ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Λ. ΚΡΟΥΕΖΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΚΤΩΝ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΙΣΤΟΥΣ (ΠΑΓΚΡΕΑΣ - ΣΤΟΜΑΧΟΣ - ΗΠΑΡ) ΑΠΟ ΝΕΑΡΑ ΧΟΙΡΙΔΙΑΚΡΕΑΤΟΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΤΡΟΦΗΣ ΜΕ ΠΟΛΥΦΑΙΝΟΛΙΚΑ ΠΡΟΣΘΕΤΑ. ASSESSMENT OF OXIDATIVE STRESS MARKERS IN PIG TISSUES (PANCREAS - STOMACH- LIVER) ΙΝ ABLACTATION PERIOD TREATED WITH POLYPHENOLIC ADDITIVES. ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Λ. ΚΡΟΥΕΖΑΣ ΛΑΡΙΣΑ 2014 1

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Δημήτριος Στάγκος (επιβλέπων): Λέκτορας Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Δημήτριος Κουρέτας: Καθηγητής Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Κων/νος Πετρωτός: Επίκουρος Καθηγητής του Τμήματος Μηχανικής Βιοσυστημάτων του ΤΕΕΛάρισας. 2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Στην οικογένεια μου, που πάντα με προέτρεπε στη γνώση και μου έδωσε όλα τα εφόδια και τα θεμέλια να εξελιχθώ και να ολοκληρωθώ ως άνθρωπος και ως επιστήμονας. Και στην αγαπημένη μου, Βιολέτα Γκινάλας, για την συμπαράσταση και βοήθεια της. Η παρούσα διπλωματική εργασία, υπό την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Δημήτρη Κουρέτα, εκπονήθηκε στα εργαστήρια: Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας - Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, στο εργαστήριο Μηχανικής Τροφίμων - Βιοσυστημάτων και στο αγρόκτημα του ΤΕΙ / Θεσσαλίας. Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω θερμά, για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριο του, όπως επίσης και για τις πολύτιμες συμβουλές του. Ευχαριστώ τον Λέκτορα κ. Δημήτριο Στάγκο, για τη συνεχή και ουσιαστική παρουσία και υποστήριξη του, τόσο στα εργαστηριακά πειράματα όσο και στην συγγραφή αυτής της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης, τον Επίκουρο Καθηγητή του ΤΕΙ/Λάρισας κ. Κωνσταντίνο Πετρωτό για τις πολύτιμες συμβουλές του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον υποψήφιο διδάκτορα Κώστα Γερασόπουλο που βοήθησε τα μέγιστα τόσο στην εκπόνηση της διπλωματικής μου εργασίας και στην ολοκλήρωση της πειραματικής διαδικασίας, όσο και για την καθολική παρουσία του καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος κάνοντας όλη την εμπειρία ακόμα πιο ευχάριστη. Ευχαριστώ ακόμη όλη την υπόλοιπη ομάδα του εργαστηρίου, για το συνεργατικό και ιδιαίτερα φιλικό κλίμα που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. 3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Για τους στόχους της παρούσας εργασίας εκτράφηκαν είκοσι (20) χοίρίδια τα οποία διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες των δέκα (10). Σε αυτές τις δύο ομάδες χορηγήθηκε διαφορετικό σιτηρέσιο. Στην πρώτη ομάδα η οποία αποτελούσε την ομάδα ελέγχου χορηγήθηκε κανονικό σιτηρέσιο για χοίρους, ενώ το σιτηρέσιο της δεύτερης ομάδας περιείχε επιπλέον επεξεργασμένα Υγρά Απόβλητα Ελαιοτριβείου (ΥΑΕ) τα οποία περιέχουν πολυφαινόλες. Στα αρχικά στάδια του πειράματος παρασκευάστηκε ενσίρωμα το οποίο περιείχε τα ΥΑΕ και στη συνέχεια προστέθηκε στο σιτηρέσιο των χοίρων που ανήκαν στην πολυφαινολική ομάδα. Τα χοιρίδια εκτράφηκαν για 50 ημέρες και κατά τη διάρκεια έγιναν 4 ιστοληψίες - αιμοληψίες (2, 20, 35 και 50 ημέρες μετά την γέννηση). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν ο ηπατικός, παγκρεατικός και στομαχικός ιστός από το σύνολο των 9 ιστών που ελήφθησαν. Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν πειράματα για να μελετηθεί εάν θα υπήρχε ενίσχυση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών των χοιριδίων σε νεαρή ηλικία. Οι δείκτες του οξειδωτικού στρες που ελέγχθηκαν ήταν: η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH), η δραστικότητα της καταλάσης (CAT), η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC- Totalantioxidantcapacity), οι ουσίες που αντιδρούν με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS- Thiobarbituricacidreactivesubstances) και τα πρωτεϊνικά καρβονύλια. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι όλοι οι δείκτες του οξειδωτικού στρες και στις πέντε (5) μετρήσεις βελτιώθηκαν αισθητά και στους τρείς (3) ιστούς. Συνεπώς από τα παραπάνω αποδείχτηκε η αντιοξειδωτική δράση των πολυφαινολικών προσθέτων από τα επεξεργασμένα ΥΑΕ ύστερα από χορήγησή τους σε χοίρους κρεατοπαραγωγής νεαρής ηλικίας. 4

ABSTRACT The aim of the present work was to raise young pigs with feed containing polyphenolic additives, from processed OMWW (olive mill waste waters), in order to examine the effect on their antioxidant status in blood and tissues, using oxidative stress biomarkers. For this reason, 20 young pigs were divided into two (2) groups. The control group, with the basic diet throughout the experiment, while the other group was received special feed with polyphenolic additives.in the initial stages of the experiment,silage was prepared by addingomww, which was then added to the feed ration of pigs belonging to the polyphenol group. Piglets were reared for 50 days and during this period 4 tissue and blood extractions were performed (2, 20, 35 and 50 days after birth). From the 9 different types of tissues that were extracted in total, this study analysesthe tissues from liver, stomach and pancreas. Experiments were performed in order to determine whether the antioxidant mechanisms of piglets at a young age could be strengthened. The oxidative stress indicatorswere monitored using the following techniques: reduced glutathione (GSH), the activity of catalase (CAT), total antioxidant capacity (TAC-Total Antioxidant Capacity), substances that react with thiobarbituric acid (TBARS-Thiobarbituric Acid Reactive Substances) and protein carbonyls. The experimental results showed that measurements of all five (5) indicators of oxidative stress were significantly improved in all three (3) tissues. Thus, polyphenol additives from processed OMWW, after administration to young pigglets, enhance their antioxidant capacity. 5

ΠΕΡΙΕΧΟΜ ΕΝΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ...2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 4 ABSTRACT... 5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 6 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ... 9 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ... 10 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ... 11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 13 1.1. Πολυφαινόλες...13 1.1.1 Δομή και Τάξεις των Πολυφαινολών...14 1.1.2 Φυσικές Ιδιότητες... 14 1.1.3 Χημειοπροστατευτική Δράση Πολυφαινολών... 14 1.2. Οξειδωτικό Στρές... 18 1.2.1Ιστορική Αναδρομή... 18 1.2.2 Ελεύθερες Ρίζες και Δραστικά Είδη Ο2... 19 1.2.3 Πως Δημιουργούνται οι Ελεύθερες Ρίζες στον Οργανισμό μ α ς...20 1.2.4 Πως Εξουδετερώνονται τα Δραστικά Είδη Οξυγόνου (ΔΕΟ) στον Οργανισμό μας... 23 1.2.5Επίδραση των Ελεφθέρων Ριζών στην Υγεία... 24 1.3 Προστατευτικός Ρόλος των Πολυφαινολών από Υγρά Απόβλητα Ελαιοτριβείου (ΥΑΕ)... 25 1.3.1 Καρδιαγγειακό... 25 1.3.2 Αντιμικροβιακή και Αντι-ϊική Δραστηριότητα... 27 1.3.3 Καρκίνος... 27 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 29 2.1 Γενικά... 29 2.2 Περιγραφή Σιτηρεσίου... 32 2.2.1 Εισαγωγή... 32 2.2.2 Χαρακτηριστικά Ενσιρώματος... 35 2.2.3 Παρασκευή Πολυφαινολικού Σιτηρεσίου... 35 2.3 Αιμοληψία - Ιστοληψία... 39 6

2.3.1 Υλικά... 39 2.4 Επεξεργασία Αίματος - Ομογενοποίηση Ιστών... 40 2.4.1 Περιγραφή Μεθόδου... 40 2.5 Προσδιορισμός Δεικτών Οξειδωτικού Στρες... 42 2.5.1 Γενικά... 42 2.5.2 Μέθοδοι... 42 A)GSH στο ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα... 43 Α1) Αρχή της Μεθόδου... 43 Α2) Αντιδραστήρια... 44 A3) Πειραματικό Προτόκολο... 44 Α4) Υπολογισμοί... 45 Β) Δραστηριότητα της Καταλάσης... 45 Β1) Αρχή της Μεθόδου... 45 Β2) Αντιδραστήρια... 46 Β3) Πειραμάτικό Προτόκολο... 47 Β4) Υπολογισμοί... 47 Γ) Ολική Αντιοξειδωτική Ικανότητα (Total Antioxidant Capacity, TAC)... 48 Γ1) Αρχή της Μεθόδου... 48 Γ2) Αντιδραστήρια... 49 Γ3) Πειραματικό πρωτόκολλο... 49 Γ4) Υπολογισμοί... 50 Δ) Ουσίες που Αντιδρούν με το Θειοβαρβιτουρικό Οξύ (TBARS)...50 Δ1) Αρχή της μεθόδου... 50 Δ2) Αντιδραστήρια... 51 Δ3) Πειραματικό Πρωτόκολλο...52 Δ4) Υπολογισμοί... 52 Ε) Πρωτεϊνικά Καρβονύλια...52 Ε1) Αρχή της Μεθόδου... 52 Ε2) Αντιδραστήρια... 53 Ε3) Πειραματικό Πρωτόκολλο... 54 Ε4) Υπολογισμοί... 55 2.6 Προσδιορισμός Δεικτών Οξειδωτικού Στρές στον Ηπατικό, Παγκρεατικό και Στομαχικό Ιστό...55 7

2.6.1 GSH... 55 2.6.2 Δραστηριότητα της Καταλάσης...56 2.6.3 Ολική Αντιοξειδωτική Ικανότητα (TotalAntioxidantCapacity, TAC)... 56 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 57 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 66 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 71 8

