ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΝΤΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ» ΙΩΑΝΝΑ ΓΙΟΠΑΝΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ-ΕΡΕΥΝΗΤΡΙΑ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΝΤΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ» ΙΩΑΝΝΑ ΓΙΟΠΑΝΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ-ΕΡΕΥΝΗΤΡΙΑ ΠΑΤΡΑ 215

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΟΣΤΕΟΠΟΝΤΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ» ΙΩΑΝΝΑ ΓΙΟΠΑΝΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ-ΕΡΕΥΝΗΤΡΙΑ Επιβλέπων Καθηγητής: Γεώργιος Σταθόπουλος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών ΠΑΤΡΑ 215 1

Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Σταθόπουλος Γεώργιος Αγγελάτου Φεβρωνία Πέτρου-Παπαδάκη Ελένη Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Σταθόπουλος Γεώργιος Αγγελάτου Φεβρωνία Πέτρου-Παπαδάκη Ελένη Κωστόπουλος Γεώργιος Καρδαμάκης Δημήτριος Πανουτσακοπούλου Βασιλική Κωστούρου Βασιλική Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών PhD, Ερευνήτρια Β Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών PhD, Ερευνήτρια Γ Ερευνητικό Κέντρο Βιοϊατρικών Επιστημών «Αλ. Φλέμινγκ» 2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...5 Περίληψη...8 Abstract...9 Κεφάλαιο 1- Εισαγωγή...1 1.1 Καρκίνος...11 1.2 Καρκίνος του πνεύμονα...11 1.3 Μοριακή βιολογία του καρκίνου του πνεύμονα...12 1.4 Καρκίνος και μετάσταση...16 1.5 Μετάσταση στον πνεύμονα...18 1.6 Οστεοποντίνη...2 1.7 Δομή της οστεοποντίνης...2 1.8 Έκφραση της οστεοποντίνης...22 1.9 Υποδοχείς πρόσδεσης της οστεοποντίνης...22 1.1 Λειτουργίες της Οστεοποντίνης...24 1.11 Ο ρόλος της οστεοποντίνης στην καρκινογένεση...26 1.12 Η προερχόμενη από την ξενιστή και το καρκινικό κύτταρο οστεοποντίνη 29 Κεφάλαιο 2- Υλικά και μέθοδοι...31 2.1 Κυτταρικές Σειρές...32 2.2 Ζωικά Μοντέλα 34 2.3 Επεξεργασία ιστών για μελέτη με φωτονικό μικροσκόπιο- Μονιμοποίηση..36 2.4 Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί...39 2.5 Προσδιορισμός ρυθμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης και κυτταρικού θανάτου...4 2.6 Ανοσοφθορισμός...41 2.7 Ανοσοκυτταροχημεία...42 2.8 Ποσοτικός προσδιορισμός mrna επιπέδων και ανάλυση μικροσυστοιχιών.43 2.9 Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων...44 Κεφάλαιο 3- Αποτελέσματα.. 45 3.1 Η Οστεοποντίνη εκφράζεται στους πνεύμονες και στον ορό του αίματος 3

ποντικών κατά την διάρκεια της μετάστασης στους πνεύμονες..46 3.2 Η προερχόμενη από τον ξενιστή οστεοποντίνη δεν παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη μετάσταση στον πνεύμονα..48 3.3 Έκφραση της ενδοκυττάριας και εκκρινόμενης SPP1 από διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων...5 3.4 Η ισομορφή 2 της SPP1 αποτρέπει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μέσα από κυτταρικά αυτόνομα μονοπάτια...52 3.5 Ο TrP53 διαμεσολαβεί στην κυτταρικά αυτόνομη δράση της SPP1...54 3.6 Ο ρόλος των ισομορφών της SPP1 στην ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο της αυτόματης μετάστασης...57 3.7 Η SPP1 προάγει την επαγόμενη μετάσταση στους πνεύμονες...59 3.8 Η δράση της SPP1 πραγματοποιείται μέσω σημάτων επικοινωνίας της CCL2 προς τον CCR2 υποδοχέα..6 Κεφάλαιο 4- Συζήτηση....65 Βιβλιογραφία...73 Παράρτημα...83 4

Πρόλογος Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Καρκινογένεσης του Αναπνευστικού στο τμήμα Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών από τον Οκτώβρη του 212 έως τον Οκτώβρη του 215 και χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο Έρευνας (Starting Grant #26524, που δόθηκε στον κ. Γεώργιο Σταθόπουλο για την ερευνητική του πρόταση με τίτλο KRASHIMPE). Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή, κ. Γεώργιο Σταθόπουλο που τρία χρόνια πριν αποκρίθηκε θετικά στην πρόθεσή μου να συμμετάσχω στην ερευνητική του ομάδα ως υποψήφια Διδάκτωρ. Μου έδωσε την ευκαιρία να αναζητήσω την καινούργια για μένα γνώση και τεχνογνωσία και να την εφαρμόσω σε μια σειρά πειραμάτων που οδήγησαν στο παρόν έργο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, κ. Πέτρου Παπαδάκη Ελένη και κ. Αγγελάτου Φεβρωνία για την καθοδήγηση, τις συμβουλές τους και για την κριτική σκέψη στην συγγραφή του κειμένου. Επιπλέον, ευχαριστώ πολύ τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, κ. Γ. Κωστόπουλο, Δ. Καρδαμάκη, Β. Πανουτσακοπούλου και Β. Κωστούρου που δέχτηκαν να συμμετάσχουν στην ολοκλήρωση της διατριβής. Θα ήθελα να τονίσω πως στα ερευνητικά αυτά χρόνια κατάφερα να εξελιχθώ τόσο σε γνωστικό επίπεδο όσο και σε επίπεδο χαρακτήρα. Έμαθα να δουλεύω μεθοδικά, να αξιολογώ τα αποτελέσματά μου, να μην απογοητεύομαι και να μην εγκαταλείπω. Αν με ρωτούσε κανείς θα έλεγα πως τα δύο βασικά χαρακτηριστικά που πρέπει να διαθέτει ένας ερευνητής στην καθημερινή μάχη που δίνει με την υπόθεσή του είναι η υπομονή και η επιμονή. Αισθάνομαι πως παρά τα εμπόδια και τις δυσκολίες που συνάντησα στο δύσκολο αυτό μονοπάτι αυτά τα δύο στοιχεία είναι που με οδήγησαν στο τέλος της διαδρομής. Όμως, όπως γνωρίζουμε η εκπόνηση μιας διδακτορικής διατριβής είναι αποτέλεσμα όχι μόνο προσωπικού μόχθου αλλά και ομαδικής δουλειάς. Σε αυτό το ταξίδι λοιπόν συνάντησα πολλούς ερευνητές κάθε ένας από τους οποίους κατάφερε να μου δώσει και κάτι διαφορετικό, μια καινούργια προσέγγιση των πραγμάτων, μια λύση μπροστά στο τέλμα, μια πρόταση, μια κουβέντα ενθάρυνσης. Οφείλω και ευχαριστώ θερμά τα μέλη του εργαστηρίου που με βοήθησαν και ιδιαίτερα τους Λιλή Ιωάννη, Παπαλεωνιδόπουλο Βασίλειο, Σπέλλα Μάγδα, Αρντιάνα Μουστάκη και Πάππου Ευθυμία για την υποστήριξη και καθημερινή βοήθειά τους. 5

Τέλος, θα ήθελα να αναφέρω πόσο σημαντικό είναι κάποιος να έχει την υποστήριξη των ανθρώπων του και ειδικά των γονιών του. Θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου μέσα από τα βάθη της καρδιάς μου για όλους τους αγώνες και τις θυσίες που έχουν κάνει ώστε να φτάσω σε αυτό το σημείο, να εκπληρώσω τα ονειρά μου, να γίνω καλύτερος άνθρωπος. 6

When I was a child I caught a fleeting glimpse out of the corner of my eye. I turned to look but it was gone. I cannot put my finger on it now. The child is grown... the dream is gone. -PINK FLOYD...για την Άννα 7

Περίληψη Ο πνεύμονας αποτελεί μια από τις κυριότερες θέσεις εγκαθίδρισης μεταστατικών όγκων μαζί με τον εγκέφαλο, το ήπαρ και τα οστά. Μέχρι σήμερα η οστεοποντίνη (secreted phosphoprotein 1, SPP1) έχει συσχετισθεί με την διασπορά ποικίλων όγκων στο σώμα, ωστόσο η δράση της στις πνευμονικές μεταστάσεις δεν έχει πλήρως αποσαφηνισθεί. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση και αποσαφήνιση του ρόλου της SPP1 στη μετάσταση στον πνεύμονα. Προκειμένου να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών επαγόμενης (υποδόρια εμφύτευση) αλλά και αυτόματης (ενδοφλέβια χορήγηση) μετάστασης, τριών διαφορετικών καρκινικών σειρών (MC38 και LLCαδενοκαρκίνωματα παχέος εντέρου και πνεύμονα αντίστοιχα, B16F1 μελάνωμα) σε φυσικού τύπου C57BL/6 ποντικούς (Spp1 +/+ ) αλλά και σε υπόστρωμα ένδειας SPP1 του ξενιστή (Spp1 -/- ). Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα τροποποιήθηκαν με αποσιώπηση χρησιμοποιώντας anti-spp1 shrna και με επαγόμενη υπερέκφραση της ενδοκυττάριας (Spp1is2) και της εκκρινόμενης (Spp1is4) ισομορφής. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα πνευμονικά επιθηλιακά και μυελοειδή κύτταρα εξέφραζαν κυρίως την Spp1is4, η οποία ωστόσο δεν επηρέασε την πνευμονική αποίκηση, αφού τόσο οι Spp1 +/+ όσο και οι Spp1 -/- ποντικοί ανέπτυξαν παρόμοιο αριθμό αυτόματων και επαγόμενων μεταστάσεων. Αντίθετα, τα καρκινικά κύτταρα εξέφραζαν και τις δύο ισομορφές με διαφορετικές ωστόσο επιδράσεις στο φαινόμενο: η Spp1is2 προήγαγε την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων στον πνεύμονα καταστέλλοντας την σταθεροποίηση του TRP53, ενώ η Spp1is4 επιτάχυνε την πνευμονική μετάσταση επάγοντας την έκκριση της χημειοκίνης CCL2. Παράλληλα, ποντικοί ενδεείς για το γονίδιο του CCR2 υποδοχέα (Ccr2 -/- ) εμφανίστηκαν μη προστατευμένοι στην πνευμονική μετάσταση καθώς καρκινικά κύτταρα επαρκή και μη σε SPP1 μπορούσαν να αποικήσουν παρόμοια πνεύμονες Ccr2 +/+ και Ccr2 -/- ποντικών, γεγονός που τονίζει την συμμετοχή της CCL2 στα επαγόμενα από SPP1 μεταστατικά φαινόμενα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η προερχόμενη από το καρκινικό κύτταρο SPP1 προάγει τις πνευμονικές μεταστάσεις και αποτελεί ενδεχομένως θεραπευτικό στόχο ώστε να αποφευχθεί η πνευμονική διασπορά ποικίλων όγκων του σώματος. Λέξεις-κλειδιά: οστεοποντίνη (SPP1), καρκινικά κύτταρα, πνευμονικές μεταστάσεις. χημειοκίνη CCL2, ογκοκατασταλτικό γονίδιο Trp53. 8

Abstract Together with the brain, liver, and bones, the lungs are frequent targets of tumor metastasis. Although osteopontin (secreted phosphoprotein 1, SPP1) has been associated with the dissemination of various bodily tumors, its role in lung-directed metastasis remains unknown. This study is designed in order to clarify the mechanism by which SPP1 induces pulmonary metastasis. To investigate this, we employed mouse models of spontaneous (after s.c. injection of a million tumor cells) and induced (after i.v. injection of half a million tumor cells) lung-targeted metastasis of three different cancer cell lines (MC38 colon and LLC lung adenocarcinomas; B16F1 melanoma) in syngeneic C57BL/6 mice competent (Spp1 +/+ ) and deficient (Spp1 -/- ) in both Spp1 alleles. Tumor-derived SPP1 expression was modulated using stable anti-spp1 shrna and forced overexpression of intracellular (Spp1is2) and secreted (Spp1is4) Spp1 isoforms. We determined that lung epithelial and myeloid cells expressed predominantly Spp1is4, which played no role in pulmonary metastasis, since Spp1 +/+ and Spp1 -/- mice equally developed spontaneous and induced metastases. On the contrary, tumor cells expressed both Spp1is2 and Spp1is4, which exerted distinct effects: Spp1is2 promoted blood-borne tumor cell survival in the lungs via suppressing TRP53 expression, whereas Spp1is4 accelerated lung metastasis by enhancing tumor-derived CCL2 secretion. Consistently with the above findings, CCR2 gene-deficient mice (Ccr2 -/- ) were protected from lung metastasis. In addition, SPP1-competent and -incompetent tumor cells could equally colonize the lungs of both Ccr2 +/+ and Ccr2 -/- mice, indicating a major contribution of CCL2 to SPP1-mediated pro-metastatic effects. In conclusion, our data indicate that tumor-derived SPP1 promotes pneumotropic metastasis and present a possible therapeutic target aimed at preventing pulmonary dissemination of various bodily tumors. Key words: osteopontin (SPP1), cancer cells, lung metastasis, CCL2 chemokine, tumor suppressive Trp53 gene. 9

1. Εισαγωγή 1

1.1 Καρκίνος Η μελέτη της βιολογίας του καρκίνου αποτελεί ένα πεδίο εκτεταμένης έρευνας κυρίως λόγω των ποικίλων μονοπατιών τα οποία μπορεί να ακολουθήσει ένα καρκινικό κύτταρο αλλά και των ποικίλων αλληλεπιδράσεών του με διάφορα μόρια. Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια η οποία μπορεί να επηρεάσει οποιοδήποτε μέρος του σώματος και οφείλεται στον ανώμαλο πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενός ιστού. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται πέρα από τα συνήθη όριά τους, ενώ στη συνέχεια μπορούν να επεκταθούν, να εισβάλουν και να μεταναστεύσουν σε άλλους ιστούς ή όργανα στο σώμα του ασθενούς[1]. Κατά τη διαδικασία της ανάπτυξης των καρκινικών όγκων, τα κύτταρα αποκτούν κάποια χαρακτηριστικά τα οποία δικαιολογούν την πολυπλοκότητα της νεοπλασματικής ασθένειας. Τέτοια χαρακτηριστικά είναι η σηματοδότηση για πολλαπλασιασμό, η αποφυγή καταστολέων της αύξησης, η αντίσταση σε σήματα κυτταρικού θανάτου (απόπτωση), η ενεργοποίηση ασταμάτητου διπλασιασμού του γενετικού υλικού, η επαγωγή αγγειογένεσης και τέλος η ενεργοποίηση εισβολής σε γειτονικούς ιστούς και η μετάσταση [2]. Πίσω από αυτά τα χαρακτηριστικά βρίσκονται αιτίες όπως η γενομική αστάθεια και η φλεγμονή που διευκολύνει την νεοπλασματική πρόοδο. Η ανάπτυξη που έχει λάβει χώρα τα τελευταία χρόνια στην έρευνα έχει προσθέσει δύο ακόμα χαρακτηριστικά στη λίστα όπως είναι ο επαναπρογραμματισμός του κυτταρικού μεταβολισμού και η ανοσο-ανθεκτικότητα. Επίσης, οι καρκινικοί όγκοι έχουν την ικανότητα να στρατολογούν και άλλα φαινομενικά φυσιολογικά κύτταρα, τα οποία αποτελούν το μικροπεριβάλλον του όγκου και βοηθούν στη τροφοδότησή του [3]. 1.2 Καρκίνος του πνεύμονα Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί περισσότεροι από 1 διαφορετικοί τύποι καρκίνου. Ο τύπος ονομάζεται από τα όργανα ή τους ιστούς στους οποίους δημιουργούνται οι όγκοι, παραδείγματος χάριν ο καρκίνος του πνεύμονα ξεκινάει στον πνεύμονα, του παχέος εντέρου στο παχύ έντερο κ.ο.κ.. Επίσης οι τύποι του καρκίνου χαρακτηρίζονται και από το είδος του κυττάρου από το οποίο προέρχονται, όπως τα επιθηλιακά και τα πλακώδη κύτταρα. 11

Γενικά, ο καρκίνος αποτελεί μία σημαντική απειλή για την δημόσια υγεία παγκοσμίως και οι ρυθμοί εμφάνισής του έχουν αυξηθεί στις περισσότερες χώρες, μετά το 199. Αποτελεί μάστιγα κυρίως για τις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου δεν υπάρχουν καλά οργανωμένα και εξοπλισμένα συστήματα υγείας, ώστε να προσφερθούν οι περίπλοκες και ακριβές θεραπείες που είναι απαραίτητες [4]. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου που εμφανίζεται στον άνθρωπο και αποτελεί την σημαντικότερη αιτία θανάτου που οφείλεται στον καρκίνο, σε άντρες και γυναίκες. Σύμφωνα με την ετήσια αναφορά της Αμερικανικής Εταιρίας για τον Καρκίνο για το έτος 215, περίπου 221,2 Αμερικάνοι εκ των οποίων 115,61 άντρες και 15,59 γυναίκες εμφάνισαν καρκίνο του πνεύμονα ενώ, 158,4 άνθρωποι εκ των οποίων 86,38 άντρες και 71,66 γυναίκες πέθαναν από αυτή την αιτία [5, 6]. Η βασική αιτία για τα επίπεδα εμφάνισης και θνησιμότητας της νόσου είναι το κάπνισμα [6]. Ο καρκίνος του πνεύμονα υποδιαιρείται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με την ιστολογία του. Συνήθως πρόκειται για καρκινώματα, τα οποία προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα και χωρίζονται σε δύο μεγάλες υποομάδες: μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα (non-small-cell lung carcinoma-nsclc) και μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα (small cell lung carcinoma-sclc). Ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα υποδιαιρείται περαιτέρω σε αδενοκαρκίνωμα, το οποίο προέρχεται από τον περιφερικό ιστό του πνεύμονα, πλακώδες καρκίνωμα που προέρχεται από τους κύριους αεραγωγούς και συνήθως οφείλεται σε ανικανότητα απόπτωσης των κυττάρων και μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα που αποτελούν το 4%, 3% και 1% αντίστοιχα, των νέων περιστατικών NSCLC που διαγιγνώσκονται [7]. Ακόμα, διάφορες μελέτες αναφέρουν ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ του φύλου του ασθενούς και του τύπου καρκίνου του πνεύμονα που αναπτύσσει. Πιο συγκεκριμένα οι άνδρες εμφανίζουν με μεγαλύτερη συχνότητα πλακώδες καρκίνωμα πνεύμονα ενώ οι γυναίκες αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα [8]. 1.3 Μοριακή βιολογία του καρκίνου του πνεύμονα Η παθογένεση του καρκίνου οφείλεται στη συσσώρευση μοριακών ανωμαλιών, οι οποίες προσδίδουν διάφορες ικανότητες στα καρκινικά κύτταρα όπως αναφέραμε και προηγουμένως. Οι ανωμαλίες αυτές αφορούν: μεταλλάξεις σε πρωτοογκογονίδια, οπότε τα καρκινικά κύτταρα έχουν επάρκεια σε σήματα αύξησης, μεταλλάξεις σε ογκοκατασταλτικά γονίδια, ώστε τα κύτταρα να μην αποπίπτουν, αυξορύθμιση έκφρασης αντιαποπτωτικών και μειωρύθμιση αποπτωτικών μορίων και ενεργοποίηση 12

