ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ# ΕΝΩΣΗ#ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ# Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων, Πολιτισμού και Αθλητισμού Ε.#Π.#Ανταγωνιστικότητα#και#Επιχειρηματικότητα#(ΕΠΑΝ#ΙΙ),#ΠΕΠ#Μακεδονίας# #Θράκης,#ΠΕΠ#Κρήτης#και#Νήσων#Αιγαίου,#ΠΕΠ# Θεσσαλίας# #Στερεάς#Ελλάδας# #Ηπείρου,#ΠΕΠ#Αττικής ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΣ ΒΟΗΘΟΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ELECTRONIC MOLECULAR DIAGNOSTICS ASSISTANT ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π2.3 Προσδιορισμός και Διευθέτηση των Γονιδιωματικών Ερευνητικών Δοκιμών του emodia: Μέλη (ομάδες ασθενών και ομάδες ελέγχου), Πλατφόρμες πειραμάτων, Στοχευμένοι Βιοδείκτες- Ζητήματα Βιοηθικής και Νομικά Ζητήματα Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: ΕΜΒΙΑ (1) Ημερομηνία: 11/02/2014 Ιστορικό Εγγράφου Έκδοση Ημερομηνία Κατάσταση Προετοιμασία Διανομή* - Ονομ./Επώνυμο, (#Φορέα) - Γ. Ποταμιάς, (3) 0.1 20/11/2013 Προσχέδιο Γ. Πατρινός, (1) K 1.0 15/12/2013 1 η έκδοση Γ. Πατρινός, (1) K Τελική 11/02/2014 Τελικό Γ. Πατρινός, (1) EE * Κ: Κοινοπραξία έργου, EE: ΕΥΔΕ- ΕΤΑΚ, Δ: Δημόσιο έγγραφο (ελεύθερο, π.χ., Web- Site έργου)
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σήμερα, η ανάπτυξη της μετα- γενωμικής καθιστά σαφή την ανάγκη κατανόησης της γενετικής βάσης των ασθενειών, προκειμένου να σχεδιαστεί η βέλτιστη θεραπευτική προσέγγιση. Ωστόσο, η μετάβαση από την παρούσα «βασισμένη σε αποδείξεις» ιατρική στη «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική δεν μπορεί παρά να λάβει χώρα, μόνο, όταν και αν η γενωμική πληροφορία είναι ακριβής και εξατομικευμένη ή αφορά μικρούς πληθυσμούς ασθενών. Η «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική εξαρτάται έντονα από την μεταφραστική έρευνα, τη μετάφραση και μετάβαση της νέας πληροφορίας από το ερευνητικό εργαστήριο στην κλινική πράξη. Για αυτό, απαιτείται η σωστή διαχείριση της πληροφορίας, ώστε τα ευρήματα μαζί με την κλινική τους εφαρμογή και σημασία να αποδίδονται κατάλληλα και έγκαιρα. Αυτό, ακριβώς, είναι το όραμα του παρόντος έργου, δημιουργώντας μια πλατφόρμα κλινικο- γενωμικής πληροφορίας, όπου τέθηκαν ως κλινικοί πυλώνες δύο νευρολογικές ασθένειες, η ΔΠΑ και η ΑΜΣ. Σε αυτό το παραδοτέο, προσδιορίζονται και διευθετώνται οι γονιδιωματικές ερευνητικές δοκιμές του έργου. Πιο αναλυτικά, θέτονται οι ομάδες ασθενών (καθώς και ελέγχου), οι πλατφόρμες των πειραμάτων και οι βιοδείκτες- στόχοι. Επιπρόσθετα, παρουσιάζονται και επιλύονται τα ζητήματα ηθικής και τα νομικά ζητήματα που συνοδεύουν τις προσεγγίσεις μας. EXECUTIVE SUMMARY Today, with the raise of post- genomics, it becomes evident that there is a great need to understand the genetic basis of disease towards the design of the ultimate therapeutic approach. Nevertheless, the transition from the evidence- based medicine to the genomic- based medicine will not be accomplished, if genomic information does not become more accurate and individualized or narrowed down to small patient popoulation groups. Genomic medicine depends to a great extent on translational research; the translation and transition of the new genomic information from the research laboratory to the clinic. Thus, proper information management is of paramount importance, so that findings accompanied by their clinical relevance and applicability are appropriately and timely delivered. This is the exact vision of this proposal via the creation of a platform of clinico- genomic information, where two neurological diseases BD and ALS are considered as its clinical benchmarks. Herein, we will determine and present the exact genomic research strategies followed. Hence, the patient and control populations for both diseases are set as well as the experimental platforms to be employed and the biomarkers of interest. In parallel, bioethics and legal issues are presented and tackled. 1 /14 Παραδοτέο Π2.3
ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. Εισαγωγικά Στοιχεία... 3 2. Ομάδες Ασθενών και Ελέγχου... 4 2.1 ΑΜΣ... 4 2.2 ΔΠΑ... 4 3. Πλατφόρμες Πειραμάτων - ΑΜΣ... 5 3.1 Απομόνωση Γενωμικού DNA... 5 3.2 Αλληλούχιση Ολόκληρου του Γονιδιώματος... 5 3.3 Επεξεργασία και Ανάλυση Δεδομένων... 6 3.4. Επικύρωση Αποτελεσμάτων... 6 4. Πλατφόρμες Πειραμάτων - ΔΠΑ... 8 4.1 Απομόνωση Γενωμικού DNA... 8 4.2 Μελέτη Γενετικής Συσχέτισης σε Γονιδιωματική Κλίμακα... 8 4.3 Επεξεργασία και Ανάλυση Δεδομένων... 8 4.4. Επικύρωση Αποτελεσμάτων... 9 5. Στοχευμένοι Βιοδείκτες... 9 5.1 ΑΜΣ... 9 5.2 ΔΠΑ... 11 6. Ζητήματα Βιοηθικής και Νομικά Ζητήματα... 12 Αναφορές... 14 2 /14 Παραδοτέο Π2.3
1. Εισαγωγικά Στοιχεία Σήμερα, η ανάπτυξη της μετα- γενωμικής καθιστά σαφή την ανάγκη κατανόησης της γενετικής βάσης των ασθενειών, προκειμένου να σχεδιαστεί η βέλτιστη θεραπευτική προσέγγιση. Ωστόσο, η μετάβαση από την παρούσα «βασισμένη σε αποδείξεις» ιατρική στη «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική δεν μπορεί παρά να λάβει χώρα, μόνο, όταν και αν η γενωμική πληροφορία είναι ακριβής και εξατομικευμένη ή αφορά μικρούς πληθυσμούς ασθενών. Η «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική εξαρτάται έντονα από την μεταφραστική έρευνα, τη μετάφραση και μετάβαση της νέας πληροφορίας από το ερευνητικό εργαστήριο στην κλινική πράξη. Είναι γνωστό πως πολλά υποσχόμενες ανακαλύψεις στη βασική και κλινική επιστήμη «χάνονται στη μετάφραση» [1, 2]. Συνεπώς, η ορθή διαχείριση της μεταφραστικής έρευνας είναι ζωτικής σημασίας, έτσι, ώστε τα σχετικά ευρήματα - σε συνδυασμό με την κλινική σημασία και εφαρμογή τους να αποδίδονται κατάλληλα και έγκαιρα [3]. Η μετάφραση των ευρημάτων της έρευνας σε κλινικές εφαρμογές δεν αποτελεί εύκολο έργο. Πράγματι, οι δυσκολίες στη λήψη ιατρικών αποφάσεων στην καθημερινή πρακτική είναι σε μεγάλο βαθμό αποτυχίες συνδυασμού της γνώσης. Μάλιστα, σε ένα τόσο σημασιολογικά ετερογενές περιβάλλον, οι σχετικές διαδικασίες λήψης ιατρικών αποφάσεων γίνονται πιο απαιτητικές, αναφορικά με την περιοχή αναφοράς τους. Ενδεικτικό παράδειγμα αποτελούν τα κλινικά προφίλ με πληθυσμιακό προσανατολισμό κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου, τα οποία και εμπλουτίζονται με γονιδιωματικές/ γενετικές πληροφορίες, αποσκοπώντας σε αξιόπιστες σχέσεις γονοτύπου - φαινοτύπου και βιοδείκτες ευαισθησίας. Προσπαθώντας να ικανοποιήσει τις προαναφερθείσες δυσκολίες και ελλείψεις και να ανταποκριθεί στην πρόκληση της γονιδιωματικής ιατρικής, το παρόν έργο ακολουθεί ένα συμπαγή σχεδιασμό έρευνας και ανάπτυξης, αποσκοπώντας στην παράδοση επικυρωμένων φαρμακογονιδιωματικών στόχων, στην ανάπτυξη μιας ολοκληρωμένης πλατφόρμας διαχείρισης δεδομένων και τέλος, σε ένα περιβάλλον ανακάλυψης γνώσης. Το όραμα του έργου αφορά στη διευκόλυνση της λήψης αποφάσεων στην κλινική, καθιστώντας δυνατή την εξατομικευμένη διαγνωστική ή/ και ιατρική, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής του ασθενούς και μειώνοντας τα κόστη στην υγεία. Δυο είναι οι κλινικού πυλώνες, στα πλαίσια του έργου: η ΑΜΣ και η ΔΠΑ. Σε αυτό το παραδοτέο η έμφαση δίδεται στις γονιδιωματικές ερευνητικές δοκιμές του έργου, καθώς και στα ηθικά και νομικά ζητήματα που τις συνοδεύουν. 3 /14 Παραδοτέο Π2.3
2. Ομάδες Ασθενών και Ελέγχου 2.1 ΑΜΣ Για τη διερεύνηση της ΑΜΣ, οι ομάδες ασθενών και ελέγχου ορίστηκαν ως εξής:! Υγιή άτομα (ομάδα ελέγχου), ελληνικής καταγωγής! Ασθενείς με ΑΜΣ, οικογενούς ή σποραδικής μορφής, ελληνικής καταγωγής Τα δείγματα αίματος, στο σύνολό τους, συλλέχθηκαν κατόπιν έγγραφης συγκατάθεσης των συμμετεχόντων. Στην περίπτωση των ασθενών με ΑΜΣ, οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν για τη μελέτη μας μέσω του Ελληνικού συλλόγου (http://www.alshellas.org/). Με αυτόν τον τρόπο, ο αρχικός μας πληθυσμός των 15 ασθενών, εμπλουτίστηκε περαιτέρω, έχοντας εν τέλει 27 ασθενείς με ΑΜΣ. Όλοι οι ασθενείς βρέθηκαν αρνητικοί ως προς τις SOD1 μεταλλάξεις. Η ομάδα ελέγχου, επίσης εμπλουτίστηκε και αφορά σε 50 υγιή άτομα. 