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1. Κυριότερες Πολυφαινόλες στα ΥΑΕ. 17 Πίνακας 2. Μέσος Όρος Μέτρησης Βάρους των Χοιριδίων. 31 Πίνακας 3. Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού, ομάδας (Β) με Πολυφαινολικά Πρόσθετα. 36 Πίνακας 4. Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού, ομάδας Α (ελέγχου) (χωρίς πολυφαινόλες) 38 Πίνακας 5. Διαδοχική Σειρά Προσθήκης και οι Ποσότητες των Αντιδραστηρίων 44 για τη Μέτρηση της GSH. Πίνακας 6. Διαδοχική σειρά προσθήκης και οι ποσότητες των αντιδραστηρίων, 47 για την μέτρηση της Καταλάσης. Πίνακας 7. Διαδοχική Σειρά Προσθήκης και οι Ποσότητες των Αντιδραστηρίων 49 για τη Μέτρηση της TAC. Πίνακας 8. Αύξηση GSH στο Ήπαρ της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση με 57 την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 9.Αύξηση GSH στο Πάγκρεας της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 58 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 10. Αύξηση GSH στον Στόμαχο της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 58 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 11. Αύξηση Καταλάσης στο Ήπαρ της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 59 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 12. Αύξηση Καταλάσης στο Πάγκρεας της Πολυφαινολικής Ομάδας 59 σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 13. Αύξηση Καταλάσης στον Στόμαχο της Πολυφαινολικής Ομάδας 60 σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 14. Αύξηση TAC στο Ήπαρ της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 60 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 15. Αύξηση TAC στο Πάγκρεας της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 61 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 16. Αύξηση TAC στον Στόμαχο της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 61 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 17ΜείωσηTBARSστο Ήπαρ της Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση 62 με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 18. ΜείωσηTBARSστο Πάγκρεας της Πολυφαινολικής Ομάδας 62 9

σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 19. ΜείωσηΤΒΑΚΞστον Στόμαχο της Πολυφαινολικής Ομάδας 63 σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 20.Μείωση Πρτεϊνικών Καρβονυλίων στο Ήπαρ της 63 Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 21.Μείωση Πρτεϊνικών Καρβονυλίων στο Πάγκρεας της 64 Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. Πίνακας 22.Μείωση Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων στον Στόμαχο της 64 Πολυφαινολικής Ομάδας σε σχέση με την Ομάδα Ελέγχου. ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα Ι.Χημικές Δομές Διαφορετικών Πολυφαινολικών Τάξεων. 14 Εικόνα 2. Βιολογικές Ιδιότητες των φαινολικών συστατικών του ελαιολάδου 16 (Cicerale et al., 2008). Εικόνα 3.Κυριότερες Φαινολικές Ενώσεις που Συναντώνται στα Απόβλητα 17 Ελαιοτριβείων (Niaounnakis&Halvadakis, 2006) Εικόνα 4.Συνέχεια από: Κυριότερες Φαινολικές Ενώσεις που Συναντώνται στα 18 Απόβλητα Ελαιοτριβείων (Niaounnakis&Halvadakis, 2006) Εικόνα 5. Το DNA, οι Πρωτεΐνες και τα Λιπίδια, Αποτελούν τους Στόχους των 22 Ελευθέρων Ριζών. Εικόνα 6. Τρόποι Σχηματισμού των Ελευθέρων Ριζών. 22 Εικόνα 7. Κλινικές Καταστάσεις Με Τις Οποίες Έχει Βρεθεί Ότι Σχετίζονται Τα 24 ROS (Lee et al., 2003). Εικόνα 8.Αποτελεσματικότητα των Πολυφαινολικών Συστατικών του 25 Ελαιολάδου σε Βιοδείκτες της Ανθρώπινης Υγείας. (Cicerale et al., 2010). Εικόνα 9.Προτεινόμενο μοντέλογια τους μηχανισμούςδράσηςτηςτου ελαϊκού 26 οξέωςκαι άλλων ενώσεων του ελαιολάδου,με βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία. Εικόνα 10. Οι Χώροι Εγκατάστασης στις Οποίες Εκτράφηκαν οι Χοίροι που 29 Συμμετείχαν στην Παρούσα Μελέτη. Εικόνα 11.Ανάλυση Επεξεργασμένων ΥΑΕ (Συμπύκνωση με Αντλία Κενού, με 36 Ένα Πέρασμα), με την HPLC μέθοδο. Εικόνα 12.Ευγαριά Ακριβείας Και Συσκευή Αποσυμπίεσης. 37 10

Εικόνα 13. Αιμοληψία από Πρόσθια Κοίλη Φλέβα και Τοποθέτηση Αίματος σε 40 Σωληνάρια Περισυλλογής. Εικόνα 14.Διατήρηση Πλάσματος και Αιμολύματος σε Φιαλίδια Eppendorf 41 Εικόνα 15. Τα Εργαλεία που Χρησιμοποιήθηκαν για την Ομογενοποίηση Ιστών 42 Εικόνα 16.Συντακτικός τύπος της Γλουταθειόνης. 43 Εικόνα 17.Ανακύκλωση Και Αρχή Προσδιορισμού της Γλουταθειόνης. 44 Εικόνα 18.Μονοπάτι Αναγωγής του H2O2 σε H2O. 46 Εικόνα 19.Αντίδραση TBA (1) με MDA (2), που οδηγεί στην παραγωγή του 51 μορίου TBA-MDA. Εικόνα 20.Σύνδεση πρωτεΐνης με την DNPH (δίνιτριφαινυλυδραζίνη) και 53 σχηματισμός του δίνιτροφαινυλυδραζονίου ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ Διάγραμμα 1.Ημερήσια Κατανάλωση Σιτηρεσίου από την Εικοστή Μέρα της 30 Γέννησης Μέχρι την Πεντηκοστή. Διάγραμμα 2.ΑύξησηΣτα Βάρη Των Χοίρων Σε Σχέση Με Το Χρόνο. 31 Δ ιάγραμμα 3.Αντιοξειδωτική Δράση Σιτηρεσίων. 39 Δ ιάγραμμα 4. Πρότυπη Καμπύλη Αλβουμίνης. 5 5 Διάγραμμα 5.GSH στον Ηπατικό ιστό (*p < 0,05 σε σύγκριση με το Control 57 ανά ιστοληψία). Δ ιάγραμμα 6. GSH στον Παγκρεατικό Ιστό. 5 8 Δ ιάγραμμα 7. GSH στον Στομαχικό Ιστό. 5 8 Διάγραμμα 8.Καταλάση στο Ήπαρ (*p < 0,05 σε σύγκριση με το Control ανά 59 αιμοληψία). Διάγραμμα 9. Καταλάση στον Παγκρεατικό Ιστό. 59 Δ ιάγραμμα 1 Ο.Καταλάση στον Στομαχικό Ιστό. 60 Διάγραμμα 11. TAC στον Ηπατικό Ιστό (*p < 0,05 σε σύγκριση με το Control 60 ανά ιστοληψία). Δ ιάγραμμα 12.TAC στον Παγκρεατικό Ιστό των Χοίρων. 61 Διάγραμμα 13. TAC στον Στομαχικό Ιστό των Χοίρων. 61 11

Διάγραμμα 14. TBARS στο Ήπαρ των Χοίρων. 62 Δ ιάγραμμα 15. TBARS στον Παγκρεατικό Ιστό των Χοίρων. 62 Διάγραμμα 16. TBARS στον Στομαχικό Ιστό των Χοίρων. 63 Διάγραμμα 1 7.Πρωτεϊνικά Καρβονύλια στον Ηπατικό Ιστό. 63 Δ ιάγραμμα 18. Πρωτεϊνικά Καρβονύλ ια στον Παγκρεατικό Ιστό. 64 Δ ιάγραμμα 19. Πρωτεϊνικά Καρβονύλ ια στον Στομαχικό Ιστό. 64 Δ ιάγραμμα 20.Συγκεντρωτικά Αποτελέσματα Αύξησης - Μείωσης των Δεικτών του Οξειδωτικού Στρες. (Ηλικία 35 Ημερών). 65 Δ ιάγραμμα 21.Συγκεντρωτικά Αποτελέσματα Αύξησης - Μείωσης των Δεικτών του Οξειδωτικού Στρες. (Ηλικία 50 Ημερών). 65 12

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1Πολυφαινόλες Οι πολυφαινόλες είναι χημικές ενώσεις που απαντώνται στην φύση και βρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες στα φρούτα, λαχανικά, δημητριακά και τα ποτά. Τα φρούτα όπως τα σταφύλια, μήλα, αχλάδια, κεράσια και τα μούρα περιέχουν μέχρι 200-300 mg πολυφαινολών ανά 100 γραμμάρια νωπού βάρους. Τα προϊόντα που κατασκευάζονται από αυτά τα φρούτα, περιέχουν επίσης πολυφαινόλες σε σημαντικές ποσότητες. Στα τρόφιμα, οι πολυφαινόλες μπορούν να συμβάλλουν στην πικρή γεύση, στυφότητα, στο χρώμα, στη γεύση, στην οσμή και στην οξειδωτική σταθερότητα. Προς το τέλος του 20ου αιώνα, διάφορες επιδημιολογικές μελέτες και αναλύσεις προτείνουν ότι η μακροχρόνια λήψη φυτικών πολυφαινολών μέσω της διατροφής, προσφέρει κάποια προστασία ενάντια στην ανάπτυξη του καρκίνου, των καρδιαγγειακών παθήσεων, του διαβήτη, της οστεοπόρωσης και των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Πολυφαινόλες και άλλα φαινολικά συστατικά των τροφίμων αποτελούν αντικείμενο αυξημένου επιστημονικού ενδιαφέροντος, λόγω των πιθανών ευεργετικών επιδράσεών τους στην ανθρώπινη υγεία. 1.1.1Δομή και Τάξεις των Πολυφαινολών Περισσότερες από 8.000 πολυφαινολικές ενώσεις έχουν εντοπιστεί σε διάφορα φυτικά είδη. Όλες οι φυτικές φαινολικές ενώσεις προκύπτουν από ένα κοινό ενδιάμεσο, την φαινυλαλανίνη, ή μια προδρόμη ένωση, το σικιμικό οξύ. Κυρίως απαντώνται σε συζευγμένες μορφές, με ένα ή περισσότερα υπολείμματα σακχάρων που συνδέονται με υδροξυλομάδες, αν και υπάρχουν επίσης άμεσες συζευξεις του σακχάρου (πολυσακχαρίτη ή μονοσακχαρίτη) με έναν αρωματικό άνθρακα. Συσχέτιση με άλλες ενώσεις, όπως καρβοξυλικά και οργανικά οξέα, αμίνες, λιπίδια και συνδεση με άλλες φαινόλες είναι επίσης κοινή.οι πολυφαινόλες μπορούν να ταξινομηθούν σε διαφορετικές ομάδες σύμφωνα με τον αριθμό των δακτυλίων φαινόλης που περιέχουν και βάσει των δομικών στοιχείων τα οποία δεσμεύουν τους δακτυλίους μεταξύ τους. Οι κύριες κατηγορίες πολυφαινολών περιλαμβάνουν φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή, στιλβένια και λιγνάνες. Η διαφορετικότητα τους έγκειται στο υδροξυλικό τους πρότυπο και μπορεί να είναι γλυκοσυλιωμένες ή/και ακετυλιωμένες. Το μέγεθος τους ποικίλει από μικρά μόρια (όπως η 13