της τελομεράσης, οπότε και υπάρχει ικανότητα αέναου πολλαπλασιασμού. Τέλος, πολύ σημαντικό ρόλο παίζει και η ικανότητα αγγειογένεσης καθώς και η δυνατότητα εισβολής και μετακίνησης των καρκινικών κυττάρων σε νέους ιστούς στόχους. Πιο συγκεκριμένα, κινάσες καταλοίπων τυροσίνης των πρωτεϊνών (Proteintyrosine kinases-ptks) που είναι υπεύθυνες για την ενδοκυτταρική μεταβίβαση σημάτων για την ανάπτυξη και την διακυτταρική επικοινωνία μπορεί να δώσουν σήματα μη ελεγχόμενης αύξησης. Υπό κανονικές συνθήκες η λειτουργία τους είναι αυστηρά ελεγχόμενη, όμως σε περιπτώσεις όπου έχουν προκληθεί μεταλλάξεις και άλλες γενετικές αλλαγές, η λειτουργία τους επηρεάζεται και έχουν ως αποτέλεσμα την καρκινική μεταμόρφωση. Επίσης, η υπερέκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου όπως οι κυκλίνες D1, E και B1 ενισχύουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μειώνουν την πιθανότητα απόπτωσης του κυττάρου [9]. Σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό παίζει και ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Epidermal growth factor receptor-egfr), στον οποίο όταν προσδεθεί το πρόσδεμα EGF, ενεργοποιείται η ενδοκυττάρια επικράτεια κινάσης της τυροσίνης και αυτοφωσφορυλιώνεται. Στη συνέχεια ενδοκυτταρικά ενεργοποιείται το σύμπλοκο p21-ras και οι πρωτεϊνικές κινάσες MAPK. Η σηματοδότηση του EGFR είναι απαραίτητη για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ενώ η απορύθμισή του οδηγεί στην παθογένεση του καρκίνου και στην καταστολή της απόπτωσης [1]. Τo πρωτοογκογονίδιο MYC κωδικοποιεί μεταγραφικό παράγοντα, ο οποίος ελέγχει την αύξηση και την απόπτωση του κυττάρου. Οι φωσφοπρωτεΐνες MYC εντοπίζονται στον πυρήνα και ασκούν τον μεταγραφικό έλεγχο μέσω ετεροδιμερισμού με τις πρωτεΐνες MAX, MAD και MX11. Το ετεροδιμερές MYC-MAX προσδένεται σε DNA αλληλουχίες, που βρίσκονται σε υποκινητές γονιδίων και ονομάζονται Ε-box, οπότε και ενεργοποιεί την μεταγραφή των γονιδίων που βρίσκονται καθοδικά [11]. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η ενεργοποίηση της ακετυλάσης ιστονών, που οδηγεί σε αλλαγές στη δομή της χρωματίνης και κατά συνέπεια τροποποιείται και η μεταγραφή γονιδίων [12]. Επίσης, το πρωτοογκογονίδιο RAS είναι μέγιστης σημασίας για την μεταγωγή αυξητικών σημάτων από την κυτταρική μεμβράνη στον πυρήνα και για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η οικογένεια των RAS γονιδίων συμπεριλαμβάνει τα γονίδια HRAS, KRAS και NRAS. Τα γονίδια RAS κωδικοποιούν μικρές πρωτεΐνες που εντοπίζονται αγκυροβολημένες στο εσωτερικό της πλασματικής μεμβράνης όπου αλληλεπιδρούν εύκολα με τους ενεργοποιητές τους. Στην ενεργή τους κατάσταση, οι RAS πρωτεΐνες 13

προσδένονται με τριφωσφορική γουανοσίνη (guanosine triphosphate-gtp) και μέσω της ενεργότητας GTPάσης και αλλαγής της στερεοδιαμόρφωσης τους υδρολύουν το GTP σε GDP, φωσφορυλιώνουν την πρωτεΐνη Raf1 και επανέρχονται στην ανενεργή τους κατάσταση. [13]. Στα καρκινικά κύτταρα με μεταλλαγμένο RAS γονίδιο, η πρωτεΐνη βρίσκεται μονίμως σε ενεργή κατάσταση ενεργοποιώντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια ευθύνονται για την διακοπή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και ενεργοποιούνται έπειτα από βλάβες στο γενετικό υλικό καθώς και στις διαδικασίες επανόρθωσης των βλαβών. Είναι σύνηθες να έχουμε απώλεια της λειτουργίας ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου κατά την νεοπλασματική πρόοδο στον πνεύμονα. Αυτή η απώλεια οφείλεται, είτε σε απώλεια ετεροζυγωτίας (loss of heterozygosity-loh) του γενετικού τόπου του ογκοκατασταλτικού γονιδίου δηλαδή απώλεια λόγω απαλοιφής ενός γενετικού τόπου από το ένα χρωμόσωμα και μετάλλαξη του έτερου κανονικού αλληλομόρφου, είτε σε επιγενετική υπερμεθυλίωση του υποκινητή ενός γονιδίου [14]. Παράδειγμα υπερεμεθυλίωσης του υποκινητή γονιδίου έχουμε για τον υποδοχέα β του ρετινοϊκού οξέος (retinoic acid receptor beta-rarβ) του οποίου χαμήλη ή καθόλου έκφραση παρατηρήθηκε με υψηλή συχνότητα σε καρκινικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και σε πρωτοπαθείς πνευμονικούς όγκους [15]. Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο Trp53 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11 στον ποντικό και στο 17 στον άνθρωπο (ΤΡ53) στη θέση p13.1 και υπό κανονικές συνθήκες κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 53 kda, που εντοπίζεται στον πυρήνα σε πολύ μικρές ποσότητες. Αυτή η πρωτεΐνη δρα ως μεταγραφικός παράγοντας, αφού προσδένεται σε συγκεκριμένα πρότυπα αλληλουχίας του DNA και ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων που επάγουν την παύση του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση του, ως απόκριση σε βλάβη που έχει υποστεί το γενετικό υλικό. Ο ρόλος δηλαδή του p53 είναι να διατηρεί την ακεραιότητα του γονιδιώματος σε καταστάσεις στρες του κυττάρου που οφείλονται σε βλάβη του DNA, υποξία και παρουσία ογκογονιδίων όπως αυτό της β-κατενίνης. Στην τελευταία περίπτωση η μεταλλαγμένη και μόνιμα ενεργοποιημένη β-κατενίνη ενεργοποιεί τον p53, μέσω της επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου ARF. Η πρωτεΐνη ARF προσδένεται και απενεργοποιεί την πρωτεΐνη Mdm2, η οποία κανονικά ουβικιτινυλιώνει την p53 και την οδηγεί προς αποικοδόμηση από το πρωτεάσωμα. Άρα η p53 είναι ενεργή και οδηγεί το κύτταρο σε σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου. Μεταλλάξεις που οδηγούν σε αλλαγή αμινοξέων της p53, καταστρέφουν την 14

ογκοκατασταλτική της δραστηριότητα και συνεπώς σε ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων [16]. Απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος χαρακτηρίζεται το φαινόμενο μίας γενετικά ελεγχόμενης διαδικασίας, η οποία είναι απαραίτητη κατά την αναδιαμόρφωση των ιστών κατά την εμβρυογένεση και κατά την διατήρηση της ομοιόστασης όσον αφορά στον αριθμό των κυττάρων του σώματος, σε ένα ενήλικο άτομο. Η απορύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών κυτταρικού θανάτου, έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη και πρόοδο των όγκων που αυτά σχηματίζουν [17]. Η οικογένεια πρωτεϊνών BCL-2 αποτελεί τους σημαντικότερους ρυθμιστές της απόπτωσης. Το γονίδιο Bcl-2 είναι το πρώτο ογκογονίδιο το οποίο δρα μέσω της προαγωγής της επιβίωσης των κυττάρων. Η πρωτεΐνη BCL-2 εντοπίζεται στην εξωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου, στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στον πυρηνικό φάκελο παίζοντας αντιαποπτωτικό ρόλο. Πιο συγκεκριμένα όταν δίνεται στο κύτταρο ένα αποπτωτικό ερέθισμα, οι πρωτεΐνες τελεστές ενεργοποιούνται μέσω μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων ή αλλαγών στη στερεοδιαμόρφωσή τους. Η πρωτεΐνη BCL-2 σχηματίζει ετεροδιμερή με πρωτεΐνες τελεστές οπότε και τις απενεργοποιεί. Σε περιπτώσεις κυτταρικής βλάβης ή βλάβης στο γενετικό υλικό, κανονικά έχουμε την παραγωγή αποπτωτικών σημάτων. Στα καρκινικά κύτταρα όμως σε τέτοιες περιπτώσεις, μέσω υπερέκφρασης της BCL-2 έχουμε αποφυγή της απόπτωσης [18]. Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διαιρούνται οφείλεται στη συνεχή ενεργοποίηση της τελομεράσης. Η τελομεράση είναι ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό ένζυμο που καταλύει την προσθήκη πολυνουκλεοτιδίων "TTAGGG" στο 3 άκρο των τελομερών. Τα τελομερή είναι ετεροχρωματινικές δομές στα άκρα των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων, που χρησιμεύουν ως προστατευτικά καλύμματα για την διατήρηση της ακεραιότητας του χρωμοσώματος. Στα κανονικά σωματικά κύτταρα τα τελομερή μικραίνουν σε μήκος σε κάθε κυτταρικό κύκλο εξαιτίας της ανικανότητας των DNA πολυμερασών να αντιγράψουν το 5' άκρο του γραμμικού DNA. Έχει υπολογιστεί ότι σε κάθε κύκλο αντιγραφής χάνονται περίπου 5-1 ζεύγη βάσεων και για αυτό το λόγο τα ανθρώπινα σωματικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να διαιρεθούν περίπου 5-7 φορές, πριν να σταματήσουν την αύξηση τους και να εισέλθουν σε φάση κυτταρικής απραξίας. Η μείωση του μήκους των τελομερών διευκολύνει την εξέλιξη του κυττάρου σε 15

καρκινικό επιτρέποντας την χρωμοσωμική σύντηξη των άκρων ή τη δημιουργία ανευπλοϊδίας[19]. Η δραστηριότητα της τελομεράσης απουσιάζει από τα κανονικά κύτταρα ενός οργανισμού, αλλά αυξάνεται κατά την ανάπτυξη και κατά την νεοπλασματική πρόοδο, έτσι ώστε να επιτρέψει τον ασταμάτητο πολλαπλασιασμό των κυττάρων λόγω αποικοδόμησης των τελομερών και κατά συνέπεια των χρωμοσωμάτων. Η αναστολή της δράσης της τελομεράσης σε καρκινικές σειρές με γενετικές ή φαρμακολογικές μεθόδους έχει οδηγήσει σε διακοπή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [2]. Η αυξημένη δράση της τελομεράσης οδηγεί τα καρκινικά κύτταρα σε αθανασία και η έκφραση της στο αδενοκαρκινώματα πνεύμονα αποτελεί δείκτη κακής πρόγνωσης [21]. Η νεοαγγειογένεση είναι μία διαδιακασία σχηματισμού νέου αγγειακού πλέγματος που θεωρείται απαραίτητη για την ανάπτυξη των όγκων σε μεγέθη μεγαλύτερα από 3 χιλιοστά και για τη μετάσταση. Για την παραπάνω διαδικασία χρειάζεται ο πολλαπλασιασμός και η μετακίνηση των ενδοθηλιακών κυττάρων που ρυθμίζεται από επαγωγείς όπως ο αυξητικός αγγειακός ενδοθηλιακός παράγοντας (vascular endothelial growth factor-vegf), ο βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (basic fibroblast growth factor-bfgf), ο αυξητικός παράγοντας αιμοπεταλίων (platelet-derived growth factor-pdgf) και άλλοι [22]. Ο VEGF φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα, καθώς ασθενείς με αυξημένα επίπεδα στο αίμα έχουν μικρότερο χρόνο επιβίωσης σε σχέση με ασθενείς με χαμηλά επίπεδα [23]. 1.4 Καρκίνος και μετάσταση Η μετάσταση είναι το πιο θανατηφόρο χαρακτηριστικό του καρκίνου καθώς είναι υπεύθυνη για πάνω από το 9% των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο [24]. Η μετάσταση είναι μία νεοπλασματική κάκωση που έχει προέλθει από άλλο όγκο ο οποίος δεν βρίσκεται σε γειτονική περιοχή. Η ικανότητα της παραγωγής μεταστάσεων αποδίδεται μόνο στα κακοήθη καρκινικά κύτταρα. Γενικά, η διαδικασία της μετάστασης περιλαμβάνει: την ενδοαγγείωση, δηλαδή την μετακίνηση μερικών κακοηθών καρκινικών κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο προς το εσωτερικό των αγγείων, την επιβίωση στην κυκλοφορία, την εξαγγείωση στο παρέγχυμα άλλων οργάνων, την προσαρμογή στο νέο μικροπεριβάλλον του οργάνου και την δημιουργία ενός δευτεροπαθούς όγκου [25]. 16

Τα καρκινικά κύτταρα φαίνεται πως αποκτούν την ικανότητα να εισβάλουν στους γειτονικούς ιστούς, αντιστέκονται στην απόπτωση και διασκορπίζονται σε ολόκληρο το σώμα μέσω μίας διαδικασίας που ονομάζεται επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάβαση (epithelial-mesenchymal transition-emt). Υπό κανονικές συνθήκες η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα κατά την εμβρυογένεση, στη φάση κατά την οποία τα κύτταρα μετακινούνται για τον σχηματισμό των τριών βλαστικών στιβάδων και κατά την διαδικασία επούλωσης πληγών. Η εισβολή των καρκινικών κυττάρων στους παρακείμενους ιστούς και στα αγγεία ενισχύεται από τα πρωτεολυτικά ένζυμα -μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας ύλης (Matrix metalloproteinases-mmps) αλλά και από τον ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase-type plasminogen activator-upa ή αλλιώς PLAU). Η πρόσδεση συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε υποδοχείς, μπορούν να ενεργοποιήσουν τα προένζυμα των ΜΜΡ, όπως συμβαίνει στις περιπτώσεις της MMP-2 που ενεργοποιείται από την ιντεγκρίνη αvβ3 και της MMP-7 που ενεργοποιείται από το CD44. Ο εντοπισμός των παραπάνω ΜΜΡ στις προεκβολές των κυττάρων που εισβάλουν στους γειτονικούς ιστούς αποτελεί χαρακτηριστικό των κακοηθών καρκινικών κυττάρων. Για να προχωρήσει η ΕΜΤ χρειάζονται εξωκυττάρια σήματα, όπως είναι η πρόσδεση του TGF-β παράγοντα και η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt. Ο TGF-β είναι μία κυτταροκίνη που προσδένεται στους υποδοχείς τύπου Ι και ΙΙ, επάγωντας το σηματοδοτικό μονοπάτι των Smad που τελικά ρυθμίζει την μεταγραφή γονιδίων. Αποτέλεσμα των παραπάνω είναι η μείωση των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, και η έκφραση μεσεγχυματικών κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών όπως η βιμεντίνη και η παραγωγή πρωτεασών όπως της ΜΜΡ-13 [26]. Επίσης σημαντικό ρόλο στη μετάσταση παίζει και το μικροπεριβάλλον του πρωτοπαθούς όγκου, το οποίο αποτελείται από κύτταρα του στρώματος και λευκά αιμοσφαίρια. Η επικοινωνία στρώματος και όγκου διαμεσολαβείται από αυξητικούς παράγοντες και χημειοκίνες. Τα καρκινικά κύτταρα φέρουν στην επιφάνειά τους υποδοχείς χημειοκινών που επηρεάζουν διεργασίες όπως η κυτταρική προσκόλληση, η διαπερατότητα των αγγείων, η καταστολή του ανοσοποιητικού και γενικότερα η μεταστατικότητα. Οι φλεγμονώδεις χημειοκίνες CCL2 και CCL5 θεωρούνται υπεύθυνες για την εξαγγείωση των καρκινικών κυττάρων σε άλλα όργανα και για την εγκατάσταση και τον πολλαπλασιασμό τους. Η CCL2 και η CCL5 παράγονται τόσο από τα κακοήθη καρκινικά κύτταρα όσο και από τα μονοκύτταρα, έτσι ώστε να ενεργοποιηθούν τα 17

ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και να διευκολυνθεί η εξαγγείωση των καρκινικών κυττάρων [27]. 18