2.2 ΔΠΑ Στην περίπτωση της ΔΠΑ, θα χρησιμοποιηθούν δεδομένα από μελέτη σε πληθυσμό ασθενών με ΔΠΑ στη Σαρδηνία (τουλάχιστον τέσσερις γενεές), παρέχοντάς μας την πρόσβαση σε 52 δείγματα DNA (άσχετων ατόμων, με ΔΠΑ διάγνωση). Η ομάδα ελέγχου αποτελείται από περισσότερα από 100 υγιή άτομα. Τα κρίτηρια εισόδου στη μελέτη ήταν:! Τουλάχιστον 12μηνη συνεχής χορήγηση λιθίου! Παρουσία τουλάχιστον ενός επεισοδίου πριν τη χορήγηση της θεραπείας! Ικανοποιητικά κλινικά δεδομένα προς γραφική αποτύπωση της ασθένειας κατά τη θεραπεία (σε συμφωνία με τις οδηγίες του National Institute of Mental Health Retrospective Life Chart)! Επίπεδα λιθίου στο αίμα εντός του θεραπευτικού εύρους (0,5-1 meq/l) Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, πραγματοποιήθηκε καταγραφή ρουτίνας των ειπέδων του λιθίου στο αίμα, ώστε να αξιολογείται η υπακοή του ασθενούς και να προσδιορίζεται το βέλτιστο επίπεδο απόκρισης για κάθε ασθενή. Αυτή η προσέγγιση μας επέτρεψε τον σχεδιασμό εξατομικευμένης δόσης. Η απόκριση στο λίθιο βασίζεται σε κλίμακα, σύμφωνα με την οποία το μηδέν «0» υποδηλώνει «καμία απόκριση» στη θεραπεία, ενώ το δέκα «10» υποδηλώνει την «πλήρη απόκριση» στη θεραπεία με λίθιο. Στην περίπτωση της μερικής/ μη απόκρισης κατά το χαμηλότερο όριο του θεραπευτικού εύρους, αυξήσαμε τη δόση του λιθίου μέχρι και το υψηλότερο όριο του εν λόγω εύρους, πριν την κατάταξη ενός ασθενή στους «μη αποκρινόμενους». Οι περίοδοι κατά τις οποίες οι ασθενείς ελάμβαναν και άλλους σταθεροποιητές διάθεσης αποκλείστηκαν από την παρούσα μελέτη. 4 /14 Παραδοτέο Π2.3
3. Πλατφόρμες Πειραμάτων ΑΜΣ 3.1 Απομόνωση Γενωμικού DNA Η απομόνωση του γενωμικού DNA έγινε με τη χρήση του προτυποποιημένου συστήματος QIAamp Blood Midi Kit (Spin Protocol). Το εν λόγω πρωτόκολλο εφαρμόστηκε για την απομόνωση γενωμικού DNA από 2 ml περιφερικού, ολικού αίματος, στο οποίο είχε προστεθεί EDTA, ως αντιπηκτικό. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου, χρησιμοποιήθηκαν στήλες χαλαζία. Η απομόνωση του DNA στηρίζεται στο γεγονός ότι τα νουκλεϊκά οξέα προσροφώνται στη στήλη, σε περιβάλλον υψηλής ιοντικής ισχύος και χαμηλού ph, που δημιουργείται από την προσθήκη χαοτροπικού παράγοντα, ενώ η έκλουσή του γίνεται με νερό ή με ρυθμιστικό διάλυμα Tris- EDTA (TE) σε ph 8,3. Σε μια προσπάθεια εφαρμογής μη επεμβατικής μεθόδου, επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε απομόνωση γενωμικού DNA από σίελο. Ο σίελος συλλέχθηκε κατόπιν αποχής από φαγητό, ποτό και κάπνισμα (τουλάχιστον μιας ώρας) σε σωληνάκια των 15 ml που περιείχαν 3 ml ΤΝΕ (Tris- HCl ph 8, 50 mm NaCl, 7 mm EDTA, diluredin 66% αιθανόλη). Ζητήθηκε από τα άτομα να τρίψουν τη γλώσσα στο εσωτερικό της στοματικής τους κοιλότητας, καθώς και στα δόντια τους, δαγκώνοντας παράλληλα ελαφρά την εσωτερική επιφάνεια των παρειών για περίπου 30 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια, να φτύσουν στο δοχείο συλλογής που τους δόθηκε. Η διαδικασία επαναλήφθηκε έως τη συλλογή σιέλου συνολικού όγκου περίπου 8 ml. Η απομόνωση του ολικού γενωμικού DNA έλαβε χώρα με βάση το εξής πρωτόκολλο από τους Aidar and Line (2007) [4]. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης και της ποιότητας των δειγμάτων έγινε με τη χρήση του φωτομέτρου Nanodrop. 3.2 Αλληλούχιση Ολόκληρου του Γονιδιώματος Η αλληλούχηση νέας γενιάς (ΑΝΓ), όπως και η αλληλούχηση κατά Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού της αλληλουχίας του DNA. Το κύριο κοινό γνώρισμα των νέων αυτών μεθόδων έγκειται στη μαζική παράλληλη αλληλούχηση χωρικά διαχωρισμένων, κλωνικά ενισχυμένων πρότυπων αλληλουχιών (templates) ή ενός μορίου DNA. Για την έναρξη της διαδικασίας σχηματίζονται βιβλιοθήκες του γονιδιώματος και η προς αλληλούχηση αλληλουχία ενισχύεται κλωνικά ή μη. Επίσης, όπως και οι παλαιότερες μέθοδοι, στηρίζονται στην υβριδοποίηση νουκλεοτιδίων ή ολιγονουκλεοτιδίων με την αλληλουχία μήτρα και η αλληλούχηση γίνεται παράλληλα, ενώ οι αλληλουχίες είναι χωρικά απομονωμένες [5]. Η πλατφόρμα που χρησιμοποιήθηκε, στα πλαίσια του παρόντος έργου, για την αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος των δύο συμμετεχόντων πληθυσμών ήταν αυτή της Complete Genomics, με κάλυψη 116Χ. Πρόκειται για αλληλούχηση με χρήση νανοσφαιριδίων DNA και συνδυασμό λιγάσης με ανιχνευτή άγκυρα. Πιο αναλυτικά, η εν λόγω πλατφόρμα βασίζεται στο συνδυασμό παραγωγής νανοσφαιριδίων DNA για κάθε θραύσμα του γονιδιώματος και την τοποθέτησή τους ανά ένα σε μικροσυστοιχία, ενώ η αλληλούχηση των νανοσφαιριδίων στηρίζεται στην ευαισθησία της λιγάσης που συνδέει τον υβριδοποιημένο ανιχνευτή (probe) με ένα ολιγονουκλεοτίδιο- άγκυρα (anchor), (combinatorial Probe- Anchor Ligation - cpal). Σήμερα, η 5 /14 Παραδοτέο Π2.3