φαινόλη), έως πολυμερή (όπως οι ταννίνες) μεγάλου μοριακού βάρους (Perez-Jimenez et al., 2010). o h H O Phenolic acids (hvdroxy-benzioc & cinnamic acids) Flavonoids C H jo. C'H io H HO C H io H O C H 3 Stilbenes Lisnans Εικόνα Ι.Χημικές Δομές Διαφορετικών Πολυφαινολικών Τάξεων. 1.1.2 Φυσικές Ιδιότητες. Οι πολυφαινόλες είναι συνήθως μόρια μικρού μοριακού βάρους και βρίσκονται σε υγρή μορφή ή σε στερεή με χαμηλό σημείο τήξεως. Λόγω των δεσμών υδρογόνου, οι φαινόλες μικρού μοριακού βάρους, είναι υδατοδιαλυτές. Τείνουν να έχουν υψηλότερα σημεία βρασμού από τις αλκοόλες ιδίου μοριακού βάρους, λόγω του ισχυρότερου δεσμού υδρογόνου που έχουν. 1.1.3 Χημειοπροστατευτική Δράση Πολυφαινολών. Από την αρχαιότητα ακόμη, σε πολιτισμούς όπως ο Ελληνικός, ο Αιγυπτιακός, ο Ρωμαϊκός, ο Κινέζικος και ο Ινδικός, ήταν γνωστές οι δράσεις κάποιων φυτών για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών (Klein et. al., 2011; Chang et. al.; 2012, Wells et. al., 2008). Εκατοντάδες χρόνια μετά, πληθώρα ερευνών αποδεικνύει μέρα με τη μέρα πως βιοδραστικά συστατικά των τροφών μπορούν να επηρεάσουν όλες τις καρκινικές διαδικασίες σε όλα τα στάδια του καρκίνου (Kushi et. al., 2011; Lee et al., 2005; Kloetzel 14

et al. 2013; Bidinotto et al., 2012; Chang et al., 2012; Arcidiacono et al., 2012; Pauwels, 2010; LaVecchia, 2004; LaVecchia, 2009). Η χημειοπροστασία ως όρος χρησιμοποιήθηκε πριν 35 χρόνια από τον LeeWattenberg (20) και είναι η χρήση φυσικών ή συνθετικών ουσιών για την πρόληψη ασθενειών και μολύνσεων (Kushi et al., 2011; Kiani et al., 2005; Lee et al., 2005; Klein et al., 2011; Baliga et al., 2011; Brownell & Warner, 2009; Wang et al., 2012). Η χημειοπροστατευτική δράση των φυτικών τροφών οφείλεται στα φυτοχημικά τους συστατικά, τα οποία είναι μη θρεπτικά συστατικά που έχουν σημαντική βιολογική δράση, όπως η ρύθμιση της κυτταρικής σηματοδότησης, η ενίσχυση του ανοσοποιητικού, η γονιδική ρύθμιση, η κυτταρική διαφοροποίηση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η απόπτωση (Karpi et al., 2012) και δρουν ως αντιοξειδωτικά, ενώ θεωρούνται φυτοοιστρογόνα, γιατί έχουν παρόμοια δράση με τις ορμόνες. Παίζουν ρόλο στον καθορισμό της γεύσης, του αρώματος, των χρωμάτων και άλλων χαρακτηριστικών των φυτικών τροφών. Τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερες μελέτες αποδεικνύουν πως μόνο ένα συστατικό της τροφής δε φτάνει για να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου, αλλά είναι ο συνδυασμός των συστατικών που βρίσκονται σε όλη την υγιεινή διατροφή που εμφανίζουν αυτή την ικανότητα (Banerjee et al., 2006, Baliga et al., 2011; Alexander & Cushing, 2009;Kumar et al., 2012; Cristensen et al., 2012; Kontou et al., 2012; Giacosa et al., 2012). 15

M icrobial activity X Microbial ictivity PlaslllU lipoproteins X LDL-C re K. T HDL-C M arkers of platelet function 1 Platelet activity I Platelet aggregation X Endothelial adhesion molecule expression Markers of cellular function X Deregulated cell Olive Oil Pbenolics i = > Markers ol inflammation proliferation Χ Τ Χ Β, X Suppressed death M arkers of oxidation X LDL oxidation X DNA oxidation X Fs- isoprostanes X GSSG TC.SII T GSH-Px X ROS T Plasma antioxidant capacity I Arachidomc acid release X C O X -1 & COX activtty Εικόνα 2. Βιολογικές Ιδιότητες των φαινολικών συστατικών του ελαιόλαδου (Cicerale et al., 2008). Οι φυτικές πολυφαινόλες, ποικίλουν τόσο ανάλογα με το είδος του φυτού, όσο και στα διάφορα μέρη του. Τα ΥΑΕ περιέχουν πολυφαινόλες, των οποίων οι κυριότερες παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα. 16

Κατηγορία Πολυφαινόλες Χημικοί Τύποι Υδροξυτυροσόλη Ο Η / -------\ / /------COOH Υ.Α.Ε. Καφεϊκό Οξύ n2 Υδροξυφαινολικό Οξύ λ------;\ Η Ο ^ ^ --------/ cooh R Πίνακας 1. Κυριότερες Πολυφαινόλες στα ΥΑΕ. Εικόνα 3. Κυριότερες Φαινολικές Ενώσεις που Συναντώνται στα Απόβλητα Ελαιοτριβείων (Niaounnakis&Halvadakis, 2006) [συνέχεια στην επόμενη σελίδα). 17

Εικόνα 4. Συνέχεια από: Κυριότερες Φαινολικές Ενώσεις που Συναντώνται στα Απόβλητα Ελαιοτριβείων (Niaounnakis&Halvadakis, 2006). 1.2 Οξειδωτικό Στρες. 1.2.1 Ιστορική Αναδρομή. Το 1775 ο Priestley ανέφερε ότι «η συνεχής έκθεση στο οξυγόνομπορεί να σβήσει το κερί της ζωής πολύ γρήγορα.». Η προφητική αυτή παρατήρηση από τον άνθρωπο που ανακάλυψε το οξυγόνο, έδωσε το έναυσμα για τη λύση ενός από τα σημαντικότερα προβλήματα της σύγχρονης επιστήμης: του «παράδοξου του οξυγόνου». Το Ο2 είναι πολύ σημαντικό στοιχείο για τη διατήρηση της ζωής, αλλά κάτω από κάποιες περιπτώσεις μπορεί να γίνει τοξικό, καθώς η έκθεση του οργανισμού σε αυξημένες συγκεντρώσεις οξυγόνου προκαλεί ανεπιθύμητες αντιδράσεις για την υγεία. Τα τελευταία χρόνια ο ρόλος των ελευθέρων ριζών οξυγόνου στην παθογένεση πολλών ασθενειών κίνησε το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας, με αποτέλεσμα μέρα με τη μέρα οι ερευνητές να έρχονται όλο και πιο κοντά στην κατανόηση των επιβλαβών δράσεων τους, αλλά και στην επίλυση αυτών με τη μελέτη των 18

αντιοξειδωτικών συστατικών του οργανισμού και των τροφίμων, τα οποία παρουσιάζουν σημαντική προστατευτική δράση. 1.2.2 Ελεύθερες Ρίζες και Δραστικά Είδη Ο2. Τα μόρια αποτελούνται από έναν ή περισσότερους ατομικούς πυρήνες, οι οποίοι περιβάλλονται από ηλεκτρόνια, τα οποία περιφέρονται γύρω από τον πυρήνα. Τα ηλεκτρόνια είναι διευθετημένα σε έναν αριθμό τροχιακών, τα οποία βρίσκονται σε διαφορετικές αποστάσεις από τον πυρήνα. Στα περισσότερα μόρια, τα ηλεκτρόνια που βρίσκονται σε κάθε τροχιακό, ζευγαρώνουν με ένα άλλο ηλεκτρόνιο. Τα δύο ηλεκτρόνια κάθε ζεύγους περιστρέφονται γύρω από τον εαυτό τους (spin) σε αντίθετες κατευθύνσεις. Τα ζευγαρωμένα ηλεκτρόνια διατηρούν το μόριο σχετικά σταθερό εμφανίζοντας μικρότερη ενεργειακή κατάσταση, με αποτέλεσμα να είναι λιγότερο δραστικό. Όταν ένα ή περισσότερα ηλεκτρόνια, ιδιαίτερα αυτά που βρίσκονται στα εξωτερικά τροχιακά του ατόμου, είναι ασύζευκτα, δεν έχουν δηλαδή ζευγάρι, τότε το μόριο γίνεται ασταθές, εμφανίζοντας μεγαλύτερη ενεργειακή κατάσταση, με αποτέλεσμα να είναιπιο δραστικό από άλλα μόρια. Άτομα ή μόρια με ασύζευκτα ηλεκτρόνια ονομάζονται παραμαγνητικά, ενώ όταν δεν διαθέτουν τέτοια ηλεκτρόνια, διαμαγνητικά. Ένα ασύζευκτο ηλεκτρόνιο έχει τεράστια έλξη στα ηλεκτρόνια γειτονικών ατόμων με αποτέλεσμα την πρόκληση χημικών αντιδράσεων μεταξύ ατόμων ή μορίων, κατά τις οποίες έχουμε μεταφορά ηλεκτρονίων. Τέτοιες αντιδράσεις ονομάζονται οξειδοαναγωγικές (redox), εκ των οποίων κατά την οξείδωση έχουμε απώλεια ηλεκτρονίων, ενώ κατά την αναγωγή έχουμε απόκτηση ηλεκτρονίων από ένα άτομο. Ένα άτομο ή μόριο με ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια και ανεξάρτητη παρουσία λέγεται ελεύθερη ρίζα και συμμετέχει πολύ εύκολα σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής με γειτονικά μόρια (Gilbert, 2000, Halliwell & Gutteridge, 1990). Κατά τις αντιδράσεις αυτές όχι μόνο μεταβάλλονται σημαντικά τα γειτονικά μόρια στόχοι, αλλά μερικές φορές μεταβιβάζονται τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια από στόχο σε στόχο, δημιουργώντας έτσι μία δεύτερη, τρίτη κ.ο.κ. ελεύθερη ρίζα υπό μορφή αλυσιδωτής αντίδρασης. (Halliwell & Gutteridge, 1990). Η πολύ μεγάλη βλαπτική επίδραση των ελευθέρων ριζών οφείλεται ακριβώς στον πολλαπλασιασμό των μεταβολών που προκαλούνται από παρόμοιες αλυσιδωτές αντιδράσεις. 19

