ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ-ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ Β ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ 2010-2011 Αρ. Διατριβής 3099 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΤΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΕΝΔΟΓΕΝΗ ΚΑΙ ΕΞΩΓΕΝΗ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ ΘΡΑΣΥΒΟΥΛΟΣ ΤΖΕΛΛΟΣ ΙΑΤΡΟΣ, MSc ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011
ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΠΑΠΑΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΡΙΣΤΕΙΔΗΣ ΚΡΙΤΗΣ ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΠΑΠΑΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΡΙΣΤΕΙΔΗΣ ΚΡΙΤΗΣ ΕΠ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΚΟΚΚΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΟΥΒΕΛΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΣΩΤΗΡΙΑΔΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλεί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως» (Νόμος 5343/42, άρθρο 202, παρ. 2, ν. 1268/82, άρθρο 50, παρ. 8)
Στους Γονείς μου με ευγνωμοσύνη Στη Ναταλία με αγάπη
Στους Καθηγητές μου Γεώργιο Καρακιουλάκη Χρήστο Ζουμπούλη Ελένη Παπακωνσταντίνου με σεβασμό
ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Η γήρανση ένα μείζον ιατρικό, κοινωνικό και οικονομικό φαινόμενο Η γήρανση ως βιολογική διαδικασία Η γήρανση ως επιδημιολογικό και κοινωνικό φαινόμενο Η γήρανση ως μείζον οικονομικό και ιατρικό πρόβλημα Η ανάγκη για μελέτη της γήρανσης 2. Η δερματική γήρανση Η φυσιολογική-ενδογενής δερματική γήρανση Η φυσιολογική-ενδογενής δερματική γήρανση ως μοντέλο μελέτης της γήρανσης όλου του οργανισμού Η μακροσκοπική και ιστολογική εικόνα της ενδογενούς δερματικής γήρανσης Η εξωγενής δερματική γήρανση Η φωτογήρανση Η κλινική μακροσκοπική εικόνα της φωτογήρανσης Η ιστολογική εικόνα της φωτογήρανσης 3. Το εξωκυττάριο στρώμα του συνδετικού ιστού της δερμίδας 4. Οι μεταλλοπρωτεάσες και οι ιστικοί αναστολείς τους Η δομή των MMP Ταξινόμηση των MMP με βάση τη δομή τους Ταξινόμηση των MMP με βάση το υπόστρωμά τους Η ενεργοποίηση των MMP Ο έλεγχος της δραστηριότητας των MMP Οι ειδικοί ιστικοί αναστολείς των MMP (TIMP) Οι MMP και TIMP στο δέρμα και τη νοσολογία του Η σύγχρονη θεραπευτική σε συνάρτηση με MMP και TIMP 5. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες Οι γλυκοζαμινογλυκάνες Το υαλουρονικό οξύ Οι ενεργοί υποδοχείς του υαλουρονικού Το μοριακό βάρος του υαλουρονικού 6. Οι πρωτεογλυκάνες Οι πρωτεογλυκάνες Αγκρεκάνη Συνδεκάνη Βερσικάνη Ντεκορίνη Διγλυκάνη Περλεκάνη
7. Πειραματικά μοντέλα για τη μελέτη της γήρανσης Το πειραματικό μοντέλο του Caenorhabditis elegans Το πειραματικό μοντέλο της καλλιέργειας ινοβλαστών Πειραματόζωα 8. Η επίδραση της UV ακτινοβολίας στο δέρμα Γενικά Η ηλιακή ακτινοβολία Οι βραχυπρόθεσμες δράσεις της UV ακτινοβολίας Οι μακροπρόθεσμες δράσεις της UV ακτινοβολίας 9. H συμμετοχή των ορμονών στη δερματική γήρανση Γενικά Το δέρμα ως ένα περιφερικό ενδοκρινικό όργανο Η επίδραση των οιστρογόνων στο πάχος του δέρματος και στο κολλαγόνο Η επίδραση των οιστρογόνων στην περιεκτικότητα του δέρματος σε νερό Η επίδραση των οιστρογόνων στη ρυτίδωση του δέρματος 10. Τα μόρια του εξωκυτταρίου στρώματος στη δερματική γήρανση Οι γλυκοζαμινογλυκάνες στη δερματική γήρανση Τα λιπίδια στη δερματική γήρανση Το νερό στη δερματική γήρανση Η ελαστίνη στη δερματική γήρανση Το κολλαγόνο στη δερματική γήρανση Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στη δερματική γήρανση Οι πρωτεογλυκάνες στη δερματική γήρανση 11. H σύγχρονη φαρμακολογία και θεραπευτική στη δερματική γήρανση Ορμόνες του φύλου και δερματική γήρανση Οι κυτταροκίνες Η laser φωτοανάπλαση Επεμβατικές μέθοδοι Η L-φουκόζη και οι πλούσιοι σε φουκόζη πολυσακχαρίτες (FROP-s - fucose-rich polysaccharides) Τα ρετινοειδή
ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. Υλικά και μέθοδοι Ασθενείς Κριτήρια αποκλεισμού Λήψη ανθρώπειων δειγμάτων Ανάπτυξη κυτταροκαλλιεργειών Πειραματικός σχεδιασμός για τη μελέτη της ενδογενούς γήρανσης στους πρωτογενείς ινοβλάστες Ανάπτυξη παρακρινούς μοντέλου για τη μελέτη της επίδρασης της 17-β-οιστραδιόλης Απομόνωση, καθαρισμός, κλασματοποίηση και ταυτοποίηση των GAG από πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών και από ανθρώπινα δείγματα Προσδιορισμός του μοριακού βάρους του υαλουρονικού οξέος σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και γέλη αγαρόζης Ποσοτικός προσδιορισμός υαλουρονικού οξέος με ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA) Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Προσδιορισμός δραστικότητας των ΜΜPs με ζυμογραφία ζελατίνης Στατιστική Ανάλυση 2. Αποτελέσματα 2.1. Εξωγενής δερματική γήρανση 2.1.1. Υαλουρονικό οξύ 2.1.2. Πρωτεογλυκάνες 2.1.3. Μεταλλοπρωτεϊνάσες 2.2.