μεθυλικής ομάδας στο DNA, για παράδειγμα στον 5 C του πυριμιδινικού δακτυλίου της Κυτοσίνης και δημιουργία 5-μεθυλ-κυτοσίνης Παρατηρείται συνήθως σε δινουκλεοτίδια CpG στο γονιδίωμα του ανθρώπου και γενικά σχετίζεται με αναστολή της μεταγραφικής δραστηριότητας Υπερμεθυλίωση του DNA παρατηρείται στην ετεροχρωματίνη και σχετίζεται με πλήρη καταστολή της γονιδιακής έκφρασης Τα δινουκλεοτίδια CpG συναντώνται συνήθως ως ομάδες στην 5 ρυθμιστική περιοχή ενεργών γονιδίων ως CG νησίδες (CpG islands). CpG islands θεωρούνται γονιδιακές περιοχές που φέρουν το δινουκλεοτιδίο CpG (cytosine base followed by a guanine base) σε αναλογία μεγαλύτερη του 60%. Στα ανώτερα θηλαστικά, τα CpG islands έχουν συνήθως μέγεθος 200 3000 base pairs.

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μέθοδοι ανίχνευσης της Μεθυλίωσης Η ανίχνευση των μεθυλιωμένων κυτοσινών (C) στην αλληλουχία του DNA είναι δυνατό να πραγματοποιηθεί με διάφορες πειραματικές μεθόδους Σε ένα πρώτο στάδιο το DNA γονιδιώματος επιδέχεται κατεργασία (bisulfite treatment) Με την κατεργασία όλες οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες (C) μετατρέπονται σε ουρακίλες (U), ενώ οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες (C), δεν μεταβάλλονται Όξινο θειώδες νάτριο

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μέθοδοι ανίχνευσης της Μεθυλίωσης Οι ουρακίλες (U) σε ένα δεύτερο στάδιο (με αντίδραση PCR) μετατρέπονται σε θυμίνες (Τ) Η αντίδραση ανίχνευσης της αλληλουχίας του συγκεκριμένου DNA τμήματος με pyroseqyencing αποδίδει για κάθε υποψήφια θέση το ποσοστό μεθυλίωσης

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Οι DNA methyltranferases μεταφέρουν μεθυλομάδες στο DNA (στον 5 C του πυριμιδινικού δακτυλίου της Κυτοσίνης) και οι πιο γνωστές στα θηλαστικά είναι οι DNMT1, DNMT3a και DNMT3b Οι DNMT3a και DNMT3b κάνουν de novo μεθυλίωση Η DNMT1 συντηρεί την προϋπάρχουσα μεθυλίωση (maintenance DNMT) DNMTs: Έχουν μία ρυθμιστική περιοχή στο Ν-τελικό και μια καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Οι γνωστοί τρόποι με τους οποίους η μεθυλίωση των Κυτοσινών στα CpG islands μπορεί να επηρεάσει τη γονιδιακή έκφραση είναι: - Η αναστολή πρόσδεσης ρυθμιστικών μεταγραφικών παραγόντων (transcription factors) σε θέσεις αναγνώρισης πάνω στο DNA - Η πρόσδεση στις μεθυλιωμένες Κυτοσίνες των methyl-cpg-binding proteins (MBPs), οι οποίες με τη σειρά τους αλληλεπιδρούν και προσελκύουν τις αποακετυλάσες των ιστονών (HDAC) με αποτέλεσμα την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, που την καθιστά ανενεργή μεταγραφικά

Επίδραση των διαφόρων ρυθμιστικών μηχανισμών για την διατήρηση ή μη της χρωματίνης σε ενεργή μορφή