Οι πλέον σημαντικές ελεύθερες ρίζες είναι μοριακά είδη με κέντρο το οξυγόνο και μερικές φορές το άζωτο (Sengupta et al., 2004; Pani & Galeotti, 2010; AICR, 2007), το θείο (Battin et al., 2009; Pani & Galeotti, 2010) ή τον άνθρακα. Το ίδιο το οξυγόνο που αναπνέουμε αποτελεί μία ελεύθερη ρίζα, αφού περιέχει δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια, που βρίσκονται σε δύο διαφορετικά τροχιακά. Η μορφή όμως αυτή του Ο2, που λέγεται οξυγόνο τριπλής κατάστασης (tripletstate) και συμβολίζεται με 3Ο2, δεν είναι ιδιαίτερα δραστική. Όμως, είναι δυνατή η ενεργοποίηση του μοριακού οξυγόνου, με αποτέλεσμα τα δύο ηλεκτρόνια να βρεθούν στο ίδιο τροχιακό. Η πολύ δραστική αυτή μορφή οξυγόνου ονομάζεται οξυγόνο μονής κατάστασης (singletstate) και συμβολίζεται με *Ο2. Αν και το οξυγόνο μονής κατάστασης δεν αποτελεί ελεύθερη ρίζα, τα ηλεκτρόνια του βρίσκονται σε διεγερμένη κατάσταση, δηλαδή είναι πολύ δραστικά και ως εκ τούτου μπορεί να προκαλέσουν βλαπτικές αντιδράσεις παρόμοιες με αυτές των ελευθέρων ριζών οξυγόνου. Παρόμοιο μόριο το οποίο δεν είναι ελεύθερη ρίζα αλλά περιέχει δραστικό οξυγόνο αποτελεί και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Halliwell 2001). Συνολικά, όλα τα μοριακά είδη που περιλαμβάνουν οξυγόνο, είτε είναι ελεύθερες ρίζες είτε όχι, ονομάζονται δραστικά είδη οξυγόνου (ΔΕΟ) (Cheeseman et al, 1993; Gutteridge, 1995). Τα κυριότερα ΔΕΟ (Aqil et al., 2012; Vainio et al., 1999; Weisburger, 2001; AICR, 2007) είναι: η ρίζα σουπεροξειδίου (O2^-), η ρίζα υδροξυλίου (-OH^), η ρίζα υπεροξειδίου (-ROO^), το Ο2 απλής κατάστασης, το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και το υποχλωριώδες οξύ (HOCl). 1.2.3 Πως Δημιουργούνται οι Ελεύθερες Ρίζες στον Οργανισμό μας. Οι ελεύθερες ρίζες δημιουργούνται στον οργανισμό μας, είτε από φυσιολογικές διαδικασίες του είτε από εξωτερικές πηγές. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που σχηματίζονται φυσιολογικά μέσω οξειδωτικού μεταβολισμού, έχουν σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση του κυττάρου και την προστασία του οργανισμού σε μολύνσεις (Pal et al., 2010; Kiani et al., 2005; Ibiebele et al., 2013; Shim et al., 2012; Niclis et al., 2011; Lin & Cai, 2012; Cicerale et al., 2008; Vainio et al., 1999; Wells et al., 2008). Όπως συμβαίνει σε καταστάσεις stress, οι ελεύθερες ρίζες αυξάνονται, προκαλώντας εκτεταμένες βλάβες στο γενετικό υλικό, σε πρωτεΐνες και σε λιπίδια (Lee et al., 2005; Cicerale et al., 2008; Battin et al., 2009; Pani & Galeotti, 2010; Vainio et al., 1999; Khalluki et al., 2003). Αν 20

αυτές οι βλάβες δε διορθωθούν από τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς που έχει το κύτταρο, προκαλούν σοβαρές επιπτώσεις στο κύτταρο (Kushi et al., 2011; Kiani et al., 2005; Klein et al., 2011; Takata et al., 2013; Kumar et al., 2012; ) Οι κυριότεροι φυσιολογικοί μηχανισμοί παραγωγής ελευθέρων ριζών περιλαμβάνουν: (α) Την παραγωγή ελευθέρων ριζών σουπεροξειδίου, ως παραπροϊόν ή «χημικό ατύχημα» κατά τη λειτουργία της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων των κυττάρων. Κατά τη διαδικασία αυτή ορισμένα ηλεκτρόνια ξεφεύγουν από τα μόρια που μεταφέρουν τα ηλεκτρόνια στην αναπνευστική αλυσίδα και περνούν στο οξυγόνο, ανάγοντάς το σε σουπεροξείδιο (Battin et al., 2009; Pani & Galeotti, 2010; Fujisawa et al., 2004; Weisburger, 2001; AICR, 2007). (β) Τη φυσιολογική δράση οξειδωτικών ενζύμων όπως, οι λιποξυγονάσες, οι κυκλοοξυγονάσες, οι υπεροξειδάσες και οι αφυδρογονάσες όπου παράγονται ελεύθερες ρίζες ως παραπροϊόντα των ενζυμικών αντιδράσεων (Kiani et al., 2005; Klein et al., 2011, Kumar et al., 2012; Li & Tollefsbol, 2010; Pani & Galeotti, 2010). (γ) Την παραγωγή των ιδιαίτερων δραστικών ελευθέρων ριζών υδροξυλίου με χημικές αντιδράσεις παρουσία μεταλλικών ιόντων (Pani & Galeotti, 2010; Battin et al., 2009; Cooke et al., 2013; AICR, 2007). (δ) Την παραγωγή ελευθέρων ριζών ως μέρος της λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος. Ορισμένα από τα κύτταρα του συστήματος αυτού παράγουν ελεύθερες ρίζες για να εξουδετερώσουν βακτήρια εισβολείς. Σε περιπτώσεις που η διαδικασία αυτή είναι εκτός ελέγχου, όπως συμβαίνει με τις αυτοάνοσες ασθένειες, μερικές ελεύθερες ρίζες που παράγονται προκαλούν βλάβες στα ίδια μας τα κύτταρα (Pani & Galeotti, 2010; Cooke et al., 2013; Fujisawa et al., 2004;Vainio et al., 1999). 21

Εικόνα 5. Το DNA, οι Πρωτεΐνες και τα Λιπίδια, Αποτελούν τους Στόχους των Ελευθέρων Ριζών. Μια άλλη σημαντική πηγή παραγωγής ελευθέρων ριζών αποτελούν πολλοί εξωτερικοί παράγοντες, όπως ο καπνός του τσιγάρου, οι ακτίνες-χ, η υπεριώδης ακτινοβολία, διάφορες χημικές ενώσεις και φάρμακα καθώς επίσης το νέφος της ατμοσφαιρικής ρύπανσης (όζον, νιτροξείδια) (Battin et al., 2009). Εικόνα 6. Τρόποι Σχηματισμού των Ελευθέρων Ριζών. 22

1.2.4 Πως Εξουδετερώνονται τα Δραστικά Είδη Οξυγόνου (ΔΕΟ), στον Οργανισμό μας. Σε κάθε βιολογικό σύστημα, πρέπει να διατηρείται η ισορροπία μεταξύ του σχηματισμού και της απομάκρυνσης των ΔΕΟ. Η αύξηση των οξειδώσεων από τα ΔΕΟ οδηγεί τα κύτταρα σε μία κατάσταση που λέγεται οξειδωτικό στρες και είναι παράγοντας πρόκλησης ασθενειών (Cicerale et al., 2008; AICR, 2007). Λόγω της συνεχούς έκθεσης σε ΔΕΟ και για την πρόληψη του οξειδωτικού στρες, ο οργανισμός μας, όπως όλα τα φυτά και τα ζώα, έχει αναπτύξει για προστασία διάφορους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς στους οποίους παίρνουν μέρος αντιοξειδωτικές ουσίες. Γενικά χαρακτηρίζουμε ως αντιοξειδωτική ουσία κάθε ουσία η οποία βρίσκεται σε μικρές συγκεντρώσεις σε σύγκριση με το υπόστρωμα που οξειδώνεται και η οποία καθυστερεί σημαντικά ή αποτρέπει την οξείδωση του υποστρώματος αυτού. (Vaya J. and Aviram M., 2001). Επιπλέον, για να είναι μια ουσία αντιοξειδωτικό πρέπει να προσφέρει ανοχή έναντι του οξειδωτικού στρες, μειώνοντας τις ελεύθερες ρίζες, αναστέλλοντας την υπεροξείδωση των λιπιδίων κι άλλων μηχανισμών, προλαμβάνοντας την εμφάνιση ασθενειών (Kushi et al., 2011; Ibiebele et al., 2013; Klein et al., 2011; Baliga et al., 2011; Chen & Ross, 2012; Giaginis & Theocharis, 2011; Lin & Cai, 2012; Bozkurt et al., 2012; Ouyang et al., 2012; AICR, 2007). Τα αντιοξειδωτικά γενικά λειτουργούν με δύο τρόπους (Baliga et al., 2011; Long et al., 2013; Hamizah et al., 2012): παρεμποδίζουν τη δημιουργία ΔΕΟ, σταματούν τη διάδοση των ελεύθερων ριζών που προκαλείται από τις αλυσιδωτές αντιδράσεις. Επίσης είναι δυνατόν, η παρουσία κάποιου αντιοξειδωτικού (για παράδειγμα της βιταμίνης C), να συμβάλλει στη διατήρηση της αντιοξειδωτικής δράσης κάποιου άλλου αντιοξειδωτικού, όπως της τοκοφερόλης. Στην περίπτωση αυτή, έχουμε συνεργατική δράση των δύο αντιοξειδωτικών και λέμε ότι η βιταμίνη C έχει συν-αντιοξειδωτική δράση (AICR, 2007; Khalluki et al., 2003). Ο όρος οξειδωτικό στρες περιγράφει την κατάσταση ανισορροπίας, ανάμεσα στις συγκεντρώσεις των δραστικών μορφών οξυγόνου ReactiveOxygenSpecies - (ROS) και των αντιοξειδωτικών αμυντικών μηχανισμών ενός οργανισμού (Halliwel & Gutteridge, 1990; Dotan, et.al., 2004; AICR, 2007). 23