Ενδογενής γήρανση σε ανθρώπεια δερματικά δείγματα 2.2.1. Υαλουρονικό οξύ 2.2.2. Πρωτεογλυκάνες 2.3. Ενδογενής γήρανση στο μοντέλο των πρωτογενών δερματικών ινοβλαστών 2.3.1. Υαλουρονικό οξύ 2.4. Η επίδραση της 17-β-οιστραδιόλης στο μοντέλο παρακρινούς δράσης 2.4.1. Υαλουρονικό οξύ 3. Συμπεράσματα 3.1. Εξωγενής γήρανση 3.2. Ενδογενής γήρανση 3.3. Ο ρόλος της 17β-οιστραδιόλης και του παρακρινούς άξονα και οι πιθανές φαρμακολογικές παρεμβάσεις ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AP-1 (activator protein 1): ενεργοποιός πρωτεΐνη 1 BCC (basal cell carcinoma): βασικοκυτταρικό καρκίνωμα CDK (cyclin-dependent kinase): εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση Cys (cysteine): κυστεΐνη DMEM (Dulbecco s modified Eagle s medium): θρεπτικό υλικό ECM (extracellular matrix): εξωκυττάριο στρώμα EGF (epidermal growth factor): επιδερμιδικός αυξητικός παράγοντας ER (estrogen receptor): οιστρογονικός υποδοχέας FCS (fetal calf serum): ορός εμβρύου μόσχου FROP-s (fucose-rich polysaccharides): πολυσακχαρίτες πλούσιοι σε φουκόζη GAG (Glycosaminoglycans): γλυκοζαμινογλυκάνες HAS (hyaluronan synthase): συνθετάση του υαλουρονικού HLE (human leucocytic elastase): ανθρώπεια ελαστάση των λευκοκυττάρων HYAL (hyaluronidase): υαλουρονιδάση IGF-I (insulin-like growth factor type I): ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας Ι MMP (matrix metalloproteinases): μεταλλοπρωτεάσες ή μεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού NER (nucleotide excision repair): επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου PDGF (platelet-derived endothelial cell growth factor): αιμοπεταλιακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας PBS (phosphate buffer solution): φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα PG (proteoglycans): πρωτεογλυκάνες RHAMM (receptor for hyaluronan mediated motility) RAR (retinoic acid receptors): υποδοχείς ρετινοικού οξέος ROS (reactive oxygen species): αντιδραστικά στοιχεία οξυγόνου RXR (retinoid X receptors): Χ υποδοχείς ρετινοειδούς TGF-β (transforming growth factor-b) μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β SCC (Squamous cell carcinoma): ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα TIMP (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases): ειδικοί ιστικοί αναστολείς των MMP UV (Ultraviolet): υπεριώδη ακτινοβολία VDGF (vascular endothelial growth factor): αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας
ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η γήρανση στον άνθρωπο είναι μια πολύπλοκη και πολυπαραγοντική διαδικασία, με τη συμμετοχή τόσο κληρονομικών όσο και ποικίλων περιβαλλοντικών παραγόντων. Σήμερα η γήρανση αποτελεί ένα κοινωνικό, οικονομικό, δημογραφικό και επιδημιολογικό φαινόμενο, με οικονομικές επιπτώσεις και πολυεπίπεδο αντίκτυπο. Η δερματική γήρανση είναι και αυτή μια πολυπαραγοντική διαδικασία, που μπορεί να διακριθεί σε δύο ανεξάρτητα, κλινικά και βιολογικά, φαινόμενα που επηρεάζουν το δέρμα ταυτόχρονα. Το πρώτο είναι η φυσιολογική ή ενδογενής γήρανση του δέρματος, το λεγόμενο «βιολογικό ρολόι», το οποίο επηρεάζει το δέρμα με τον ίδιο τρόπο που επηρεάζει και όλα τα εσωτερικά όργανα, δηλαδή με μη αναστρέψιμη εκφύλιση του ιστού, κυρίως του συνδετικού. Η δεύτερη αποτελεί την εξωγενή δερματική γήρανση, τη λεγόμενη φωτογήρανση, η οποία είναι αποτέλεσμα της έκθεσης σε εξωγενείς παράγοντες, με κυριότερο την UV (Ultraviolet υπεριώδη) ακτινοβολία. Το δέρμα άλλωστε αποτελεί το κύριο όργανο στο οποίο είναι ιδιαίτερα εμφανείς οι αλλαγές της γήρανσης. Η δερματική γήρανση γοήτευε τους ερευνητές για δεκαετίες. Πρόκειται για μια πολύπλοκη και μακρόχρονη διαδικασία που επηρεάζει όλα τα δομικά και λειτουργικά στοιχεία του δέρματος. Η σημασία της μελέτης της δερματικής γήρανσης είναι ιδιαίτερα ουσιώδης σήμερα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ενδογενής δερματική γήρανση προσομοιάζει τη γήρανση όλου του ανθρώπινου οργανισμού και των λοιπών οργάνων και συστημάτων, η μελέτη της και η αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε αυτή μπορεί να οδηγήσει σε πολύτιμες επιστημονικές πληροφορίες για τη γήρανση του ανθρώπου και σε πιθανούς φαρμακολογικούς στόχους για την αντιμετώπισή της. Η μελέτη της εξωγενούς δερματικής γήρανσης από την άλλη και η αποσαφήνιση της φυσιοπαθολογίας της μπορεί να προσφέρει νέους φαρμακολογικούς στόχους και θεραπείες με ειδικό μηχανισμό δράσης. Είναι γνωστό ότι οι περισσότερες από τις σύγχρονες θεραπείες για την εξωγενή δερματική γήρανση δεν στηρίζονται στις αρχές της ιατρικής βασισμένης στην τεκμηρίωση και δεν έχουν ειδικό μηχανισμό δράσης. Η φαρμακοοικονομία πίσω από τη δερματική γήρανση είναι τεράστια, με μεγάλα ποσά να ξοδεύονται παγκοσμίως, χωρίς την ανάλογη κλινική αποτελεσματικότητα. Τα μόρια του εξωκυτταρίου στρώματος του συνδετικού ιστού της δερμίδας, όπως το υαλουρονικό οξύ, οι πρωτεογλυκάνες και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, εμπλέκονται καθοριστικά σε όλες τις φυσιολογικές διεργασίες και στις περισσότερες δερματικές παθήσεις. Παρόλα αυτά, ο ρόλος τους και η συμμετοχή τους στη δερματική γήρανση δεν έχουν πλήρως 1
