-практична настава- ФАРМАЦЕВТСКИ ФАКУЛТЕТ 2013/2014 ГОД. Асс. Надица Матевска
Имунологија со имунохемија - програма за вежби Вежба 1 Имунолошки техники за изолирање на имуни клетки Вежба 2 Електрофоретски методи и имуноблотинг Вежба 3 Реакции на аглутинација Вежба 4 Имунохемолитички тестови, реакција на врзување на комлемент Вежба 5 Одредување и квантификација на растворливи антигени и антитела 2
Обврски и задачи на студентот: Секој студент во рамки на предметот Имунологија со имунохемија ќе биде задолжен да: Редовно ги посетува лабораториските вежби. Дозволено отсуство од максимум еден термин на лабораториски вежби, што повлекува намалување на освоените поени предвидени за практична настава. Однесувањето во лабораторија мора да е во рамки на предвидените правила на работење во лабораторија. Водење на лабораториски дневник во кој се запишуваат сите чекори од лабораториската вежба, протоколот на истата, цртање и означување на графичките прикази. Дневникот се доставува на преглед кај асистентот по секоја завршена вежба. Активно учество во тек на изработката на вежбата. Задолжението кое студентот го добива во тек на вежбата треба да го одговори (изведе, припреми, нацрта) во предвидениот термин на вежбата. За истото е задолжен да го води дненикот и за тоа е соодветно оценет. Пред почетокот на вежбата и по завршување на истата предвидени се мини квизови или кратки тест прашања кои се во однос на проблематиката која ја обработува тековната вежба. Завршната вежба е задолжителна за секој студент, и со нејзино успешно совладување студентот се стекнува со право за завршен испит. Опис на лабораториската настава: Практичнатна настава и предвидените лабораториски вежби имаат за цел да го едуцираат студентот со основните принципи и правила на работење во имунолошка лабораторија, ракување со биолошки материјал и користење на апарати и методи во областа на имунологијата и имунохемијата. Преку компјутерски анимации и графички прикази, ќе се објаснат имунолошките процеси, градба и функција на имунокомпетентни клетки, основни имунохемиски методи и имунодијагностички постапки. Студентите ќе имаат можност да се запознаат и практично да ги изведат основните имунохемиски методи како работа со крв и крвни деривати, клетки и протеини, како и теоретски осврт за примена на имунолошките методи во биомедицинските науки. 3
Организација и работа во имунолошка лабораторија Работата во имунолошка лабораторија, како и во друг тип на лаборатории во кои се работи со биолошки материјал (за молекуларна биологија и генетика, микробиолошка, хематолошка и др. лаборатории) бара посебни услови и апарати како и специфичен начин на ракување со материјалот и посебно едуциран персонал кој ќе работи во овој вид лаборатории. Најчесто, загрозувањето на личната безбедност како и безбедноста на околината, настанува поради невнимание. Затоа секоја постапка при практичната работа бара потполна ангажираност, сериозност, сигурност и спремност при изведување на одредени операции. Самата природа на работата во биолошка лабораторија бара непосреден допир со различни супстанции во цврста, течна или гасовита состојба, па оттука секогаш е присутна и можноста на директно изложување на опасностите и тоа преку непосреден контакт, орално или преку органите за дишење. Многу често во имунолошките лаборатории се ракува со т.н биохазарден материјал, материјал кој може да биде опасен (токсичен, канцероген, радиолошки) па оттука обезбедувањето на безбедност при работа е примарно. Воспоставени се три нивоа на безбедност во биохазард лаборатории, дефинирани како ниво на биозаштита 1, 2 и 3 (Biosafety level 1, 2, 3) во зависност од видот на работата што се изведува и степенот на мерки на претпазливост што треба да се преземат. Мерките на претпазливост се поделени и дефинирани како: Стандардна лабораториска пракса 1. Лабораториите се означени со биохазард симбол 2. Лимитиран е пристапот на луѓе 3. Обезбедени апарати за миење раце 4. Забрането е јадење, пиење, пушење, вадење/ставање на контактни леќи, користење на козметички средства 5. Забрането е пипетирање со уста - се користат механички пипети 6. Чекорите при работењето се така организирани да има минимално создавање на аеросоли и движење на воздухот 7. Работните површини се деконтаминираат најмалку еднаш дневно 8. Сите користени раствори, пластика и стакларија по и пред користење се автоклавираат (и во случај да треба да фрлат, и за пластика која е за една употреба) Заштитна опрема 1. Задолжително е носење на лабораториски мантил или одела со цел да се спречи контминација на облеката 2. Лабораториските ракавици се задолжителни 3. Заштитните маски и наочари се потребни ако се ракува со распрснувачки материјал, микроорганизми или др. испарлив материал. 4
Посебни мерки на заштита 1. Безбедосен лабораториски прирачник во кој се објаснуваат сите безбедносни чекори се припрема или усвојува. 2. Персоналот кој работи во ваков вид лаборатории е со посебен тренинг едуциран за ваков тип на работа 3. Лабораторискиот персонал е имунизиран од потенцијално присутните агенси на кои би биле изложени при работа во лабораторијата 4. Кога се смета за потребно се земаат примероци од крв од сите членови на лабораторискиот персонал за испитувања 5. Со висок степен на претпазливост се ракува со сите оштри објекти (игли, ножеви, ножици, скалпери, стаклени оштри објекти) 6. При ниво на заштита 2 и 3, биолабораториите се опремени со посебни системи за влез и излез (со двојни врати, врати под притисок, посебни меѓу простории за припрема, деконтаминација, проверка) а самите лаборатории технички се изведени според прописите за биолаборатори (без ивици на ѕидовите, со специјални лабораториски површини изработени од материјал кој лесно се одржува) 7. Лаборатории се опремени и со посебни системи за прочистување и одржување на внатрешниот простор (филтрирање на воздух, УВ светло за стерилизација, апарати за гаснење пожар и др.) 5