Εικόνα 1: Οι μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι συμμετέχουν σε κάθε στάδιο της μετάστασης. Με πράσινο χρώμα δηλώνεται η θετική τους ρύθμιση, με κόκκινο η μειωρύθμιση, ενώ με πορτοκαλί οι μεταλλάξεις τους [28]. Μόλις τα καρκινικά κύτταρα εισέλθουν στο σημείο, στο οποίο θα σχηματίσουν τον δευτεροπαθή όγκο, δεν έχουν πλέον μεσεγχυματικό φαινότυπο γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι πιθανώς έχουμε αντιστροφή της ΕΜΤ. Δηλαδή τα κύτταρα αποκτούν επιθηλιακό χαρακτήρα ώστε να αποικίσουν το νέο όργανο που προσβάλλουν. Αυτή η μετάβαση από μεσεγχυματικό σε επιθηλιακό χαρακτήρα (mesenchymalepithelial transition-μετ) φαίνεται να οφείλεται στη μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης Twist [29] και της πρωτεΐνης Prrx1, που μαζί βοηθούν στην αποκατάσταση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού των καρκινικών κυττάρων [3]. 1.5 Μετάσταση στον πνεύμονα Οι μεταστατικοί όγκοι στους πνεύμονες είναι ιδιαίτερα συχνοί, καθώς, ο πνεύμονας αποτελεί τον κύριο στόχο των εξωπνευμονικών νεοπλασμάτων, και συνήθως καταλήγουν στο σχηματισμό μεγάλων μαζών. Αναγνωρίζονται τρεις διαφορετικές οδοί μεταστάσεως στον πνεύμονα: 1.αιματογενείς 2.λεμφογενείς 3.κατά συνέχεια ιστών, στις οποίες καταχωρούνται οι προερχόμενες από καρκίνο του ήπατος, του παγκρέατος και του μαστού.[31] Οι παράγοντες που ευθύνονται για τη συχνότητα των εξωπνευμονικών μεταστάσεων στους πνεύμονες συγκαταλέγονται: το εκτεταμένο τριχοειδικό δίκτυο του πνεύμονα, το γεγονός ότι οι πνευμονικές αρτηρίες είναι τελικές αρτηρίες και η 19

διαμόρφωση τους είναι ευνοϊκή για εμφύτευση νεοπλασματικών κυττάρων προσερχομένων με το αίμα[32]. Εικόνα 2: Τα κύρια στάδια της μετάστασης στον πνεύμονα. a. Αύξηση του πρωτοπαθούς όγκου, b. Αγγείωση του πρωτοπαθούς όγκου, c. Αποκόλληση των καρκινικών κυττάρων από την πρωτοπαθή εστία και διήθηση τους στο τοίχωμα των αγγείων, d. Αποκόλληση και είσοδος στην κυκλοφορία, προσκόλληση στο ενδοθήλιο των τριχοειδών ή στην υποενδοθηλιακή βασική μεμβράνη, e. Εξαγγείωση, f. Πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων στο παρέγχυμα του οργάνου-στόχου[31]. Συχνότερα μεθίστανται στον πνεύμονα ο καρκίνος του μαστού, του εντέρου, του στομάχου, του παγκρέατος, των νεφρών, του προστάτη, του ήπατος, του θυρεοειδούς, των επινεφριδίων, των όρχεων, της μήτρας και των ωοθηκών[33]. Επίσης σαρκώματα από τα οστά, τους μαλακούς ιστούς και τα σπλάχνα είναι επιρρεπή στην αιματογενή διασπορά και την εμφύτευσή τους στον πνεύμονα. Τα μελανώματα μεθίστανται στον πνεύμονα αλλά όχι τόσο συχνά. Παρά τις προσπάθειες, μερικοί μεταστατικοί όγκοι στον πνεύμονα δεν μπορούν να ταξινομηθούν ως προς την πρωτοπαθή εστία τους, αλλά αυτό συμβαίνει στην μειονότητα των περιπτώσεων[34]. 2

Οι περισσότερες πνευμονικές μεταστάσεις εντοπίζονται στην περιφέρεια των πνευμόνων και είναι δυνατό να μην προκαλούν συμπτώματα αλλά να ανακαλύπτονται τυχαία κατά τη διάρκεια της σταδιοποίησης της πρωτοπαθούς εστίας. Όταν προκαλούνται συμπτώματα, οφείλονται σε γειτνίαση του όγκου με κεντρικές αεροφόρες οδούς ή σε προχωρημένη νόσο. Τα συμπτώματα είναι βήχας, αιμόπτυση, δύσπνοια προοδευτικά επιδεινούμενη και θωρακικός πόνος [35]. 1.6 Η ιστορία της Οστεοποντίνης Η οστεοποντίνη (OPN, SPP1, Eta-1) περιγράφηκε πρώτη φορά από τον Senger [36, 37] ως μια φωσφοπρωτεΐνη μεγέθους 6 kda. Η μελέτη της με τεχνικές Γενετικής Μηχανικής την επανέφερε στο προσκήνιο το 1989[38], και οι ερευνητές την περιέγραφαν ως σιαλυκή πρωτεΐνη του εξωκυττάριου στρώματος των οστών [39-41]. Η ονομασία οστεοποντίνη δόθηκε σε μια προσπάθεια να περιγραφεί η δράση της πρωτεΐνης των οστών ως γέφυρα μεταξύ των κυττάρων και της υδροξυαπατίτης διαμέσου μοτίβων αργινίνης-γλυκίνης-ασπαρτικού οξέος και πολυασπαρτικού οξέως που ανακαλύφθηκαν στην πρώιμη αλληλουχία της[42]. Παράλληλα, το ίδιο γονιδιακό προϊόν αναγνωρίστηκε ότι παράγεται ακόμα και από κύτταρα του ανοσοποιητικού όπως λεμφοκύτταρα και μακροφάγα. Η ονομασία που του δόθηκε ήταν Eta-1 (early T- lymphocyte activation gene I)[43]. Λόγω του ότι οι ερευνητές συναντούσαν την πρωτεΐνη σε διάφορους ιστούς και με ποικίλους ρόλους κατέστη η ανάγκη για μια πιο γενική περιγραφή, οπότε και εισήχθη ο όρος εκκρινόμενη φωσφοπρωτεΐνη SPP1(secreted phosphoprotein). Ωστόσο, η ονομασία οστεοποντίνη (ορολογία που χρησιμοποιείται για το ανθρώπινο γονίδιο) έχει ευρέως διατηρηθεί[44]. 1.7 Δομή της οστεοποντίνης Η SPP1ανήκει σε μια ομάδα πέντε γλυκοπρωτεϊνών οι οποίες προσδένονται σε ιντεγκρίνες και ονομάζονται SIBLINGs (small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins)[45]. Η οικογένεια αυτών των πρωτεϊνών επίσης περιλαμβάνει την οστική σιαλοπρωτεΐνη (BSP), την πρωτεΐνη του στρώματος της οδοντίνης (DMP1), την σιαλυκή φωσφοπρωτεΐνη οδοντίνης (DSPP), και την εξωκυττάρια φωσφογλυκοπρωτεΐνη του στρώματος (MEPE). Η οστεοποντίνη είναι μια πρωτεΐνη μεγέθους 44 kda η οποία υφίσταται εκτεταμένες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Το γονίδιο της SPP1 εδράζεται στον 21

άνθρωπο στο χρωμόσωμα 4 (4q13) και διαθέτει 7 εξώνια [46, 47]. Στο ποντικό το μεγέθους 4.8kb γονίδιο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 5[48, 49] και στον χοίρο στο χρωμόσωμα 8[44]. Στον άνθρωπο, η πρωτεΐνη αποτελείται από 314 αμινοξέα[37, 5]. Το μοριακό της βάρος και οι ισομορφές που προκύπτουν από τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίσταται υπολογίζονται μεταξύ 41 και 75 kda. Η οστεοποντίνη είναι ιδιαίτερα υδρόφιλη και έχει χαμηλό ισοηλεκτρικό σημείο (3.5). Αποτελείται από 42 σερίνες, 48 μόρια ασπαρτικού οξέος και 27 μόρια γλουταμινικού οξέος. Είναι σημαντικό εδώ να αναφέρουμε ότι οι 27 από τις 42 σερίνες αποτελούν στόχους φωσφορυλίωσης κατά τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Οι βασικές περιοχές στο μόριο της πρωτεΐνης περιλαμβάνουν μια περιοχή πλούσια σε ασπαρτικό με την οποία συνδέεται όπως προαναφέραμε με υδροξυαπατίτη και μια περιοχή αργινίνης-γλυκίνης-ασπαρτικού οξέος (RGD domain) με την οποία προσδένεται στις ιντεγκρίνες α ν β3, α ν β1, α ν β5 και α 5 β1. Η RGD περιοχή είναι χαρακτηριστική πολλών πρωτεϊνών που συνδέονται με ιντεγκρίνες[51]. Ακολουθεί μια αλληλουχία πλούσια σε σερίνη και αργινίνη με την οποία συνδέεται στις ιντεγκρίνες α 9 β1 και α 1 β1[52, 53], μια θέση διάσπασης από την θρομβίνη[53], μια θέση πρόσδεσης ασβεστίου και δύο θέσεις ηπαρίνης με την οποία προσδένεται στον CD44v3 υποδοχέα (Εικόνα 3) [54]. Η θρομβίνη διασπά την SPP1 και τα μόρια που προκύπτουν αφενός αναγνωρίζονται και συνδέονται με ιντεγκρίνες και αφετέρου ενισχύουν τις δράσεις της κυτταροκίνης[55]. Εικόνα 3: Η δομή του γονιδίου της ανθρώπινης οστεοποντίνης. Τα εξόνια παρουσιάζονται ως κουτιά όπου τα λευκά είναι οι αμετάφραστες περιοχές και τα μαυρισμένα οι κωδικές.[56] 22

Τέλος, ανάλογα με τις μετα-μεταγραφικές (εναλλακτικό μάτισμα) και μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις (φωσφορυλιώσεις, γλυκοζυλιώσεις) που θα υποστεί το μόριο της SPP1 παράγονται διαφορετικές ισομορφές [57, 58]. Για παράδειγμα, στον ποντικό υπάρχουν πέντε μετάγραφα εκ των οποίων δύο κωδικοποιούν την ίδια ισομορφή, ενώ οι βασικότερες και περισσότερο μελετημένες ισομορφές είναι δύο, η εκκρινόμενη και η ενδοκυττάρια. Στον άνθρωπο έχουν αναγνωριστεί επίσης πέντε μετάγραφα[59] από τα οποία προκύπτουν 3 βασικές ισομορφές OPN-a, OPN-b, OPN-c [6]. Ακόμα, δεν έχει ξεκαθαριστεί με σαφήνεια η λειτουργικότητα αλλά και οι δράσεις της κάθε ισομορφής. 1.8 Έκφραση της οστεοποντίνης H SPP1, είναι μία πρωτεΐνη η οποία παράγεται φυσιολογικά στον ανθρώπινο οργανισμό και εκφράζεται σε μια ποικιλία ιστών όπως τα οστά, η οδοντίνη, η οστεΐνη, οι νεφροί, ο εγκέφαλος, ο μυϊκός ιστός, τα γάγγλια του έσω ωτός, καθώς επίσης από ποικιλία κυττάρων όπως τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, Τ και Β λεμφοκύτταρα [43, 61-65], οστεοκλάστες και οστεοβλάστες [66-69], κύτταρα του μαστού, επιθηλιακά κύτταρα του δέρματος, νευρικά και ενδοθηλιακά κύτταρα[61] κ.α. Η SPP1 εντοπίζεται στον ανθρώπινο οργανισμό είτε ως πρωτεΐνη της εξωκυττάριας ουσίας είτε κυκλοφορεί ως κυτταροκίνη. Σε φυσιολογικές συνθήκες μπορεί να ανιχνευτεί σε διάφορα βιολογικά υγρά του ανθρώπινου σώματος όπως αίμα, ούρα ακόμα και στο μητρικό γάλα[37]. 1.9 Υποδοχείς πρόσδεσης της οστεοποντίνης Οι λειτουργίες της SPP1 εκτελούνται μετά την πρόσδεση της σε δύο τύπους υποδοχέων, τις ιντεγκρίνες και στον CD44 υποδοχέα. Οι ιντεγκρίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες επιφανείας με δύο υποομάδες τις α και β. Οι ιντεγκρίνες με τις οποίες συνδέεται η SPP1 είναι οι ακόλουθες : αvβ3, αvβ1, αvβ5, α4β1, α5β1, α8β1 και α9β1. Η αλληλεπίδραση της οστεοποντίνης με τις αvβ3, αvβ1, αvβ5[7-72], α8β1[72] και α9β1[73] επάγει την προσκόλληση των κυττάρων, την μετακίνησή τους και την χημειόταξη. Επιπλέον, εμπλέκεται ενεργά στην ενδοκυττάρια σηματοδότηση σε διάφορους κυτταρικούς τύπους όπως τα ενδοθηλιακά λεία μυϊκά κύτταρα[7], τους τροφοβλάστες του πλακούντα [74], τα νεφρικά κύτταρα[73, 75] κ.α. Ανάλογα με τους συνδυασμούς ετεροδιμερών που δημιουργούνται μεταξύ των ιντεγκρινών και της SPP1 δίνονται και διαφορετικά σήματα ενεργοποίησης στα 23

κύτταρα. Για παράδειγμα, το αμινοτελικό τμήμα που δημιουργείται μετά την πέψη από θρομβίνη, το οποίο περιέχει το RGD μοτίβο έξι αμινοξέα μακριά από τη θέση πέψης, αυξάνει την επιφανειακή του προσέγγιση από τους υποδοχείς αυξάνοντας κατά συνέπεια και την ικανότητα πρόσδεσης του μορίου[76]. Εκτός από την RGD αλληλουχία όμως με τον ίδιο τρόπο επάγουν το φαινόμενο της κυτταρικής προσκόλλησης και άλλες περιοχές που εντοπίζονται είτε στο αμινοτελικό είτε στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης[77]. Ο υποδοχέας CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη επιφανείας η οποία ρυθμίζει ποικίλες αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων αλλά και μεταξύ κυττάρων και συστατικών της θεμέλιας ουσίας, διαμεσολαβώντας στην προσκόλληση και μετακίνηση κυττάρων. Ο υποδοχέας CD44 εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα, κύτταρα μυελού των οστών, ινοβλάστες καθώς και σε διαφόρους τύπους καρκινικών κυττάρων[55]. Το κυριότερο μόριο το οποίο προσδένεται στον υποδοχέα CD44 είναι το υαλορουνικό οξύ. Ωστόσο, διάφορες κυτταροκίνες τις εξωκυττάριας ουσίας μεταξύ των οποίων και η SPP1, συνδέονται εξίσου με τον συγκεκριμένο υποδοχέα[63]. Οπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία η SPP1 εμπλέκεται στην σύνδεση του υποδοχέα με το υαλουρονικό. Η έκφραση του CD44 και η αλληλεπίδραση του με το υαλουρονικό παρουσία της SPP1 λαμβάνει χώρα στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης των ιστών καθώς επίσης και σε συνθήκες αναδόμησής τους, ενώ παράλληλα εκφράζεται και σε μεταναστευτικά κύτταρα του ανοσοποιητικού, γεγονός που τον συνδέει με την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Βέβαια, ο ακριβής ρόλος του σε αυτή τη διαδικασία δεν είναι γνωστός. Επομένως, η θετική ρύθμιση του CD44 και της SPP1 σε κύτταρα του ανοσοποιητικού και καρκινικά κύτταρα σχετίζεται με την άμεση μεταστατικότητα αυτών των κυττάρων κατόπιν πρόσδεσης της κυτταροκίνης στον υποδοχέα[78]. 24

Εικόνα 4: Η δομή της SPP1. Η εικόνα παρουσιάζει τις βασικές περιοχές αμινοξέων του μορίου, την θέση τους στην ανθρώπινη SPP1 και στην SPP1 ποντικού και το ρόλο τους[79]. 1.1 Λειτουργίες της Οστεοποντίνης Στον ανθρώπινο οργανισμό η έκφραση της SPP1 συσχετίζεται με διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες. Καταρχάς, αποτελεί έναν σημαντικό διαμεσολαβητή στην επικοινωνία μεταξύ οστεοβλαστών και οστεοκλαστών καθώς επίσης και στην δημιουργία, μετανάστευση και χημειοταξία των οστεοκλαστών. Επιπλέον, η έκφραση της SPP1 εντείνεται από δράση της βιταμίνης D3, η οποία επάγει την διαφοροποίηση των οστεοκλαστών και την απορρόφηση του οστίτη ιστού[37, 8]. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι η έκφραση της κυτταροκίνης παίζει σημαντικό ρόλο στην αθηροσκλήρωση, την επαναδιοργάνωση του μυϊκού ιστού και την επαναστένωση αγγείων μετά από αγγειοπλαστική[81]. Επιπλέον, σε περιπτώσεις τραυματισμού, διάφορα ερεθίσματα τα οποία επάγουν την απελευθέρωση παραγόντων ανάπτυξης, όπως του παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών (FGF) ο οποίος ενισχύει την υπερπλασία λείων μυϊκών και ενδοθηλιακών κυττάρων, μαζί ενεργοποιούν την έκφραση της SPP1. Ταυτόχρονα, η κυτταροκίνη συμμετέχει στη διαδικασία επούλωσης τραυμάτων και στην υπερπλασία ενδοθηλιακών κυττάρων και λείων μυϊκών ινών[82]. Πρόσφατα έχει αποσαφηνισθεί ο ρόλος της SPP1 στην ρύθμιση φλεγμονωδών κυττάρων σε θέσεις φλεγμονής και επιδιόρθωσης ιστού[83]. Μια ποικιλία φλεγμονωδών διαμεσολαβητών και παραγόντων ανάπτυξης όπως IL-1, TNF-α, και PDGF, ενεργοποιούν την μεταγραφή της πρωτεΐνης, συνήθως μέσω ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης kinase C[64]. Παρόλο που ο ακριβής ρόλος της SPP1 στις 25