διευκρινισθεί. Οι λόγοι αυτοί και η προτροπή των καθηγητών μου κ. Γεωργίου Καρακιουλάκη και κ. Ελένης Παπακωνσταντίνου με ώθησαν στη διενέργεια αυτής της μελέτης με σκοπό τη διερεύνηση των μορίων του εξωκυτταρίου στρώματος στην ενδογενή και εξωγενή δερματική γήρανση με τελικό σκοπό την αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών και τη διαπίστωση πιθανών φαρμακολογικών στόχων για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της γήρανσης. Η μελέτη αυτή διαιρείται σε δύο μέρη, το Γενικό Μέρος και το Ειδικό Μέρος. Στο γενικό μέρος γίνεται μια ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σχετικά με τη γήρανση, την επιδημιολογία της και τη φαρμακοοικονομική σημασία της, την εξωγενή και ενδογενή δερματική γήρανση και την κλινική τους εικόνα, τα μόρια του εξωκυτταρίου στρώματος και τη σύγχρονη φαρμακολογία για την αντιμετώπιση της δερματικής γήρανσης. Το ειδικό μέρος περιλαμβάνει το σκοπό της μελέτης, τα άτομα που μελετήθηκαν και τις μεθόδους και τα πειραματικά μοντέλα που αναπτύχθηκαν, τα αποτελέσματα και τη στατιστική ανάλυση, τη συζήτηση και τα συμπεράσματα. Ακολουθούν η περίληψη στα ελληνικά και στα αγγλικά και η βιβλιογραφία. Η πραγματοποίηση της παρούσης διδακτορικής διατριβής δεν θα ήταν δυνατή χωρίς τη συνδρομή ορισμένων ανθρώπων, τους οποίους αισθάνομαι ηθικά υποχρεωμένος να ευχαριστήσω. Αισθάνομαι την υποχρέωση να εκφράσω τη μεγάλη μου ευγνωμοσύνη στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή αποτελούμενη από τους Καθηγητή και Διευθυντή του Β Εργαστηρίου Φαρμακολογίας κ. Γεώργιο Καρακιουλάκη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ελένη Παπακωνσταντίνου και Επίκουρο Καθηγητή κ. Αριστείδη Κριτή. Ευχαριστώ εγκάρδια τον επιβλέποντά μου σε αυτήν την προσπάθεια Καθηγητή κ. Καρακιουλάκη ο οποίος με ενέπνευσε να ασχοληθώ με τη δερματική γήρανση και τη φαρμακολογία της, μου έκανε την τιμή να με επιλέξει ως συνεργάτη του και να μου αναθέσει την εκπόνηση αυτής της διδακτορικής διατριβής. Θερμά, λοιπόν, τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, για τη συνεχή ενθάρρυνση που μου παρείχε, αλλά και για το αμέριστο ενδιαφέρον του για την ολοκλήρωση της μελέτης αυτής καθώς, επίσης, και για τη διόρθωση του χειρογράφου της διατριβής. Ευχαριστώ, επίσης, ολόψυχα την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ελένη Παπακωνσταντίνου, που ήταν συνεχώς δίπλα μου σε όλα τα στάδια της εκπόνησης της διδακτορικής αυτής διατριβής, από τη σύλληψη της ερευνητικής ιδέας μέχρι την τελική δημοσίευση των αποτελεσμάτων και στήριξε με κάθε τρόπο την προσπάθεια μου αυτή με την ανεκτίμητη βοήθειά της και τις πολύτιμες συμβουλές της, που συνέβαλαν στην ολο- 2
κλήρωσή της. Οφείλω να ευχαριστήσω, επίσης, βαθύτατα τους χειρουργούς και κλινικούς ιατρούς Επίκουρο Καθηγητή κ. Στέφανο Τριαρίδη, Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Αθανασία Πρίντζα, Επίκουρο Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Βαχτσεβάνο, Λέκτορα κ. Ξενοφώντα Σινωπίδη και Ιατρό κ. Αθανάσιο Κυργίδη, με τους οποίους συνεργάστηκα άψογα για τη λήψη των ανθρώπινων δερματικών δειγμάτων και οι οποίοι αφιέρωσαν χρόνο από το ήδη επιβαρυμένο τους κλινικό πρόγραμμα, για να με βοηθήσουν ανιδιοτελώς. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή και Τομεάρχη του Τομέα Φαρμακολογίας-Φυσιολογίας κ. Βασίλειο Κόκκα για την επίμονη προσπάθεια και επίτευξη της υλοποίησης και δημιουργίας ειδικού χώρου για την ανάπτυξη των κυτταροκαλλιεργειών που βοήθησε ουσιαστικά στην ολοκλήρωση της ερευνητικής αυτής προσπάθειας. Ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Δημήτριο Κούβελα για την αμέριστη ηθική συμπαράσταση που μου παρείχε και για τις πολύτιμες και ανεκτίμητες συμβουλές του. Θερμές ευχαριστίες οφείλω επίσης στην επταμελή εξεταστική επιτροπή που αφιέρωσε πνεύμα και χρόνο στην κρίση της παρούσης διδακτορικής διατριβής. Τέλος, οφείλω να ευχαριστήσω την ιατρό κ. Ευγενία Μακραντωνάκη για τις συνεχείς και ανεκτίμητες συμβουλές της και τον Καθηγητή κ. Χρήστο Ζουμπούλη, για την καταλυτική συμπαράστασή του, την πίστη του στην προσπάθειά μου και τη μοναδική ιδιότητά του να μετατρέπει τα πειραματικά αποτέλεσματα σε νέες ερευνητικές ιδέες. 3
4
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5
6
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Η ΓΗΡΑΝΣΗ ΕΝΑ ΜΕΙΖΟΝ ΙΑΤΡΙΚΟ, ΚΟΙΝΩΝΙΚΟ ΚΑΙ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ Η γήρανση στον άνθρωπο είναι μια πολύπλοκη και πολυπαραγοντική διαδικασία, με τη συμμετοχή τόσο κληρονομικών όσο και ποικίλων περιβαλλοντικών παραγόντων. Πρόκειται για μια σταδιακή, βραδεία και μη αναστρέψιμη ιστική εκφύλιση, που επηρεάζει όλα τα όργανα του ανθρώπινου οργανισμού και αντανακλά σε «φυσιολογικές» προοδευτικές αλλαγές. Οι αλλαγές αυτές οδηγούν με το χρόνο σε φθίση των βιολογικών λειτουργιών και της ικανότητας του οργανισμού να προσαρμόζεται στο μεταβολικό στρες [1]. Πολλοί πολιτισμοί θεωρούν το γήρας ως ένδειξη σοφίας. Παρόλα αυτά, στις κοινωνίες της Δύσης η γήρανση αποτελεί «νοσηρό» φαινόμενο και ένα είδος κοινωνικού στίγματος [2]. Η ανάγκη και αναζήτηση της αναστροφής αυτής της διαδικασίας και της αιώνιας νεότητας είναι τόσο παλιά όσο και ο άνθρωπος και αντανακλάται σε αρχαίους μύθους και ιστορίες από διάφορους πολιτισμούς [3]. Η γήρανση ως βιολογική διαδικασία Οι βασικές βιολογικές διεργασίες της γήρανσης οδηγούν σε μείωση των βιολογικών λειτουργιών και της ικανότητας του οργανισμού να απαντάει επαρκώς σε μεταβολικό στρες. Υπάρχουν δύο βασικές γενικές θεωρίες για τη γήρανση [4]. Η πρώτη υποστηρίζει ότι η γήρανση είναι μια προκαθορισμένη διαδικασία που είναι γενετικά προγραμματισμένη. Η θεωρία αυτή στηρίζεται στη μελέτη του μήκους των τελομερών, που αποτελούν τα τελικά τμήματα των χρωματοσωμάτων και τα οποία μειώνονται σε μέγεθος σε κάθε κυτταρικό κύκλο. Όταν τα τελομερή φθάνουν σε ένα «κρίσιμο» μήκος, ο κυτταρικός κύκλος παύει και αρχίζει η διαδικασία της απόπτωσης [5, 6]. Η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι η γήρανση είναι διαδικασία που αποδίδεται κατεξοχήν σε περιβαλλοντικούς παράγοντες που δρούνε αθροιστικά και συνεργικά [4,7]. Για παράδειγμα, ελεύθεροι οξειδωτικοί παράγοντες μπορούν να παραχθούν από το οξυγόνο κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού μεταβολισμού και να συνεισφέρουν στη διαδικασία της γήρανσης [8]. Οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει κυτταρικά αμυντικά συστήματα ενάντια στην τοξικότητα των οξειδωτικών παραγόντων, κυρίως έναντι αυτών που έχουν ως βάση το οξυγόνο και ονομάζονται αντιδραστικά στοιχεία οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS). Οργανισμοί με μακροβιότητα έχουν υψηλότερα επίπεδα ενζυματικής προστασίας έναντι των ROS [9]. Η 7
δραστηριότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων [7] και τα επίπεδα των μη ενζυματικών αντιοξειδωτικών μορίων μειώνονται με την ηλικία [10], επιτρέποντας, έτσι, να συμβεί εκφύλιση από το οξειδωτικό στρες. Η γήρανση ως επιδημιολογικό και κοινωνικό φαινόμενο Η γήρανση, όμως, αποτελεί και ένα μείζον κοινωνικό πρόβλημα. Μια δημογραφική επανάσταση είναι σε εξέλιξη στον κόσμο, με την Ευρώπη να είναι στην πρώτη γραμμή [11]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, ο παγκόσμιος πληθυσμός συνέχισε την αξιοπρόσεκτη μετάβαση από την κατάσταση υψηλής γεννητικότητας και θνησιμότητας σε αυτήν της χαμηλής γεννητικότητας και θνησιμότητας. Στο επίκεντρο αυτής της μετάβασης είναι η αύξηση στην αναλογία και τον αριθμό των ηλικιωμένων ανθρώπων. Τέτοια απότομη, μεγάλη και καθολική αύξηση δεν έχει καταγραφεί ξανά στην ιστορία της ανθρωπότητας. Η παρούσα δημογραφική επανάσταση προβλέπεται να συνεχιστεί στις ερχόμενες δεκαετίες. Τα κύρια χαρακτηριστικά της δημογραφικής αυτής επανάστασης είναι [12]: - στο δεύτερο μισό του εικοστού αιώνα, 20 έτη προστέθηκαν στο μέσο προσδόκιμο όρο ζωής, οδηγώντας την παγκόσμια αύξηση του στα 66 έτη. - 1 στους 10 ανθρώπους είναι σήμερα 60 ετών ή άνω και μέχρι το 2050 η αναλογία αυτή θα γίνει 1 στους 5. - ο ίδιος ο ηλικιωμένος πληθυσμός φαίνεται να γηράσκει. H ηλικιακή ομάδα των 80 ετών και άνω είναι η πιο ταχέως αυξανόμενη του ηλικιωμένου πληθυσμού. Σήμερα αποτελεί το 11% της ηλικιακής ομάδας των 60 και άνω ετών και θα αυξηθεί στο 19% μέχρι το 2050. Ο αριθμός των ανθρώπων ηλικίας 100 ετών και άνω προβλέπεται να αυξηθεί 15 φορές, από περίπου 145000 το 1999 σε 2.2 εκατομμύρια μέχρι το 2050. Οι γυναίκες αποτελούν την πλειοψηφία (55%) των ηλικιωμένων, ενώ στους υπερήλικες οι γυναίκες αποτελούν το 65%. Εφόσον ο ρυθμός αυτός στις αναπτυσσόμενες χώρες είναι πιο ραγδαίος από τις αναπτυγμένες, οι αναπτυσσόμενες χώρες θα έχουν λιγότερες ευκαιρίες να προσαρμοστούν στις επιπτώσεις της γήρανσης του πληθυσμού [13]. Ενώ το φαινόμενο αυτό στον αναπτυγμένο κόσμο έλαβε χώρα σε ένα σχετικά ευρύ χρονικό διάστημα, στον αναπτυσσόμενο η εξέλιξή του συμπιέζεται σε μερικές δεκαετίες. Αυτό λοιπόν το ταχέως εξελισσόμενο φαινόμενο της γήρανσης είναι το αποτέλεσμα της εντυπωσιακής αύξησης του μέσου όρου ζωής, που αντανακλά την ταχέως μειούμενη θνησιμότητα, κυρίως μετά το 1950, ακολουθούμενη από μια ακόμη ταχύτερη πτώση στη γεννητικότητα. Σε λίγα χρόνια, η κύρια πλειοψηφία των ηλικιωμένων θα μετατοπιστεί στον αναπτυσσόμενο κόσμο. 8
Η γήρανση ως μείζον οικονομικό και ιατρικό πρόβλημα Η γήρανση αποτελεί πλέον και οικονομικό πρόβλημα και απασχολεί ιδιαίτερα τα ασφαλιστικά ταμεία, τις φαρμακοβιομηχανίες και τα συστήματα υγείας παγκοσμίως. Τα συστήματα υγείας επιβάλλεται επειγόντως να ανταποκριθούν σε αυτή την επιδημιολογική μεταβολή που ήδη παρατηρείται σε κάποιες αναπτυσσόμενες χώρες. Εφόσον τα συστήματα υγείας σήμερα βασίζονται στην παροχή φροντίδας στα οξέα και επείγοντα περιστατικά, δεν είναι επαρκή στην παροχή φροντίδας στα χρόνια νοσήματα και ιδιαίτερα στην κατεύθυνση της γεροντολογίας. Οι στρατηγικές υγείας δεν είναι επαρκείς και η σημερινή προσέγγιση στο προαναφερθέν πρόβλημα οδηγεί σε αναποτελεσματική διαχείριση και αξιοποίηση των πόρων. Κάθε φορά που οι πόροι ανεπαρκούν και αποτυγχάνουν να διαχειριστούν αποτελεσματικά τις συνέπειες της ταχείας πληθυσμιακής γήρανσης, οι χαμένες ευκαιρίες για αξιοποίηση των πόρων σε άλλη κατεύθυνση θα μεταφράζονται σε βασανιστικά και άλυτα προβλήματα σε άλλους τομείς υγείας. Οι χαμένες ευκαιρίες για πρόληψη και ικανοποιητική αντιμετώπιση των χρόνιων νοσημάτων οδηγούν σε αύξηση του επιπολασμού, της επιπτώσεως και των επιπλοκών τους, άρα συμπερασματικά και σε λιγότερους πόρους για νοσήματα σε άλλες ηλικιακές ομάδες, όπως η βρεφική θνησιμότητα ή η υγεία του παιδιού. Τα συστήματα υγείας στον αναπτυσσόμενο κόσμο πρέπει επειγόντως να συγκεντρώσουν τις προσπάθειές τους στην αναζήτηση γνώσης για την πρόβλεψη της εξέλιξηςς των νοσημάτων στους ηλικιωμένους παρά στη θεραπεία των χρόνιων νοσημάτων. Βελτιωμένα συστήματα υγείας σε απάντηση στη ραγδαία γήρανση του πληθυσμού είναι, επίσης, απαραίτητα και από την κοινωνικοοικονομική σκοπιά. Τέτοια συστήματα θα έχουν ως αποτέλεσμα αυξημένη παραγωγικότητα ως σύνολο, όπως, επίσης, και βέλτιστη αποτελεσματικότητα στο επίπεδο της παρεμβάσεως. Η ανάγκη για μελέτη της γήρανσης Όλα τα παραπάνω δεδομένα που παρουσιάστηκαν δεικνύουν την ανάγκη για μελέτη της γήρανσης, των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε αυτήν, της γενετικής συμμετοχής, των εμπλεκομένων γονιδίων καθώς και των μορίων του εξωκυτταρίου στρώματος. Αυτό θα οδηγήσει στην αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών σηματοδότησης και της συμμετοχής του εξωκυτταρίου στρώματος με τελικό σκοπό την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων και την πρόληψη των νοσημάτων του γήρατος. Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην ανίχνευση μοριακών μηχανισμών της δερματικής γήρανσης. Με τη βοήθεια της σύγχρονης τεχνολογίας και πρωτοπόρες πειραματικές μεθόδους στοχεύει στο να ανιχνεύσει μοριακούς μηχανισμούς και τη βιολογική τους σημαντικότητα. 9