ЛАБОРАТОРИСКИ ПРАВИЛА И БЕЗБЕДНОСНИ ПОСТАПКИ Пред започнување со лабораториска работа...!!! 1. Да се проучи пишаниот материјал од лабораторискиот практикум и теоретските предавања кои се однесуваат на проблематиката за вежбата која ќе се работи и да се дефинираат сите поими и термини кои се користат при изведување на вежбата 2. Запознавање со типот и целта на вежбата, сите методи кои таа ги опфаќа, супстанциите потребни за изведување, нивните количини и својства (токсичност, канцерогеност, експлозивност, запаливост итн.) и приборот и апаратите кои се користат за изведување на истата. Само добро подготвен студент ќе може успешно да ја заврши својата задача и максимално да го искористи времето во лабораторија!!! За време на вежбата... Да се води лабораториски дневник во кој ке се забележуваат сите чекори од вежба и ќе се цртаат слики и шематски прикази кои се објаснуваат во тек на вежбата. Неопходно е придржување кон сите мерки за предпазливост: 1. носење на заштитна опрема 2. внимателна работа со токсични, запалливи, екслозивни и корозивни супстанции, 3. со испарливите токсични супстанции се работи во дигестор со исправна вентилација; 4. внимателно ракување со апаратури под зголемен притисок и вакум; 5. прочитај ги опасносните ознаки на сите хемиските супстанции кои се користат во експериментот. 6. запознај се со мерките кои треба да се превземат во случај на опасност која може да настане при самата изведба на експериментот. 7. вежбата и лабораториската работа секогаш се изведува по прописот и инструкциите дадени од асистентот. 6
Х А З А Р Д Н И С И М Б О Л И Materijalot e mnogu nestabilen Mo`e nenadejno da oslobodi gas, pritisok ili toplina koga }e se izlo`i na udar, pritisok ili visoka temperatura E EXPLOSIVE Pri kontakt predizvikuva seriozna iritacija na o~i i ko`a Pri prodol`en kontakt predizvikuva seriozni o{tetuvawa na tkivoto C COROSIVE Mo`e da bide {teten dokolku se vdi{e Materijalot e potencijalna opasnost od po`ar Mo`e da bide zapaliv na niska temperatura Iskri, plamen ili toplina mo`e da predizvikaat negovo zapaluvawe Dokolku postoi golema koncentracija na parei mo`no e i samiot sponatno da se zapali F HIGHLY FLAMMABLE F+ EXTREMELY FLAMMABLE 7
Materijalot e potencijalno fatalna, toksi~na supstanca Mo`e da bide fatalna ili da predizvika privremeno o{tetuvawe ako se inhalira, vnese preku usta ili absorbira preku ko`a Mo`e da predizvika iritacija ili izgoretini koi se opasni po zdravjeto T TOXIC T+ VERY TOXIC Mo`e da e potencijalen karcinogen Materijal koj e opasen po zdravje pomalku od T i T+ Pri kontakt mo`e da predizvika reverzibilen inflamatoren efekt na ko`a i o~i (o{tetuvaweto zavisi od vremeto na kontakt i koncentracijata na materijalot) Xi IRRITANT Xn HARMFUL Materijal koj pri prva ekspozicija predizvikuva mala ili voop{to na predizvikuva reakcija, no po pove}ekratno izlo`uvawe mo`e da predizvika reakcija Materijalot predstavuva potencijalna opasnost od eksplozija dokolku se najde blizu plamen ili zapaliv materijal Osloboduva kislorod koj go zasiluva zapalivosta na organskiot materijal O OXIDISING Vo kontakt so ko`ata i o~ite mo`e da predizvika izgoretini 8
Имунолошки техники за изолирање на имуни клетки вежба бр. 1 Лимфоцитите се главни учесници во имунолошките и имунохемиските реакции. Сите лимфоцити се воглавно поделени во две популации: Б и Т лимфоцити кои понатаму се делат на субпопулации. Б лимфоцитите се вклучени во продукција на антитела, а Т лимфоцитите посредуваат во реализација на имунолошкиот одговор на клеточно ниво. Материјал за изолација и фракционирање на лимфоцитите претставува периферната крв и лимфа или цврсти ткива и органи како: тонзили, слезина, тимус, мезентерични лимфни јазли и др. 1. Изолација на лимфоцити од полна крв Лимфоцитите можат да се изолираат од полна крв со помош на центрифугирање врз база на густинскиот градиент. При тоа се искористува разликата во густината на различните крвни клетки. Клетките се центрифугираат се додека не се постигне рамнотежа меѓу нивната густина и густината на нивната околна средина. Како медиум за двоење на лимфоцитите се користи градиентна микстура од фикол-триозил која има густина од 1.077. Лимфоцитите имаат помала густина од градиентната микстура и по центрифугирањето ќе образуваат слој над неа, додека другите крвни клетки ќе патуваат кон дното. Слика 1. Изолација на лимфоцити од полна крв Забелешка: Овој метод ги двои мононуклеарните клетки: моноцити и лимфоцити. Доколку во понатамошната употреба на клетките, моноцитите значајно интерферираат, тие можат да се отстранат со инкубација 2 часа на 37 С, при што поради атхерентните својства моноцитите ќе останат на дното на епруветата. 9
2. Изолација на лимфоцити од цврсти ткива и органи: Лимфоцитна суспензија може да се приготви и од цвсти лимфоидни органи: сплинка, лимфни јазли, бурза или тимус. Лимфоцитите можат од овие органи директно да се истиснат во медиум на ткивна култура, користејќи широк форцепс (клешта) или механички се истиснуваат преку железна мрежа или цедилка со фин форцепс. Макрофагите се отстрануваат од лимфоцитната суспензија со помош на железни струготини. Макрофагите ги ингестираат железните струготини по што се елиминираат со употреба на јак магнет. МОЖНОСТИ ЗА СЕПАРАЦИЈА НА Т- ОД Б- КЛЕТКИ Покрај рецептори за специфичниот антиген лимфоцитите поседуваат и неспецифични рецептори за различни структури како: еритроцити, Fc фрагментот на имуноглобулинската молекула, компонентите на комплементот, вируси и др. Рецепторите претставуваат точно дефинирани структури, локализирани најчесто на површината на клеточните мембрани. Преку нив се одигруваат сите интеракции и се примаат сите стимулациски и инхибиторни сигнали. Присуството на специфични рецептори на различни субпопулации на лимфоцити дава можности за нивна сепарација. Постојат главно пет методи за сепарација на Б- од Т-клетки и тоа: комплемент или токсин посредувана цитотоксичност, адхеренција на најлонска волна, матодот panning, техниката на розетирање и употребата на флуоресцентно активирани клеточни сортери. 1. Комплемент или токсин посредувана цитотоксичност Методот се базира на елиминација на клетките кои не треба да се присутни во лимфоцитната суспензија, на пример Б- лимфоцитите или пак обратно Т- лимфоцитите. Тоа се постигнува така што потребно е најпрво да се произведат специфични антитела вперени против селективниот и специфичниот антигенски репертоар на клетките кои треба да бидат елиминирани, кои потоа ќе се поврзат со C1q компонентата на комплементот, за да се покрене неговата каскада. Со оваа комплементна активација се создаваат услови за презентирање на литичката активност на комплементот врз клетките кои треба да се елиминираат. При создавањето на литичкиот тунел во мембраната на целните клетки тие се однесуваат метафорично кажано како брод кој тоне, и набргу умираат. Втор начин да се спроведе истата цел е да се конјугира специфично произведеното антитело со некој токсин (пр. рицин) и да се оформи имунотоксин кој на сличен начин со покренување на автокрините литички системи на целната клетка (ендолитички органели) успева да ја уништи истата. 2. Адхеренција на најлонска волна Следниот сепаративен пат се состои во употреба на најлонска волна, со која се полни еден шприц низ кој потоа се истиснува лимфоцитната суспензија која треба да се сепарира. Притоа, на најлонската волна се адхерираат 90-95% од Б- клетките, со чистота 95-98%. Доколку сепак ни се потребни Б-клетките за понатамошни истражувања, постапката за нивна сепарација ќе оди разбирливо потешко, заради едновременото присуство на макрофагите, мртвите клетки и заостанатите Т- лимфоцити. 10