αποκρίσεις του ανοσοποιητικού in vivo δεν είναι ξεκάθαρος, ωστόσο φαίνεται να είναι σημαντική για την στρατολόγηση μακροφάγων, την έκκριση συγκεκριμένων κυτταροκινών και την ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών που ενισχύουν αυτές τις αποκρίσεις[84]. Επιπλέον, όπως έχουμε ήδη αναφέρει, συμμετέχει στην επιδιόρθωση τραύματος ιστού καθώς εκφράζεται ευρέως σε φλεγμονώδη κύτταρα, όπως Τ λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, και κυτταροτοξικά[85]. Η έκφρασή της αυξάνεται σε μια ποικιλία φλεγμονωδών καταστάσεων όπως για παράδειγμα η αθηροσκλήρωση και το σαρκοοίδημα. Ωστόσο, παρουσιάζει τόσο προ- όσο και αντι-φλεγμονώδεις δράσεις. Η SPP1 που παράγεται από ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα, κατατάσσεται στις Th1 κυτταροκίνες[86] και είναι σημαντική για τις πρώιμες Th1 αποκρίσεις[87]. Μελέτες σε πειραματόζωα υπέδειξαν πως η κύρια ανοσοτροποποιητική δράση της SPP1 είναι η ενίσχυση της Th1 έναντι στην Th2 απόκριση. Αυτό πραγματοποιείται είτε μέσω παραγωγής IL-12 που μεσολαβείται από την ιντεγκρίνη αvβ3, είτε μέσω ελάττωσης της παραγωγής IL-1, ένα φαινόμενο στο οποίο μεσολαβεί ο υποδοχέας CD44. Επίσης, ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των Β-λεμφοκυττάρων και την παραγωγή ανοσοσφαιρινών[88]. Στα πλαίσια των αντι-φλεγμονωδών δράσεών της η SPP1 αναστέλλει την έκφραση νιτρικού οξέος (NO). Σε in vitro πειράματα έχει βρεθεί ότι μειωρυθμίζει την NO συνθάση (inos) μειώνοντας κατ επέκταση την παραγωγή του NO από τα μακροφάγα και τα κυλινδρικά επιθηλιακά κύτταρα των νεφρών[89]. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια σήψης η SPP1 αυξάνεται στους μυς όπου μπλοκάρει την παραγωγή των NO μεταβολιτών[9]. Πρόκειται για έναν φαύλο κύκλο κατά τον οποίο το NO ενεργοποιεί την έκφραση της SPP1 η οποία αναστέλλει την μεταγραφή της inos και μειώνει περαιτέρω την παραγωγή του. Τέλος, η SPP1 εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στις άωρες μορφές των δενδριτικών κυττάρων και συμμετέχει στις διαδικασίες ωρίμανσης τους [91] ενώ παράλληλα αναστέλλει την απόπτωσή τους. 26

Εικόνα 5: Η SPP1 επηρρεάζει όλα τα αξιοσημείωτα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Μέχρι τώρα δεν υπάρχουν αρκετές αποδείξεις του ρόλου της στην γενωμική αστάθεια και μεταλλαγή.[92] 1.11 Ο ρόλος της οστεοποντίνης στην καρκινογένεση Αρκετές μελέτες αναφέρουν ότι η SPP1 παρουσιάζει υψηλά επίπεδα έκφρασης σε διάφορους τύπους κακοηθειών. Τα επίπεδα έκκρισης της μπορούν να εκτιμηθούν ως δείκτες για τον καρκίνο του μαστού, του προστάτη, το οστεοσάρκωμα, το γλοιοβλάστωμα, τον καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων[93] και το μελάνωμα[94] καθώς οι τιμές της κυτταροκίνης στον ορό αίματος ασθενών συγκριτικά με αυτές υγιών ατόμων είναι δραματικά υψηλές[95]. Σε μελέτη που έγινε στο προφίλ έκφρασης 12. γονιδίων σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου η SPP1 ενοχοποιήθηκε ως το γονίδιο με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης [96]. Επιπλέον, κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει συσχέτιση των επιπέδων αυτών με το φορτίο του όγκου και την κακή πρόγνωση της νόσου. Η υπερέκφραση της οστεοποντίνης φαίνεται σε πολλές περιπτώσεις ότι επάγει την εξέλιξη της νόσου καθώς ενισχύει την αγγειογένεση[79]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι συμμετέχει στον σχηματισμό των αγγείων στην μήτρα και στην χοριοαλλαντοική μεμβράνη παρουσία FGF-2, γεγονός που υποδεικνύει την πιθανή συνεργασία της με προ-αγγειογενετικά μόρια κατά την αγγειογένεση[97]. Η SPP1 συμμετέχει στη δημιουργία της αγγειακής κοίτης, κατά τη διαδικασία αντικατάστασης των αγγείων ενώ ακόμα επάγει την παραγωγή VEGF, του κυριότερου αγγειογενετικού παράγοντα[98]. 27

Εκτός όμως από τον αγγειογενετικό της ρόλο η κυτταροκίνη αυτή, μέσα από την έκφρασή της, συμμετέχει ενεργά στην ρύθμιση των μηχανισμών επιβίωσης του καρκινικού κυττάρου αλλά και στην αναστολή του μηχανισμού της απόπτωσης. Η αλληλεπίδρασή της με τους υποδοχείς αvb3 και CD44 επάγει την έκκριση του προστατευτικού παράγοντα Η (Factor H) στην επιφάνεια των κυττάρων, αναστέλλoντας τον κυτταρικό θάνατο[99]. Επιπλέον, έχει την ικανότητα να παρεμποδίζει την κατάτμηση του DNA και να ενεργοποιεί την έκφραση αντι-αποπτωτικών πρωτεΐνών, όπως η Bcl-xl, ενώ απουσία της ευαισθητοποιούνται τόσο οι ενεργοποιητικές όσο και οι εκτελεστικές κασπάσες [1-12]. Η αναστολή της απόπτωσης φαίνεται να ολοκληρώνεται με την ενεργοποίηση διαφόρων σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως η φωσφορυλίωση του Akt[13]. Ο ρόλος της SPP1 στην παθοφυσιολογία του καρκίνου είναι αρκετά περίπλοκος και χρίζει εκτεταμένης έρευνας, ενώ οι μοριακοί μηχανισμοί οι οποίοι ενέχονται στην μεταστατική διαδικασία και στους οποίους συμμετέχει η κυτταροκίνη εμφανίζονται ποικίλοι. Η SPP1 η οποία παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα και τα μακροφάγα ενεργοποιεί διαφορετικά σήματα. Ενώ η παραγόμενη από τα μακροφάγα κυτταροκίνη συνεισφέρει στη στρατολόγηση κυττάρων του ανοσοποιητικού τα οποία επιτίθενται στον όγκο, η εκκρινόμενη από το καρκινικό κύτταρο αναστέλλει την δράση των μακροφάγων ενισχύοντας την ανάπτυξή του[14]. Η ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών όπως έχει ήδη αναφερθεί διαμεσολαβείται από την αλληλεπίδραση της κυτταροκίνης με τους υποδοχείς ιντεγκρίνης και CD44. Αυτή η αλληλεπίδραση ρυθμίζει μεταξύ άλλων την μεταστατικότητα των καρκινικών κυττάρων, την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, το σχηματισμό της μεταστατικής φωλιάς, την τροφοδότησή της με αγγεία[76] και τον μετασχηματισμό των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά [15]. Σήματα τα οποία διακόπτουν τον κυτταρικό κύκλο, αναστέλλουν την απόπτωση, και προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την μετακίνηση, ενισχύονται από τη δράση της SPP1. Σε αυτά περιλαμβάνεται η ενεργοποίηση του PI3K/Akt[16]. Το καρκινικό κύτταρο για να διασπάσει τη βασική μεμβράνη και να μετασταθεί εκτός της πρωταρχικής εστίας όπως έχουμε ήδη αναφέρει πρέπει να παράγει πρωτεάσες και συγκεκριμένα μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜPs). Οι MMPs βρίσκονται φυσιολογικά στην μεμβράνη ωστόσο, διαταραχή της ισορροπίας στην έκφραση ή στη δραστικότητα διαφόρων ΜΜPs υπό τη δράση της SPP1 μπορεί να συμβάλει σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις και κυρίως στην νεοπλασματική διήθηση και μετάσταση. Αυτή η 28

διαταραχή μπορεί να ενταθεί με την ταυτόχρονη ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα κb (NF-κB) και των προ-μεταλλοπρωτεϊνασών του στρώματος (pro- MMP2)[17]. Η αποδόμηση των πρωτεϊνών του εξωκυττάριου στρώματος διεκπεραιώνεται και με την παράλληλη ευαισθητοποίηση από την κυτταροκίνη του ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης Upa (urokinase plasminogen activator), ο οποίος μετατρέπει το πλασμινογόνο σε πλασμίνη και ακολούθως ενεργοποιεί τις MMPs[18]. Εικόνα 6: Ο ρόλος της οστεοποντίνης στην εξέλιξη του καρκίνου μέσω ενεργοποίησης διαφόρων κινασών, πρωτεασών και μεταγραφικών παραγόντων[37] Όπως είναι γνωστό, από το σύνολο των καρκινικών κυττάρων τα οποία διαφεύγουν από την πρωτοπαθή εστία και μεθίστανται σε απομακρυσμένες θέσεις μόνο ένα μικρό ποσοστό κυττάρων επιβιώνουν. Τα περισσότερα αναγνωρίζονται από τα ανοσοποιητικά κύτταρα του ξενιστή και καταστρέφονται. Μελέτες αναφέρουν ότι η παραγωγή SPP1 από τα καρκινικά κύτταρα τους δίνει τη δυνατότητα διαφυγής από το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού. Η παραγωγή αυτή ενισχύει μονοπάτια ενεργοποίησης όπως του επιδερμικού παράγοντα ανάπτυξης (EGF) και του ηπατοκυτταρικού παράγοντα ανάπτυξης (HGF)[19, 11]. Επιπλέον, η οστεοποντίνη επιδρά στο ανοσοποιητικό του ξενιστή μειώνοντας τη λειτουργία του κυτοχρώματος C[111] καθώς και των μακροφάγων κυττάρων ενώ όπως έχουμε αναφέρει νωρίτερα ταυτόχρονα αναστέλλει στα μακροφάγα την δράση της συνθετάσης νιτρικού οξέος inos[112]. Τέλος, η SPP1 λειτουργεί ανασταλτικά στην δράση κινασών, όπως η φωσφολιπάση C/πρωτεϊνική κινάση C (PLC/PKC), η μιτογόνος πρωτεϊνική κινάση (MAPK) και η PI3 κινάση επάγοντας την μετάσταση και διήθηση[19]. Είναι σαφές πως η SPP1 εμπλέκεται στη ρύθμιση πολλών και ποικίλων μονοπατιών σηματοδότησης 29

μέσα από τα οποία προάγεται η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε απομακρυσμένες περιοχές. Εικόνα 7: Η σύνδεση της οστεοποντίνης στους υποδοχείς ιντεγκρινών και στον CD44 υποδοχέα ενεργοποιεί διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία συμβάλουν στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων.[37] 1.12 Η προερχόμενη από την ξενιστή και το καρκινικό κύτταρο οστεοποντίνη Η SPP-1 παράγεται τόσο από τα κύτταρα του ξενιστή όσο και από τα καρκινικά κύτταρα, ωστόσο υπάρχουν δομικές διαφορές οι οποίες οφείλονται στο διαφορετικό μοτίβο μετά-μεταφραστικών τροποποιήσεων τις οποίες υφίσταται και οι οποίες προσδίδουν στην πρωτεΐνη των κυττάρων διαφορετικές λειτουργίες. Μία από αυτές τις τροποποιήσεις αφορά την φωσφορυλίωση των σερινών του μορίου οι οποίες είναι λιγότερες σε αριθμό στα καρκινικά κύτταρα σε σχέση με τις φωσφορυλιώσεις που υφίσταται η πρωτεΐνη στα φυσιολογικά κύτταρα[113]. Το γεγονός αυτό αντικατοπτρίζεται στην ικανότητα των κυττάρων του ξενιστή, μέσω έκκρισης της ισχυρά φωσφορυλιωμένης SPP1, να ενεργοποιούν τα μακροφάγα ως πρώτη γραμμή άμυνας. Από την άλλη μεριά, τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνοντας την λιγότερο φωσφορυλιωμένη SPP1 αναστέλλουν τον κυτταρικό θάνατο αλλά και την 3

κυτταροτοξική δράση των συγκεντρωμένων από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή μακροφάγων. Παρόλο που ο ρόλος της SPP1 των καρκινικών κυττάρων είναι ξεκάθαρος και επάγει την καρκινογένεση[79] δεν ισχύει το ίδιο και για το ρόλο της κυτταροκίνης που παράγεται από τα κύτταρα του ξενιστή. Η μέχρι σήμερα βιβλιογραφία παραθέτει αντικρουόμενα αποτελέσματα ως προς τον ρόλο της SPP-1 του ξενιστή σε σχέση με την πρόοδο του καρκίνου. Αρχικά, ο Crawford και οι συνεργάτες του εφαρμόζοντας το μοντέλο της χημικά επαγόμενης καρκινογένεσης σε ποντικούς που παράγουν και σε ποντικούς που δεν παράγουν SPP1, διαπίστωσαν πως η κυτταροκίνη του ξενιστή έχει ανασταλτικό ρόλο ως προς της καρκινογένεση καθώς έχει την ικανότητα να στρατολογεί τα μακροφάγα προκειμένου να καταστρέψουν τα κύτταρα-εισβολείς[14]. Ενισχύοντας αυτήν την υπόθεση το 24 ερευνητές έδειξαν με in vitro πειράματα ότι η SPP1 που παράγεται από τα μακροφάγα του ξενιστή επάγει την καταστροφή των καρκινικών κυττάρων μέσω της παραγωγής του μονοξειδίου του αζώτου[114]. Ωστόσο, ο Nemoto και οι συνεργάτες του απέδειξαν πως η προερχόμενη από τον ξενιστή κυτταροκίνη προάγει την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων καθώς διαμεσολαβεί στην προσκόλληση τους στις μεταστατικές εστίες[115], μελέτη η οποία ενισχύθηκε αργότερα από παρόμοια έρευνα του Chakraborty και των συνεργατών του σε μοντέλα πειραματοζώων με καρκίνο του μαστού[116]. Από τα προαναφερόμενα αντιλαμβανόμαστε ότι ο ρόλος της οστεοποντίνης στην εξέλιξη του καρκίνου είναι διττός ανάλογα με την προέλευσή της, ωστόσο δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως και για το λόγο αυτό χρειάζεται να πραγματοποιηθούν πιο ενδελεχείς μελέτες. 31

2. Υλικά Και Μέθοδοι 32

2.1 Κυτταρικές Σειρές Κύτταρα Lewis Lung cancer (LLC) Η σειρά αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ποντικού (Lewis Lung Cancer cells, LLC) αποκτήθηκε από την πρότυπη συλλογή κυτταρικών σειρών ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Κύτταρα B16F1 Η σειρά μελανώματος δέρματος ποντικού (B16F1 cells) αποκτήθηκε από την πρότυπη συλλογή κυτταρικών σειρών ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Κύτταρα Murine Colon carcinoma (MC38) Η σειρά αδενοκαρκινώματος παχέως εντέρου ήταν μια ευγενική παραχώρηση του κυρίου Dr. Timothy S. Blackwell (Vanderbilt University, Nashville, TN)[117]. Human Embryonic Kidney 293Τ κύτταρα Η σειρά εμβρυϊκών κυττάρων νεφρού του ανθρώπου αποκτήθηκε από την πρότυπη συλλογή κυτταρικών σειρών ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA). Αποσιώπηση της έκφρασης οστεοποντίνης στα LLC και ΜC38 κύτταρα- Δημιουργία κλώνων shrnas Η αναστολή της έκφρασης SPP-1 στα κύτταρα MC38 πραγματοποιήθηκε με παρέμβαση στο μηχανισμό γονιδιακής ρύθμισης (RNA interference-rnai) [118][118]. Στη συγκεκριμένη τεχνική, χρησιμοποιούνται ειδικά RNA μικρού μεγέθους με αλληλουχία φουρκέτας (short hairpin RNA-shRNA), ώστε να στοχεύουν κατάλληλα το επιθυμητό γονίδιο. Για την έκφραση του shrna στα κύτταρα χρησιμοποιείται ένας φορέας (πλασμίδιο), με τον οποίο διαμολύνονται τα κύτταρα και εκφράζεται συστατικά, μέσω ειδικών αλληλουχιών υποκινητών που εμπεριέχονται σε αυτό (π.χ. CAG υποκινητής). Το shrna είναι ειδικό για ένα συγκεκριμένο mrna και συνδέεται μαζί του, εμποδίζοντας την μετάφραση του. Ο φορέας ενσωματώνεται στο γενετικό υλικό των διαμολυσμένων κυττάρων, οπότε και μεταφέρεται στα θυγατρικά κύτταρα με κάθε μίτωση. Ο εκάστοτε φορέας διαθέτει μια αλληλουχία-δείκτη επιλογής που προσδίδει 33

ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικό, έτσι ώστε παρουσία του αντιβιοτικού να επιβιώσουν μόνο τα κύτταρα που φέρουν την αλληλουχία shrna[119]. Για την αποσιώπηση του γονιδίου SPP1 κατασκευάστηκαν δύο ειδικά shrnas το sh-spp1 16 και το sh-spp1 444, τα οποία κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδια psuper.retro.puro (Oligoengine, Seattle, WA). Οι αλληλουχίες των shrnas ήταν οι ακόλουθες: AGCTTAAAAACAGATCCTATAGCCACATGTCTCTTGAACATGTGGCTATAGG ATCTGGGG για το sh-spp1 16 και AGCTTAAAAAGCTTATGGACTGAGGTCAA TCTCTTGAATTGACCTCAGTCCA TAAGCGGG για το sh-spp1 444. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα MC38, τα οποία διαμολύνθηκαν με τον ίδιο φορέα που περιείχε μία αλληλουχία μη ειδική για οποιοδήποτε γονίδιο : GATCAGGACAACAACGGAA (shc). Τα MC38 διαμολύνθηκαν με τα πλασμίδια shrna και με το πλασμίδιο μάρτυρα με χρήση Xfect Transfection Reagent (Takara Clontech Bio Company # 631317) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε, ανεξαρτήτως αν περιείχε shrna ή μάρτυρα, προσέδιδε στα κύτταρα αντοχή στη πουρομυκίνη. Για την επιλογή των κλώνων χρησιμοποιήθηκε πουρομυκίνη σε δόση 1μg/ml θρεπτικού υλικού για 1 ημέρες, ακολούθως επιλέχθηκαν οι κλώνοι των κυττάρων και εκτιμήθηκε η παραγωγή SPP1. Τα LLC καρκινικά κύτταρα με αποσιώπηση του γονιδίου Spp1 ήταν μια ευγενική προσφορά του κ. Ιωάννη Ψαλλίδα[12]. Yπερέκφραση της ενδοκυττάριας SPP1 (isoform 2-is2) και εκκρινόμενης ισομορφής (isoform 4-is4) στα B16F1 και HEK293T κύτταρα. Η υπερέκφραση των δύο ισομορφών της SPP1 από τα κύτταρα B16F1 και HEK293T, πραγματοποιήθηκε κατόπιν διαμόλυνσης αυτών με πλασμίδια που φέρουν την αλληλουχία που εκφράζει την ενδοκυττάρια SPP1 (isoform 2-is2) και την εκκρινόμενη ισομορφή SPP1 (isoform 4-is4). Η κλωνοποίηση των παραπάνω αλληλουχιών έγινε κατόπιν απομόνωσης του ολικού RNA από τα MC38 κύτταρα και παραγωγής του cdna του γονιδίου της Spp1 με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης με ανάστροφη μεταγραφάση (RT-PCR) με τη χρήση ειδικών εκκινητών (oligo-dt primers). Έπειτα με PCR και με βάση το cdna, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών, πήραμε δύο διαφορετικά προϊόντα για τις δύο ισομορφές της SPP1, την ισομορφή 2 και 4 (is2, is4). 34