Το οξειδωτικό στρες προκαλείται συνήθως από: Μειωμένη δράση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Αυτό μπορεί να συμβεί είτε εξαιτίας μεταλλάξεων ή τοξικών παραγόντων που επηρεάζουν τη δραστικότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων είτε από τη μείωση των διατροφικών αντιοξειδωτικών ουσιών. Αυξημένη παραγωγή ελευθέρων ριζών (ROS). Αυτό συμβαίνει είτε λόγω της έκθεσης των κυττάρων σε υψηλά επίπεδα ROS, λόγω της ύπαρξης παραγόντων που οδηγούν στην αυξημένη παραγωγή σε ROS. 1.2.5. Επίδραση των Ελευθέρων Ριζών στην Υγεία. Έχει γίνει πλέον επιστημονικά αποδεκτό ότι η παραβίαση της απαραίτητης οξειδοαναγωγικής ισορροπίας των κυττάρων μας προς την κατάσταση του οξειδωτικού στρες, έχει ως αποτέλεσμα την εκδήλωση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων, ενώ επιπλέον, συμμετέχει και στη διαδικασία της γήρανσης (Aqil et al., 2012). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το οξειδωτικό στρες οδηγεί σε οξείδωση των βασικών βιοχημικών συστατικών του κυττάρου, όπως τα λιπίδια, οι πρωτεΐνες και το DNA με αποτέλεσμα τη μεταβολή των δομικών και λειτουργικών τους ιδιοτήτων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί σε, οι ελεύθερες ρίζες ευθύνονται για την πρόκληση και εμφάνιση πολλών ασθενειών, με το κατάλογο αυτών συνεχώς να αυξάνεται (Haliwell, 2001). G a s tro in testing Eye Skin H e a rt ] k'palius * Catariictogenesis - Dermalitis Heart attack * L it v-r in j -1 Retinal damage * Age pigment T e e th t 1 Joints Penodontis * R e a c tiv e O x y g e n S p e c ie s * * Anhrilis / l 1 \ Vessels M u ltio rg a n fa ilu re Bruin L u n g Atlierosclerosis Cancer * Trauma Aslhrma \ iisospasms * S tro ke Hypero\ia Εικόνα 7. Κλινικές Καταστάσεις Με Τις Οποίες Έχει Βρεθεί Ότι Σχετίζονται Τα ROS (Lee et al., 2003). 24

1.3 Προστατευτικός Ρόλος των Πολυφαινολών από Υγρά Απόβλητα Ελαιοτριβείου (Υ.Α.Ε) Πλήθος ερευνών - μελετών, υποστηρίζουν την άποψη πως οι πολυφαινόλες που βρίσκονται στο ελαιόλαδο και κατά συνέπεια στα απόβλητά του, είναι ικανές να δρουν ως φυτοχημικά αντιοξειδωτικά. PLASMA LIPOPROTEINS Bone formation MARKERS OF PLATELET FUNCTION Platelet activity Platelet aggregation Endothelial adhesion molecule expression PAM FV1I TXBj ltb; Arachidonic acid release COX-I & COX-2 activity OLIVE OIL PHENOLIC COMPOUNDS MICROBIAL ACTIVITY Microbial activity MARKERS OF CELLULAR FUNCTION Deregulated cell proliferation Suppressed cell death MARKERS OF OXIDATION LDL oxidation DNA oxidation Fj- isoprostanes GSSG ROS GSH GSH-Px Plasma antioxidant capacity Εικόνα 8. Αποτελεσματικότητα των Πολυφαινολικών Συστατικών του Ελαιολάδου σε Βιοδείκτες της Ανθρώπινης Υγείας. (Cicerale et.al., 2010). Παρακάτω, οι μελέτες παρουσιάζονται ανάλογα με την συγκεκριμένη - στοχευμένη βιοδραστικότητα. 1.3.1Καρδιαγγειακό. 1) Τα αποτελέσματα μιας μελέτης της επίδρασης των πολυφαινολών του ελαιολάδου, στα αντισώματα, κατά της οξειδωμένης LDL - LowDensityLipoprotein, έδειξαν ότι οι 25

πολυφαινόλες του ελαιολάδου, προωθούν την δημιουργία OLAB (OxLDL autoantibodies - Αυτοαντισώματα της οξειδωμένης LDL). Καλύτερα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν, σε υψηλές συγκεντρώσεις της οξειδωμένης LDL.(OlgaCastaner, et. al., 2011). 2) Καρδιοπροστατευτικός και νευροπροστατευτικός ρόλος της ελευρωπαΐνης στο ελαιόλαδο. (SyedHarisOmar. 2010). Εικόνα 9. Προτεινόμενο μοντέλογια τους μηχανισμούςδράσηςτηςτου ελαϊκού οξέωςκαι άλλων ενώσεων του ελαιολάδου,με βάση την υπάρχουσα βιβλιογραφία. Η μελέτη υποστηρίζει πως το ελαϊκό οξύ, η ελευρωπαΐνη και η β- σιτοστερόλη (φυτική στερόλη), ενδέχεται ενδοκυτταρικά, να μειώνουν τις ελεύθερες ρίζες του οξυγόνου. Η απομάκρυνση των ελευθέρων ριζών του οξυγόνου και των νιτρικών μονοξειδίων NO~, καθώς επίσης και η μείωσητου σχηματισμούτων νιτρικών ιόντωνοονο~, είναι οι λόγοι που οι συγκεκριμένες πολυφαινόλες του ελαιόλαδου έχουν καρδιοπροστατευτικό και νευροπροστατευτικό ρόλο. 3) Τα φαινολικά συστατικά του ελαιολάδου καταστέλλουν την προσκόλληση της ομοκυστεΐνης στα ενδοθηλιακά κύτταρα, ανεξάρτητα από την διαφορετική τους αντιοξειδωτική δράση (Manna, et.al. 2009). 4) Επιδράσεις της 3,4-DHPEA-EDA (3-Υδροξυτυροσόλη) του ελαιολάδου, στην οξειδωτική βλάβη των ερυθροκυττάρων (Paiva-Martins et.al, 2009). 5) Η προστατευτική δράση του ελαιολάδου και των φαινολικών του συστατικών, κατά της οξείδωσης της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (Fito et.al. 2000). 26

6) Αντιθρομβωτικές δυνατότητες του ελαιολάδου σε κουνέλια με υψηλά επίπεδα χοληστερόλης. (DeLaCruz, et.al. 2000). 7) Αναστολήτωνλευκοκυττάρων5-λιποξυγενάσης από τις φαινόλες υδροξυτυροσόλη, καφεϊκό οξύ, ελευρωπαΐνη και τυροσόλη του ελαιόλαδου (delapuerta, et.al. 1999). 8) Αναστολή της δραστηριότητας της αραχιδονικής λιποξυγενάσης, από την υδροξυτυροσόλη, ένα φαινολικό συστατικό του ελαιολάδου. (Kohyama, et.al, 1997). 1.3.2. Αντιμικροβιακή και Αντι-ιϊκή Δραστηριότητα. 1) Μελέτες έχουν δείξει ότι οι φαινολικές ενώσεις του ελαιολάδου (ελευρωπαΐνη, τυροσόλη και η διαλδεϊκή μορφή του δεκαρβοξυμέθυλου ελανολικού οξέως), έχουνμια ισχυρήβακτηριοκτόνο δράσηακόμη μεγαλύτερη από εκείνητων άλλωνφαινολικών ενώσεων των τροφίμωνή των συνθετικών βιοκτόνων.(medina, et.al. 2009). 2) Ο αντι-ιϊκός μηχανισμός της υδροξυτυροσόλης, στον ιο της γρίπης, φαίνεται να εμπλέκεται στην μορφολογική αλλαγή του ιού. (Yamada, et.al. 2009). 3) Αντιβακτηριακές πολυφαινόλες από τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου (Capasso, et.al. 1995). Η μελέτη έγινε σε φυτοπαθογόνα Gram-αρνητικά (Pseudomonassyringae,Pseudomonassavastanoi) και Gram-θετικά (C orynebacteriummi chiganense) β ακτή ρια. 1.3.3. Καρκίνος. Σε μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των πολυφαινολών ελευρωπαΐνης και υδροξυτυροσόλης από το ελαιόλαδο παρατηρήθηκε ότι μείωσαν την εκφύλιση των ενδοθηλιακών κυττάρων (ποροειδείς αυλοί). (Scoditti, 2012). Πολλές ακόμα invitro μελέτες έχουν δείξει ότι οι πολυφαινόλες διαθέτουν αντιοξειδωτική δράση. Επίσης, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα διαιτητικά φλαβονοειδή μπορούν να προστατεύουν το DNA από βλάβες που μπορεί να προκληθούν από ελεύθερες ρίζες μέσω ενός μηχανισμού διαφορετικού από την άμεση εξουδετέρωση ελεύθερων ριζών. Αποτελέσματα από μελέτες έχουν δείξει ότι τα φλαβονοειδή μπορούν να μειώσουν τη συχνότητα εμφάνισης μονού σπασίματος στη διπλή έλικα του DNA, καθώς και την πρόκληση μόνιμης βλάβης μέσω ταχέων χημικών επισκευών. Η ερευνητική ομάδα του εργαστηρίου Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών, στο οποίο εκπονήθηκε η παρούσα εργασία, έχει εξετάσει πλήθος φυτικών εκχυλισμάτων, σχετικά με την πιθανή αντιοξειδωτική και αντιμεταλλαξιγόνο δράση τους, που οφείλονταν κυρίως στις φυτικές πολυφαινόλες που περιείχαν (Stagos et. al., 2012). Τα περισσότερα 27

εκχυλίσματα επέδειξαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση καθώς και εξαιρετική προστατευτική δράση έναντι της επαγόμενης από τις ελεύθερες ρίζες, βλάβη του DNA. (Stagos et al., 2007, Spanou et al. 2007), με αποτέλεσμα αυτά τα εκχυλίσματα να αποτελέσουν σημαντική πηγή χημειοπροστατευτικών παραγόντων. Τέλος, επηρέαζαν τη δραστικότητα ενζύμων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες. (Spanou et al., 2012; Spanou et al., 2008). 28