10
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Η ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Το δέρμα είναι ένα από τα μεγαλύτερα όργανα του ανθρωπίνου σώματος και όπως όλοι οι ιστοί υπόκειται στις εκφυλιστικές διαδικασίες της γήρανσης. Το δέρμα άλλωστε αποτελεί το κύριο όργανο στο οποίο είναι ιδιαίτερα εμφανείς οι αλλαγές της γήρανσης [14]. Η δερματική γήρανση γοήτευε τους ερευνητές για δεκαετίες. Πρόκειται για μια πολύπλοκη και μακρόχρονη διαδικασία που επηρεάζει όλα τα δομικά και λειτουργικά στοιχεία του δέρματος [15]. Σήμερα πλέον αναγνωρίζουμε δύο ανεξάρτητα, κλινικά και βιολογικά διακριτά, φαινόμενα που επηρεάζουν το δέρμα ταυτόχρονα. Το πρώτο είναι η φυσιολογική ή ενδογενής γήρανση του δέρματος, το λεγόμενο «βιολογικό ρολόι», το οποίο επηρεάζει το δέρμα με τον ίδιο τρόπο που επηρεάζει και όλα τα εσωτερικά όργανα, δηλαδή με μη αναστρέψιμη εκφύλιση του ιστού, κυρίως του συνδετικού. Η δεύτερη αποτελεί την εξωγενή δερματική γήρανση, τη λεγόμενη φωτογήρανση, η οποία είναι αποτέλεσμα της έκθεσης σε εξωγενείς παράγοντες, με κυριότερο την UV (Ultraviolet υπεριώδη) ακτινοβολία [16]. Η φυσιολογική-ενδογενής δερματική γήρανση Η φυσιολογική ενδογενής δερματική γήρανση είναι μια ετερογενής διαδικασία που επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, με κύριο τη γενετική προδιάθεση [17, 18]. Σε αντίθεση με τη μη φυσιολογική γήρανση του δέρματος, η οποία είναι ειδική για το δέρμα και επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, η φυσιολογική αντανακλά τις εκφυλιστικές διεργασίες όλου του σώματος [19]. Το κύριο τμήμα του δέρματος που υφίσταται την ενδογενή γήρανση είναι ο συνδετικός ιστός της δερμίδας. Ο συνδετικός ιστός άλλωστε αποτελεί τη σπονδυλική στήλη των κυριότερων οργάνων. Η φυσιολογική-ενδογενής δερματική γήρανση ως μοντέλο μελέτης της γήρανσης όλου του οργανισμού Με γνώμονα ότι η συλλογή δειγμάτων από τον εγκέφαλο, την καρδιά και τα αγγεία κατά τη διάρκεια της ζωής για πειραματικές ερευνητικές προσπάθειες σχετίζεται με μείζονα πρακτικά και ηθικά εμπόδια, το ανθρώπινο δέρμα, το μεγαλύτερο και βαρύτερο όργανο του ανθρωπίνου σώματος, προσφέρει μια διαφορετική εναλλακτική προσέγγιση. Αποτελεί ένα πολύπλοκο όργανο, στο οποίο η γήρανση μπορεί να μελετηθεί βέλτιστα. 11
Οι χρονολογικές ενδογενείς αλλαγές της γήρανσης επηρεάζουν το δέρμα με παρόμοιο τρόπο με τα άλλα όργανα [20]. Ηλικιακο-εξαρτώμενες μεταβολές στο συνδετικό δερματικό ιστό σχετίζονται αρκετά με αλλαγές που ανιχνεύθηκαν στο συνδετικό ιστό άλλων οργάνων του ανθρωπίνου οργανισμού [20]. Είναι πλέον αποδεδειγμένο ότι οι βασικές αρχές και μηχανισμοί που ισχύουν για την ενδογενή δερματική γήρανση είναι οι ίδιες που σχετίζονται με τα εκφυλιστικά ηλικιακό-εξαρτώμενα νοσήματα του συνδετικού ιστού και άλλων οργάνων, όπως η οστεοαρθρίτιδα, η οστεοπόρωση και η αρτηριοσκλήρυνση [21]. Όλα τα παραπάνω δεδομένα δίνουν ιδιαίτερη αξία στη μελέτη της ενδογενούς γήρανσης στο δέρμα καθώς αυτό αποτελεί ιστό εύκολα προσβάσιμο και μελετήσιμο. Η μακροσκοπική και ιστολογική εικόνα της ενδογενούς δερματικής γήρανσης Σε γενικές γραμμές τα μακροσκοπικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά της αμιγώς ενδογενούς γήρανσης είναι ήπια φαινόμενα και διαφέρουν σε πολλά σημεία από αυτά της εξωγενούς. Το δέρμα είναι ήπια ατροφικό, οι ρυτίδες που δημιουργούνται είναι ήπιες, χωρίς τηλεαγγειεκτασίες και υπερκεράτωση, ενώ οι μελαγχρωματικές διαταραχές είναι ελάχιστες. Χαρακτηριστικός είναι και ο γεροντικός κνησμός που ενίοτε είναι ιδιαίτερα βασανιστικός καθώς και η μειωμένη εφίδρωση του δέρματος. Όλα αυτά τα μακροσκοπικά ευρήματα έχουν την προέλευσή τους από το ιστολογικό επίπεδο, στο οποίο και εδώ τα φαινόμενα είναι ήπια. Η κερατίνη στοιβάδα παραμένει σχετικά ανεπηρέαστη, αλλά η επιδερμίδα και η δερμίδα λεπταίνουν, ενώ χαρακτηριστική είναι η αποπλάτυνση του δερματοεπιδερμικού φραγμού που έχει τεράστια σημασία για την προστασία του δέρματος [22]. Ιστολογικά παρατηρείται ακόμη μείωση στον αριθμό και τη βιοσυνθετική ικανότητα των ινοβλαστών [23] και προοδευτική μείωση του ελαστικού ιστού στη θηλώδη δερμίδα [24]. Το δερματικό κολλαγόνο μειώνεται με την ηλικία και οι λεπτές αρχιτεκτονικά δομημένες ίνες του που παρατηρούνται στην παιδική ηλικία γίνονται παθολογικά πυκνές και τυχαία δομημένες [25]. Ο αριθμός και η λειτουργία των σμηγματογόνων και ιδρωτοποιών αδένων μειώνονται δραματικά. Η εξωγενής δερματική γήρανση Η εξωγενής δερματική γήρανση του δέρματος είναι αυτή που προκαλείται από τους εξωγενείς παράγοντες. Οι δύο κύριοι παράγοντες που 12