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Μεταγραφική καταστολή λόγω επιγενετικής αποτύπωσης Η επιγενετική κληρονόμηση στα ανώτερα θηλαστικά Τα μοτίβα της γονιδιωματικής μεθυλίωσης διαγράφονται σε μεγάλο βαθμό κατά τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των αρχέγονων γαμετικών κυττάρων και επανέρχονται εκ νέου με φύλλο- εξαρτώμενο τρόπο κατά τη διάρκεια της γαμετογένεσης, με αποτέλεσμα ένα υψηλό ποσοστό μεθυλίωσης του γονιδιώματος. Μετά τη γονιμοποίηση, μια δεύτερη φάση μεγάλου επιγενετικού επαναπρογραμματισμού λαμβάνει χώρα: Εκτενής απομεθυλίωση του DNA παρατηρείται στον αρσενικό προπυρήνα ενώ το μητρικό γονιδίωμα απομεθυλιώνεται πιο αργά. Στη συνέχεια, η επιγενετική αποτύπωση για διάφορους γονιδιακούς τόπους διατηρείται τόσο στο πατρικό όσο και στο μητρικό γονιδίωμα σε όλες τις επόμενες γενεές κυττάρων.

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Μεταγραφική καταστολή λόγω επιγενετικής αποτύπωσης Η επιγενετική παραλλαγή λόγω διατροφικών και περιβαλλοντικών παραγόντων Η διαλεύκανση του αντίκτυπου των επιγενετικών αλλαγών στη συμπεριφορά και την ψυχική υγεία παρουσιάζει μια πολύ ενδιαφέρουσα πρόκληση. Πειράματα σε τρωκτικά δείχνουν ότι ορισμένες επιγενετικές αλλαγές μπορεί να προκληθούν αμέσως μετά τη γέννηση μέσω της φυσικής συμπεριφοράς της μητέρας προς το νεογέννητό της. Η προσοχή και η περιποίηση του νεογέννητου φαίνεται να ωθεί την ήρεμη συμπεριφορά τους ως ενήλικα ζώα. Σε αντίθεση, παραμελημένα νεογέννητα όταν μεγαλώσουν εκδηλώνουν νευρική και υπερκινητική συμπεριφορά. Η ανάλυση της επιγενετικής τροποποίησης περιοχών του εγκέφαλου, όπως ο ιππόκαμπος αποκαλύπτει διαφορετικά μοτίβα DNA μεθυλίωσης σε διάφορα γονίδια, τα οποία συνάδουν με τις παρατηρούμενες διαφορές στη συμπεριφορά των ενήλικων ζώων. Πρόσφατα αποτελέσματα ερευνών έδειξαν ότι σύνθετοι επιγενετικοί παράγοντες προάγουν μόνιμες αλλαγές σε ώριμους νευρώνες που πιθανώς παίζουν ζωτικό ρόλο στην αιτιολογία σοβαρών ψυχώσεων, όπως η σχιζοφρένεια ή η διπολική διαταραχή.

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Μεταγραφική καταστολή και ανθρώπινη νόσος Το σύνδρομο Rett είναι σποραδική νόσος που χαρακτηρίζεται από διανοητική καθυστέρηση Κοινός παράγοντας που ενοχοποιείται για την εκδήλωση του συνδρόμου είναι η μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί την κατασταλτική πρωτεΐνη MeCP2 (methyl-cpg-binding proteins, MBP) στο χρωμόσωμα Χ Ένας από τους μηχανισμούς που έχουν προταθεί είναι η καταστολή από την MeCP2 της έκφρασης του νευροτροφικού παράγοντα BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Ο BDNF είναι αυξητικός παράγοντας, του οποίου η έκφραση έχει συνδυαστεί με την ανάπτυξη του εγκεφάλου και τις συναπτικές αλλαγές που συνδέονται με τη μάθηση και τη μνήμη. Η διαταραχή αυτών των δραστηριοτήτων εξηγεί ως ένα βαθμό κάποια από τα γνωστικά συμπτώματα του συνδρόμου Rett