2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Γενικά. Στο εργαστήριο Μηχανικής Τροφίμων - Βιοσυστημάτων και στο χοιροστάσιο του ΤΕΙ / Θεσσαλίας: Εκτροφή χοιριδίων (Εφαρμογή σιτηρεσίου και συνθηκών ομαλής διαβίωσης - ανάπτυξης). Στις 2 Απριλίου 2014 γεννήθηκαν είκοσι (20) χοίροι από δύο (2) χοιρομητέρες (10 από την κάθε χοιρομητέρα). Το γενετικό υπόβαθρο των χοιρομητέρων προήλθε από τη διασταύρωση Landrace (μητέρα) X LargeWhite - Duroc - Pietrain (πατέρας). ΘΑΛΑΜΟΣ Ξ Η Ρ Α Σ Π Ε Ρ ΙΟ Δ Ο Υ Τ Ο Κ Ε Τ Ο Υ -Ο Χ Ε Ι Α Σ Α Π Ο Γ Α Λ Α Κ Τ ΙΣ Μ Ο Υ Εικόνα 10. Οι Χώροι Εγκατάστασης στις Οποίες Εκτράφηκαν οι Χοίροι που Συμμετείχαν στην Παρούσα Μελέτη. Τόσο οι συνθήκες διαβίωσης τους όσο ο τρόπος θανάτωσης τους για τη λήψη αίματος και ιστών έγιναν σύμφωνα με τις Οδηγίες 2010/63/ΕΕ του Ε. Κ. και του Συμβουλίου της 22/10/2010 περί προστασίας των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς. Παρακολούθηση ανάπτυξης χοίρων (Ημερήσια αύξηση ζωικού βάρους, ημερήσια κατανάλωση τροφής). Είκοσι (20) ημέρες από την γέννησή τους, ξεκίνησε ο απογαλακτισμός τους και τα δέκαέξι (16) εναπομείναντα χοιρίδια, χωρίστηκαν σε δύο (2) ομάδες, εκ των οποίων οκτώ (8) αποτέλεσαν την ομάδα Α (ελέγχου) και τα άλλα οκτώ (8) την ομάδα Β, όπου στο σιτηρέσιό της υπήρχαν πολυφαινολικά πρόσθετα. Κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας του απογαλακτισμού, τα χοιρίδια απομακρύνονταν καθημερινά, από τις χοιρομητέρες τους σε διαφορετικά κελιά για 29

χρονικό διάστημα οκτώ (8) ωρών, ενώ κατά τη δεύτερη βδομάδα του απογαλακτισμού η καθημερινή απομάκρυνση από τις χοιρομητέρες αυξήθηκε σε δέκα (10) ώρες. Η απομάκρυνση των χοιρομητέρων έγινε 35 μέρες μετά την γέννηση τους. Συγχρόνως, όλες αυτές τις μέρες γινόταν συνεχής παρακολούθηση της ημερήσιας κατανάλωσης στα σιτηρέσια απογαλακτισμού, όπως φαίνεται στο διάγραμμα 1. Διάγραμμα 1. Ημερήσια Κατανάλωση Σιτηρεσίου από την Εικοστή Μέρα της Γέννησης Μέχρι την Πεντηκοστή. Όπως βλέπουμε χαρακτηριστικά στο διάγραμμα 1, μετά την απομάκρυνση των χοιρομητέρων, η κατανάλωση και των δύο σιτηρεσίωνυπερδιπλασιάστηκε. Εκτός από την ημερήσια μέτρηση της κατανάλωσης σιτηρεσίου, γινόταν και μετρήσεις στα βάρη των χοίρων. Στο διάγραμμα 2 που ακολουθεί φαίνεται η αύξηση στα βάρη των χοίρων με το πέρας των ημερών και μέχρι το τέλος του πειράματος. 30

Ημέρες μετά την γέννηση Μέσος Όρος Contol Polyph. 2 1,207 20 5,131 5,131 5,131 26 5,859 5,720 5,999 30 6,600 6,450 6,850 35 8,537 8,434 8,640 50 13,395 12,540 14,250 Πίνακας 2.Μέσος Όρος Μέτρησης Βάρους των Χοιριδίων. Διάγραμμα 2. ΑύξησηΣτα Βάρη Των Χοίρων Σε Σχέση Με Το Χρόνο. Από το παραπάνω διάγραμμα παρατηρείται ότι κατά μέσο όρο το βάρος των γουρουνιών που ανήκαν στην πολυφαινολική ομάδα παρουσιάζεται κατά 1,7 χιλιόγραμμα αυξημένο από αυτό της ομάδας ελέγχου, στις 50 ημέρες μετά την γέννησή τους, παρότι κατανάλωσαν κατά μέσο όρο 380 γραμμάρια σιτηρεσίου λιγότερο από αυτό της ομάδας ελέγχου. Εκτέλεση τεσσάρων (4) ιστοληψιών (σε2, 20, 35 και 50 ημέρες μετά την γέννησή τους) 9 διαφορετικών ιστώνστο Μικροσφαγείο που υπάρχει στο αγρόκτημα του ΤΕΙ/Θεσσαλίας. Στην παρούσα εργασία θα παρουσιαστούν τα αποτελέσματα που 31

πάρθηκαν από τον παγκρεατικό,ηπατικό και στομαχικό ιστό. Τα αποτελέσματα των υπόλοιπων ιστών θα παρουσιαστούν σε επόμενες εργασίες. Η πρώτη ιστοληψία εκτελέστηκε σε δύο (2) χοιρίδια ηλικίας δύο (2) ημερών και βάρους 0,950 και 1,560 kg. Χρησιμοποιήθηκε το αναισθητικό φάρμακο Xylopan (VetoquinolS.A., France) για να διασφαλιστεί ότι προκαλείται ο ελάχιστος δυνατός αναπόφευκτος πόνος, ταλαιπωρία ή αγωνία (Οδηγίες 2010/63/ΕΕ) και η θανάτωση έγινε στην εγκατάσταση του εκτροφέα από αρμόδιο, εκπαιδευμένο πρόσωπο. Η δεύτερηιστοληψίαέγινε είκοσι (20) μέρες μετά την γέννηση σε δύο (2) χοιρίδια ημερών καιβάρους 4,900 και 4,550kg. Hτρίτηιστοληψία πραγματοποιήθηκετριάντα πέντε (35) μέρες από τη γέννηση τους σε τέσσερα (4) χοιρίδια, 2 από το πολυφαινολικό group και 2 από το group των control. Η τέταρτη ιστοληψία έγινε πενήντα (50)μέρες από τη γέννηση τους σε δώδεκα (12) χοιρίδια, 6 από το πολυφαινολικό group και 6 από το group των control. Στο εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών του Τμήματος Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας: Ταχεία και ασφαλή μεταφορά των δειγμάτων των αιμοληψιών και των ιστών, καθώς και η τοποθέτησή τους σε ψυγείο στους -80 C. Επεξεργασία του αίματος (Λήψη πλάσματος - αιμολύματος) και ομογενοποίηση ιστών. Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες. 2.2 Περιγραφή Σιτηρεσίου. 2.2.1 Εισαγωγή Για την ενσίρωση επιλέγονται φυτά με ψηλή περιεκτικότητα σε σάκχαρα, σε ξηρή ουσία ψηλής πεπτικότητας και ικανοποιητικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες, βιταμίνες και ανόργανα στοιχεία. Τα πιο κατάλληλα φυτά που προσφέρονται για ενσίρωση είναι το καλαμπόκι και η μηδική. Για την παρασκευή του πολυφαινολικού σιτηρεσίου έπρεπε αρχικά να παρασκευαστεί ενσιρωμένο καλαμπόκι. Το ενσιρωμένο καλαμπόκι περιέχει μεγάλα ποσοστά υγρασίας, οργανικά οξέα, όπως γαλακτικό οξύ και χορηγείται στα ζώα σαν χονδροειδής ζωοτροφή. Η ενσίρωση είναι η διαδικασία ζύμωσης φυτικών προϊόντων με υψηλό ποσοστό υγρασίας και υπό αναερόβιες συνθήκες, με σκοπό τη διατήρηση του 32

προϊόντος αλλά και τη βελτίωση της θρεπτικής του αξίας, για χρήση ως ζωοτροφή. Κατά την ενσίρωση δημιουργούνται όξινες συνθήκες που εξασφαλίζουν την διατήρηση της υγρασίας και της γεύσης τους. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται βακτήρια. Τα βακτήρια τα οποία είναι παρόντα στην καλλιέργεια εμπίπτουν σε δύο κατηγορίες. Αυτά που είναι επιθυμητά και τα ανεπιθύμητα. Τα επιθυμητά βακτήρια είναι αυτά που μπορούν να μετατρέψουν υδατανθράκες σε γαλακτικό οξύ και είναι συνήθως στελέχη των βακτηρίων του Lactobacillus και Streptococcus. Είναι αναερόβια βακτήρια και πρέπει να είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλη την καλλιέργεια. Η αντίδραση που πραγματοποιείται από τα βακτήρια είναι ταχύτερη με την κοπή του χόρτου και την ταχεία εδραίωση του αποκλεισμού του αέρα. Το γαλακτικό οξύ είναι ένα ισχυρό οργανικό οξύ και η γρήγορη παραγωγή του στο ενσιρωμένο χόρτο οδηγεί σε ένα χαμηλό ph και σε συνθήκες οι οποίες θα παρεμποδίζουν την παραγωγή βακτηρίων που παράγουν γαλακτικό οξύ και πολλών ακόμα βακτηρίων. Αυτή η αντίδραση είναι γνωστή ως μία διεργασία καθαρισμού και το ph το οποίο προκύπτει εξαρτάται από την περιεκτικότητα της τροφής σε υγρασία. Αν η τροφή περιέχει μεγάλα ποσοστά υγρασίας τότε το ph πρέπει να είναι αρκετά χαμηλό και να παραχθεί πολύ μεγαλύτερη ποσότητα γαλακτικού οξέος. Για το ενσίρωμα τα βακτήρια γαλακτικού οξέος που χρησιμοποιούνται ζυμώνουν τους υδατοδιαλυτούς υδατάνθρακες (WSC) στην καλλιέργεια σε γαλακτικό οξύ, και σε μικρότερο βαθμό σε οξικό οξύ, παράγοντας ταυτόχρονα διοξείδιο του άνθρακα και νερό. Η μείωση του ph του ενσιρωμένου υλικού οφείλεται στην παραγωγή αυτών των οξέων με αποτέλεσμα την αναστολή των μικροοργανισμών αλλοίωσης της τροφής. Μόλις η τροφή προς ενσίρωση έχει αποκλειστεί από τον αέρα, η διαδικασία ενσίρωσης μπορεί να διαιρεθεί σε 4 φάσεις (Oude et al.): Φάση 1η: Αερόβια Φάση Η φάση αυτή συνήθως διαρκεί μόνο λίγες ώρες στις οποίες το ατμοσφαιρικό οξυγόνο παρόν μεταξύ των σωματιδίων των φυτών μειώνεται, λόγω της αναπνοής του φυτικού υλικού αλλά και των αερόβιων και προαιρετικά αερόβιων μικροοργανισμών, όπως ζύμες και εντεροβακτήρια. Επιπλέον, τα ένζυμα φυτών όπως πρωτεάσες αλλά και ένζυμα που διασπούν υδατάνθρακες είναι ενεργά κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης, εφόσον το ρη εξακολουθεί να είναι εντός του φυσιολογικού εύρους για φρέσκο ενσίρωμα (ρη 6.5-6.0). 33