3. Panning метода Оваа техника се базира на селективна адхезија на Б- или Т- лимфоцитите на колона обложена со високомолекуларни партикли на кои со хемиска реакција, специфичните имуноглобулини се фиксирани со Fc фрагментот, така да им се слободни Fab фрагментите и наликуваат на трапез- акробати со раширени раце, со кои можат да интереагираат со различниот антигенски репертоар на Б- или Т- клетките. Како високомолекуларни партикли се користат декстран (Sephadex), агароза (Sepharose), полиакриламид или стаклени топчиња. Селективно нафатените лимфоцити треба да се елуираат најчесто со промена на рн на средината, која треба да ги ослободи од специфичните антитела. Но, ова оди толку тешко, што е рамно на постапката на измивање во тавче (англ. pan) на златото за отстранување на земјата што го практикувале поранешните трагачи по злато. Оттаму и целата метода го носи називот Panning. 4. Техниката на розетирање Ова техника претставува основа за сепарација на Т од Б лимфоцити од лимфоцитна суспензија. Се базира на присуството на неспецифични рецептори за необработени овчи еритроцити кои ги поседуваат само хуманите Т-лимфоцити. Т-лимфоцитите преку овие рецептори се врзуваат за овчите еритроцити и создаваат розети (т.н. директни или Е-розети). Розетите се создаваат спонтано во тек на 1-2 часа од мешањето на хуманите лимфоцити со овчите еритроцити на собна температура. Препаратот обично се третира со Гимза или друга техника на боење, а потоа се набљудува под микроскоп. Розетите обично се дефинираат како формации од централно поставен лимфоцит, опкружен со 5 или повеќе еритроцити. Покрај директните розети, познати се и методите за формирање на индиректни розети од типот ЕА (еритроцит-антитело) како и ЕАЦ (еритроцит-антителокомплемент). 5. Флуоресцентно активирани клеточни сортери Оваа метода е најверојатно најелегантната од претходно спеменатите методи, а се изведува во специјални апарати. Во рамки на методата најпрво се врши обработување на клеточната суспензија со имуноглобулини кои се флуоресцентно маркирани и специфично произведени само против репертоарот на антигени на само еден вид на клетки (пр. Б- лимфоцити). Потоа, клеточната суспензија ултрасонично се разбива до капки, при што секоја капка претставува една клетка, која ќе се карактеризира со различна флуоресценција осветлена во УВ светло. Оваа флуоресценција се детектира и се преведува во одреден набој, кој по поставувањето на клетките капки во електромагнетно поле доведува до нивно одбивање или задржување према што тие клетки се сортираат. 11
ПРАКТИЧНА РАБОТА: 1. Изолација на лимфоцити од полна крв со употреба на центрифугирање со градиент на густина Периферна крв (3ml) земена со венепукција во епрувета со антикоагуланс (хепарин, ЕДТА) се дилуира во однос 1:1 со физиолошки раствор. Во постапката се користат пластични или стаклени (специјално стакло за крвни деривати) епрувети за еднократна употреба или силиконизирани стаклени епрувети за повеќекратна употреба. Во епрувета се пипетира 1ml од градиентната микстура фикол-триозил. Ова микстура се приготвува од 43.4ml 9.2% автоклавиран воден раствор на Фикол и 6.6ml Триозил 75. Постојат и комерцијални раствори за двоење на лимфоцити од различни производители. (Limphoprep, Histopaque и сл.) Врз слојот од фикол-триозил се налеваат 3ml од дилуираната крв. Ова се изведува внимателно со цел да не дојде со мешање на двата слоја. Епруветата се центрифугира 30 минути на 4 C, 1200rpm. При тоа на дното на епруветката се исталожуваат еритроцитите, гранулоцитите и мртви клетки, бидејќи имаат поголема густина, а на граничниот слој меѓу површината на градиентната микстура и крвната плазма се нафаќаат лимфоцитите како бел слој. Слојот од лимфоцити се собира внимателно со помош на пастерова пипета и се пренесува во нова епрувета. Чист производ од лимфоцити се добива откога тие два пати ќе се измијат со физиолошки раствор (3000rpm, 5 мин. на 4 C). Талогот од лимфоцити се дотерува до бараната концентрација со медиум Ханкс. 12
2. Сепарација на Т-лимфоцитите со розетна техника По сепарацијата на лимфоцитите со градиент на густина се подесува нивната концентрација до 3x10 7 /ml во медиум кој е збогатен со 5% фетален телешки серум или со нормален човечки АБ серум. Вака приготвената суспензија од лимфоцити се меша во однос 1:1 со 0.5% овчешки еритроцити. Смешата се инкубира на водена бања на 37 С за 10мин. и седиментира со центрифугирање на 1000rpm. Потоа епруветата се инкубира 18 часа на 4 С. Добиениот талог внимателно се ресуспендира да не се разбијат розетите, од него се прави размаска и се набљудуваат розетите микроскопски. Двоењето на Т-лимфоцитите со розети од другите лимфоцити може да се изврши со центифугирање со градиент на густина. Суспензијата од Т-лимфоцитините розети внимателно се нанесува на градиентна микстура и се центрифугира 20 мин. на 1500-2000rpm. Со пастерова пипета се собира слојот во кој се наоѓаат Т-лимфоцитните розети. За изолација на Т-лимфоцитите неопходно е да се разрушат еритроцитите од нивната површина што се прави со додавање на секој еден дел лимфоцитна суспензија по три дела амониум хлорид и инкубација 10 мин. на собна температура. Потоа лимфоцитите се плакнат три пати со медиум на 1000rpm по 10 мин. и повторно се ресуспендираат во медиум. дата: освоени бодови: асистент: 13