προκαλούν την εξωγενή δερματική γήρανση είναι η ηλιακή ακτινοβολία και το κάπνισμα. Ο ρόλος του καπνίσματος στην πρόκληση της εξωγενούς γήρανσης είναι απόλυτα τεκμηριωμένος με επιδημιολογικές μελέτες. Η πιο αξιόλογη μελέτη για το ρόλο του καπνίσματος απόδειξε ότι το κάπνισμα είναι ένας ιδιαίτερα σημαντικός παράγοντας [26] στην εξωγενή γήρανση. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι κάπνισμα 20 τσιγάρων την ημέρα για 10 χρόνια ισοδυναμεί με 10 χρόνια χρονολογικής γήρανσης. Η φωτογήρανση Πέρα από τη φυσιολογική πορεία της γήρανσης, οι φωτοεκτεθειμένες περιοχές, όπως το πρόσωπο, ο λαιμός και η ραχιαία επιφάνεια των χειρών αντιμετωπίζουν ένα επιπλέον καταστρεπτικό παράγοντα, την ηλιακή ακτινοβολία και κύρια την UV ακτινοβολία. Η φωτογήρανση αναφέρεται στη διαδικασία που είναι αποτέλεσμα των επιδράσεων της μακρόχρονης έκθεσης στη UV ακτινοβολία και γενικότερα στην ηλιακή ακτινοβολία. Συνήθως η διαδικασία αυτή επηρεάζει ανοιχτόχρωμους στη χροιά του δέρματος πλυθησμούς [27]. Πολλές από τις λειτουργίες του δέρματος που καταστέλλονται με την ηλικία, παρουσιάζουν μια αυξημένη καταστολή στο φωτογηρασμένο δέρμα [28]. Σε άλλο κεφάλαιο της παρούσης διδακτορικής διατριβής αναλύεται διεξοδικά η δράση της UV στο δέρμα. Η κλινική μακροσκοπική εικόνα της φωτογήρανσης Τα κλινικά σημεία που σχετίζονται με τη φωτογήρανση περιλαμβάνουν τις μελαγχρωματικές αλλοιώσεις, τη χαρακτηριστική κίτρινη χροιά του δέρματος, βαθιές ρυτίδες, τηλλεαγγειεκτασία καθώς και ακτινικές προκαρκινικές βλάβες, όπως η ακτινική υπερκεράτωση και δερματικά ακτινικά καρκινώματα, όπως το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα του δέρματος [29-32]. Το γηρασμένο φωτοπροστατεύμενο δέρμα μπορεί να έχει ρυτίδες, αλλά είναι πιο ήπιες, κύρια στα εκφραστικά σημεία, επίσης, είναι λεπτό και δεν δείχνει σημεία ακτινικών βλαβών [33]. Συγκεκριμένοι παθολογικοί φαινότυποι του δέρματος που έχουν άμεση σχέση με την ηλιακή ακτινοβολία και παρατηρούνται πολύ συχνά είναι η ακτινική ελάστωση και το σύνδρομο Favre-Racouchot, το οποίο χαρακτηρίζεται από οζώδη ελάστωση και ηλιακούς φαγέσωρες [34]. Ο όρος ακτινική ελάστωση χρησιμοποιείται για να περιγράψει την παθολογική συγκέντρωση ελαστικών ινών που σχετίζεται άμεσα με την έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία. Η ιστολογική εικόνα της φωτογήρανσης Ιστολογικά το φωτοεκτεθειμένο δέρμα δείχνει μια απώλεια της φυσιολογικής δομής των κερατινοκυττάρων της επιδερμίδας. Συγκεκριμέ- 13
να τα κερατινοκύτταρα χαρακτηρίζονται από ατυπία, ειδικά στα κατώτερα επιδερμιδικά στρώματα [35, 36]. Το πάχος της φωτοπροστατευμένης επιδερμίδας μειώνεται με την ηλικία αν και υπάρχουν αναφορές που τονίζουν ότι μπορεί να παραμένει και σταθερό [36]. Αντίθετα, το πάχος της επιδερμίδας είναι μεγαλύτερο στο φωτοεκτεθειμένο δέρμα [36]. Επίσης, παρατηρείται αποπλάτυνση του δερματοεπιδερμικού φραγμού που μπορεί να οδηγήσει στην ατροφική εμφάνιση του δέρματος, όπως βλέπουμε χαρακτηριστικά στο ποικιλόδερμα [36]. Γενικά οι κυτταρικοί πληθυσμοί της δερμίδας στη φωτογήρανση αυξάνονται. Οι ινοβλάστες είναι πολυάριθμοι και παθολογικά υπερπλαστικοί [37] και τα φλεγμονώδη φαινόμενα είναι έντονα. Η κλινική και ιστολογική αυτή εικόνα χαρακτηρίζεται ως ηλιοδερματίτιδα [38]. Η μικροαγγείωση παρουσιάζει και αυτή παθολογικές αλλαγές [39] και τα αγγειακά τοιχώματα είναι παχυσμένα με εναπόθεση με υλικό που μοιάζει δομικά με αυτό της βασικής μεμβράνης [38]. Οι ινοβλάστες του φωτοεκτεθειμένου δέρματος είναι, επίσης, επιμηκυσμένοι και κατακερματισμένοι [40]. Μείωση του δερματικού κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ παρατηρείται στο φυσιολογικό γηρασμένο δέρμα. Παρόλα αυτά, η μείωση αυτή επιταχύνεται ραγδαία στις φωτοεκτεθειμένες περιοχές. Η περιεκτικότητα σε ελαστικές ίνες μειώνεται με την ηλικία, ενώ στη φωτογήρανση η ποσότητα της ελαστίνης αυξάνεται ανάλογα με την ποσότητα της συνολικής ηλιακής ακτινοβολίας. Η παραγωγή ελαστίνης έχει αποδειχθεί ότι επάγεται in vitro από UV ακτινοβόληση [41]. Η ελαστίνη, όμως, στο φωτογηρασμένο δέρμα παρουσιάζεται ανώμαλη και φαίνεται να κατέχει τις περιοχές που υπό φυσιολογικές συνθήκες κατείχε το κολλαγόνο. Έχει υποστηριχθεί ότι το φαινόμενο αυτό οφείλεται σε μια διφασική διαδικασία, στην οποία αρχικά παρατηρείται παθολογική υπερπλασία του φυσιολογικού ελαστικού ιστού. Στη συνέχεια, η ελαστίνη αυτή γίνεται δομικά και λειτουργικά ανώμαλη εξαιτίας των χρόνιων φλεγμονωδών φαινομένων [42]. 14
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΤΟ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΣΤΡΩΜΑ ΤΟΥ ΣΥΝΔΕΤΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ ΤΗΣ ΔΕΡΜΙΔΑΣ Γενικά Η δερμίδα έχει τις δομικές και λειτουργικές ιδιότητες του χαλαρού συνδετικού ιστού. Η γενική δομή και σύστασή της φαίνεται στην Εικόνα 1. Το εξωκυττάριο στρώμα (extracellular matrix, ECM) της είναι ένα πολύπλοκο σύμπλεγμα μορίων, κυρίως πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών και συνεισφέρει στη δομή και τη λειτουργία της. Οι πολυσακχαρίτες που κύρια βρίσκονται στο εξωκυττάριο στρώμα είναι οι γλυκοζαμινογλυκάνες, οι οποίες συνδέονται με πρωτεΐνες για να σχηματίσουν πρωτεογλυκάνες. Η δομή τους και η σημασία τους αναλύονται σε άλλο κεφάλαιο. Οι πρωτεΐνες του χωρίζονται σε δομικές και πρωτεΐνες που έχουν ρόλο σύνδεσης με άλλα μόρια. Οι δομικές πρωτεΐνες κατά κύριο λόγο είναι το κολλαγόνο, η ελαστίνη και οι δικτυωτές ίνες, ενώ από τις