Οι δύο ισομορφές κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο-φορέα pbabe-hygro (βλ. παράρτημα), που προσδίδει στα κύτταρα αντοχή στη υγρομυκίνη (βλ παράρτημα). Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με τον φορέα με χρήση Xfect Transfection Reagent όπως αναφέρεται παραπάνω. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν με τον άδειο φορέα (backbone vector). Για την επιλογή των κλώνων χρησιμοποιήθηκε το αντιβιοτικό υγρομυκίνη σε συγκέντρωση 4μg/ml θρεπτικού υλικού για 1 ημέρες και ακολούθως εκτιμήθηκε η παραγωγή SPP1 από τα κύτταρα. Οι παραπάνω κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό DMEM συμπληρωμένο με ορό βοός (fetal bovine serum-fbs) σε συγκέντρωση 1% v/v. Στο θρεπτικό μέσο προστέθηκε μείγμα αντιβιοτικών πενικιλίνης (1U/ml)-στρεπτομυκίνης (1 mg/ml). Οι καλλιέργειες των κυττάρων επωάζονταν σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 37 ο C παρουσία O 2, 5% CO 2 και υγρασίας. Όλες οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε περιβάλλον υγρού αζώτου για μακροχρόνια αποθήκευση. Συγκεκριμένα, 1x1 6 κύτταρα, σε εκθετική φάση αύξησης, συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 3g και επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml φυσιολογικού ορού βοός παρουσία DMSO σε συγκέντρωση 1% v/v. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ειδικό κρυοανθεκτικό σωλήνα στους -8 ο C περιβεβλημένα με υλικό κατάλληλο για τη σταδιακή και αργή κατάψυξή τους για 24 ώρες. Στη συνέχεια αποθηκεύθηκαν σε περιβάλλον υγρού αζώτου. Kατά την αντίστροφη πορεία της απόψυξης των κυττάρων, ο κρυοανθεκτικός σωλήνας απομακρύνθηκε από το υγρό άζωτο και τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο των 37 ο C για την ταχύτερη τήξη του πάγου. Στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα 3xg, επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml θρεπτικού υλικού και τοποθετήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο στους 37 ο C. 2.2 Ζωικά Μοντέλα Διαγονιδιακοί ποντικοί Χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδιακοί ποντικοί ενδεείς (knock out) στο γονίδιο της SPP1 σε C57BL/6 υπόβαθρο. Η αποικία διατηρήθηκε σε ομοζυγωτία ενώ για τη δημιουργία ετεροζυγωτών τα Spp1 -/- διασταυρώθηκαν με ποντικούς φυσικού τύπου C57BL/6 (Spp1 +/+ ). Οι ποντικοί αποκτήθηκαν από το Jackson Laboratories (Bar Harbor, MΕ, USA) [B6.129S6(Cg)-Spp1tm1Blh/J (#4936), C57BL/6 (#664)] και εκτράφηκαν στο Πρότυπο Κέντρο Πειραματοζώων του Τμήματος Ιατρικής, του 35

Πανεπιστημίου Πατρών. Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Κτηνιατρική υπηρεσία και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες διαχείρισης πειραμματοζώων της Ευρωπαϊκής Επιτροπής, που στηρίζονται σταθερά στην αρχή των «τριών R» (Replacing, Reducing, and Refining / αντικατάσταση, μείωση και βελτίωση των δοκιμών σε ζώα). Οι ποντικοί που χρησιμοποιήθηκαν σταθμίστηκαν ως προς το φύλο, το βάρος (2-25gr) και την ηλικία (6-12 εβδομάδες). In vivo παρεμβάσεις Η έγχυση των καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με δύο μεθόδους: έγχυση δια της φλεβικής κυκλοφορίας (μέσω της ουραίας φλέβας) και υποδόρια έγχυση στο γλουτό των ποντικών. Στην πρώτη περίπτωση οι ποντικοί τοποθετήθηκαν υπό ειδικό λαμπτήρα θέρμανσης προκειμένου να γίνει διαστολή των αγγείων της ουράς, υπό στενή παρακολούθηση. Κατόπιν τοποθετούνταν σε ειδική συσκευή (restrainer) για να ακινητοποιηθούν. Ενέθηκαν ανά περίπτωση πειράματος 25./1μL (PBS) LLC και MC38 κύτταρα και 15./1μL (PBS) B16F1. Κατά την υποδόρια έγχυση οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με διάλυμα ισοφλουράνιου (παρουσία συνεχούς παροχής οξυγόνου), ενώ ενέθηκαν 1.. LLC και MC38 και 25. B16F1 κύτταρα ενώ ακολούθησαν εβδομαδιαίες μετρήσεις των τριών διαστάσεων των αναπτυσσόμενων όγκων. Τέλος, σε κάθε περίπτωση οι ποντικοί παρακολουθούνταν καθημερινά και θυσιάστηκαν με το πέρας 14 ημερών στην περίπτωση της έγχυσης καρκινικών κυττάρων δια της φλεβικής κυκλοφορίας και 3 ημερών στην περίπτωση της υποδόριας έγχυσης. Συλλογή των βιολογικών δειγμάτων Μετά από 14 ή 3 ημέρες από την έγχυση των καρκινικών κυττάρων τα πειραματόζωα θανατώθηκαν με υπερδοσολογία ισοφλουρανίου και πραγματοποιήθηκε η συλλογή των δειγμάτων. Τα στάδια της συλλογής ήταν τα ακόλουθα: 1. διάνοιξη της κοιλιακής χώρας 2. εξαγγείωση του αίματος των πνευμόνων με έγχυση φυσιολογικού ορού 3. έκπτυξη πνευμόνων με διάλυμα 1% ουδέτερης φορμόλης και 4. αφαίρεση και τοποθέτηση σε διάλυμα 1% ουδέτερης φορμόλης για μονιμοποίηση του ιστού. 36

Μακροσκοπική παρατήρηση μεταστάσεων Μετά την διατήρηση σε διάλυμα 1% φορμόλης για μία ημέρα, οι πνεύμονες εμβαπτίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS 1x) και ακολούθησε παρατήρηση τους στο στερεοσκόπιο. Ξεκινώντας από το δεξιό ενιαίο λοβό κάθε πνεύμονας εκτιμήθηκε ως προς τον αριθμό των μεταστάσεων. 2.3 Επεξεργασία ιστών για μελέτη με φωτονικό μικροσκόπιο Μονιμοποίηση Για να διατηρηθεί η αρχιτεκτονική του ιστού και η μορφολογία των κυττάρων, απαιτείται άμεση και επαρκής μονιμοποίηση. Η μονιμοποίηση των ιστών είναι απαραίτητη: 1. για την επαρκή διατήρηση των κυτταρικών συστατικών 2. την αποφυγή της αυτόλυσης και εκτόπισης των κυτταρικών συστατικών 3. τη σταθεροποίηση των κυτταρικών συστατικών ενάντια σε επιβλαβείς παράγοντες των επακόλουθων διαδικασιών και 4.τη διευκόλυνση της πραγματοποίησης ιστοχημικών και ανοσοϊστοχημικών χρώσεων. Γενικά, πολλά αντιγόνα μπορούν να ανακτηθούν επιτυχώς σε τομές ιστών επεξεργασμένους με φορμαλδεΰδη και εμποτισμένους σε παραφίνη. Για το λόγο αυτό, μετά την μακροσκοπική εκτίμηση του αριθμού των μεταστάσεων οι πνεύμονες σκηνώθηκαν με εμβάπτιση σε διαδοχικά διαλύματα: αιθανόλης 7%, αιθανόλης 96%, καθαρής αιθανόλης (1%), ξυλόλης και τελικά εμβάπτιση σε παραφίνη στους 6 ο C. Λήψη τομών Από κάθε περιστατικό ελήφθησαν αντιπροσωπευτικές τομές 4 μm από όλη την έκταση του πνεύμονα με τη χρήση ειδικής μικροτόμου σε απλές ή θετικά φορτισμένες αντικειμενοφόρους πλάκες πολυλυσίνης, προκειμένου να εφαρμοστεί αντίστοιχα χρώση ηωσίνης αιματοξυλίνης ή ανοσοϊστοχημική χρώση. Μορφομετρία Προκειμένου να εκτιμηθεί ο όγκος του φυσιολογικού πνεύμονα που έχει καταληφθεί από κακοήθη ιστό (lung tumor burden), μετά τη σκήνωσή τους οι 37

πνεύμονες τοποθετήθηκαν σε πηγαδάκια παραφίνης με ειδική διάταξη που επιτρέπει την λήψη συνεχών τομών από όλο το εμβαδό του οργάνου (εικόνα13). Ακολούθησε χρώση των τομών με ηωσίνη και αιματοξυλίνη όπως αναφέρεται παρακάτω. Στη συνέχεια, ελήφθησαν αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες από όλες τις τομές με τη βοήθεια του στερεοσκοπίου και ειδικά προσαρτημένης σε αυτό κάμερας. Πραγματοποιήθηκε επεξεργασία και ανάλυση εικόνας με το πρόγραμμα Fiji όπου προσδιορίστηκε ο όγκος του πνεύμονα ο οποίος ήταν κατειλημμένος από μεταστατικό καρκινικό ιστό. Εικόνα 13: Απεικόνιση της διάταξης του πνεύμονα κατά την παραφίνωση για τη λήψη διαδοχικών τομών από όλη την έκτασή του. Ιστολογικές χρώσεις Χρώση Ηωσίνης Αιματοξυλίνης Για την παρατήρηση των ιστών πνεύμονα στο οπτικό μικροσκόπιο οι τομές επεξεργάσθηκαν ως εξής: Τοποθετήθηκαν σε κλίβανο στους 6 ο C για 2 λεπτά. Ακολούθησε εμβάπτιση σε τρείς διαδοχικές ξυλόλες από 5 λεπτά, ενυδάτωση σε κατιούσα αλκοολών (96%, 8%, 7%), εμβάπτιση σε αιματοξυλίνη για 15 sec για χρώση των πυρήνων, διάλυμα οξινισμένης αλκοόλης, λιθίου και διάλυμα ηωσίνης. Εν συνεχεία οι ιστοί αφυδατώθηκαν σε ανιούσα αλκοολών (7%, 8%, 96%, 1%,1%), εμβαπτίστηκαν σε κρύα ξυλόλη και τέλος επικολλήθηκαν οι καλυπτρίδες. Ανοσοϊστοχημική χρώση Η ανοσοϊστοχημεία είναι μια τεχνική ανάδειξης αντιγόνων σε τομές ιστών με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων η οποία βασίζεται στην αλληλεπίδραση αντιγόνου αντισώματος. Η εντόπιση των αντιγόνων γίνεται ορατή με τη χρήση ειδικών δεικτών όπως είναι ένα φθορίζον χρώμα, ένα ένζυμο, ένα ραδιενεργό στοιχείο ή κολλοειδής 38

χρυσός κάτω από παρατήρηση με φωτονικό ή ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Η τεχνική αυτή αρχικά εξαρτάται από την προετοιμασία και τον καθαρισμό του ιστού σε διαδοχικά διαλύματα ξυλόλης, ξυλόλης/αλκοόλης, αλκοόλης ελαττωμένης συγκέντρωσης (1%-96%-8%) και τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος Tris-HCl [Tris-HCl-buffered saline (TBS)],5 Μ, ph=7,6. Μία από τις προκλήσεις της ανοσοϊστοχημείας είναι η ανάπτυξη μεθόδων που αντιστρέφουν τις αλλαγές που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της μονιμοποίησης. Η μονιμοποίηση τροποποιεί την τριτοταγή και τεταρτοταγή δομή των πρωτεϊνών (αντιγόνων), καθιστώντας τις πολλές φορές μη ανιχνεύσιμες από ειδικά αντισώματα. Η ανάδειξη των αντιγόνων μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά κατόπιν επεξεργασίας με τους παράγοντες ανάκτησης αντιγονικών επιτόπων όπως είναι η θερμική επεξεργασία παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού νατρίου 1 mm, ph=6. Επίσης, η ενεργότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης έχει βρεθεί σε πολλούς ιστούς και μπορεί να ανιχνευτεί από την αντίδραση των μονιμοποιημένων τομών με το υπόστρωμα του χρωμογόνου. Η λύση για την απαλοιφή της ενεργότητας της ενδογενούς υπεροξειδάσης είναι η προεπεξεργασία της τομής με υπεροξείδιο του υδρογόνου,3 %, πριν από την επώαση με το αντίσωμα. η χρώση background μπορεί να είναι ειδική ή μη ειδική. Επιπλέον, η κύρια αιτία μη ειδικής χρώσης background είναι η μη ανοσολογική πρόσδεση του ειδικού ανοσο-ορού εξαιτίας υδροφοβικών και ηλεκτροστατικών δυνάμεων σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στις τομές. Αυτό το είδος χρώσης background είναι συνήθως ομοιόμορφο και μπορεί να μειωθεί με το μπλοκάρισμα αυτών των θέσεων με φυσιολογικό ορό (TBS/BSA, 3%). Ακολουθεί επώαση με το πρωτογενές αντίσωμα στην κατάλληλη αραίωση το οποίο είναι ειδικό για το αντιγόνο αναζήτησης με σκοπό την παραγωγή του βέλτιστου σε ένταση σήματος και κατόπιν επώαση παρουσία δεύτερου αντιγόνου που συνδέεται στο πρώτο αντίσωμα και είναι ένα ειδικά σημασμένο πολυμερές DAKO EnVision + HRP, (Dakocytomation, USA), Τέλος, πραγματοποιείται ανίχνευση των θέσεων δέσμευσης της υπεροξειδάσης με την εφαρμογή διαλύματος Η 2 Ο 2 και 3,3 -τετραϋδροχλωρικής διαμινο-βενζιδίνης (DAB) η οποία δίνει το χαρακτηριστικό χρωματομετρικό προϊόν. Οι ιστοί χρωματίζονται με αιματοξυλίνη Harris (Surgipath) ως χρώση αντίθεσης των πυρήνων (counterstain) και αφυδατώνονται σε σειρά αλκοολών αυξανόμενης συγκέντρωσης (8%-96%-1%- 1%). Ακολουθεί διαύγαση των τομών σε ξυλόλες και επικόλληση καλυπτρίδων με τη χρήση διαλυτού στην ξυλόλη μέσου (Entellan). Όλα τα αντισώματα αναφέρονται στους πίνακες αντισωμάτων στη σελίδα 86 του παραρτήματος. 39

2.4 Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί ELISA Η τεχνική ELISA η οποία χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της SPP1 και CCL2 σε υπερκείμενα καλλιέργειας ήταν του τύπου «σάντουιτς». Η αρχή λειτουργίας της είναι η εξής: ο πυθμένας ειδικών πλακών των 96 πηγαδιών από πολυστυρένιο επικαλύπτεται με αντίσωμα πρόσδεσης έναντι του αντιγόνου που μελετάται. Στη συνέχεια μπλοκάρονται οι μη ειδικές θέσεις πρόσδεσης με τη χρήση διαλύματος 1% BSA σε PBS. Όταν προστεθεί το δείγμα το οποίο περιέχει το αντιγόνο, αυτό θα δεσμευθεί από το ακινητοποιημένο στον πυθμένα αντίσωμα. Το σύμπλοκο αυτό μπορεί να ανιχνευθεί από ένα δεύτερο αντίσωμα έναντι του παραπάνω συμπλόκου το οποίο είναι συνδεδεμένο με ένα ένζυμο με ικανότητα να μετατρέπει ένα υπόστρωμα σε προϊόν με χρωμοφόρο σήμα. Με τον τρόπο αυτό, μετρώντας την απορρόφηση του κάθε δείγματος και με βάση μια πρότυπη καμπύλη σήματος-συγκέντρωσης αντιγόνου είναι δυνατή η ποσοτική εκτίμηση του προς μελέτη αντιγόνου στα δείγματα τα οποία μπορεί να είναι υπερκείμενα καλλιεργειών, ορός αίματος, λύμματα ιστών ή άλλα βιολογικά υγρά ανάλογα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στην παρούσα εργασία για την ανίχνευση SPP1 και CCL2 στα υπερκείμενα των κυτταροκαλλιεργειών χρησιμοποιήθηκαν τα ELISA kit (Peprotech, London, UK and R&D, Minneapolis, MN) Ανοσοανίχνευση κατά Western Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τις κυτταρικές σειρές γενετικά τροποποιημένες και μη απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer) [25mM Tris-HCl (ph 7.6), 15mM NaCl, 1% NP-4, 1% sodium deoxycholate,.1% SDS]. Κατόπιν διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 1% παρουσία SDS και ακολούθησε μεταφορά τους σε μεμβράνη PVDF(Millipore, Billerica, MA). Στη συνέχεια οι μεμβράνες επωάστηκαν σε διάλυμα blocking (PBS+ 5% αποβουτυρωμένο γάλα) για την δέσμευση στις μη ειδικές θέσεις πρόσδεσης για 6 λεπτά. Ακολουθεί επώαση της μεμβράνης με το πρωτογενές αντίσωμα, το οποίο αραιώνεται κατάλληλα στο διάλυμα blocking σε θερμοκρασία 4 ο C overnight. Έπειτα οι μεμβράνες ξεπλένονται και επωάζονται με το δευτερογενές αντίσωμα το οποίο είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο της υπεροξειδάσης (HRP). Η 4