πλατφόρμα είναι σε θέση να αλληλουχήσει 18 γονιδιώματα σε ένα πείραμα, το οποίο διαρκεί 11 μέρες και έχει μικρό κόστος. Επίσης, προσφέρει κάλυψη από 45 έως 85 φορές ανά γονιδίωμα και μεγάλη ακρίβεια, που προσεγγίζει το ένα λάθος νουκλεοτίδιο ανά 100 χιλιάδες. Η πειραματική διαδικασία περιλαμβάνει τέσσερα κύρια στάδια:! Την κατασκευή βιβλιοθήκης του εκάστοτε γονιδιώματος από θραύσματα 500 βάσεων, που παράγονται κατόπιν εφαρμογής υπερήχων και επιλέγονται με ηλεκτροφόρηση! Τον σχηματισμό των νανοσφαιριδίων (κλωνικός πολλαπλασιασμός)! Την αλληλούχιση! Την απεικόνιση και ανάλυση των αποτελεσμάτων 3.3 Επεξεργασία και Ανάλυση Δεδομένων Δεδομένης της πολυπλοκότητας και της ετερογένειας της ΑΜΣ, η επεξεργασία και ανάλυση των πειραματικών δεδομένων - για την επιλογή των γονιδίων/ βιοδεικτών προς μελέτη - πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ποικίλων μεθόδων βιοπληροφορικής, ακολουθώντας συνολικά τρεις προσεγγίσεις. Πρώτη Προσέγγιση Τα γονίδια και οι πολυμορφισμοί προς μελέτη επιλέχθηκαν μεταξύ 174 πολυμορφισμών, που προέκυψαν από την αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος των Ελλήνων ασθενών με ΑΜΣ και την επακόλουθη σύγκριση όλων των πολυμορφισμών που εντοπίστηκαν συνολικά, με τους πολυμορφισμούς που βρέθηκαν στα γονιδιώματα των υγιών Ελλήνων. Δεύτερη Προσέγγιση Η δεύτερη προσέγγιση που ακολουθήθηκε αφορά στη σύγκριση των δεδομένων μας με βάσεις δεδομένων καταγραφής μικρών προσθηκών, ελλείψεων, αντικαταστάσεων ή SNPs. Σκοπός αυτής της προσέγγισης ήταν ουσιαστικά η αναζήτηση νέων παραλλαγών. Τρίτη Προσέγγιση Η τρίτη προσέγγιση επεξεργασία των δεδομένων αφορά στη σύγκριση των γονιδιωμάτων των Ελλήνων ασθενών με ΑΜΣ, με τη βάση δεδομένων HGMD (The Human Gene Mutation Database) [6]. Από την παρούσα προσέγγιση επιλέχθηκαν οι μεταλλάξεις που έχουν συσχετισθεί με την ΑΜΣ και παρουσιάζονται σε τουλάχιστον ένα ασθενή 3.4 Επικύρωση Αποτελεσμάτων Στα πλαίσια του παρόντος έργου, επιπρόσθετα, σχεδιάστηκαν και εφαρμόστηκαν οι κατάλληλες πλατφόρμες πειραμάτων για την επικύρωση των αποτελεσμάτων. Στην περίπτωση της ΑΜΣ, η επικύρωση επετεύχθη με το σχεδιασμό και την εφαρμογή ποικίλων τύπων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, αλλά και αλληλούχισης κατά Sanger. 6 /14 Παραδοτέο Π2.3
Κάθε γονίδιο/ βιοδείκτης μελετήθηκε ξεχωριστά, με την ανάπτυξη της βέλτιστης για αυτό(ν) μεθοδολογίας. Το πρώτο αναλυτικό βήμα αφορά τον σχεδιασμό των εκκινητών. Ο σχεδιασμός των εκκινητών έγινε με τη βοήθεια μιας σειράς υπολογιστικών προγραμμάτων. Αρχικά, εντοπίστηκε η ακριβής θέση των υπό μελέτη παραλλαγών μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl (http://www.ensembl.org/), όπου δίδεται και μέρος της αλληλουχίας που περιβάλλει τον εκάστοτε πολυμορφισμό. Ο σχεδιασμός των εκκινητών έγινε έτσι, ώστε το προϊόν της PCR να περικλείει τον πολυμορφισμό περίπου στο κέντρο του. Σε αυτό το σημείο, έγινε χρήση του προγράμματος Primer3 (v. 0.4.0) (Koressaar and Remm 2007) (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Επίσης, μέσω του Primer3 ελέγχονται βασικές παράμετροι, όπως η θερμοκρασία τήξης (Tm) των εκκινητών και η ποσοστιαία σύστασή τους σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης (GC content). Ο κάθε εκκινητής ελέγχθηκε ως προς το αν εμφανίζει συμπληρωματικότητα, είτε με τον εαυτό του (self- complementarity) ή με τον έτερο εκκινητή, μέσω του προγράμματος DNAMAN ή εναλλακτικά του DINAMELT two- state melting (hybridization), το οποίο εντοπίζεται στον σύνδεσμο (http://mfold.rna.albany.edu/?q=dinamelt/two- state- melting). Διερευνήθηκε, ακόμη, η ειδικότητα των εκκινητών ως προς το ανθρώπινο γονιδίωμα. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος BLAST (Basic Local Alignment Tool) του Ensembl. Τέλος, με τη βοήθεια του DINAMELT two- state melting (folding) βλέπουμε τις δευτεροταγείς δομές του pcr προϊόντος στον ακριβή σύνδεσμο (http://mfold.rna.albany.edu/?q=dinamelt/two- state- folding). Στον τελευταίο έλεγχο, ανασταλτικός παράγοντα της επιλογής των εκκινητών αποτελεί η δημιουργία βρόγχου στην περιοχή των εκκινητών, ενώ προτιμώνται τιμές διαφοράς στην ελεύθερη ενέργεια του Gibbs (ΔG) μεταξύ - 1 και +1. Ανάλογα με το υπό μελέτη γονίδιο/βιοδείκτη, αναπτύχθηκε, επικυρώθηκε και εφαρμόστηκε (i) η διαδικασία PCR- ARMS (Polymerase Chain Reaction Amplification Refractory Mutation System), (ii) η διαδικασία PCR- RFLP (Polymerase Chai Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism) και τέλος, (iii) η αλληλούχιση κατά Sanger. 7 /14 Παραδοτέο Π2.3
4. Πλατφόρμες Πειραμάτων ΔΠΑ 4.1 Απομόνωση Γενωμικού DNA Η απομόνωση γενωμικού DNA έλαβε χώρα, όπως περιγράφηκε παραπάνω για την ΑΜΣ. 4.2 Μελέτη Γενετικής Συσχέτισης σε Γονιδιωματική Κλίμακα Παρά το πλήθος των μελετών που έχουν λάβει χώρα, σήμερα είναι ακόμη ασαφές ποια γονίδια και ποια χρωμοσώματα συμμετέχουν στην παθογένεια της ΔΠΑ. Η εν λόγω ασάφεια ενισχύεται από το σύνολο των γονιδιακών θέσεων ευαισθησίας στη νόσο ή/ και των υποψήφιων γονιδίων που εντούτοις αποτυγχάνει να επικυρωθεί. Τέλος, ακόμη και οι μελέτες που εστιάζουν στην απόκριση στο λίθιο, διερευνώντας τη γενετική της βάση, δεν έχουν καταλήξει σε συμφωνία. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με την αποτυχία των προσεγγίσεων αναζήτησης υποψήφιων γονιδίων, μας οδήγησαν στην πραγματοποίηση μελέτης γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα, αποσκοπώντας στον προσδιορισμό φαρμακογονιδιωματικών δεικτών απόκρισης στο λίθιο. Συγκεκριμένα, η γονοτυπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των μικροσυστοιχιών Affymetrix GeneChip SNP 6.0, εφαρμόζοντας τα πρωτόκολλα ανάλυσης, κατά τις οδηγίες του κατασκευαστή (Affymetrix Inc, CA, USA). Εν συνεχεία, δημιουργήσαμε μια λίστα με SNPs, συμπεριλαμβανομένων των δεικτών που αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τα ακόλουθα κριτήρια: MAF> 0,01 - genotype call rate > 0,97 - τιμή p για την ισορροπία Hardy- Weinberg > 1 10-4. Οι SNPs που δεν επιβίωσαν των εν λόγω κριτηρίων (261.452 από τους 906.600) αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση. Επίσης, τα δεδομένα μας ελέγχθηκαν για πιθανή πληθυσμιακή διαστρωμάτωση. 4.3 Επεξεργασία και Ανάλυση Δεδομένων Για την ποσοτικοποίηση της συσχέτισης γονοτύπου φαινοτύπου, ακολουθήσαμε τρεις διαφορετικές αναλυτικές προσεγγίσεις, αναφορικά με την κλίμακα απόκρισης:! Επιλογή των ασθενών στα δύο ακραία άκρα της κλίμακας απόκρισης στο λίθιο, ώστε να αυξηθεί η φαινοτυπική και γενετική ποικιλομορφία ανάμεσα στις δύο ομάδες! Διχοτόμηση του φαινοτύπου απόκρισης, με την εφαρμογή της τιμής «7» ως «πλήρης απόκριση» ή υψηλότερα, σε ένα μεγαλύτερο δείγμα ασθενών, αντιπροσωπεύοντας τη συνολική ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει τον φαινότυπο της απόκρισης στο λίθιο! Έλεγχος των διαφορών στο μέσο συνολικό σκορ απόκρισης, κατόπιν κανονικοποίησης (ΤS), ανάμεσα στους γονότυπους των SNPs, εφαρμόζοντας μια προσέγγιση ποσοτικού γνωρίσματος 8 /14 Παραδοτέο Π2.3
4.4 Επικύρωση Αποτελεσμάτων Αποσκοπώντας στην επικύρωση των ευρημάτων, κατόπιν εφαρμογής των μικροσυστοιχιών, επιλέξαμε 11 SNPs από τους 50, που εμφάνισαν τις πιο ισχυρές συσχετίσεις και εφαρμόσαμε άμεση γονοτύπιση στα ίδια αρχικά δείγματα. Οι εν λόγω πολυμορφισμοί επιλέχθηκαν, (i) έχοντας τιμή p < 10-5, (ii) στη βάση του πιο κοντινού γονιδίου, της σχέσης του με τη ΔΠΑ και τη θέση του SNP σε αυτό το γονίδιο (προτεραιότητα δόθηκε στους ιντρονικούς και εξωνικούς πολυμορφισμούς) και τέλος, (iii) απορρίπτοντας τους πολυμορφισμούς σε ανισορροπία σύνδεσης (D =1, r 2 >0,98). 