Електрофоретски методи и имуноблотинг Вежба бр. 2 Електрофорезата претставува процес на движење на наелектизирани молекули под дејство на електрично поле. Поради тоа што во електично поле различните молекули се движат со различна брзина која зависи од нивната големина, облик и набој, електрофоретските методи можат да се користат за раздвојување на макромолекули од смеса. Како матрикси за раздвојување најчесто се користат врстено-поврзани агарозни и полиакриламидни гелови, кои можат да бидат во облик на хоризонтална или вертикална плоча. Големината на порите на овие гелови е варијабилна во зависност од концентрацијата на употребените мономери, што овозможува приготвување на гелови со различна резолуциска моќ и раздвојување на макромолекули со различни молекулски маси. Од аспект на раздвојување на протеини (со Мr од 5.000 до 200.000 Da), многу почесто се користат полиакриламидните гелови бидејќи тие имаат помали пори во однос на агарозните. Агарозните гелови почесто се користат за раздвојување на нуклеински киселини, многу големи протеини и протеински комплекси. Слика 6. Агарозни и полиакриламидни гелови. (а) Агарозните гелови се формираат со нековалентни водородни врски и хидрофобни интеракции. (б) Полиакриламидните гелови гелови се формираат со ковалентни вкрстени врски. Полиакриламид гел електрофореза (PAGE) Полиакриламидниот гел се подготвува со ко-полимеризација на акриламид и N,N'- метилен бисакриламид како врстен-поврзувач во присуство на амониум персулфат (APS), кој служи како иницијатор на полимеризацијата, и N,N,N,N - тетраметилетилендиамин, како катализатор. Големината на порите зависи од два параметри: - %Т што претставува вкупна маса на акриламид и бисакриламид во растворот изразена како % м/в. Зависноста е обратнопропорционална, имено, колку е поголема вредноста на %Т, толку порите се помали - %С што претставува масен удел на врсниот проврзувач бисакриламид во однос на вкупна маса на акриламид и бисакриламид изразена како % м/м. За гелови 14
со било која вредност на %Т, најмали пори се добиваат доколку врсниот поврзувач е застапен во 5% м/м, односно вредноста на %С =5. Над и под оваа вредност порите на гелот се зголемуваат. Слика 7. Пресметување на %Т и %С за полиакриламидни гелови. Протеините претставуваат амфотерни (цвитерјонски) соединенија бидејќи содржат и позитивни и негативни странични групи. Најголемиот дел од нивниот набој потекнува од ph-зависната јонизација на страничните карбоксилни и амино групи. Според тоа вкупниот набој на еден протеин е одреден од бројот и видот на аминокиселините од кои е составен и ph средината на медиумот. За секој протеин постои единствена ph вредност на која тој не поседува електричен набој, која е наречена изоелекрична точка (pi). Во медиум со ph поголема од неговата pi тој ќе има вкупен негативен полнеж и при електрофореза ќе се движи кон позитивната електрода (анода), и спротивно во медиум со ph помала од неговата pi тој ќе има вкупен позитивен полнеж и ќе се движи кон негативната електрода (катода). Ова укажува на важноста од одржување на константна вредност на ph средината при електрофореза, особено кога протеините се сепарираат во нивната нативна состојба. Многу почесто раздвојувањето на протеините се изведува во денатурирачки услови, при што доаѓа до губење на нивната секундарна и терциерна структура. Во овој случај обликот на молекулата повеќе не претставува фактор кој го ограничува движењето на протеините при елктрофореза. Денатурацијата на протеините најчесто се изведува со користење на анјонски детергенти како натриум додецил сулфатот (SDS - sodium dodecyl sulphat). Овој вид на електрофореза се нарекува SDS-PAGE. Натриум додецил сулфат ги денатурира протеините преку нарушување на хидрофобните интеракции, раскинување на водородните врски и и формирање на стабилни комплекси со молекулите, на тој начин што ги обвиткува полипептидните вериги со својата хидроофобна опашка. Количината на SDS која се комплексира со протеините не зависи од нивниот полнеж и аминокиселинска секвенца, туку само од нивната големина. Високиот негативен полнеж на SDS од комплексот ги маскира разликите во pi (полнежот) помеѓу различните протеини кои влијаат на електрофоретската подвижност. Обработени на овој начин, сите протеини ќе имаат негативен полнеж и притоа големината на негативниот полнеж претставува фунција од нивната големина. Како последица на ова, единствениот фактор од кој зависи електрофоретската подвижност на протеините при SDS-PAGE претставува молекулската маса. Врз основа на бројот на пуфери кои се употребуваат при една протеинска гел електрофореза, таа може да биде континуирана или дисконтинуирана. Во континуираниот систем се користи само еден пуфер и за изработка на гелот и како медиум за течење на електрофорезата, додека во дисконтинуираниот систем се користат повеќе различни пуфери со различна ph. Иако првиот е многу полесен за изведба, дисконтинуираниот систем е многу подобар бидејќи на овој начин се избегнуваат многу проблеми поврзани со преципитација и агрегација на примероците и 15
има многу поголема резолуциска моќ. Геловите кои се користат при дисконтинуирани системи се составени од два дела (Слика 6): - сепарациски гел, кој има помали пори и во кој се врши разделувањето на протеините. ph средината во овој гел овозможува одржување на негативниот полнеж на протеините, а со тоа и нивна подвижност. - апликациски гел, кој е нерестиктивен и се излева над сепарацискиот гел. ph средината во овој гел го делумно поништува негативниот полнеж и електрофоретската подвижност со што се овозможува концентрирање на протеините во облик на лента на допирната површина меѓу двата гела. Дисконтинуираната денатурирачка полиакриламид електрофореза, позната под името Laemmli SDS-PAGE (според нејзиниот пронаоѓач) денес претставува најчесто употребуваната метода за сепарација на протеини. Слика 8. Дисконтинуирана SDS полиакриламид гел електрофореза Анализата на електрофореграмите вклучува детекција и квантификација на сепарираните протеински фракции по нивна визуелизација со употреба на соодветни боени техники. Најчесто користени техники на боење се Coomassie blue во раствор за фиксација и редукција на среброто од неговите соли по фиксација на електрофореграмите. Лимитот на детекција Coomassie blue техниката е 100-300ng протеин/трака, додека техниката на боење со сребро е околу 100 пати посензитивна, со лимит на детекција од 1ng протеин. Одредувањето на големината на траките (Mr на протеинот) е овозможено преку споредување со стандарди со позната големина кои секогаш се аплицираат паралелно со испитуваните примероци. Наједноставен начин за квантификација на испитуваниот протеин претставува визуелно споредување на интензитетот на траката со интензитетот на стандардите, течени на истиот гел, кои се со позната концентрација. Поточен метод на квантификација претставува дензитометриско скенирање на обоените гелови. 16