υβριδοποίηση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου για 6 λεπτά. Εν συνεχεία, οι μεμβράνες τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί και εμποτίζονται με διάλυμα ενισχυμένης φωταύγειας (ECL-Millipore). Η μεμβράνη τοποθετείται σε κασετίνα εμφάνισης και επάνω από αυτή τοποθετείται φωτογραφικό φιλμ (KODAK). Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται σε σκοτεινό θάλαμο. Τέλος, το φιλμ εμβαπτίζεται σε διαλύματα εμφάνισης (developer, fixer-kodak). 2.5 Προσδιορισμός ρυθμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επιβίωσης και κυτταρικού θανάτου MTT assay Το κίτρινου χρώματος τετραζόλιο MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide) ανάγεται από μεταβολικά ενεργά κύτταρα όπου ένζυμα το καταναλώνουν αφήνοντας ίσα ποσά NADH και NADPH. Κατά τη διαδικασία αυτή σχηματίζονται μωβ κρύσταλλοι οι οποίοι μπορούν να διαλυθούν με οξινισμένη ισοπροπανόλη και να ποσοτικοποιηθούν με φωτομέτρηση. Όσο μεγαλύτερος ο αριθμός των κυττάρων τόσο μεγαλύτερες οι τιμές απορρόφησης. Για κάθε κυτταρικό τύπο η γραμμική σχέση μεταξύ του αριθμού των κυττάρων και του παραγόμενου σήματος επιτρέπει μια ακριβή ποσοτική εκτίμηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού. Για το σκοπό αυτό τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 96-πλά πιάτα καλλιέργειας με πλήρες θρεπτικό υλικό σε συγκέντρωση 3, κύτταρα ανά πηγάδι (1μl θρεπτικού υλικού). Κάθε 24 ώρες για τέσσερις ημέρες στα πιάτα τοποθετούταν 1μl διαλύματος MTT (5mg/ml) και μετά από τέσσερις ώρες το ίζημα διαλυόταν σε οξινισμένη ισοπροπανόλη (,1Ν HCl) και φωτομετρούταν στα 492 nm. Εκτίμηση απόπτωσης Η απόπτωση είναι μια φυσιολογική διαδικασία κυτταρικής αυτό-καταστροφής γονιδιακά ελεγχόμενης, η οποία αναφέρεται συχνά και ως «προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος». Τα αποπτωτικά κύτταρα μπορούν να αναγνωριστούν βάσει ενός χαρακτηριστικού προτύπου μορφολογικών και βιοχημικών αλλαγών όπως είναι και η έκθεση των καταλοίπων φωσφατιδυλσερίνης (PS, phosphatidylserine)[121]. Στα φυσιολογικά κύτταρα, τα κατάλοιπα PS βρίσκονται στην εσωτερική στιβάδα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, τα κατάλοιπα PS 41

μεταπηδούν στην εξωτερική στιβάδα της μεμβράνης. Η Annexin-V είναι μια πρωτεΐνη που δεσμεύεται ειδικά στα κατάλοιπα PS και χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση των αποπτωτικών κυττάρων. Επειδή η Annexin-V δεσμεύεται τόσο στα πρώιμα αποπτωτικά όσο και στα όψιμα αποπτωτικά/νεκρωτικά κύτταρα (τα οποία μπορεί να είναι αποτέλεσμα αποπτωτικών και νεκρωτικών γεγονότων), τα κύτταρα προς ανάλυση πρέπει να σημανθούν επιπροσθέτως και με μια χρωστική που επιτρέπει την διάκριση νεκρών κυττάρων, όπως το 7-AAD[122-124]. Η διαδικασία σήμανσης αποπτωτικών κυττάρων με Annexin-V και 7-AAD είναι η εξής: Συγκέντρωση και φυγοκέντρηση των κυττάρων σε δοκιμαστικό σωλήνα. Επαναιώρηση των κυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης Annexin-V 1x. Το διάλυμα αραιώνεται σε συγκέντρωση 1x με ddh 2 O πριν τη χρήση και η περίσσεια απορρίπτεται μετά το τέλος της διαδικασίας) σε συγκέντρωση 1x1 6 κύτταρα/ml. 1μL του κυτταρικού εναιωρήματος μεταφέρονται σε άλλο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη Annexin-V-PE (αραίωση 1/2) και 7-AAD (αραίωση 1/2), και επώαση της αντίδρασης για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη 4 μl ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης Annexin-V. Η συλλογή των δεδομένων στον κυτταρομετρητή πρέπει να γίνει μέσα σε 1 ώρα. Τα όψιμα αποπτωτικά κύτταρα ορίζονται ως Annexin-V + 7-AAD + ενώ τα πρώιμα αποπτωτικά ως Annexin-V + 7-AAD -. 2.6 Ανοσοφθορισμός Η τεχνική του ανοσοφθορισμού επιτρέπει την ανίχνευση επί του ιστού ενός γονιδίου σε επίπεδο πρωτεΐνης. Η γενική αρχή αυτής της τεχνικής είναι σχετικά απλή: αρχικά πραγματοποιείται επώαση του ιστού με ειδικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Στη συνέχεια γίνεται κατεργασία του ιστού με ειδικό δεύτερο φθορίζων αντίσωμα που αναγνωρίζει το πρωτογενές αντίσωμα έτσι, στις περιοχές όπου έχει επικαθήσει το πρωτογενές αναπτύσσεται φθορίζων σήμα. Πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού: Αρχικά οι τομές αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου σε επωαστικό θάλαμο που περιέχει νερό για να μην ξεραθούν για 5 λεπτά. Στη συνέχεια ενυδατώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα PBS και ακολουθεί η ανάδειξη των αντιγονικών επιτόπων επί του ιστού με τη χρήση διαλύματος κιτρικού νατρίου (sodium citrate) pη=6 σε υψηλή 42

θερμοκρασία. Οι τομές μονιμοποιούνται με διάλυμα παραφορμαλδεϋδης (PFA) 4% θερμοκρασίας 4 ο C. Έκπλυση των τομών με PBS. Προστίθεται διάλυμα PBS- TritonX1.3% σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν μπλοκάρονται οι μη ειδικές θέσεις με επώαση των τομών με διάλυμα PBS-Tween.1% +1% FBS +3% αλβουμίνη (Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma A453) σε θερμοκρασία δωματίου. Στις τομές προστίθεται έπειτα το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε διάλυμα blocking στην κατάλληλη για αυτό αραίωση. Η επώαση γίνεται στους 4 ο C overnight. Μπορούμε να επωάσουμε τις τομές με δύο πρωτογενή αντισώματα για να εκτιμήσουμε πιθανή συνέκφραση ωστόσο, πρέπει να έχουν αναπτυχθεί σε διαφορετικό είδος ώστε να αναγνωρίζονται από διαφορετικά δευτερογενή αντισώματα. Την επομένη μέρα οι τομές ξεπλένονται με PBS-Tween.1%, επωάζονται παρουσία δευτερογενούς αντισώματος σε αραίωση 1:1 σε διάλυμα blockingγια μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές ξεπλένονται και ακολουθεί χρώση τους με τη χρωστική Hoechst σε αραίωση 1:15 σε PBS-Tween.1%, προκειμένου να ιχνηθετηθούν οι πυρήνες των κυττάρων. Τοποθετούνται οι καλυπτρίδες με το μέσο Mowiol και ακολουθεί παρατήρηση των τομών σε μικροσκόπιο φθορισμού. 2.7 Ανοσοκυτταροχημεία Σε αυτήν την περίπτωση εφαρμόζουμε πάλι το πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας που προαναφέρθηκε με τις εξής διαφοροποιήσεις: Τα κύτταρα διατηρούνται στην καλλιέργεια πάνω σε καλυπτρίδες με πολύ-lλυσίνη που έχουν τοποθετηθεί μέσα στα πηγαδάκια των πιάτων κυτταροκαλλιέργειας. Όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει τις καλυπτρίδες αφαιρείται το θρεπτικό μέσο και τοποθετείται μεθανόλη για την μονιμοποίηση τους. Κατόπιν τα κύτταρα επωάζονται παρουσία εμβρυϊκού ορού βοός (FBS) και στη συνέχεια τοποθετείται το πρωτογενές αντίσωμα. Η επώαση εδώ διαρκεί ανάλογα το αντίσωμα μέχρι 2 ώρες, διαφορετικά overnight. Εν συνεχεία τοποθετείται το δευτερογενές αντίσωμα για μισή ώρα και ακολουθεί το χρωμογόνο DAB. Οι καλυπτρίδες εμβαπτίζονται σε αιματοξυλίνη ξεπλένονται και τοποθετούνται σε απλές αντικειμενοφόρους πλάκες με το μέσο Mowiol. Ακολουθεί παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο. Όλες οι επωάσεις πραγματοποιούνται υπό ανάδευση ενώ είναι πολύ σημαντικό στις επωάσεις οι καλυπτρίδες να τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο με αυξημένη υγρασία. Όλα τα διαλύματα τοποθετούνται με προσοχή πάνω στις καλυπτρίδες προκειμένου να μην ξεκολλήσουν τα κύτταρα. 43

2.8 Ποσοτικός προσδιορισμός mrna επιπέδων και ανάλυση μικροσυστοιχιών Απομόνωση RNA από τις κυτταρικές σειρές Η απομόνωση RNA από τις κυτταρικές σειρές έγινε με συνδυασμό των πρωτοκόλλων του αντιδραστηρίου Trizol (ThermoFisher Scientific, Cat. No. 15596-26) και του RNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany, 7414) με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. RΤ- PCR, qpcr, and microarray Το RNA που απομονώσαμε από τις καλλιέργειες των κυττάρων επεξεργάστηκε στη συνέχεια με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής (RT-PCR). Η μέθοδος αυτή εκμεταλλευόμενη την ικανότητα του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης να μεταγράφει το RNA σε DNA, χρησιμοποιεί ως μήτρα το mrna και το μεταγράφει στο αντίστοιχο cdna. Με αυτόν τον τρόπο μπορούμε να εκτιμήσουμε την ποσότητα του mrna του γονιδίου που μας ενδιαφέρει. Η αντίδραση μεταγραφής του RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Supercript III (ThermoFisher Scientific, Cat. No. 18885) και ολιγονουκλεοτιδίων. Η ποσοτική PCR (qpcr) είναι μια γρήγορη και αξιόπιστη μέθοδος η οποία επιτρέπει την ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων αλληλουχιών στόχων. Η πραγματικού χρόνου (Real-Time) ποσοτική PCR επιτρέπει την μέτρηση της ποσότητας του προϊόντος καθ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης, μέσω της παρακολούθησης αύξησης του φθορισμού κάποιας φθορίζουσας ουσίας. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα μηχάνημα StepOnePlus cycler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), χρησιμοποιώντας ως φθορίζουσα ουσία το SYBR Green, KAPA SYBR FAST qpcr Kit (Kapa Biosystems, Cat. No. KK464). Η ουσία αυτή διεγείρεται με ακτινοβολία μήκους κύματος 497 nm και εκπέμπει στα 52 nm. Σημειώνεται δε ότι η ουσία αυτή δεν φθορίζει όταν βρίσκεται ελεύθερη σε διάλυμα. Ωστόσο, η ενσωμάτωσή της στο δίκλωνο DNA, έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή φθορισμού. Επομένως η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη του παραγόμενου προϊόντος. Όλες οι αντιδράσεις αναφέρονται αναλυτικά στο παράρτημα. 44

Ανάλυση μικροσυστοιχιών Για την ανάλυση μικροσυστοιχιών όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε τριπλέτες από τις οποίες πραγματοποιήθηκε απομόνωση RNA όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Για την ανάλυση, αρχικά συγκρίναμε τα LLC κύτταρα μάρτυρες με τα LLC κύτταρα με αποσιώπηση και τα Mc38 κύτταρα μάρτυρες με τα Mc38 κύτταρα με αποσιώπηση για να εντοπίσουμε ποιά γονίδια επηρεάζονται από την παρέμβαση. Στη συνέχεια με βάση τα γονίδια που εντοπίσαμε ότι εκφράζονται διαφορετικά ακολούθησε pathway analysis. Η ανάλυση των μικροσυστοιχιών έγινε με βάση τον αλγόριθμο RMA-16. Επιπλέον αναζητήσαμε τα κοινά γονίδια των οποίων αυξάνεται ή μειώνεται η έκφρασή υπό την επίδραση του sh RNA για την SPP1 με τη χρήση του προγράμματος MatLab. 2.9 Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± μέσο σταθερό σφάλμα. Ο έλεγχος της στατιστικής σημαντικότητας πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού πακέτου Prism v5. (GraphPad, La Jolla, CA).. Η σύγκριση μεταξύ μέσων τιμών έγινε με τις δοκιμασίες student t-test (δυο ομάδες) ή one way ANOVA-post hoc Bonferroni (περισσότερες ομάδες) και για τις διάμεσους μεταξύ δύο ή περισσότερων ομάδων με Mann-Whitney U-test ή Kruskal-Wallis test με Dunn s post-tests, όπου απαιτείται. Two-way ANOVA με Bonferoni post-tests χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της επίδρασης δύο παραμέτρων στα αποτελέσματα. Οι συσχετίσεις έγιναν με τη βοήθεια Pearson s R ή Spearman s ρ κατά περίπτωση. Οι διαφορές κρίθηκαν ως στατιστικά σημαντικές όταν η πιθανότητα να οφείλονται σε τυχαία διακύμανση ήταν μικρότερη από 5%, δηλαδή * P <.5, ** P <.1, *** Ρ<.1,και ns, P >.5. 45

3. Αποτελέσματα 46

3.1 Η Οστεοποντίνη εκφράζεται στους πνεύμονες και στον ορό του αίματος ποντικών κατά την διάρκεια της μετάστασης στους πνεύμονες Για να εκτιμηθεί ο εντοπισμός της οστεοποντίνης επί του πνευμονικού ιστού, απομονώσαμε πνεύμονες C57BL/6 ποντικών και αφού τους μονιμοποιήσαμε λάβαμε από αυτούς αντιπροσωπευτικές τομές παραφίνης τις οποίες και επεξεργαστήκαμε με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο. Η μέθοδος αυτή αποκάλυψε την παρουσία της SPP1 σε μεγάλο βαθμό στο βρογχικό επιθήλιο και καθόλου στα αγγεία. Ως προς τον τύπο των κυττάρων που εξέφρασαν την SPP1, ανοσοθετικότητα παρατηρήθηκε από τα μη βλεφαριδωτά επιθηλιακά κύτταρα (γνωστά και ως κύτταρα κλάρα), τα λιποκύτταρα, τα τύπου II κύτταρα των κυψελίδων και τέλος και από τα μακροφάγα. Ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του μεσοθηλιώματος εμφανίστηκαν αρνητικά στην έκφραση της πρωτεΐνης (εικόνα 1a, 1b) Για να διερευνήσουμε περαιτέρω το πρότυπο έκφρασης τη πρωτεΐνης, εφαρμόσαμε ανοσοφθορισμό σε κρυοτομές πνεύμονα C57BL/6 ποντικού, χρησιμοποιώντας ως πρωτογενή αντισώματα το CD68 (ως δείκτη μακροφάγων) και anti-spp1 αντίσωμα. Όπως φαίνεται στην (εικόνα 1c) τα τύπου II κύτταρα των κυψελίδων εξέφραζαν αποκλειστικά και μόνο το δείκτη της SPP1 ενώ τα μακροφάγα εξέφραζαν και τους δύο δείκτες. Για την αποφυγή των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας χόνδρινος ιστός. Προκειμένου να διευκρινίσουμε διαφορές στα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης μεταξύ των ξενιστών πραγματοποιήσαμε την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA. Η μέθοδος αυτή εφαρμόστηκε σε δείγματα ορού από το περιφερικό αίμα ποντικών αγρίου τύπου (Spp1 +/+ ), ποντικών στους οποίους απουσίαζαν και τα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου της οστεοποντίνης (Spp1 -/- ), και ποντικών στους οποίους απουσίαζε ένα από τα δύο αλλήλια του γονίδιο της οστεοποντίνης (Spp1 +/- ). Παρόλο που τα επίπεδα της πρωτεΐνης στον ορό ήταν σημαντικότατα αυξημένα για τους Spp1 +/+ ποντικούς, η ανάλυση πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωση κατά western blot αποκάλυψε την διαφορετική έκφραση της εκκρινόμενης (is4) ισομορφής της πρωτεΐνης (εικόνα 1d, 1e). 47

Εικόνα 1: a,b. Ανοσοϊστοχημική εκτίμηση και εντοπισμός της έκφρασης της ενδογενούς οστεοποντίνης σε πνεύμονες ποντικών φυσικού τύπου. c. έλεγχος με ανοσοφθορισμό πιθανού συνεντοπισμού της SPP1 και μακροφάγων κυττάρων με δείκτη το CD68. Tα τύπου II κύτταρα των κυψελίδων εξέφραζαν αποκλειστικά και μόνο SPP1 ενώ τα μακροφάγα εξέφραζαν ταυτόχρονα CD68 και SPP1. d. έλεγχος των επιπέδων έκφρασης της SPP1 σε ορό αίματος ποντικών Spp1 +/+, Spp1 -/-, και Spp1 +/-. e. εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης της SPP1 από εκχυλίσματα πνεύμονα ποντικών Spp1 +/+ και Spp1 -/-. Στο ανοσοαποτύπωμα διακρίνονται οι ζώνες που αντιστοιχούν στην ενδοκυττάρια (i) και εκκρινόμενη (s) ισομορφή. 48