5. Στοχευμένοι Βιοδείκτες 5.1 ΑΜΣ Στην περίπτωση της ΑΜΣ, η οριστική επιλογή των βιοδεικτών προς μελέτη αποτελεί τη συνισταμένη των τριών προσεγγίσεων που ακολουθήθηκαν κατά την επεξεργασία των δεδομένων. Πιο συγκεκριμένα, αναφορικά με την πρώτη προσέγγιση και στη βάση των δεδομένων έκφρασης των γονιδίων στον εγκέφαλο, καταλήξαμε στην επιλογή των παρακάτω δεικτών: για το γονίδιο FAM181B, ο rs34030508 (C>T) για το γονίδιο A2LD1, ο rs10581954 (7bp del) για το γονίδιο A2LD1, ο rs4772303 (C>T) για το γονίδιο FTO, ο rs2892469 (C>T) & o rs1861869 (G>C) για το γονίδιο TBC1D1, ο rs6850200 (C>A) για το γονίδιο KAZN, ο rs6676539 (C>T) Αναφορικά με τη δεύτερη προσέγγισή μας, της οποίας στόχος ήταν η αναζήτηση νέων παραλλαγών, εν τέλει, στραφήκαμε προς την 5 αμετάφραστη περιοχή, διερευνώντας αν κάποια από τις απορρέουσες παραλλαγές βρίσκεται στον υποκινητή και επομένως, αν μπορεί να επηρεάζει τη ρύθμιση του αντίστοιχου γονιδίου. Στην 5 αμετάφραστη περιοχή βρέθηκαν οι εξής νέες παραλλαγές (Πίνακας 1): Πίνακας 1. Νέες παραλλαγές στην 5 αμετάφραστη περιοχή FGF13 Γονίδιο Έναρξη Λήξη θέσης στο χρωμόσωμα chrχ:137793516-137793518 Απόσταση από το κωδικόνιο έναρξης 350bp Αλληλουχία Αναφοράς/ Αλληλουχία αλληλομόρφου AGTG*/GCT SLC36A1 C2orf88 Chr5:150827301-150827304 Chr2:191002540-191002547 79bp GCTG/ACGAGTT ATATCTGT/TTAGTGATT A *Αυτή η αλληλουχία βρέθηκε στους ασθενείς 9 /14 Παραδοτέο Π2.3
Εν τέλει, επιλέχθηκαν να αλληλουχηθούν οι 5 αμετάφραστες περιοχές του FGF13 και του SLC36A1. Οι 5 UTR αποτελούν ενδιαφέρουσες περιοχές του γονιδίου λόγο του ρυθμιστικού ρόλου που έχουν. Είναι πιθανό, κάποια παραλλαγή στην 5 UTR να επηρεάζει την πρόσδεση κάποιου μεταγραφικού παράγοντα, για παράδειγμα. Η επιλογή της παραλλαγής στο γονίδιο FGF13, στηρίχθηκε στην αυξημένη έκφρασή του στον εγκέφαλο (http://www.ebi.ac.uk/gxa/genes/ensg00000129682) και στη σχέση του με την πόλωση, διακλάδωση και μετακίνηση των αξόνων στον φλοιό του εγκεφάλου και στον ιππόκαμπο. Η επιλογή του ενισχύθηκε λόγο της συσχέτισης του με την ανάπτυξη των νευρώνων [7]. Σχετικά με το SLC36A1, τα στοιχεία που έχουμε αφορούν κυρίως πειράματα σε μύες, στους οποίους ο εν λόγω μεταφορέας αμινοξέων, εντοπίζεται στα ενδοκυττάρια οργανίδια των νευρώνων. Η υποψηφιότητά του ενισχύθηκε, μετά από αναζήτηση μεταγραφικών παραγόντων με τη βοήθεια του διαδικτυακού προγράμματος rvista (2.0), το οποίο υπέδειξε την ακολουθία γύρω από την παραλλαγή, ως πιθανή θέση πρόσδεσης του μεταγραφικό παράγοντα ELK1 (θεωρείται ότι έχει νευροπροστατευτικό ρόλο). Η τρίτη προσέγγιση αφορά στη σύγκριση των γονιδιωμάτων των Ελλήνων ασθενών με ΑΜΣ με τη βάση δεδομένων HGMD (The Human Gene Mutation Database) [6]. Από την παρούσα προσέγγιση επιλέχθηκαν οι μεταλλάξεις που έχουν συσχετισθεί με την ΑΜΣ και παρουσιάζονται σε τουλάχιστον ένα ασθενή (Πίνακας 2). Πίνακας 2. Αποτελέσματα 3 ης προσέγγισης Γονίδιο Καταγραφή στο dbsnp Περιγραφή Πηγή (C- T) - 1668 to initiation codon (Luquin et al. 2009) TARDBP rs9430335 ALAD rs1800435 Lys59Asn (Kamel et al. 2005) APEX1 rs1130409 Asp148Glu (Hayward et al. 1999) ANG rs11701 Gly110Gly (Greenway et al. 2004) FUS ZNF512B NEFH rs80301724 (G- A) +41 to termination codon (T- C) +5057 to initiation codon (Iida et al. 2011) (Brown et al. 2012, Sabatelli et al. 2013) rs2275294 rs80301724; rs165923 del 18 bp codon 744 (Al- Chalabi et al. 1999) Παρόλο που κανένα από τα αποτελέσματα του παραπάνω πίνακα δεν κρίθηκε ιδιαίτερης σημασίας, η περιοχή 3 UTR του γονιδίου FUS επιλέχθηκε προς ανάλυση. Η επιλογή στηρίχθηκε στον ήδη γνωστό ρόλο του γονιδίου στην ασθένεια και στις σύγχρονες πειραματικές εξελίξεις, οι οποίες στρέφουν το ενδιαφέρον προς τις μεταλλάξεις της 3 UTR περιοχής του γονιδίου, οι οποίες έχουν συσχετισθεί με την ΑΜΣ [8]. 10 /14 Παραδοτέο Π2.3
5.2 ΔΠΑ Στην περίπτωση της ΔΠΑ, οι βιοδείκτες που επιλέχθηκαν προς μελέτη παραθέτονται ακολούθως (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Τα επιλεγμένα γονίδια/ δείκτες SNP Χρωμόσωμα Θέση.(bp) Πλησιέστερο. Γονίδιο. Απόσταση MAF Συχνότητα. Αλληλομόρφων. (Πλήρης.Απόκριση) Συχνότητα. Αλληλομόρφων. (Μη.