Протеински (Western) блотинг Понатамошните анализи кои вклучуваат реактивност на антитела на протеините сепарирани со електрофореза имаат потреба од отстранување на електрофоретскиот матрикс. Ова наједноставно се постигнува со протеински блотинг. Протеинскиот блотинг подразбира едноставен трансфер (елуција) на сепарираните протеински фракции од широката страна на полиакриламидниот гел на постабилен медиум за имобилизација, односно мембрански филтер кој ги врзува протеинските молекули во моментот кога тие го напуштаат гелот. Медиумот за имобилизација претставува мембрана од различен материјал нитроцелулоза, најлон или поливинилиден дифлуорид (PVDF). Слика 9. Електрофоретски блотинг системи. (а) шематски приказ на вертикален систем и хоризонтален полусув систем. (б) правец на движење на протеинските фракции. Протеинскиот блотинг може да се изведе како капиларен или електрофоретски блотинг. Капиларниот блотинг се врши така што неколку листови филтерна хартија со голема апсорптивна моќ се натопуваат со трансферен пуфер и се поврзуваат со резервоарите со пуфер. На филтерната хартија се става исечокот од полиакриламидниот гел а над него нитроцелулозната мембрана. Над мембраната се ставаат неколку листови филтерна хартија и сунѓер. Капиларниот блотинг тече 24-48 часа. При електрофоретскиот блотинг, протеините се пренесуваат од гелот на мембраната по пат на електрофореза во рок од само 30 мин. до неколку часа. Гелот и мембраната се поставуваат во вертикален систем потопен во трансферен пуфер. Под дејство на електрично поле сепарираните протеини излегуваат од гелот и навлегуваат во мембраната. Алтернативно, пуферскиот систем може да се замени со филтерна 17
хартија потопена во транферен пуфер. Ова е т.н. хоризонтален полусув елекрофоретски блотинг. По транферот протеинсите фракции, сега веќе поврзани за мембраната, можат да се детектираат или преку врзување со специфични антитела или неспецифично со употреба на различни техники на боење. Детекцијата со антитела се изведува на тој начин што нитроцелулозната мембрана се третира со антитела специфично вперени против одреден протеин, а потоа се воведуваат секундарни антиимуноглобулински антитела кои се коњугирани со ензим. Со употреба на хромоген супстрат специфичен за ензимот со кој е маркирано антителото се јавува обојување на мембраната. ПРАКТИЧНА РАБОТА: 1. Сепарација на протеини од смеса со употреба на Laemmli SDS-PAGE. Протокол за работа: 18
Резултати: дата: освоени бодови: асистент: 19
Реакции на аглутинација Вежба бр.3 Аглутинацијата претставува појава на слепување на клетки (бактерии, еритроцити) или крупни честички (полистиренски латекс, бентонит, каолин, микрокристали на холестерол и др.) на чија површина се лоцирани антигени кои стапуваат во интеракција со специфични антитела. При интереагирањето со барем два антигена, антителата воспоставуваат еден вид мостови меѓу нив и доведуваат до слепување на клетките или честичките на кои се сместени тие антигени. При тоа антителата мора да ја совладаат јонската обвивка на клетката на која се наоѓа антигенот со кој се поврзуваат. Аглутинацијата доведува до формирање на големи агрегати на клетки или честички, наречени аглутинати, кои можат да бидат видливи микроскопски или макроскопски. Антителата кои учествуваат во реакцијата на аглутинација се нарекуваат аглутинини, а антигените со кои интереагираат аглутиногени. На реакцијата на аглутинација влијаат концентрацијата на аглутинините и аглутиногените, природата на антигенската структура, јонската јакост на медиумот, температурата и др. фактори. Иако во реакциите на аглутинација стапуваат IgG, IgM и поретко IgA антителата, начелно IgM антителата претставуваат најдобри аглутинини поради големата валентност. Слика 10. Принцип на реакција на аглутинација Врз основа на принципот на реакцијата тестовите на аглутинација се делат на: 1. тестови на активна (директна) аглутинација кои служат за детекција на партикуларни антигени; 2. тестови на пасивна (индиректна) аглутинација кои служат за детекција на солубилни антигени; 3. тестови на инхибиција на аглутинација. 20
Тестовите на активна аглутинација се делат на тестови на брза аглутинација, кои се изведуваат на предметни стакла и тестови на спора (класична) аглутинација кои се изведуваат во епрувети. Тестовите на брза аглутинација се квалитативни тестови (+/-). Одредувањето на крвните групи претставува класичен пример на брза директна аглутинација. Се испитува присуство на аглутинат по инкубација на еритроцитите од испитуваното лице со анти-а, анти-б и анти-аб серум. Слика 11. Одредување на крвни групи Слика 12. (а) изведба на тест на брза аглутинација; (б) негативен и позитивен разултат. 21
Тестовите на спора аглутинација можат да послужат за квантификација на аглутинините во серумот. Одредувањето се врши во епрувети или микротитарски плочи со употреба на константна количина на аглутиногени додека серумот се додава во различни разредувања. Најчесто се работи со двојни разредувања на серумот (1:20, 1:40, 1:80 ). Најголемото разредување на серумот со кое сеуште се постигнува аглутинација го дава титарот на аглутинините. При позитивна реакција аглутинатите се таложат на дното на епруветата а преостаната течност е бистра, при што талогот е со нерамни рабови. При негативната реакција, содржината во епруветата има едномерно заматување, можна е појава на талог со мазни рабови кој со протресување хомогено се суспендира. Слика 13. Одредување на титар на антитела со реакција на спора аглутинација. (а) позитина реакција, (б) негативна реакција Кај пасивната аглутинација доаѓа до аглутинирање на солубилни антигени врзани за некој носач како полистиренски латекс (латекс аглутинација) или овчи еритроцити (хемаглутинација). Самиот носач не е имуногеничен. Еритроцитите лесно се врзуваат за полисахариден антиген, но ако антигенот по потекло е протеински или нуклеинска киселина мораат претходно да се обработат со танинска киселина или хром хлорид. Пример за пасивна хемаглутинација претставува Waaler - Rose -овиот тест за одредување на реуматидниот фактор. Се изведува со додавање на серум од пациент на серум од хиперимунизиран зајак со овчи или хумани еритроцити. Ако се јави аглутинација значи дека во серумот на пациентот е присутен реуматиден фактор кој претставува анти - IgG. Постојат и т.