3.2 Η προερχόμενη από τον ξενιστή οστεοποντίνη δεν παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη μετάσταση στον πνεύμονα Προκειμένου να διασαφηνίσουμε το ρόλο του ξενιστή στο μεταστατικό φαινόμενο χρησιμοποιήσαμε ως μοντέλα αυτόματης και επαγόμενης μετάστασης ποντικούς C57BL/6 άγριου τύπου (Spp1 +/+ ) και ποντικούς ενδεείς και για τα δύο αλλήλια του γονιδίου της οστεοποντίνης (Spp1 -/- ). Στους ποντικούς αυτούς εγχύθηκαν και για τα δύο μοντέλα μετάστασης του πνεύμονα (υποδόρια και ενδοφλέβια) οι τρεις καρκινικές σειρές: MC38 κύτταρα αδενοκαρκινώματος παχέoς εντέρου ποντικού, LLC κύτταρα αδενοκαρκινώματος πνεύμονα ποντικού και B16F1 κύτταρα μελανώματος ποντικού. Όπως φαίνεται στην εικόνα 2a δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στον πρωτογενή όγκο μεταξύ των Spp1 +/+ και Spp1 -/- ποντικών που έλαβαν τις τρεις καρκινικές σειρές. Σε αντίθεση με τις δύο άλλες καρκινικές σειρές που δεν εμφάνιζαν την ικανότητα μετάστασης από τον πρωτοπαθή όγκο στον πνεύμονα τα LLC καρκινικά κύτταρα εμφάνισαν την ίδια ικανότητα αποίκησης στους πνεύμονες ποντικών. Για να διερευνήσουμε αυτό το αποτέλεσμα περαιτέρω χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο της επαγόμενης μετάστασης στον πνεύμονα ενύοντας τα καρκινικά κύτταρα από το φλεβικό σύστημα των ποντικών όπως έχει περιγραφεί προηγούμενα. Όπως φαίνεται στην εικόνα 2b, 2c σε κάθε περίπτωση τόσο ο αριθμός των μεταστάσεων όσο και το φορτίο δεν έδειξαν κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων των ξενιστών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η SPP1 του ίδιου του ξενιστή δεν συμμετέχει στο φαινόμενο αποίκησης των καρκινικών κυττάρων στον πνεύμονα. 49

Εικόνα 2: a. Εκτίμηση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου σε σχέση με το πέρας του χρόνου κατόπιν υποδόριας έγχυσης των τριών καρκινικών σειρών MC38, LLC, B16F1 σε ποντικούς Spp1 +/+ και Spp1 -/-. Επιπλέον στην εικόνα παρουσιάζεται η εκτίμηση του αριθμού των μεταστάσεων και το φορτίο του όγκου επί του πνευμονικού ιστού για τις μεταστάσεις που προέκυψαν από την έγχυση των LLC καρκινικών κυττάρων, b. Εκτίμηση του αριθμού των μεταστάσεων και του φορτίου του όγκου που καλύπτει το σύνολο του πνεύμονα σε ποντικούς Spp1 +/+ και Spp1 -/- κατόπιν έγχυσης των τριών καρκινικών σειρών MC38, LLC, B16F1 από την ουραία φλέβα των ποντικών, c. Οι φωτογραφίες απεικονίζουν την στερεοσκοπική εικόνα των πνευμόνων αμέσως μετά την απομόνωση τους από τους ποντικούς. Σε κάθε περίπτωση οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων ποντικών δεν είναι στατιστικά σημαντικές αναιρώντας έτσι το ρόλο του ξενιστή στο φαινόμενο. 5

3.3 Έκφραση της ενδοκυττάριας και εκκρινόμενης SPP1 από διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων Τα μέχρι τώρα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η οστεοποντίνη του ξενιστή δεν διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη μετάσταση στον πνεύμονα. Για το λόγο αυτό αποφασίσαμε να εξετάσουμε το ρόλο της πρωτεΐνης που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα. Ελέγξαμε τις τρεις καρκινικές σειρές για τα επίπεδα έκφρασης των δύο βασικών ισομορφών της SPP1 τόσο σε επίπεδο RNA όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Όπως παρουσιάζεται και στην εικόνα 3a τα B16F1 καρκινικά κύτταρα μελανώματος εκφράζουν μηδαμινές ποσότητες RNA και πρωτεΐνης και για τις δύο ισομορφές (ενδοκυττάριας is2 και εκκρινόμενης is4). Αντίθετα, τα LLC καρκινικά κύτταρα παράγουν και τις δύο ισομορφές εξίσου, ενώ τα MC38 εκφράζουν κυρίως την εκκρινόμενη (is4) ισομορφή. Ο επόμενος στόχος ήταν να διερευνήσουμε το λειτουργικό ρόλο των δύο ισομορφών (is2 και is4) στη μετάσταση. Για το σκοπό αυτό, αποφασίσαμε να τροποποιήσουμε τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης στις πατρικές καρκινικές σειρές. Αρχικά, κλωνοποιήσαμε τις DNA αλληλουχίες που παράγουν τις δύο ισομορφές στα B16F1 καρκινικά κύτταρα, που φυσιολογικά στερούνται της πρωτεΐνης, επάγοντας έτσι την υπερέκφρασή τους. Επίσης, αποσιωπήσαμε το γονίδιο της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας anti-spp1 shrna, στα LLC και MC38 καρκινικά κύτταρα (τα οποία εκφράζουν και τις δύο ισομορφές). Τα αποτελέσματα αυτών των τροποποιήσεων εκτιμήθηκαν με τρεις μεθόδους όπως παρουσιάζεται στην εικόνα 3b με ανοσοαποτύπωση με Western blot, 3c με ELISA και 3d με ανοσοκυτταροχημεία για το αντίσωμα της SPP1. Επειδή στη μέχρι τώρα βιβλιογραφία υπάρχουν αντιφάσεις ως προς τις παραγόμενες ισομορφές της SPP1 αποφασίσαμε να εκτιμήσουμε περαιτέρω τα μετάγραφα Spp1 που δημιουργήσαμε. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε τα HEK293T ανθρώπινα κύτταρα τα οποία φυσιολογικά παράγουν όλες τις ισομορφές της πρωτεΐνης. Δημιουργήσαμε διακιστρονικούς ευκαρυωτικούς φορείς που κωδικοποιούσαν την SPP1 στο ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης με τον α-gfp. Όπως παρουσιάζεται στην εικόνα 3e η ισομορφή 2 ανταποκρίνεται στην ενδοκυττάρια έκφραση ενώ η ισομορφή 4 στην εκκρινόμενη. 51

Εικόνα 3: a. Έλεγχος με RT-PCR των επιπέδων RNA των δύο ισομορφών της SPP1 για τις τρεις καρκινικές σειρές (LLC, MC38, B16F1) και b. των πρωτεϊνικών επιπέδων 52

με Western blotting, c. ανοσοενζυμική μέτρηση της SPP1 των υπερκειμένων από κυτταρικές καλλιέργειες d. ανοσοκυτταροχημική έκφραση της SPP1 και των ισομορφών της στα τροποποιημένα κύτταρα και κύτταρα μάρτυρες, e. εκτίμησηαναγνώριση του πρότυπου ζωνών των πρωτεϊνικών επιπέδων των ισομορφών της SPP1 σε τροποποιημένα HEK-293T κύτταρα για την SPP1 και τον α-gfp. 3.4 Η ισομορφή 2 της SPP1 αποτρέπει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μέσα από κυτταρικά αυτόνομα μονοπάτια Πριν να ελέγξουμε το ρόλο των δύο ισομορφών στην in vivo μετάσταση εκτιμήσαμε την συμπεριφορά τους in vitro. Αρχικά, μελετήσαμε την ικανότητα πολλαπλασιασμού και επιβίωσης όλων των κυτταρικών σειρών με τη μέθοδο MTT. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4a, τα τροποποιημένα με τις δύο ισομορφές καρκινικά κύτταρα επέδειξαν διαφορετικό πρότυπο πολλαπλασιασμού. Συγκεκριμένα, τα MC38 καρκινικά κύτταρα (τα οποία εκφράζουν κυρίως την is4) στα οποία είχε αποσιωπηθεί η Spp1, δεν παρουσίασαν ικανότητα αυτόνομης επίδρασης της ισομορφής στον πολλαπλασιασμό μιας και αναπτύσσονταν με τον ίδιο σχεδόν ρυθμό όπως και τα κύτταρα μάρτυρες. Αντίθετα, τα LLC καρκινικά κύτταρα, τα οποία εκφράζουν εξίσου τις δύο ισομορφές φαίνεται να χάνουν την ικανότητα επιβίωσης μετά από αποσιώπηση της Spp1 ενώ όταν υπερεκφράστηκε η is2 στα B16F1 κύτταρα μελανώματος (τα οποία φυσιολογικά δεν εκφράζουν σχεδόν καθόλου Spp1) αυτά οδηγήθηκαν σε σημαντική αύξηση στην ικανότητα επιβίωσης και πολλαπλασιασμού. Για να επιβεβαιώσουμε τα παραπάνω ευρήματα ελέγξαμε την ικανότητα απόπτωσης όλων των κυτταρικών σειρών (εικόνα 4b,c). Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήσαμε χρώση όλων των κυττάρων με Annexin και 7AAD, δύο δείκτες πρώιμου και όψιμου κυτταρικού θανάτου. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4b, τα B16F1 κύτταρα παρουσίαζαν σημαντική μείωση στον πρώιμο και όψιμο κυτταρικό θάνατο κυρίως όταν σε αυτά υπερεκφράστηκε η is2 (η οποία κωδικοποιεί την ενδοκυττάρια Spp1). Από την άλλη τα LLC κύτταρα (τα οποία εκφράζουν εξίσου τις δύο ισομορφές, εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα κυτταρικού θανάτου κατόπιν αποσιώπησης του γονιδίου της Spp1, ενώ τα MC38 που εκφράζουν κυρίως την εκκρινόμενη ισομορφή (is4) δεν φάνηκε να επηρεάστηκαν στον ίδιο βαθμό από την αποσιώπηση του γονιδίου παρόλο που και σε αυτά παρατηρείται αύξηση της αποπτωτικής διάθεσης. Είναι σημαντικό να σημειώσουμε ότι παρουσία ορού οι τροποποιήσεις στην έκφραση της SPP1 δεν είχαν 53

Annexin+ 7AAD+ cells (%) Annexin+ cells (%) (%) Annexin+ 7AAD+ cells (%) Annexin V counts counts SSC - SSC - FL1 Annexin-V FITC FL1 Annexin-V FITC MTT reduction (A@49 nm) MTT reduction (A@49 nm) MTT reduction MTT reduction SSC counts - (A@49 SSC (A@49 nm) counts - nm) SSC counts - SSC SSC - - SSC SSC - - FL1 counts Annexin-V FITC FL1 counts Annexin-V FITC SSC - counts SSC SSC - - counts SSC - SSC - FL1 counts Annexin-V FITC SSC - FL1 counts Annexin-V FITC FL1 Annexin-V FITC καμία επίδραση στην απόπτωση για αυτό ερεθίσαμε υπό συνθήκες πείνας τις κυτταρικές σειρές σε απόπτωση. B16F1 (no Spp1is) 2 a *** Wt b 5 1 15 2 25.1 5 1 1 15 1 2 1 25 1 5 1 15 2 25 FSC - FL1 FSC Annexin-V - FITC FSC FL1 - Annexin-V FITC File: 4 LLC shc SF 1.FCS Date: 1-5-214 Time: 1 16:39:19 25 Particles: 1333 Acq.-Time: 55 1 s 1 25 25 *** 25 25 25 4 32 8 2 Q2:.% 8 2 *** pc 1 / ml 2 2 2 1 pspp1is2 *** 2 32 24 6 15 6 15 1 15 15 15 15 24 pspp1is4 c 5 16 1 8 5 1.8 25 1 25 ** ** ns ** 5 5.1 1 1 1 1 1.1.1 1 1 1 1 1 1 1 1.1 1 1.1 1 1 1 1 FL1 Annexin-V FITC FL1 Annexin-V FL1 Annexin-V FITC FITC FL1 Annexin-V FITC File: LLC sh SF 2.FCS Date: 1-5-214 Time: 16:33:26 Particles: 13627 Acq.-Time: 73 s Concentration: 1 35 / ml 1 25 partec PAS 4 1 2 5 1 1 5 Q3:.% Q4:.% 4 2 5 1 1 5 4 Q3: 16.% / ml 1 Q2:.% Q4:.% / ml 5 5 5 5 8 16 B16F1 pc B16F1 pspp1is2 B16F1 pspp1is4.1.1.1.1 1 1 hours in culture *** 1 1 LLC.1 (both 1 5Spp1is2 1 1 15 1 & 4) 2 1 25.1 1.1 5 1 1 1 1 15 1 1 2 1 25 1.1 5 1 1 15 1 2 1 25 1.1 1 1 1 1 FL3 7AAD PerCP FL3 7AAD FSC-W PerCP - FL3 7AAD FSC-W PerCP FL3 7AAD - PerCP FSC-W FL3 7AAD - PerCP FL3 7AAD PerCP 5 1 15 2 25Region.1 Gate 5 1 1 %Gated 15 1 2 GMn-x 1 25 Region GMn-y 1 Gate.1.1 %Gated 1 1 1 GMn-x 1 1 GMn-y 1 1.1 1 1 1 1 Region Gate %Gated FSC - GMn-x GMn-y *** Q2 <None> Wt FL1 FSC. Annexin-V - - FITC Q2 - FL1 Annexin-V <None>. FL1 - Annexin-V FITC - FITC FL1 Annexin-V FITC File: Q2 4 MC38 shc <None> SF 2.FCS.Date: 1-5-214 - File: Time: - 2 MC38 Q3 16:2:15 sh SF 1.FCS 25 <None> Particles: Date:. 15466 1-5-214 Acq.-Time: Time: - 5 16:5:53 Q3 - s 1 Particles: 12987 Acq.-Time: 45 s partec 25 1 PAS Q3 <None>. - - <None>. - -.4 Q4 <None> shc. - Q4 - Q4 25 25 <None>. - - 25 25<None> 4. - - 2 Speed: 9. µl/s Count Volume:.2 ml Speed: 7. µl/s Count Volume:.2 ml Speed: 32 8. µl/s 16 Enable 2 Q2:.% Q2:.% Parameter 1.5 shspp1 Gain *** 2 Enable Log Parameter L-L 1 U-L Gain Comp. Log FSC L-LSSC 1 U-L FL1 Comp. FL2 FSC FL3 SSC FL4 FL1 FL5 FL2 FL6 FL3 FSC-A FL4 SSC-A FL5 FL5-A FL6 FSC-W FSS Enable 2 Parameter Gain Log 2 2 L-L FSC U-L - Comp. 185. lin FSC 2 FSC 5. SSC 32-999.9 FL1 FL2 185. lin --FL3 16 5. - FL4 999.9 - FL5 - FL6 -- - FSC-A - - SSC-A - - FL5-A - - FSC-W - - SSC-W - - FL5-W - - IC - - LogBias: - - FSC - 18. lin 5. SSC 999.9-23. lin -- SSC 1. - - 999.9-23. - lin - - 1. --- 999.9 - - - - - - - --- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 24 SSC - 21. lin 12 15 1. FL1 999.9 Annexin-V FITC 489. log4-15 FL1 1. -- Annexin-V 999.9 - FITC 489. - log4 - - 1. - - 999.9 -- - 11.1 - - -.1 - - - - --- - 11.1 - - -.1 - - - - - - - - - - - -.FL1 Annexin-V FITC 489. log4 1. FL2 553. log4 - FL2 1. - 999.9 -- 553. 11.1 log4 - -.1 1. - - 999.9 19.8 - -- - - 3.- - - - 19.8 - - --- - 3. - - - - - - -.6 15 15 - - - - 1. 15 15 24 1 12 1 FL2 553. log4 1. FL3 shc999.9 7AAD PerCP75. log4 - FL3 1. - 7AAD 999.9 19.8PerCP75. -- log4-3. 1. - - 999.9 12.8-83.5 - - -- - - - - 12.8 - - 83.5 - - --- - - - - - - 1.3 - - - - 16 FL3 7AAD 5PerCP75. 1 log4 8 1 1. FL4 999.9 7. log4-1fl4 1. - 999.9 12.8 7. 83.5 log4 - -- 1. - - 999.9 - - - - - 9.- - -- - - - - - - - 9. - - --- - - - 1.1 - - - - FL4 7. log4 1. FL5 999.9 351. log4 - FL5 1. - 999.9-351. - log4-9. 1. - -- 999.9 - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - ---.2 - - - - 1 1 FL5 351. log4 1 Q3:.% Q4:.% 1 Q3:.% Q4:.% 16 8 1. FL6 999.9 1..5 hours in culture shspp1 8. log4 - FL6 1. - 1 999.9-8. - log4 - - 1. - - 1 999.9 - -- - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - --- - - 8 FL6 8. log4 4MC38 5 1. FSC-A (mainly 999.9 - Spp1is4) 185. lin - 5FSC-A 5. - - 999.9-185. - lin - - 5. - - 999.9 - - - -- - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - --- FSC-A ns - 18. lin 5. 999.9 - - - - - - - - -- - - - - - - 5 5 5 5 8 4 LLC shc LLC shspp1.1.1.1. 1 1 1 1.1 1 Wt 5 1 1 1 15 2 1 25.1 5 1 1 15 1 2 1 25 1.1 1 1 1 1 FL3 7AAD PerCP FL3 7AAD FSC-W PerCP - FSC-W FL3 7AAD - PerCP FL3 7AAD PerCP 5.5 1 15 21 25.1 5 1 1 15 1 2 1 25 1.1.1 1 1 1 1 1 1 1 1.1 1 1 1 1 Region Gate %Gated FSC - GMn-x Region GMn-y Gate shc %Gated FSC FL1 Annexin-V - GMn-x FITC GMn-y FL1 Annexin-V FL1 Annexin-V FITC FITC FL1 Annexin-V FITC Q2 4 2 <None>. - Q2-25<None>. - - 25 1 1 Q3 <None>. - Q3 - <None> hours in culutre shspp1. - - Q4 <None>. - Q4 - <None>. - - 32 16 Speed: 8. µl/s Speed: 8. 2 2 µl/s Count Volume:.2 ml 1 1 Enable. Parameter Gain Enable Log Parameter L-L U-L Gain Comp. Log FSC L-L SSC U-L FL1 Comp. FL2 FSC FL3 SSC FL4 FL1 FL5 FL2 FL6 FL3 FSC-A FL4 SSC-A FL5 FL5-A FL6 FSC-W FSC-A SSC-W SSC-A FL5-W FL5-A IC FSC-W LogBias: FSC - 18. lin FSC 5. - 999.9 18. lin -- 5. - 999.9 - - --- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 24 12 SSC 2-421. 6 lin 15 15 SSC 1. - 999.9 21. lin - 1. -- 999.9 - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FL1 Annexin-V FITC 489. log4 FL1 1. Annexin-V 999.9 FITC 489. log4-1. - 1 999.9 -- 11.1 - -.1 - - 1 -- - 11.1 - -.1 - - - - - - - - - - - -.6 - FL2 553. log4 FL2 1. 999.9 553. log4-1. - 999.9 19.8 -- - 3. - - 19.8 - -- - 3.- - - - - - - - - - - - 1.3-16 8 FL3 7AAD PerCP75. log4 1FL3 1. 7AAD 999.9 PerCP75. log4-1 1. - 999.9 12.8 83.5 - -- - - 12.8-83.5 - -- - - - - - - - - - - - - 1.1 - hours FL4 in culutre 7. log4 FL4 1. 999.9 7. log4-1. - 999.9 - - - 9. - -- - - - - 9.- -- - - - - - - - - - -.2 - FL5 351. log4 FL5 1. 999.9 351. log4-1. - 1 999.9 - - - - - - 1 - -- - - - - - - -- - - - - - - - - - - 8 FL6 8. log4 4 5FL6 1. 999.9 8. log4-5 1. - 999.9 - - - - - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - - - FSC-A - 18. lin FSC-A 5. - 999.9 18. lin - 5. - 999.9 - - - - - - - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - MC38 shc MC38 shspp1.1.1.1 1 1 1 1.1 1 5 1 1 1 15 2 1 25.1 5 1 1 15 1 2 1 25 1.1 1 1 1 1 FL3 7AAD PerCP FL3 7AAD FSC-W PerCP - FSC-W FL3-7AAD PerCP FL3 7AAD PerCP Region Gate %Gated GMn-x GMn-y GMn-y Region Gate %Gated GMn-x Q2 <None>. - - - Q2 <None>. - - Q3 <None>. - Q3 <None>. - - 7AAD Q4 <None>. - - - Q4 <None>. - Speed: 8. µl/s Speed: 8. µl/s Enable Parameter Gain Log L-L U-L Comp. FSC SSC FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FSC-A SSC-A FL5-A FSC-W FSC - 18. lin ns 5. - 999.9 -- - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - SSC 5 2-21. lin SSC 1. - 999.9 21. lin 2-1. -- - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - FL15 Annexin-V FITC 489. log4 FL1 1. Annexin-V 999.9 FITC 489. log4-1. - -- 11.1 - -.1 - - -- - 11.1 - -.1- - - - - - - - - - - -.6 - FL2 553. log4 FL2 1. 999.9 553. log4 - * 1. - 999.9 19.8 -- - 3. - - 19.8 - -- - 3.- - - - - - - - - - - - 1.3 - FL3 7AAD PerCP75. log4 1. 999.9 - - 12.8 83.5 -- - - - - - - - 999.9 999.9 ** 999.9 Parameter Gain Log L-L FSC U-L Comp. 18. FSC lin SSC 5. FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FSC-A SSC-A FL5-A FSC-W SSC-W FL5-W IC Enable LogBia 1. 999.9 - - 12.8 - - FL3 7AAD PerCP75. log4 83.5 -- - - - - - - - 1.1 FL4 7. log4 1. 999.9 - - - - 9. -- - - - - - - - -.2 FL5 351. log4 FL5 1. 999.9 351. log4 - ns1. - 999.9 - - - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - - - - - FL6 8. log4 FL6 1. 999.9 8. log4 1 -* 1. - 999.9 - - - - - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - - - FSC-A - 18. lin FSC-A 5. - 999.9 18. lin - 5. - 999.9 - ns - - - - - - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - FL4 7. log4 1. 999.9 - - - - 9. -- - - - - - - 5 2 15 1 5 2 8 1 64 48 1 32 1 2 1 1 1 B16F1 pc B16F1 pspp1tv2 B16F1 pspp1tv4 LLC shc LLC shspp1 MC38 shc MC38 shspp1 B16F1 pc B16F1 pspp1is2 B16F1 pspp1is4 LLC shc LLC shspp1 MC38 shc MC38 shspp1 B16F1 pc B16F1 pspp1tv2 B16F1 pspp1tv4 LLC shc LLC shspp1 MC38 shc MC38 shspp1 B16F1 pc B16F1 pspp1is2 B16F1 pspp1is4 LLC shc LLC shspp1 MC38 shc MC38 shspp1 Εικόνα 4: a. Εκτίμηση του ρυθμού επιβίωσης και πολλαπλασιασμού των τροποποιημένων καρκινικών κυτταρικών σειρών, b-c. Μελέτη της αποπτωτικής τάσης όλων των κυτταρικών σειρών με δείκτες πρώιμου και όψιμου κυτταρικού θανάτου και εκτίμησή τους με κυτταρομετρία ροής. 54