Φάση 2η: Φάση Ζύμωσης Αυτή η φάση ξεκινά όταν η ενσίρωση γίνεται αναερόβια, και αυτό συνεχίζεται για αρκετές ημέρες έως αρκετές εβδομάδες, ανάλογα με τις ιδιότητες των τροφών προς ενσίρωση και τις συνθήκες αποθήκευσης. Αν η ζύμωση προχωρά με επιτυχία, αναπτύσσονται τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος, και γίνονται ο κυρίαρχος πληθυσμός κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης. Λόγω της παραγωγής γαλακτικού και άλλων οξέων το ρη μειώνεται σε 3,8-5,0. Φάση 3η: Σταθερή Φάση Όσο η είσοδος του αέρα στο αποθηκευμένο ενσίρωμα, λίγες μεταβολές συμβαίνουν. Οι περισσότεροι μικροοργανισμοί της φάσης 2 σιγά-σιγά μειώνονται σε αριθμούς. Μερικοί μικροοργανισμοί οι οποίοι είναι ανθεκτικοί στο οξύ επιβιώνουν σε αυτή τη φάση σε μια σχεδόν ανενεργή κατάσταση, άλλοι, όπως clostridia και bacilli επιβιώνουν ως σπόρια. Μόνο μερικές πρωτεάσες και καρβοϋδράσες, οι οποίες είναι ανθεκτικές στο οξύ και κάποιοι εξειδικευμένοι μικροοργανισμοί, όπως Lactobacillus buchneri συνεχίζουν να είναι ενεργοί σε χαμηλό επίπεδο. Φάση 4η : Αερόβια Φάση Αλλοίωσης Η φάση αυτή ξεκινά αμέσως μόλις το ενσίρωμα εκτεθεί στον αέρα. Κατά τη διάρκεια της χορήγησης του ενσιρώματος στην τροφή των ζώων αυτό είναι αναπόφευκτο, αλλά μπορεί να έχει ήδη ξεκινήσει νωρίτερα λόγω βλάβης του καλύμματος αποθήκευσης του ενσιρώματος. Η διαδικασία της αλλοίωσης μπορεί να διαιρεθεί σε δύο στάδια. Η έναρξη της φθοράς μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση των οργανικών οξέων, που συμβάλλουν στην διατήρηση, από ζύμες και περιστασιακά βακτήρια οξικού οξέος. Αυτό θα προκαλέσει μια αύξηση στο ρη, και ως εκ τούτου το δεύτερο στάδιο της αλλοίωσης, το οποίο συνδέεται με την αύξηση της θερμοκρασίας και την ενεργοποίηση των μικροοργανισμών αλλοίωσης όπως βάκιλλοι, έχει ξεκινήσει. Το τελευταίο στάδιο περιλαμβάνει επίσης τη δραστηριότητα πολλών άλλων (προαιρετικά) αερόβιων μικροοργανισμών, όπως μύκητες και εντεροβακτήρια. Αερόβια αλλοίωση συμβαίνει σε όλες σχεδόν τις αποθηκεύσεις που έχουν ανοιχτεί και εκτίθενται στον αέρα. Ωστόσο, το ποσοστό της αλλοίωσης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό τον αριθμό και την δραστηριότητα των οργανισμών που προκαλούν αλλοιώσεις στο ενσίρωμα. Η είσοδος του αέρα κατά τη διαδικασία της ζύμωσης μπορεί να καθυστερήσει ή ακόμη και να εμποδίσει την επίτευξη σωστών επίπεδων ph. Αυτό θα οδηγήσει σε υπερβολική χρήση μεγάλων ποσοτήτων υδατανθράκων η οποία θα μειώσει την αξία θρεπτική αξία της ενσίρωμένης τροφής. Είσοδος του αέρα μετά αφού η διαδικασία της 34

ενσίρωσης έχει φτάσει σε σταθερή κατάσταση θα οδηγήσει σε απώλεια της σταθερής κατάστασης μέσω αναπνοής και τη περεταίρω μείωση των υδατανθράκων. Αυτό θα μικρύνει τη διάρκεια ζωής του προϊόντος. Όταν η ενσίρωση ενσωματώνεται σε ένα σύστημα καλλιέργειας, έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την παραγωγικότητα και την αποτελεσματικότητα χρησιμοποίησης των διαθέσιμων πόρων. Σε γενικές γραμμές, με τη χορήγηση ενσιρώματος αυξάνεται η παραγωγικότητα των ζώων, λόγω καλύτερης διατροφής και συνδυάζεται η γεωργική με την κτηνοτροφική κατεύθυνση της επιχείρησης. 2.2.2 Χαρακτηριστικά Ενσιρώματος. Ένα καλό ενσίρωμα διαθέτει ένα ανοικτό καφέ στο χρώμα, έχει μια έντονη γεύση και μυρίζει ελάχιστα όταν το γαλακτικό οξύ που περιέχει βρίσκεται στην σωστή ποσότητα. Είναι πολύ σταθερό και μπορεί να διατηρηθεί για χρόνια, εάν απαιτείται υπό την προϋπόθεση ότι το οξυγόνο περιορίζεται από το υλικό. Για την καλύτερη ζύμωση, η ξηρά τροφή που χρησιμοποιείται πρέπει να έχει υψηλή περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες και χαμηλή περιεκτικότητα σε υγρασία. Η κοπή θα πρέπει να πραγματοποιηθεί όταν το περιεχόμενό τους σε υδατάνθρακες (διαλυτά σ'ακχαρα) είναι υψηλό και όταν το φυτό μπορεί να μαραθεί γρήγορα. Η περιεκτικότητα σε σάκχαρα πρέπει να είναι τουλάχιστον 3% κατά την κοπή και το φυτό θα πρέπει να μαραθεί έως ότου η περιεκτικότητα του σε υγρασία από 80% κατέβει στο 70-75%. Σε αυτό το ποσοστό εξασφαλίζεται η υψηλότερη περιεκτικότητα σε θρεπτικά στοιχεία και η ασφαλέστερη ενσίρωση. Συνήθως το κατάλληλο ph για ένα καλό ενσίρωμα πρέπει να είναι μικρότερο από 4,1 2.2.3 Παρασκευή Πολυφαινολικού Σιτηρεσίου Για την παρασκευή του πολυφαινολικού σιτηρεσίου χρησιμοποιήθηκαν βακτήρια του γένους Lactobacillus τα οποία παράγουν γαλακτικό οξύ. Για την καλλιέργεια των βακτηρίων αρχικά ζυγίζονταν 1 gr βακτηρίων για κάθε 100 κιλά τελικού ενσιρωμένου προϊόντος. Τα βακτήρια αυτά στην συνέχεια έπρεπε να διαλυθούν μέσω ανάδευσης και θέρμανσης στους 40 C σε αναλογία 1/10 W/V. Δηλαδή το 1 gr βακτηρίων διαλυόταν σε 10 ml νερού. Το τελικό προϊόν ενσιρωμένου καλαμποκιού που θα προστεθεί στο σιτηρέσιο των γουρουνιών, τα οποία θα αποτελούν την ομάδα με τις πολυφαινόλες, θα περιέχει τα συστατικά που αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα. 35

POLYPHENOL. GROUP. ΤΡΟΦΕΣ % ΚΑΛΑΜ ΠΟΚΙ (Ενσιρωμένο με κατακράτημα επεξεργασμένων ΥΑΕ, που προήλθε από μικροδιήθηση με κεραμικά φίλτρα, πολυφαινολοποιημένο με 4% στερεά + 46,5 Καλαμπόκι με 56% στερεά). Σύνολο 60% Στερεά. ΣΟΓΙΑΛΕΥΡΟ 21,0 ΟΡΟΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ 20,0 ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ (PROVET) 10,0 ΙΣΟΡΡΟΠΙΣΤΗΣ (Piglets Com 2,5%) 2,5 ΣΥΝΟΛΟ 100,0 Πίνακας 3. Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού, ομάδας (Β) με Πολυφαινολικά Πρόσθετα. 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Minutes Εικόνα 11.Ανάλυση Επεξεργασμένων ΥΑΕ (Συμπύκνωση με Αντλία Κενού, με Ένα Πέρασμα), με την HPLC μέθοδο. 36

Για την δημιουργία 100 κιλών ενσιρώματος προστέθηκαν 44 κιλά από επεξεργασμένα ΥΑΕ, τα οποία περιείχαν μέσα τις πολυφαινόλες και είχαν 4% στερεά. Επίσης ζυγίστηκαν 56 κιλά καλαμποκιού. Στα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου προστέθηκε 1ml από την καλλιέργεια των βακτηρίων και αναμίχθηκαν. Στο αλεσμένο καλαμπόκι προστέθηκαν τα υγρά απόβλητα ελαιοτριβείου και αναμίχθηκαν. Στη συνέχεια το ενσίρωμα τοποθετήθηκε σε ειδικές σακούλες, του ενός κιλού, από τις οποίες τραβήχτηκε ο αέρας, μέσω μηχανήματος που δημιουργεί κενό και κλειστήκαν αεροστεγώς.για τις ανάγκες του πειράματος παρασκευάστηκαν 300 κιλά ενσιρώματος. Εικόνα 12. Ζυγαριά Ακρίβειας Και Συσκευή Αποσυμπίεσης. Μετά το πέρας 2-4 ημερών (ανάλογα με τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος), ήταν αναγκαίο οι σακούλες να ανοίγονται και να κλείνουν ξανά αεροστεγώς. Αυτή η διαδικασία που εκτελέστηκε τέσσερις (4) φορές, είναι απαραίτητη λόγω του ότι παράγεται διοξείδιο του άνθρακα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης που πραγματοποιούν τα βακτήρια, με αποτέλεσμα αν δεν αφαιρεθεί ο αέρας οι σακούλες να ανοίξουν και να έρθουν σε επαφή με το ατμοσφαιρικό οξυγόνο. Λόγω του ότι η αντίδραση που πραγματοποιείται για την ενσίρωση του καλαμποκιού απαιτεί αναερόβιες συνθήκες, η επαφή του ενσιρώματος με τον ατμοσφαιρικό αέρα θα έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της αντίδρασης. Κατά την διάρκεια της παραπάνω διαδικασίας λαμβάνονταν δείγματα έτσι ώστε να γίνεται ο έλεγχος του ph του ενσιρώματος. Το ph το οποίο πρέπει να έχει το τελικό ενσίρωμα πρέπει να είναι μικρότερο του 4,1. Επίσης το τελικό προϊόν της ενσίρωσης έχει πιο σκούρο χρώμα από το αρχικό και τα βακτήρια σταματούν την αντίδραση με 37