н. неаглутинациски антитела кои можат да се докажат со Coombs-ов антиглобулински тест. Пример за Кумбсов тест претставува одредувањето на антителата против еритроцитниот антиген Rho или D антиген. Тој исто така може да вклучува директна или индиректна аглутинација. При директниот Кумбсов тест се одредува присуството на аглутинини од Rh- мајка на површината на еритроцитите на Rh+ новороденче. Тестот се изведува со додавање на антиглобулински антисерум кој се врзува за Fc фрагментот на аглутинините и доведува до појава на аглутинација на еритроцитите. Позитивната реакција на аглутинација упатува на присуството на 22
аглутинини во серумот на мајката. Овие аглутинини ги опкружуваат еритроцитите на новороденчето но без учеството на антиимуноглобулински антитела не можат да извршат аглутинација на еритроцитите на новороденчето ин витро. Индиректниот Кумбсов тест се користи за утврдување на присуството на аглутинините насочеени против Rho антигенот на фетусните еритроцити во серумот на гравидна жена. Тестот се изведува така што на серумот на жената се додава серум од лице со крвна група О Rh+, а потоа антиимуноглобулински антисерум кој ќе овозможи ин витро аглутинација на сензибилизираните еритроцити со припадност на крвната група Rho. Позитивната реакција на аглутинација потврдува дека во серумот на жената се присутни аглутинини. Слика 13. Изведување на директен и индиректен Кумбсов тест. Тестовите на инхибиција на аглутинацијата се темелат на способноста на некои вируси и микоплазми да се врзат за површинските рецептори од еритроцитите на некои животински врсти и да извршат нивна аглутинација. Појавата создава услови за утврдување на присуството на антивирусни антитела во серум на пациенти. Во колку на мешавината вирус и еритроцити се додаде испитуваниот серум од пациентот и не дојде до аглутинација значи во серумот се присутни антивирусни антитела кои го блокираат вирусот да изврши аглутинација на еритроцитите. Со тоа се издава позитивна дијагноза дека пациентот е инфициран со испитуваниот вирус. Слика 14. Хемаглутинација (а) и инхибиција на хемаглутинација (б) 23
ПРАКТИЧНА РАБОТА: 1. Реакција на брза директна аглутинација (Розе Бенгал тест) според протоколот на производителот. Постапка на изведување на тестот: Резултати: Интерпретација на резултатите: дата: освоени бодови: асистент: 24
Имунохемолитички тестови, реакција на врзување на комлемент Вежба бр.4 Дејството на различни физичко - хемиски фактори (температура, ph, јонска јачина, присуство на детергенти, токсини и др.) доведува до фрагментирање на еритроцитната мембрана и ослободување на хемоглобинот, процес означен како хемолиза. Врзувањето на антитела за некој еритроцитен мембрански антиген и вклучувањето на системот на комплемент исто така доведува до хемолиза на еритроцитите,, што е искористено во голем број на функционални анализи означени како имунохемолитички тестови.. Системот на комплемент претставува дел од вродениот имунолошки систем. Класичната патека на активирање на комплементот започнува со интеракцијата на присутните антигени и антителатаа кои се специфично насочени против нив. Способност за врзување и активацијаа на комплементот имаат IgG и IgM антителата. Настанатиот имунолошки комплекс антиген-антитело преку промена во стеричката конформација на антителото овозможува поврзување на C1q компонента од комплементот за Fc фрагментот на антителото. Ова доведува до сукцесивно, каскадно активирање на другите компоненти од комплементот кои доведуваат до уништување на патогенот преку реакции на опсонизација, хемотаксија и лиза. Реакција на врзување (фиксација) на комплементот (РВК). Првобитно овој метод бил воведен во 1909 година за серолошкоо докажување (серодијагностицирање) на сифилис (Wasserman-ова реакција). Денес методот е адаптиран и воведен во рутинска употреба за докажување на инфекција со различни причинители, првенствено вируси. Начелно методот може да се искористи за докажување на присуство и одредување на титарот на било кои антитела во серум на пациенти под услов да располагаме со соодветно специфичен антиген и обратно. Во суштина, тестот на врзување на комплемент се состои од две антиген-антитело реакции. Првата е помеѓу антителата чие присуство се испитува во серумот на пациентот и специфичен антиген (главна реакција или т. н. тест систем), а втората е помеѓу овчи еритроцити сензитизирани со хемолизин кој претставува антисерум од зајак односно специфични антиеритроцитни антителаа добиени со специфична сензибилизација на зајакот со овчи еритроцити. Оваа втора (споредна) реакција се нарекува индикаторски или хемолитичен систем. Двете реакции вклучуваат активација на системот на комплемент. Слика систем 15. Реакција на врзување на комплемент: тест систем (десно) и индикаторски (лево). 25
Тестот на врзување на комплемент се изведува во две фази (Слика 9): Во првата фазаа на тестотт се изведува главната (тест) реакција на тој начин што во серумот од пациентот, кај кого го одредуваме присуството на специфични антитела, се додава стандарден (комерцијален) антиген и точно определена (константна) количина на комплемент добиен од заморче (guinea pig). Серумот добиен од пациентот претходно се инкубира 30 минути на 56 C со што доаѓа до инактивација на автологниот комплемент, поради што единствениот комплемент кој може да се употреби во тек на реакцијата антиген-антитело која се очекува е оној кој е додаден во текот на изведувањето на тестот. По завршенатаа инкубација на тест системот (30 минути на 37 C) се изведува втората фаза од тестот со додавање на индикаторскиот (хемолитичен) систем на претходната реакција и инкубација под истите услови (30 минути на 37 C). Доколку во серумот од пациентот биле присутни антитела за испитуваниот антиген, ќе настане реакција на образување на имунолошки комплекси помеѓу нив при што додадениот комплемент ќе биде конзумиранн (врзан). Бидејќи комплементот е исто така потребен и за интеракцијата помеѓу овчите еритроцити и хемолизинот, додавањето на индикаторскиот систем