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Μεταγραφική καταστολή λόγω επιγενετικής αποτύπωσης Η επιγενετική αποτύπωση των γονιδίων Η19 (κωδικοποιεί ένα ρυθμιστικό RNA) και του ινσουλινοειδούς αυξητικού παράγοντα 2(Igf2-Insulinlike growth factor 2) στο χρωμόσωμα 11p15.5 στα θηλαστικά. Ο ενισχυτής downstream του Η19 ενεργοποιεί θεωρητικά και τα δύο γονίδια. Στο μητρικό χρωμόσωμα όμως προσδένεται η πρωτεΐνη CTCF που λειτουργεί ως μονωτής και κατασιγάζει την έκφραση του Igf2. Στο πατρικό χρωμόσωμα ευνοεί τη μεθυλίωση του υποκινητή του Η19 και το γονίδιο παραμένει ανενεργό. Διαταραχή της έκφρασης των αποτυπωμένων γονιδίων προκαλεί το σύνδρομο BeckwithWiedemann (BWS), που αποτελεί μία αναπτυξιακή διαταραχή. Χαρακτηρίζεται από υπεραύξηση του μεγέθους του σωματότυπου και αυξημένη επιρρέπεια σε ποικιλία μορφών καρκίνου της παιδικής ηλικίας (π.χ. όγκου Wilms). Πολλές περιπτώσεις BWS συνδέονται με διαλληλομορφική έκφραση του Igf2 και απουσία έκφρασης του Η19, ως αποτέλεσμα της μεθυλίωσης της θέσης πρόσδεσης του παράγοντα CTCF.

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Μεταγραφική καταστολή λόγω επιγενετικής αποτύπωσης Γιατί η φύση κάνει ανεκτή μια διαδικασία (διαλληλομορφική έκφραση γονιδίων) που βάζει έναν οργανισμό σε κίνδυνο, καθότι μόνο ένα από τα δύο αντίγραφα ενός γονιδίου λειτουργεί; Ο πιθανός λόγος, πολλοί ερευνητές πιστεύουν, είναι τα ανταγωνιστικά συμφέροντα, μεταξύ των δύο φύλλων ως προς του απογόνους τους!

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Υπομεθυλίωση και υπερμεθυλίωση υποκινητών γονιδίων Τα καρκινικά κύτταρα έχουν παρεκκλίνοντα πρότυπα υπομεθυλίωσης σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του γονιδιώματος και υπερμεθυλίωση σε υποκινητές ογκοκατασταλτικών γονιδίων (p53, Rb, BRCA1 και 2), δηλαδή καταστέλλουν την έκφρασή τους. Στο σύνολό τους οδηγούν σε μείωση της σταθερότητας γονιδιώματος. Υπερμεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (Rb) είναι υπεύθυνη για το συχνότερο οφθαλμικό καρκίνο στα παιδιά και έχει παρατηρηθεί σε σπάνιες οικογενείς περιπτώσεις που επλήγησαν από ρετινοβλάστωμα. Μελέτες του σποραδικού καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν δείξει αυξημένη μεθυλίωση και καταστολή της έκφρασης του γονιδίου hmlh1, υπεύθυνο για επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του γονιδιώματος.

Επιγενετικές τροποποιήσεις των νουκλεοτιδικών βάσεων του DNA: Μεθυλίωση Υπομεθυλίωση και υπερμεθυλίωση υποκινητών γονιδίων