Απόκριση) rs12693402 2q32.1 185808079 ZC3H15 /1542805 T0.14 C1.00 T0.00 7.81E/05 rs2811332 3q22.1 129515128 TMCC1 Ιντρόνιο:4 G0.45 G0.78 C0.22 4.28E/06 rs1390913 4p12 44921565 GNPDA2 /192953 T0.25 T0.44 C0.56 7.21E/06 rs2107506 5q31.1 135300277 TGFB1 /64306 G0.48 C0.72 G0.28 6.25E/05 rs869156 10q11.21 45479052 RASSF4 Ιντρόνιο:4 C0.43 C0.66 A0.44 4.84E/06 rs2499984 11p15.4 5061541 OR51L1 40381 G0.43 G0.62 A0.38 8.62E/05 Τιμή.p Εξώνιο:1: (ASN/SER) G0.50 A0.70 G0.30 7.45E/05 rs16909440 11p15.4 5080844 OR52E2 rs4512905 12q13.13 52051130 SCN8A Ιντρόνιο:1 G0.27 A0.46 G0.54 3.85E/05 rs11869731 17q12 32338871 ACCN1 Ιντρόνιο:1 G0.25 G0.44 C0.56 7.21E/06 rs16973410 18q12.3 38029873 RPL7A /1114217 G0.16 G1.00 A0.00 1.94E/05 rs2826494 21q21.1 22104695 C21orf131 10217 G0.25 G0.46 C0.54 1.17E/05 Τα πιο σημαντικά ευρήματα θεωρούνται αυτά για τον rs2811332 (ιντρόνιο 4 του γονιδίου TMCC1), τον rs1390913 (192953- bp καθοδικά του γονιδίου GNPDA2), τον rs869156 (ιντρόνιο 4 του γονιδίου RASSF4) και τον rs11869731 (ιντρόνιο 1 του γονιδίου ACCN1). Το γονίδιο TMCC1 χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 3q22.1 και κωδικοποιεί για ένα μέλος της διαμεμβρανικής και τυλιγμένης σε σπείρα επικράτειας της family 1. Αυτή η περιοχή του χρωμοσώματος δεν έχει αναφερθεί να σχετίζεται με τη ΔΠΑ ή την απάντηση στο λίθιο σε μελέτες γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα ή μελέτες σύνδεσης. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο του TMCC1, αλλά φαίνεται να έχει κάποιο ρόλο στην οικογενή προσωπική πάρεση [9]. Το γονίδιο GNPDA2 χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 4p12 και κωδικοποιεί για τη γλυκοζαμίνη- 6- φωσφορική απαμινάση, έχοντας έντονη συμμετοχή στην παχυσαρκία και το μεταβολικό σύνδρομο [10]. Η εν λόγω χρωμοσωμική περιοχή, εν γένει, έχει χαρακτηριστή ως τόπος για τη ΔΠΑ και τη σχιζοφρένεια [11]. Το γονίδιο RASSF4, που χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 10q11.21, κωδικοποιεί για ένα μέλος της οικογένειας των RAS ογκοκατασταλτικών μορίων, που ρυθμίζει κάποιες από τις λειτουργίες αναστολής της αύξησης του RAS. Το εν λόγω γονίδιο εμπλέκεται στην απόπτωση. Και η περιοχή 10q συσχετίζεται με τη ΔΠΑ [12]. Το γονίδιο ACCN1, τέλος, έχει βρεθεί πως κωδικοποιεί για την πρωτείνη ASIC2, ένα μέλος της υπερ- οικογένειας των DEG/ENaC. Αυτό το κανάλι ιόντων είναι κυρίως διαπερατό σε ιόντα νατρίου και λιγότερο σε ιόντα λιθίου ή καλίου και εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους νευρώνες. Τα εν λόγω κανάλια έχουν βρεθεί να συσχετίζονται με την παθοφυσιολογία του πόνου, το ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και τις ψυχιατρικές νόσους [13]. 11 /14 Παραδοτέο Π2.3
6. Ζητήματα Βιοηθικής και Νομικά Ζητήματα Η συλλογή δεδομένων σε μεγάλη κλίμακα και η σύγκριση των σωματικών υλικών, καθώς και τα δεδομένα που προκύπτουν από αυτές καθιστούν δυνατή τη δημιουργία συσχετισμών, που μπορεί μακροχρόνια να αποδώσουν ένα πολύτιμο διαγνωστικό και θεραπευτικό όφελος. Ωστόσο, υπάρχει ο κίνδυνος τα στοιχεία/ δεδομένα και τα δείγματα να χρησιμοποιηθούν για σκοπούς άλλους από εκείνους για τους οποίους ο δότης έχει συναινέσει ή να περάσουν σε τρίτους ή άλλους φορείς. Ως εκ τούτου, αυστηροί κανονισμοί πρέπει να διασφαλίζουν ότι οι γονοτυπικές πληροφορίες και τα μοριακά προφίλ συλλέγονται μόνο για ιατρικούς σκοπούς και παραμένουν στην αποκλειστική ιδιοκτησία του ασθενούς. Στο πλαίσιο αυτό, οι κλινικο- γονιδιωματικές μελέτες του παρόντος έργου θα πραγματοποιηθούν σύμφωνα με τις εθνικές και ευρωπαϊκές οδηγίες και κατευθυντήριες γραμμές αναφοράς. Πιο συγκεκριμένα, οι (i) "Good Clinical Practice, the Declaration of Helsinki", (ii) Convention of the Council of Europe Commissioner for Human Rights and Biomedicine" (γνωστή ως Σύμβαση του Οβιέδο, την οποία έθεσε σε εφαρμογή η Ελληνική νομοθεσία - Νόμος 2619/1998), (iii) Clinical Trials of medicines, που διέπεται από το διάταγμα ΔΥΓ / 89292 2003 και ενσωματώνει στην εθνική νομοθεσία την οδηγία της ΕΕ 2001/20, καθώς και (iv) η πρόσφατη οδηγία της ΕΕ 2005/28, που είχε συμπεριληφθεί στην εθνική νομοθεσία από το διάταγμα ΔΥΓ3α/79602 αφορούν στο παρόν έργο. Το ζήτημα των ιατρικών και γενετικών δεδομένων των προσώπων, ρυθμίζεται κυρίως από τον νόμο 2472/1997, ο οποίος προστατεύει όλα τα προσωπικά δεδομένα και ιδιαίτερα τα ευαίσθητα, όπως της ιατρικής και της γενετικής και συνεπώς, εμφανίζει επίσης άμεση σχέση με το έργο. Η Εθνική Αρμόδια Αρχή για την εφαρμογή του νόμου είναι η Ελληνική Αρχή Προστασίας Δεδομένων Προσωπικού Χαρακτήρα. Επιπλέον, έλαβε χώρα ειδική μέριμνα για την έγκριση των μελετών του έργου από τις εμπλεκόμενες δεοντολογικές επιτροπές. Αναφορικά με τη μοριακή