всушност го детектира присуството о на преостанат комплемент. Позитивна реакција (присуство на антитела во серумот на пациентот) ќе биде детектирана како отсуствоо на лиза на овчите еритроцити, и обратно, негативна реакција (отсуство на антитела во серумот на пациентот) ќе биде визуализирана како лиза на овчите еритроцити од индикаторскиот систем. Иако тестот на врзување на комплемент се смета за релативно едноставен тест, неговото изведување е комплицирано и одзема многу време поради тоа што во него се вклучени 5 варијабли. Со цел да се одреди титарот на антителата во серумот на пациентот потребно е сите останати варијабли кои влијаат на тестот да бидат строго контролирани. При секое изведување на тестот треба да се користи оптимална концентрација на хемолитичкиот систем, антигенот и комплементотт која се одредува со титрација на секоја компонента посебно. На тој начин, со стандардизирање на условите на реакцијата, секоја промена на концентрацијатаа на антителата ќе доведе до промена на интензитетот на хемолиза. Титарот на антителата се одредува со правење на сериски разредувања на серумот на пациентот, при што се забележува најголемото разредување при кое сеуштее не се јавила хемолиза (Слика 8). Слика 16. Реакција на врзување на комплемент: изведување на тестот (а) и принцип на одредување на титар на антитела во серум на пациент (б). 26
Слика 17. Интерпретација на резултати од тест на врзување на комплемент ПРАКТИЧНА РАБОТА: 1. Изведување на реакција на врзување на комплемент според протоколот на производителот. Постапка на изведување на тестот: 27
Резултати: Интерпретација на резултатите: дата: освоени бодови: асистент: 28
Одредување и квантификација на растворливи антигени и антитела, РИА и ЕЛИСА Вежба бр.5 Радиоимунолошки тестови (RIA = Radioimmunoassay) претставува збирен назив за тестови во кои се користи радиоактивен обележувач (маркер), конјугиран за антиген или антитело при што со употреба на сцинтилациски бројач се добива квантитативен увид во испитуваниот материјал. Методата е сензитивна и репродуцибилна, а од друга страна може да се примени во одредување на широка лепеза на материи: антигени, антитела, хормони, лекови (дигитоксин, морфин), ангиотензин I и II, camp и cgmp, карциноембриски антиген, простагландини и др. Како радиоактивен маркер се користат радиоактивните J 131, J 125, H 3, C 12 и др. Имуноензимските тестови (ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assays, познати и како EIA = enzyme immunoassays) се темелат на истите принципи како и радиоимунолошките тестови, меѓутоа во овој случај како маркер за обележување на специфичната антиген-антитело реакција се користи ензим. Оваа методологија е воведена во 1971 година со цел да се избегне употребата на радиоактивни маркери, а притоа да не се изгуби осетливоста, точноста и специфичноста која ја нудат радиоимунолошките тестови. Денес претставува еден од најчесто употребуваните серолошки тестови и може да се искористи за детекција и квантификација на било кои антигени или антитела. Детекцијата кај ЕЛИСА е овозможена со употреба на хромогени супстрати кои продуцираат забележлива промена на бојата под дејство на ензимот во присуство на имунолошки комплекси антиген-антитело. Промената на бојата се детектира спектрофотометриски. Најчесто употребувани ензими како маркери при ЕЛИСА се пероксидаза и алкална фосфатаза кои користат различни супстрати: 1. за алкална фосфатаза најчесто се користи p-нитрофенил фосфат (pnpp), кој под дејство на ензимот се конвертира p-нитрофенол со жолта боја која може да се измери на 405nm бранова должина. 2. за пероксидаза како супстрат се користи водороден пероксид, кој под дејство ензимот ослободува насцентен кислород одговорен за оксидација хромоген супстрат кој притоа ја менува бојата. - 3,3,5,5 -тетраметилбензидин (TMB) кој дава сино обојување кое може да се измери на 450nm бранова должина; - о-фенилендиамин дихидрохлорид (OPD) кој дава портокалово обојување кое може да се измери на 492nm бранова должина и - 2,2 -азино-ди-[3-етил-бензотиазолин-6-сулфонска киселина] диамониум сол (ABTS) кој дава зелено обојување кое може да се измери на 416nm бранова должина. - Освен како квалитативен тест, ЕЛИСА (и РИА) може да се користи и како квантитативен тест. Интензитетот на обојувањето се одредува спектрофотометриски, а од добиената вредност на апсорбанца на примерокот може да се одреди концентрацијата преку екстраполација на стандардна крива. Титарот на антителата може да се одреди и со правење на сериски разредувања на серумот на пациентот, при што како вредност се зема најголемото разредување при кое сеуште се развива боја. 29
Врз основа на принципот на изведување на реакцијата радиоимунолошките и имуноензимските тестови можат да бидат компетитивни и некомпетитивни. Некомпетитивните од своја страна се делат на индиректни, директни и т.н. сендвич методи. 1. Некомпетитивна ЕЛИСА Индиректна ЕЛИСА Индиректната ЕЛИСА претставува метод кој најчесто се користи за детекција на присуство на антитела во серум на пациенти. Како и сите други типови на ЕЛИСА, постапката се изведува во полистиренски или ПВЦ микротитарски плочи кои во овој случај се обложуваат со комерцијално приготвен антиген (специфичен за потенцијалните антитела од испитуваниот крвен серум). Доколку испитуваните антителата се присутни во серумот на пациентот тие ке се врзат за антигените со кои се обложени бунарчињата на микротитарската плоча. За детекција на имунолошките комплекси се користи второ т.н. секундарно антихумано антитело (најчесто IgG) кое е коњугирано со ензим и соодветен ензимски супстрат. Секундарните антитела се надоврзуваат на антитело-антиген комплексот преку Fc фрагментот од хуманото антитело. Интензитетот на обојување на супстратот ќе биде правопропорционален со концентрацијата на испитуваните антитела во серумот на пациентот. Директна ЕЛИСА Директната ЕЛИСА претставува метод кој најчесто се користи за детекција на присуство на антигени во серум на пациенти. При овој метод, за разлика од индиректниот, иституваниот антиген директно се врзува за бунарчињата од микротитарската плоча и се користи само едно антитело кое е обележано со ензим. Интензитетот на обојување на супстратот е правопропорционален со концентрацијата на испитуваниот антиген во серумот на пациентот. Слика 18. Директна и индиректна ЕЛИСА 30