Επιγενετική ρύθμιση μέσω παρεμβολής μορίων RNA: RNA interference-rnai Η κατασίγαση γονιδίων μέσω του μηχανισμού RNAi πραγματοποιείται με μικρά μόρια RNA, τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (small interfering RNAs, sirnas) και τα μικρο-rnas (micrornas, mirnas) Αμφότερα προέρχονται από πρόδρομα μόρια RNA, τα οποία κατατέμνονται από το ένζυμο Dicer σε μικρά μόρια RNA 21-23 νουκλεοτιδίων και έχουν ειδικές ρυθμιστικές λειτουργίες Αναστέλλουν την έκφραση γονιδίων στόχων (που φέρουν ομόλογες αλληλουχίες) με διαφορετικούς τρόπους: - Προκαλούν την αποικοδόμηση του mrna του γονιδίου στόχου (ο πιο καλά μελετημένος μηχανισμός) - Αναστέλλουν τη μετάφραση του mrna του γονιδίου στόχου - Επάγουν τροποποιήσεις της χρωματίνης στο γονιδιακό τόπο του γονιδίου στόχου με αποτέλεσμα την κατασίγαση της έκφρασής του - Σε περίπτωση επιμόλυνσης τα κύτταρα αμύνονται με αυτό το μηχανισμό ενάντια σε ιικούς εισβολείς

Επιγενετική ρύθμιση μέσω παρεμβολής μορίων RNA: Σύνθεση mirnas Παραγωγή δίκλωνου primary-mirna, με χαρακτηριστική δομή φουρκέτας Τα μόρια mirna παράγονται είτε από κωδικοποιούσες είτε από μη κωδικοποιούσες περιοχές του γονιδιώματος Η πρώτη τομή πραγματοποιείται στον πυρήνα από το ένζυμο Drosha και απελευθερώνει δομές στελέχουςβρόχου, τα pre-mirna Στο κυτταρόπλασμα αποκόπτεται και ο βρόχος με το ένζυμο DICER και δημιουργείται ένα πολυσύμπλοκο RISC, που αποτελείται από το mirna («επιβάτη» και «καθοδηγητή») και πρωτεΐνες της οικογένειας «Αργοναυτών» AGO2, με ικανότητα Slicer (κατατέμνει το υποψήφιο mrna)

Επιγενετική ρύθμιση μέσω παρεμβολής μορίων RNA: Σύνθεση των sirnas και mirnas Η κατασίγαση του γονιδίουστόχου εξαρτάται από τη συμπληρωματικότητα της αλληλουχίας μεταξύ του ώριμου mirna ή sirna και του στόχου Για τα mirnas η περιοχή μέγιστου βαθμού συμπληρωματικότητας με το γονίδιο-στόχο είναι περίπου 2-9 νουκλεοτίδια του 5 άκρου του μορίου «καθοδηγητή» από τα 21-23 νουκλεοτίδια που αποτελούν το ώριμο μόριο mirna Το μόριο «επιβάτης» είτε τέμνεται από το AGO2 είτε απομακρύνεται από το σύμπλοκο

Επιγενετική ρύθμιση μέσω παρεμβολής μορίων RNA: Ενοχοποίηση mirnas σε ανθρώπινες ασθένειες Από τα 2000-3000 περίπου είδη mirna που έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο, περισσότερα από τα μισά εδράζονται σε περιοχές του γονιδιώματος, οι οποίες είναι κατά κανόνα εξαρθρωμένες στα καρκινικά κύτταρα, είτε λόγω μεταλλαγής είτε λόγω απαλοιφής

Παραδείγματα εφαρμογής επιγενετικών μηχανισμών στο ανθρώπινο γονιδίωμα Η απενεργοποίηση του χρωμοσώματος Χ στα θηλυκά άτομα. Πραγματοποιείται μέσω μηχανισμών γονιδιακής ρύθμισης που αποσκοπούν στην εξισορρόπηση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών που καθορίζονται από γονίδια του Χ χρωμοσώματος (Εξισορρόπηση δόσης) Στο Χ χρωμόσωμα που προορίζεται για απενεργοποίηση έχουμε έκφραση του γονιδίου XIC και μεταγραφή μη κωδικού RNA (Xist) Το μη κωδικό RNA καλύπτει το Χ χρωμόσωμα που προορίζεται για απενεργοποίηση Ακολουθούν μεθυλίωση της Η3-Κ9, αποακετυλίωση της Η3-Κ9, μεθυλίωση του DNA και ενσωμάτωση της ειδικής Ιστόνης mη2α