διαγνωστική μελέτη της ΑΜΣ, η Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημίου Πατρών έχει ήδη εγκρίνει το πρωτόκολλο της μελέτης (αριθμός πρωτοκόλλου EB: 3/13/7/10). Επιπρόσθετα, λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση για τη συμμετοχή στη μελέτη από όλα τα άτομα, τους κηδεμόνες τους ή τους νόμιμους αντιπροσώπους τους. Γνωρίζουμε, βέβαια, ότι τα δεδομένα της ενδελεχούς γονιδιωματικής μελέτης ή/ και ο προσδιορισμός και η μελέτη πολυμορφισμών προσώπων δύνανται να επιτρέψει την ταυτοποίηση αυτών, μέσω μονοσήμαντων «γενετικών αποτυπωμάτων», αυξάνοντας την κρισιμότητα των ηθικών και νομικών ζητημάτων του έργου. Συνεπώς, όλα τα δεδομένα των ασθενών (κλινικά και γονιδιωματικά/ γενετικά) απαιτείται να μεταμορφωθούν, ώστε να τηρηθεί η πλήρης ανωνυμία τους. Για αυτό το λόγο, δε θα οικοδομήσουμε γονιδιωματικές/ γενετικές βάσεις δεδομένων, αναγνωρίσιμες ή σε σύνδεση με δεδομένα σε ατομικό επίπεδο. Το γεγονός αυτό μειώνει σημαντικά τους κινδύνους της κάθε αξίας ή προσωπικού δικαιώματος που σχετίζεται με την εμπιστευτικότητα. Φυσικά, η πλήρης ανωνυμία καθιστά αδύνατη τη σύνδεση ανάμεσα στα αρχεία των ασθενών και την πραγματοποίηση μελετών παρακολούθησης (στοχευμένων και στρωματοποιημένων) πληθυσμού ή ακόμη, την επανεξέταση της θεραπευτικής αγωγής για έναν μεμονωμένο ασθενή. Για το σκοπό των σημερινών στόχων του 12 /14 Παραδοτέο Π2.3
έργου, συμπερασματικά, παραμένουμε με την πεποίθηση ότι τα ευρήματα του έργου (κλινικο- γενετικό προφίλ απόκρισης ή/ και διαγνωστικά/ γενετικά προφίλ) εντάσσονται κατά κύριο λόγο στα πλαίσια ερευνητικής χρήσης και δύνανται να χρησιμοποιηθούν κατά τη λήψη κλινικών αποφάσεων, αφού δημοσιευθούν και επικυρωθούν από τα ερευνητικά ευρήματα της βιοϊατρικής κοινότητας. 13 /14 Παραδοτέο Π2.3
Αναφορές [1] Lenfant, C. 2003. Shattuck lecture: clinical research to clinical practice- lost in translation? N Eng J Med 349:868 [2] Contopouloss Ioannidis JP, Ntzami E, Ionnidis JP. 2003. Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med 114: 477 [3] Khoury MJ et al. 2007. The continuum of translation research in genomic medicine: how can we accelerate the appropriate integration of human genome discoveries into health caree and disease prevention? Genetic Med 9: 665 [4] Aidar, M., and S. R. Line. 2007. "A simple and cost- effective protocol for DNA isolation from buccal epithelial cells." Braz Dent J 18 (2):148 [5] Voelkerding, K. V., S. Dames, and J. D. Durtschi. 2010. "Next generation sequencing for clinical diagnostics- principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology." J Mol Diagn 12 (5):539 [6] Cooper, D. N., E. V. Ball, and M. Krawczak. 1998. "The human gene mutation database." Nucleic Acids Res 26 (1):285 [7] Hartung, H., B. Feldman, H. Lovec, F. Coulier, D. Birnbaum, and M. Goldfarb. 1997. "Murine FGF- 12 and FGF- 13: expression in embryonic nervous system, connective tissue and heart." Mech Dev 64 (1-2):31 [8] Sabatelli, M., A. Moncada, A. Conte, S. Lattante, G. Marangi, M. Luigetti, M. Lucchini, M. Mirabella, A. Romano, A. Del Grande, G. Bisogni, P. N. Doronzio, P. M. Rossini, and M. Zollino. 2013. "Mutations in the 3' untranslated region of FUS causing FUS overexpression are associated with amyotrophic lateral sclerosis." Hum Mol Genet 22 (23):4748 [9] Kremer H, Kuyt LP, Van Den Helm B et al. 1996. Localization of a gene for Moebius syndrome to chromosome 3q by linkage analysis in a Dutch family. Hum. Mol. Genet. 5(9):1367 [10] Blackwood DH, He L, Morris SW et al. 1996. A locus for bipolar affective disorder on chromosome 4p. Nat. Genet. 12(4): 427 [11] Eckfeld K, Hesson L, Vos MD, Bieche I, Latif F, Clark GJ. 2004. RASSF4/AD037 is a potential Ras effector/tumor suppressor of the RASSF family. Cancer Res. 64(23): 8688 [12] Ferreira MA, O Donovan MC, Meng YA et al. 2008. Collaborative genome- wide association analysis supports a role for ANK3 and CACNA1C in bipolar disorder. Nat. Genet. 40(9): 1056 [13] Wemmie JA, Price MP, Welsh MJ.2006. Acid- sensing ion channels: advances, questions and therapeutic opportunities. Trends Neurosci. 29(10): 578 14 /14 Παραδοτέο Π2.3