αποτέλεσμα να μην παρατηρείται ύπαρξη διοξειδίου του άνθρακα μέσα στην σακούλα που βρίσκεται το τελικό προϊόν. Η μέτρηση του ph έγινε με 2 μεθόδους. Στην πρώτη μέθοδο γίνεται αραίωση 1/10 του ενσιρώματος. Δηλαδή σε 1 γραμμάριο ενσιρώματος προστίδενται 9 ml απεσταγμένου νερού. Το μίγμα αναδεύεται έντονα σε vortex για τουλάχιστον 20 λεπτά. Τέλος μετρήθηκε το ph το οποίο ήταν 3,95. Με την δεύτερη μέθοδο γίνεται αραίωση 1/2 του ενσιρώματος. Δηλαδή σε 5 γραμμάρια ενσιρώματος προστίθενται 5 ml απεσταγμένου νερού. Έπειτα ακολουθεί έντονη ανάδευση σε vortex για τουλάχιστον 20 λεπτά και τέλος μετρήθηκε το ph. Το ph του ενσιρώματος με την δεύτερη μέθοδο ήταν 3,97. Όπως φαίνεται και οι δύο μέθοδοι έδωσαν παρόμοιες τιμές ph και συνεπώς το ενσίρωμά μας είχε ολοκληρωθεί η γαλακτική ζύμωση και ήταν πλέον έτοιμο για να προστεθεί στο σιτηρέσιο. Μετά την επιτυχή παρασκευή του ενσιρώματος παρασκευάστηκε το σιτηρέσιο με το οποίο θα τρέφονταν τα γουρούνια της ομάδας Β (σιτηρέσιο με πολυφαινόλες). Το σιτηρέσιο της ομάδας Β παρασκευάστικε σύμφωνα με τον πίνακα 3 και συσκευάστηκε κλεισμένο αεροστεγώς σε ειδικές σακούλες των 2 κιλών. Το σιτηρέσιο της ομάδας Α (σιτηρέσιο χωρίς πολυφαινόλες) παρασκευάστηκε σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. CONTROL GROUP ΤΡΟΦΕΣ % ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ 46,5 ΣΟΓΙΑΛΕΥΡΟ 21,0 ΟΡΟΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ 20,0 ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ (PROVET) 10,0 ΙΣΟΡΡΟΠΙΣΤΗΣ (Piglets Corn 2,5%) 2,5 ΣΥΝΟΛΟ 100,0 Πίνακας 4.Σιτηρέσιο Απογαλακτισμού, ομάδας Α (ελέγχου) (χωρίς πολυφαινόλες). Για να ελέγξουμε την αντιοξειδωτική δράση των σιτηρεσίων των ομάδων, τόσο μεμονωμένα όσο και μεταξύ τους, εκτελέσαμε τη μέθοδο DPPH. Τα αποτελέσματα αυτής της μέτρησης φαίνονται στα παρακάτω διαγράμματα. 38

Παρατηρείται ότι ενώ στο σιτηρέσιο της ομάδας ελέγχου ακόμα και στα 40mg/ml η αναστολή της ρίζας είναι στα 40,52%, στο σιτηρέσιο της ομάδας με τα πολυφαινολικά πρόσθετα το IC50 της ρίζας επιτυγχάνεται στα 15,5 mg/ml. Αυτό σημαίνει ότι το σιτηρέσιο της ομάδας που καταναλώνει τα πολυφαινολικά πρόσθετα εμφανίζει περίπου τριπλάσια αντιοξειδωτική δράση από αυτό της ομάδας ελέγχου. 2.3 Αιμοληψία - Ιστοληψία. Εκτελέστηκαν τέσσερις (4) αιμοληψίες-ιστοληψίες ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται από τους FramstadT. etal. (1988), όταν τα χοιρίδια ήταν ηλικίας 2, 20,35 και 50 ημερών, τα οποία κατανάλωναν τα σιτηρέσια που αναφέρθηκαν σε προηγούμενη ενότητα ανάλογα με την ομάδα στην οποία ανήκαν (ομάδα ελέγχου ή πολυφαινολών). 2.3.1 Υλικά: Μιας χρήσεως σύριγγες με βελόνα (PentaFerte ), χωρητικότητας 5 ml, που μετά τη χρήση τους απομακρύνονταν σε δοχεία περισυλλογής αιχμηρών αντικειμένων. M ^ χρήσεως αποστειρωμένα σωληνάρια συλλογής αίματος, (BDVacutainer EDTATubes, με Ref. nr. 3668860), που περιείχαν 7,2 mg Κ3Ε. Το αντιπηκτικό EDTA(αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ) δεσμεύει τα άλατα του ασβεστίου στο αίμα μεχηλίωση (αποσιδήρωση), έτσι ώστε να διατηρηθούν τα κύτταρα. 39

Εικόνα 13. Αιμοληψία από Πρόσθια Κοίλη Φλέβα και Τοποθέτηση Αίματος σε Σωληνάρια Περισυλλογής. Το αίμα από τα χοιρίδια λαμβάνονταν από τη σφαγίτιδα φλέβα, αφού έχει προηγηθεί αναισθησία και θανάτωση σύμφωνα με τους κανονισμούς περί θανάτωσης εργαστηριακών ζώων που αναφέρονται στις Οδηγίες 2010/63/ΕΕ. Το αίμα μεταφέρονταν σε σωληνάρια συλλογής, που περιείχαν αντιπηκτικό και ανακατεύονταναπαλάαναστρέφονταςτον σωλήνααρκετές φορές.αυτό διασφάλιζε τη σωστήανάμιξη τουαντιπηκτικού με το αίμα. Τα δείγματα τοποθετούνταν σε φορητό ψυγείο που έφεραν παγοκύστες και μεταφέρονταν στο εργαστήριο άμεσα, μετά το πέρας της αιμοληψίας. 2.4. Επεξεργασία Αίματος - Ομογενοποίησε Ιστών. Στο εργαστήριο αμέσως μετά από κάθε αιμοληψία, εκτελείτο επεξεργασία των δειγμάτων για τη συλλογή αιμολύματος και πλάσματος. (Ramnath, et. al., 2007).Στο ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα για τον προσδιορισμό της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH) και της καταλάσης και στο πλάσμα για τον προσδιορισμό των TBARS, των πρωτεϊνικών καρβονυλίων και της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας. 2.4.1 Περιγραφή Μεθόδου. 1. Τοποθετούμε τα σωληνάρια συλλογής αίματος στην φυγόκεντρο και φυγοκεντρούμε στα 1370 g, για 10 λεπτά, στους 4 oc. 2. Συλλέγουμε το υπερκείμενο (πλάσμα) και το χωρίζουμε σε φιαλίδια eppendorf, ανάλογα με τις μετρήσεις που θα γίνουν. 3. Προσθέτουμε απιονισμένο νερό (1:1 v/v) στα ερυθροκύτταρα, τα οποία μετά τη φυγοκέντρηση βρίσκονται στο κάτω μέρος του falcon. 40

4. Ανακινούμε βίαια και φυγοκεντρούμε στα 4020 g, για 15 λεπτά, στους 4 oc. 5. Συλλέγουμε το υπερκείμενο, που είναι το ερυθροκυτταρικό αιμόλυμα. Οι μεμβράνες των ερυθροκυττάρων μένουν ως ίζημα πολύ μικρού όγκου (10-20 i L). 6. Χωρίζουμε σε eppendorf το αιμόλυμα ανάλογα με τις μετρήσεις που θα γίνουν. Διατήρηση στους -20 oc. Εικόνα 14. Διατήρηση Πλάσματος και Αιμολύματος σε Φιαλίδια Eppendorf. Στη συνέχεια καθαρίζεται το αιμόλυμα για τον προσδιορισμό της γλουταθειόνης. 1. Προσθέτουμε 500 μΐ αιμολύματος σε 500 μΐ 5% TCA σε eppendorf και ανακινούμε στο vortex. 2. Φυγοκεντρούμε στα 20.000 g για 5 min στους 5 oc. 3. Συλλέγουμε το υπερκείμενο σε eppendorf και προσθέτουμε 5% TCA με την εξής αναλογία: 300 i L αιμολύματος / 90 i L 5% TCA και ανακινούμε στο vortex. 4. Φυγοκεντρούμε στα 20.000 g για 5 min στους 5 oc. 5. Μεταφέρουμε το καθαρό υπερκείμενο σε eppendorfs, τα οποία αποθηκεύονται στον καταψύκτη και θα χρησιμοποιηθούν για την μέτρηση της γλουταθειόνης. Η μεταφορά των ιστών έγινε σε eppendorftubes των 2 ml σε υγρό άζωτο.η ομογενοποίηση των ιστών (ηπατικός, παγκρεατικός και στομαχικός), εκτελέστηκε με γουδί και γουδοχέρικαι διατηρήθηκαν στους -800C μέχρι τη βιοχημική τους ανάλυση. Ο ιστοί ομογενοποιήθηκαν με αναλογία 1/2 σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS ph 7,4 που περιείχε 138mM NaCL, 2,7mM KCL και 1mM EDTA καθώς και ένα μίγμα αναστολέων πρωτεασών (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets - Roche Diagnostics GmbH), όπως: 41

Απροτινίνη (10mg/mL), η οποία αναστέλει την θρυψίνη και άλλα πρωτεολυτικά ένζυμα. Λιουπεπτίνη (1mg/mL), δ οποία αναστέλει πεπτιδάσες όπως τπν κυστεΐνη, την σερίνη και την θρεονίνη. PMSF (9mg/mL), κλπ. Κατά την προετοιμασία για τη βιοχημική ανάλυση του ιστού τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν με γουδί και γουδοχέρι χρησιμοποιώντας υγρό άζωτο. Εικόνα 15. Τα Εργαλεία που Χρησιμοποιήθηκαν για την Ομογενοποίησε Ιστών. Ακολούθως, το ομογενοποίημα υπέστη επεξεργασία με υπερήχους για την απελευθέρωση της μεγαλύτερης δυνατής ποσότητας πρωτεΐνης και φυγοκεντρήθηκε. 2.5. Προσδιορισμός Δεικτών Οξειδωτικού Στρες. 2.5.1. Γενικά. Για την αξιολόγηση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης των ερυθροκυττάρων προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ανηγμένης γλουταθειόνης καθώς και η δραστικότητα της καταλάσης. Για την εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας συχνά προσδορίζεται η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος του αίματος. Για την αξιολόγηση του οξειδωτικού στρες, ένας από τους δείκτες που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της υπεροξείδωσης των λιπιδίων είναι οι ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ, ενώ για την καταστροφή των πρωτεϊνών χρησιμοποιούνται τα πρωτεϊνικά καρβονύλια. 2.5.2. Μέθοδοι. Οι δείκτες οξειδωτικού στρες μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά και η αρχή προσδιορισμού του καθενός αναφέρεται αναλυτικά παρακάτω. 42