Сендвич ЕЛИСА Сендвич ЕЛИСА се изведува така што најпрво се врши имобилизација на комерцијални немаркирани антитела во бунарчињата од микротитарската плоча, во кои потоа се нанесува испитуван серум на пациент со потенцијален, специфичен, суспектен антиген. Ако ваков антиген присуствува во серумот на пациентот, тој ќе се врзе за имобилизираното антитело (со една антигенска детерминанта). Детекцијата се изведува со помош на второ антитело кое е коњугирано со ензим а се врзува за друга антигенска детерминанта на истиот антиген. Колку е поголема концентрацијата на суспектниот антиген од крвниот серум, толку ќе биде поголема количината на настанатите имунокомплекси немаркирано антитело-антиген-маркирано антитело, односно ќе биде поголем интензитетот на обојување. Со овој метод можат да се одредуваат само мултивалентни антигени и обично се користи во случаи кои испитуваниот антиген е во многу мала количина или доколку во примерокот има присуство на големи количини на протеински контаминенти. Слика 19. Изведување на најчестите типови на ЕЛИСА 2. Компетитивна ЕЛИСА Компетитивната ЕЛИСА исто како и некомпетитивната може да се искористи за детекција и на антигени и на антитела во серумот на пациенти, во зависност од тоа која компонента е имобилизирана а која коњугирана со ензим. Принципот, како што укажува и само име на методата, е компетиција за иста антигенска детерминанта на испитуваните антитела (или антигени) од серумот на пациентот и додадените антитела (или антигени) кои се коњугирани со ензим. Колку е поголем титарот на антителата во серумот на пациентот, во толку помала количина ќе се врзат маркираните антитела. 31
Според тоа, за разлика од некомпетитивната ЕЛИСА, во овој случај интензитетот на обојување е обратнопропорционален со концентрацијата на испитуваните антитела во серумот на пациентот. ПРАКТИЧНА РАБОТА: 1. Индиректен ELISA метод за утврдување на постоење на вкрстена реактивност на антиганглиозидните антитела кај пациенти со Guillain-Barre синдром кон LPS од Campylobacter jejuni и хуманите ганглиозиди Крвта од пациентите со Guillain-Barre синдром (кај кои се испитува присуство на присутни анти-gm 1 антитела) се собира во епрувети без антикоагуланс. Штом се формира коагулум епруветите се центрифугираат со цел да се одвои серумот. Хемолизирани, липемични и иктерични примероци не треба да се користат. Доколку тестот не се изведува веднаш по собирањето на примероците, серумот може да се чува на -20 о C (или на -80 о C за подолго чување). Смрзнатите примероци не треба да се одмрзнуваат и повторно смрзнуваат бидејќи со тоа ќе се намали активноста на антителата. Потребни реагенси: Антигени за обложување на плочите: липополисахариди (LPS) изолирани од C. jejuni и ганглиозиди (GM 1 ) Секундарно антитело (анти-igg) конјугирано со ензим алкална фосфатаза или пероксидаза Супстрат за алкална фосфатаза (pnpp: p-нитрофенилфосфат) или супстрат за пероксидаза (OPD: о-фенилдиамин) Раствор за блокирање: BSA (bovine serum albumin) Раствор за промивање: вообичаено PBS (фосфатен пуфер) или TBST (раствор на NaCl со 0.05% (v/v) Tween20 пуфериран со Tris). Реагенс за стопирање на реакцијата ензим-супстрат: 3 М NaOH (алкална фосфатаза) односно 3 M HCl или H 2 SO 4 (пероксидаза) Протокол за работа: Обложување на плочите со антиген 1. Стандардната ELISA плоча (со 96 бунарчиња) се обложува со LPS изолирани од C. jejuni. Како позитивна контрола служат бунарчињата обложени со GM 1, а бунарчињата без GM 1 и LPS служат како негативни контроли. Обложувањето се изведува така што бунарчињата од секоја наредна колона се обложуваат со 100 μl/бунарче раствори на антигените (200 ng GM1, односно 5 µg LPS), а колоните измеѓу се исполнуваат само со 100 μl/бунарче растворувач за антигените (негативни контроли). 2. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и се инкубира 2 часа на собна температура или се остава да стои на 4 О C преку ноќ. 3. Се отстранува остатокот од растворот за обложување и плочата се промива 2-пати со полнење на бунарчињата со 200 μl/бунарче раствор за промивање. Реагенсите и растворите за промивање се отстрануваат со превртување на плочата над чешмен 32
одвод. Капките кои преостануваат, се отстрануваат со тапкање на плочата на мека хартија. Блокирање на преостанатите протеин-врзувачки места од бунарчињата 4. Во сите бунарчиња се додава 200 μl/бунарче раствор за блокирање. 5. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и инкубира 2 часа на собна температура. 6. Плочата се промива 2-пати со полнење на бунарчињата со 200 μl/бунарче раствор за промивање. Додавање на примарното и секундарното антителото 7. Во секое од бунарчињата се аплицираат 100 µl од растворите на серумите во PBS- 0.1% BSA. 8. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и инкубира 2 часа на собна температура или на 4 o C преку ноќ. 9. Плочата се промива 4-пати со раствор за промивање. 10. Во секое од бунарчињата се додава 100 μl секундарно антитело конјугирано со ензим, кое веднаш пред употреба е разредено до оптимална концентрација (според инструкциите на производителот). 11. Плочата се покрива со адхезивна пластична фолија и инкубира 2 часа на собна температура или на 4 o C преку ноќ. 12. Плочата се промива 4-пати со раствор за промивање. Детекција 13. Се додава 100 μl (или 50 μl) од растворот на супстратот во секое бунарче. Во бунарчињата со позитивна реакција, се очекува да се развие обојување по 20-30 минути (жолто или портокалово, за pnpp или OPD соодветно). 14. Реакцијата се прекинува со додавање на 50 µl реагенс за стопирање. 15. Апсорбанцата се отчитува со микротитарен читач (на 405 nm или 450 nm, за pnpp или OPD соодветно). Интерпретација на резултатите 16. Оптичката густина (ОГ) која е изразена со вредноста на апсорбанцата на примероците се однесува на секое поединечно бунарче. Резултатите се добиваат со одземање на средната вредност на оптичката густина на бунарчињата без антиген од средната вредност на оптичката густина на соодветните бунарчиња со антиген. ОГ помала од 0.1 укажува на негативен примерок. ОГ помала од 0.1 укажува на позитивен примерок. Позитивните примероци повторно се испитуваат со ЕЛИСА со користење на двојни сериски разредувања отпочнувајќи со 1:100. Титарот на антитела се одредува како најголемото разредување на серумот со оптичка густина поголема од 0.1 (корегирана за ОГ во бунарчињата без антиген) 33