πρωτεΐνες σύνδεσης κύρια ανευρίσκονται η ινωδονεκτίνη, η λαμινίνη και μικρές γλυκοπρωτεΐνες, όπως οι σελεκτίνες και οι καντχερίνες. Οι πρωτεΐνες σύνδεσης είναι απαραίτητες για την αλληλεπίδραση των κυττάρων μεταξύ τους, την αλληλεπίδραση κυττάρου-εξωκυτταρίου στρώματος και τη λειτουργική σύνδεση δερμίδας και βασικής μεμβράνης. Η σύσταση του εξωκυτταρίου στρώματος έχει επίδραση στη μετανάστευση, το σχήμα, στην απόπτωση, στη σύνδεση και στην πολικότητα των κυττάρων. ΕΠΙΘΗΛΙΟ ΒΑΣΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΣΥΝΔΕΤΙΚΟΣ ΙΣΤΟΣ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ΜΑΚΡΟΦΑΓΟ ΤΡΙΧΟΕΙΔΕΣ ΙΝΟΒΛΑΣΤΗΣ ΕΛΑΣΤΙΝΗ ΜΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΟ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ, ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ ΚΑΙ ΓΛΥΚΟΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Εικόνα. 1. Η γενική δομή και η σύσταση της δερμίδας. Απεικονίζονται τα σημαντικότερα κύτταρα, ο συνδετικός ιστός καθώς και η βασική μεμβράνη και το επιθήλιο. 15
Η σύνδεση της δερμίδας με τη βασική μεμβράνη είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη νοσολογία του δέρματος και έχει μεγάλη σημασία και για τη γήρανσή του, όπως θα αναλυθεί στη συνέχεια. Στη σύνδεση αυτή και στο σχηματισμό της βασικής μεμβράνης έχουν μεγάλη εμπλοκή και τα μόρια του εξωκυτταρίου στρώματος όπως φαίνεται στη Εικόνα 2. ΝΙΔΟΓΕΝΗ ΠΕΡΛΕΚΑΝΗ ΛΑΜΙΝΙΝΗ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ ΤΥΠΟΥ ΙV ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΗ Εικόνα 2. (Α) Τρισδιάστατο μοντέλο της βασικής μεμβράνης, η οποία σχηματίζεται από την αλληλεπίδραση πολλών πρωτεϊνών, όπως το κολλαγόνο τύπου ΙV, η λαμινίνη, το νιδογόνο και η πρωτεογλυκάνη περλεκάνη. Διαμεμβρανικοί υποδοχείς λαμινίνης, οι ιντεγκρίνες, οργανώνουν τη διαμόρφωση της βασικής μεμβράνης. (Β) Τα βέλη υποδεικνύουν μόρια που συνδέονται απευθείας μεταξύ τους. Ακολούθως θα περιγραφούν δύο πρωτεΐνες σύνδεσης γιατί ο ρόλος τους στο δέρμα είναι σημαντικός. Ινωδονεκτίνη Είναι πρωτεΐνη που λειτουργεί στον εξωκυττάριο χώρο και «συναρμολογεί» ελαστικές ίνες. Συνδέεται με τις κυτταρικές επιφάνειες και με το κολλαγόνο, την ελαστίνη, την ηπαρίνη και την ακτίνη. Συμμετέχει στις αλληλεπιδράσεις κυττάρων, στη διατήρηση του σχήματος του κυττάρου και στην επούλωση. Λαμινίνη Είναι μία σύνθετη γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από 3 διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλύσους, τις α, β και γ. Θεωρείται ότι ρυθμίζει τη 16
μετανάστευση και οργάνωση των κυττάρων στους ιστούς κατά την εμβρυική ανάπτυξη αλληλεπιδρώντας με τα υπόλοιπα μόρια του ECM. Τα σημαντικότερα μόρια του εξωκυτταρίου στρώματος αναλύονται στο γενικό μέρος της παρούσης διδακτορικής διατριβής και μελετάται ο ρόλος τους στη δερματική κυτταρική γήρανση. 17
18
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΟΙ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΑΣΕΣ ΚΑΙ ΟΙ ΙΣΤΙΚΟΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΟΥΣ Οι μεταλλοπρωτεάσες ή μεταλλοπρωτεϊνάσες (matrix metalloproteinases, MMP) αποτελούν μια οικογένεια δομικά και λειτουργικά παρόμοιων ενδοπεπτιδασών, εξαρτώμενων από την ύπαρξη ψευδαργύρου [43]. Οι MMP έχουν την ικανότητα να ανασχηματίζουν στοιχεία των ιστών προκαλώντας την πρωτεολυτική αποδόμηση των μορίων του εξωκυτταρίου στρώματος και των στοιχείων της βασικής μεμβράνης, σε φυσιολογικό ph. Είναι λοιπόν σε θέση να αποδομούν in vitro και in vivo όλα τα συστατικά του εξωκυτταρίου στρώματος όπως κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες, ινωδονεκτίνη και λαμινίνη και, έτσι, συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες, όπως η εμβρυική ανάπτυξη, η επούλωση τραυμάτων, η εγκυμοσύνη και η αύξηση του οργανισμού [44]. Από την άλλη, διαταραχές της φυσιολογικής τους δραστηριότητας εμπλέκονται σε παθολογικές διεργασίες, όπως ρευματοειδής αρθρίτιδα και οστεοαρθρίτιδα, αθηροσκλήρωση, ίνωση, μετάσταση, νεοαγγειογένεση, πομφολυγώδη επιδερμόλυση, ερπητοειδή δερματίτιδα [45-49]. Η ανάπτυξη αναστολέων των MMP αποτελεί ελκυστικό στόχο φαρμακολογικής παρέμβασης και ελπιδοφόρο προσέγγιση για τη θεραπεία αυτών των παθήσεων [50, 51]. Η οικογένεια των MMP αποτελείται από τουλάχιστον 26 συγγενούς δομής μεταλλοενδοπεπτιδάσες ψευδαργύρου, των οποίων είναι γνωστό το γονίδιο που τις εκφράζει. Συμβολίζονται με το σύμβολο MMP και έναν αριθμό. Ομαδοποιούνται ανάλογα με τη δομή τους, το μοριακό τους βάρος, τα υποστρώματα τα οποία αποδομούν και την προέλευσή τους [52]. Η δομή των MMP Όλες οι MMP (Εικόνα 3) έχουν μια βασική κοινή πολυτμηματική δομή αλλά παρουσιάζουν και διαφορές που φαίνεται να έχουν άμεση σχέση με την ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα, τη δράση τους και την ενεργότητά τους [53]. Οι MMP συντίθενται ως προ-προ-ένζυμα και εκκρίνονται ως ανενεργείς προ-mmp. Αυτές οι ανενεργείς προ-mmp αποτελούνται τουλάχιστον από τρία τμήματα (Εικόνα 3) [54]. Το πρώτο είναι ένα προπεπτιδικό τμήμα που αποτελείται περίπου από 80 αμινοξέα και περιέχει ένα μόριο κυστεΐνης. Το τμήμα αυτό έχει σχήμα αυγού και αποτελείται από 3 κάθετες α-έλικες και ένα τμήμα που συνδέεται με την καταλυτική περιοχή (Εικόνα 4). Η κυστεΐνη συνδέεται με τον ψευδάργυρο του καταλυτικού τμήματος, ώστε να διατηρείται η ανενεργότητα των προ- MMP [55, 56]. Παρά τη σύνδεση αυτή, η ενεργός περιοχή 19