Εικόνα 5: a-b, ανοσοκυτταροχημική έκφραση της κασπάσης 8 και 3 για τις καρκινικές κυτταρικές σειρές LLC, MC38 και B16F1. 3.5 Ο TrP53 διαμεσολαβεί στην κυτταρικά αυτόνομη δράση της SPP1 Προσπαθώντας να εξηγήσουμε τα προηγούμενα αποτελέσματα αποφασίσαμε να πραγματοποιήσουμε ανάλυση μικροσυστοιχιών. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε ότι η αποσιώπηση του γονιδίου της Spp1 σχετίζεται με την ενίσχυση του μονοπατιού του TrP53 γονιδίου, του «προστάτη του γονιδιώματος», μέσα από την ενεργοποίηση και έκφραση των κυρίων διαμεσολαβητών της απόπτωσης, των κασπασών 3 και 8. Συγκεκριμένα, τα LLC κύτταρα μετά από αποσιώπηση του γονιδίου της Spp1 φαίνεται ότι υπερεκφράζουν τόσο την κασπάση 3 όσο και την 8. Η αποσιώπηση του γονιδίου στα MC38 κύτταρα όπως φαίνεται στον χάρτη 2 (βλ. παράρτημα) οδηγεί σε μειωρύθμιση του συνδέτη Fas ο οποίος μειώνει την κασπάση 8 και επομένως προάγεται ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός όπως παρατηρήθηκε και από τα προηγούμενα πειράματα. Από την άλλη πλευρά τα B16F1 κύτταρα στα οποία έχουν υπερεκφραστεί οι δύο ισομορφές παρουσίασαν χαμηλότερη έκφραση τόσο της κασπάσης 3 όσο και της κασπάσης 8. Τα 55

αποτελέσματα αυτά εκτιμήθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία για όλες τις κυτταρικές σειρές (εικόνα 5a,b) Όπως φαίνεται και οι δύο ισομορφές SPP1 προάγουν την ανάπτυξη του όγκου in vitro μειωρυθμίζοντας τις κασπάσες 8 και 3.. Για να αποσαφηνίσουμε τον μηχανισμό του κυτταρικά αυτόνομου πολλαπλασιασμού in vitro, συγκρίναμε τις κυτταρικές σειρές ως προς την έκφραση του Trp53. Η αδυναμία σημαντικής μείωσης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρουσία shrna στα MC38 κύτταρα μας οδήγησε στην αλληλούχηση του γονιδιώματος τους, η οποία αποκάλυψε την παρουσία μιας μετάλλαξης στο Trp53 γονίδιο (εικόνα 6a) γεγονός που ενισχύει τα μέχρι τώρα ευρήματά μας. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε την παρουσία της μετάλλαξης για το Trp53 με ανοσοφθορισμό (εικόνα 6b). Επιπρόσθετα, η ανάλυση μικροσυστοιχιών (εικόνα 6c) για την επίδραση της αποσιώπησης του γονιδίου της Spp1 μεταξύ των LLC και MC38 καρκινικών κυττάρων έδειξε ενεργοποίηση του Trp53 μονοπατιού αποκλειστικά στα LLC κύτταρα που έφεραν αποσιώπηση της Spp1 κάτι που δεν παρατηρήθηκε στα τροποποιημένα MC38 καρκινικά κύτταρα και οφείλεται πιθανά στην παρουσία της μετάλλαξης του Trp53. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με ανοσοκυτταροχημεία όπου, η σύγκριση μεταξύ των αποσιωπημένων κυττάρων και των κυττάρων μαρτύρων δείχνει μηδενική διαφορά στα MC38 καρκινικά κύτταρα (λόγω μεταλλαγμένου Trp53) και εντυπωσιακά υψηλή έκφραση στα τροποποιημένα LLC καρκινικά κύτταρα (εικόνα 6d), γεγονός που επιβεβαιώνει όλα τα προηγούμενα ευρήματα. 56

a Trp53 cdna (bases 52-54) C57BL/6 splenocytes wt/wt B16F1 skin melanoma wt/wt LLC lung adenocarcinoma wt/wt MC38 colon adenocarcinoma wt/g533c wt/r178p /G b B16F1 LLC MC38 5 μm Hoechst 33258 TRP53 merge 57

Εικόνα 6: a. αλληλούχηση του γονιδιώματος των καρκινικών σειρών LLC, MC38 και B16F1 για την ανίχνευση μεταλλάξεων στο Trp53 γονίδιο επιδεικνύει την αντικατάσταση μιας βάσης (G/C) στο γονιδίωμα των MC38 καρκινικών κυττάρων, b. έκφραση του μεταλλαγμένου γονιδίου Trp53 με ανοσοφθορισμό στα MC38 αλλά όχι στα LLC και B16F1 κύτταρα. c. η ανάλυση μικροσυστοιχιών για την επίδραση της αποσιώπησης του γονιδίου της Spp1 μεταξύ των LLC και MC38 καρκινικών κυττάρων αναδεικνύει την ενεργοποίηση του Trp53 μονοπατιού αποκλειστικά στα LLC κύτταρα, d. ανοσοκυτταροχημική έκφραση του Trp53 παράγοντα στα LLCshSPP1 κύτταρα σε αντίθεση με τα κύτταρα μάρτυρες. Στα MC38 κύτταρα η έκφραση του γονιδίου της Spp1 δεν παρουσιάζει κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση του Trp53 παράγοντα. 3.6 Ο ρόλος των ισομορφών της SPP1 στην ανάπτυξη του όγκου στο μοντέλο της αυτόματης μετάστασης Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος των ισομορφών της SPP1 in vivo χρησιμοποιήσαμε αρχικά το μοντέλο της αυτόματης πνευμονικής μετάστασης σε άγριου τύπου C57BL/6 ποντικούς. Όλες οι κυτταρικές σειρές ενέθηκαν υποδόρια όπως έχει αναφερθεί προηγούμενα. Όπως φαίνεται στην εικόνα 7a,b δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο μέγεθος του πρωτοπαθή όγκου τόσο για τα MC38 όσο και για τα B16F1 καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα μάρτυρες. Οι δύο αυτές καρκινικές σειρές όπως έχουμε ήδη αναφέρει δεν μεθίστανται αυτόματα στον πνεύμονα οπότε και δεν ήταν εφικτό να εκτιμήσουμε την επιβίωση των ποντικών. Από την άλλη μεριά, το αποτέλεσμα της μειωμένης κυτταρικής επιβίωσης κατόπιν αποσιώπησης του γονιδίου 58

tumor volume (cm 3 ) lung tumor number lung tumor burden (μl) tumor volume (cm 3 ) tumor volume (cm 3 ) fraction alive tumor volume (cm 3 ) tumor volume (cm 3 ) fraction alive της Spp1 στα LLC καρκινικά κύτταρα ήταν ορατό τόσο κατά την εκτίμηση του αριθμού των μεταστάσεων στερεοσκοπικά όσο και ιστολογικά. Οι πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν τα τροποποιημένα καρκινικά κύτταρα εμφάνισαν σχεδόν πλήρη εξάλειψη της πνευμονικής μετάστασης (εικόνα 7c). 3 2 1 a 5 1 15 2 25 2 days posttumor cells b 3 1 8 6 4 2 shc 3 2 shspp11 5 1 15 2 25 days posttumor cells 5 1 15 2 25 days posttumor cells c ns 5 1 15 2 25 ns Spp1+/+ sh C 2 days posttumor Spp1+/+ sh Spp1 1 cells overc overtv4 3 1. shc shspp1.5 ***. 5 1 15 2 25 1 5 days posttumor cells shc *** shspp1 1. shc.5 days postshspp1 LLC cells 2 4. 2 4 1 5 days post- LLC cells shc LLC shc LLC shspp1 *** shspp1 * shc LLC shc LLC shspp1 shspp1 1 cm Εικόνα 7: a-b. Αύξηση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου σε συνάρτηση με το χρόνο κατόπιν υποδόριας έγχυσης για τα καρκινικά κύτταρα MC38 και B16F1 αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στην εικόνα η αποσιώπηση ή υπερέκφραση της Spp1 δεν επιφέρει κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά με τα κύτταρα μάρτυρες, c. Στατιστικά σημαντική μείωση του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου αλλά και του αριθμού των πνευμονικών μεταστάσεων ή του φορτίου όγκου του πνεύμονα κατόπιν αποσιώπησης του γονιδίου της Spp1 στα LLC καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα μάρτυρες. Στα γραφήματα παρουσιάζεται και η επιβίωση των πειραμματοζώων. Στις φωτογραφίες παρουσιάζεται ενδεικτικά η στερεοσκοπική εικόνα των πνευμόνων κατόπιν έγχυσης των LLCshC και LLCshSPP1 κυττάρων (οι μεταστάσεις σημειώνονται με βέλη). 59

lung tumor burden (μl) lung tumor burden (μl) lung tumor burden (μl) fraction alive fraction alive lung tumor number lung tumor number lung tumor number 3.7 Η SPP1 προάγει την επαγόμενη μετάσταση στους πνεύμονες Για να εξετάσουμε την ικανότητα των κυττάρων να μεθίστανται παρουσία ή απουσία των ισομορφών της οστεοποντίνης χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο της επαγόμενης μετάστασης. Όπως φαίνεται στην εικόνα 8a,c όλες οι κυτταρικές σειρές μετανάστευσαν στους πνεύμονες, μεταφερόμενες από το αίμα, κατόπιν έγχυσής τους στην φλεβική κυκλοφορία. Στα B16F1 καρκινικά κύτταρα στα οποία απουσιάζει φυσιολογικά κάθε ισομορφή της SPP1, η υπερέκφραση της is4 (που κωδικοποιεί την εκκρινόμενη οστεοποντίνη) οδήγησε σε αξιοσημείωτα μεγαλύτερη αποίκηση των πνευμόνων σε αντίθεση με τα κύτταρα μάρτυρες αλλά και τα B16F1 στα οποία υπερεκφράστηκε η ενδοκυττάρια ισομορφή (is2). Η πνευμονική αποίκηση εκτιμήθηκε είτε ως αριθμός μεταστάσεων στερεοσκοπικά είτε ως φορτίο όγκου επί του πνευμονικού ιστού ιστολογικά. Η αποσιώπηση του γονιδίου της Spp1 στα LLC και MC38 σχεδόν εξάλειψε πλήρως το φαινόμενο. Επιπλέον, η αποσιώπηση του γονιδίου συσχετίσθηκε και με την παρατεταμένη σε αντίθεση με τους μάρτυρες επιβίωση των ποντικών (εικόνα 8c). a 1 ** ns ns 2 1 b 5 5 25 pc pspp1is2 pspp1is4 *** * *** pc pspp1is2 pspp1is4 1 5 25 shc shc ** shspp1 *** shspp1 5 5 25 shc shc *** 1. LLC shc.5 shspp1. 5 1 *** shspp1 days posttumor cells LLC shspp1 MC38 shc MC38 shspp1.5 *** ns *** ns 1. LLC shc. 5 1 days posttumor cells LLC shspp1 MC38 shc MC38 shspp1 6

Εικόνα 8: a. Στα γραφήματα παρουσιάζεται η αύξηση του αριθμού των πνευμονικών μεταστάσεων και του φορτίου του όγκου επί του συνόλου του πνευμονικού ιστού στο μοντέλο επαγόμενης μετάστασης κατόπιν υπερέκφρασης των ισομορφών 2 και 4 στα B16F1 κύτταρα. Αντίθετα η αποσιώπηση της Spp1 στα LLC και MC38 κύτταρα προκαλεί την μείωσή τους, b. Όπως φαίνεται στο γράφημα επιβίωσης η αποσιώπηση της Spp1 οδηγεί σε περαιτέρω επιβίωση των ποντικών σε αντίθεση με τους ποντικούς μάρτυρες. c. ενδεικτικές φωτογραφίες από την στερεοσκοπική και ιστολογική εκτίμηση των μεταστάσεων. 3.8 Η δράση της SPP1 πραγματοποιείται μέσω σημάτων επικοινωνίας της CCL2 προς τον υποδοχέα CCR2. Παρόλο που in vitro η is2 φαίνεται ότι συνδέεται με την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, in vivo η εκκρινόμενη ισομορφή (is4) παρουσιάζεται ως η κύρια αιτία για την αποίκηση των καρκινικών κυττάρων στον πνευμονικό ιστό. Λαμβάνοντας υπόψιν αυτά τα αποτελέσματα υποθέσαμε ότι η αποσιώπηση της SPP1 προάγει ενα μη κυτταρικά αυτόνομο αποτέλεσμα στην εγκατάσταση στον πνεύμονα. Η ανάλυση μικροσυστοιχιών για παρακρινή γονίδια υπέδειξε δύο κυτταροκίνες την CCL7 και CCL2 ως τα πιο βασικά γονίδια τα οποία μειωρυθμίζονται κατά την αποσιώπηση του γονιδίου της SPP1(εικόνα 9a). Πράγματι, η εκτίμηση του ποσού του mrna που παράγεται από τα κύτταρα στα οποία έχουμε υπερεκφράσει τις δύο ισομορφές έδειξε ότι τα κύτταρα στα οποία είχε υπερεκφραστεί η εκκρινόμενη ισομορφή (is4) είχαν και τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης CCL2 ενώ τα κύτταρα με αποσιώπηση δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά με τα 61