του καταλυτικού τμήματος σε αυτήν την προ-ενεργή μορφή είναι εκπληκτικά όμοια σε δομή με αυτήν του ώριμου ενζύμου. Η ενεργοποίηση των προ-mmp από άλλες πρωτεϊνάσες φαίνεται να εμπλέκει μηχανισμούς που ως τελικό αποτέλεσμα έχουν την καταστροφή του δεσμού κυστεΐνης - καταλυτικού ψευδαργύρου [57]. Αυτή είναι και η θεωρία του «διακόπτη της κυστεΐνης». Το δεύτερο είναι το καταλυτικό τμήμα και αποτελείται από περίπου 170 αμινοξέα. Έχει σχήμα ελλειψοειδές, ελαφρώς πλατυσμένο στους πόλους. Αποτελείται από 5 β-πτυχές, 3 α-έλικες και αγκύλες που συνδέουν τα τμήματα αυτά. Περιέχει, επίσης, έναν καταλυτικό ψευδάργυρο (Zn), ένα δομικό Zn και 2 ή 3 ιόντα ασβεστίου που είναι απαραίτητα για τη σταθερότητα και την έκφραση της ενζυματικής δραστηριότητας. Μια περιοχή που περιέχει μεθειονίνη ονομάζεται «Met-στροφή» και είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της δομής γύρω από τον καταλυτικό Zn [58]. Στις MMP- 2 και MMP-9 υπάρχουν ακόμη 3 περιοχές ινωδονεκτίνης τύπου 2 [59]. Το τρίτο τμήμα είναι ένα C-τελικό άκρο με ομολογία προς την πρωτεΐνη αιματοξυλίνη και υπάρχει σε όλες τις MMP εκτός της MMP-7. Αποτελείται από περίπου 210 αμινοξέα και έχει ένα ελλειψοειδές δισκοειδές σχήμα με 4 λεπιδωτές β-δομές που η κάθε μια αποτελείται από 4 αντιπαράλληλες β-πτυχές και μια α-έλικα [60]. Το τμήμα αυτό φαίνεται να έχει άμεση σχέση με την ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα [61]. Σημαντική δομική διαφοροποίηση παρατηρείται στις μεταλλοπρωτεάσες μεμβρανικού τύπου (ΜΤ-ΜΜP) οι οποίες, σε αντίθεση με τις υπόλοιπες μεταλλοπρωτεάσες, είναι συνδεδεμένες με την κυτταρική μεμβράνη διαθέτοντας ένα επιπλέον διαμεμβρανικό και ενδοκυτταροπλασματικό τμήμα, το οποίο είναι χαρακτηριστικό για αυτές [62]. ΠΡΟΠΕΠΤΙΔΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΣΥΝΔΕΣΜΟΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΜΗΜΑ ΟΜΟΛΟΓΟ ΠΡΟΣ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗ Εικόνα. 3. Τρισδιάστατο μοντέλο της γενικής δομής των προ-mmp. Απεικονίζονται τα τρία κύρια δομικά τμήματα καθώς και οι 4 λεπιδωτές β-δομές του C-τελικού τμήματος που έχει ομολογία προς την αιματοξυλίνη (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV). 20
Εικόνα. 4. Τα δομικά τμήματα των MMP. Διακρίνονται σχηματικά τα τρία κύρια τμήματα καθώς και επιμέρους τμήματα που συνεισφέρουν στη σύνδεση των κύριων μερών ή αποτελούν μοναδικά τμήματα ορισμένων μόνο MMP (π.χ. GPI άγκυρα). Ταξινόμηση των MMP με βάση τη δομή τους Όλα τα παραπάνω δεδομένα σχετικά με τη δομή των μεταλλοπρωτεασών δείχνουν ότι αυτές ακολουθούν ένα κοινό δομικό μοτίβο αλλά έχουν και σημαντικές δομικές διαφορές που έχουν άμεσο αντίκτυπο στη λειτουργία τους, τη δραστικότητά τους και την ειδικότητά τους με το υπόστρωμα. Με βάση, λοιπόν, τις πληροφορίες για τη δομή τους ταξινομούνται σε κατηγορίες. Στην Εικόνα 5 φαίνονται τα διάφορα δομικά τμήματα των μεταλλοπρωτεασών, καθώς και η κατάταξή τους με βάση τη δομή. 21
ΤΑ ΔΟΜΙΚΑ ΤΜΗΜΑΤΑ ΤΩΝ MMPs ΠΕΠΤΙΔΙΟ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΠΡΟΠΕΠΤΙΔΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΜΗΜΑ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ ΦΟΥΡΙΝΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΙΝΩΔΟΝΕΚΤΙΝΗΣ ΤΥΠΟΥ 2 ΜΤ ΑΓΚΥΛΗ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΗ ΟΥΡΑ Ν-ΤΕΛΙΚΗ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΗ ΑΓΚΥΡΑ ΚΥΣΤΕΙΝΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ MMPs ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΗ ΔΟΜΗ IG ΟΜΟΛΟΓΟ ΤΜΗΜΑ GPI ΑΓΚΥΡΑ ΕΛΑΧΙΣΤΟ ΔΟΜΙΚΟ ΜΟΤΙΒΟ ΚΟΛΛΑΓΟΝΑΣΕΣ, ΣΤΡΩΜΑΛΥΣΙΝΕΣ ΚΑΙ ΆΛΛΕΣ MMPs ΖΕΛΑΤΙΝΑΣΕΣ MMPs ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΜΕΝΕΣ ΑΠΌ ΦΟΥΡΙΝΗ MMPs ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ MMPs ΜΕ GPI ΑΓΚΥΡΑ ΔΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ MMPs ΤΥΠΟΥ 2 Εικόνα. 5. Σχηματικά αναπαρίστανται τα δομικά τμήματα των MMP καθώς και η ταξινόμησή τους με βάση τη δομή. Ταξινόμηση των MMP με βάση το υπόστρωμά τους Με βάση το υπόστρωμά τους και τη βιοδραστικότητά τους οι MMP ταξινομούνται σε 5 κατηγορίες: (1). κολλαγονάσες,(2). ζελατινάσες Α και Β, (3). στρωμαλυσίνες 1 και 2, (4). μια πιο ετερογενή ομάδα που περιλαμβάνει την MMP-7, MMP-20, MMP-12 και MMP-19 και (5). τις μεμβρανικού τύπου MMP. Στον Πίνακα Ι φαίνεται η ταξινόμηση αυτή, καθώς και η χρωμοσωμική τοποθεσία των γονιδίων των MMP στον άνθρωπο. 22
Πίνακας Ι. ΜΜP των θηλαστικών και υποστρώματα Πρωτεάση Αρίθμηση MMP Θέση χρωμοσώματος (στον άνθρωπο) Υπόστρωμα εξωκυττάριου χώρου Ενεργοποίηση προ-mmp Κολλαγονάσες Κολλαγονάση-1 (κολλαγονάση των ιστών, interstitial collagenase) ΜΜΡ-1 11q22-q23 Κολλαγόνο τύπου: III > I > II, VII, Χ, ζελατίνη, αγγρεκάνη, εντακτίνη, tenascin, περλεκάνη προ-mmp-1 προ-mmp-2 Κολλαγονάση-2 (κολλαγονάση των ουδετερόφιλων) Κολλαγονάση-3 Κολλαγονάση-4, xcol4 (Xenopus) (δεν υπάρχει ανάλογο στον άνθρωπο) ΜΜΡ-8 ΜΜΡ-13 ΜΜΡ-18 11 q21 -q22 11q22.3 Κολλαγόνο τύπου: Ι > II > III, VII, Χ, ζελατίνη, αγγρεκάνη, tenascin Κολλαγόνο τύπου: II > III > Ι, VII, Χ, ζελατίνη, αγγρεκάνη, εντακτίνη, Tenascin Κολλαγόνο τύπου: Ι, II, III, ζελατίνη προ-mmp-8 προ-mmp-9 προ-mmp-13 Ζελατινάσες Ζελατινάση Α, (72- kda ζελατινάση, 72- kda κολλαγονάση τύπου IV) ΜΜΡ-2 16q13 Αποδομημένο κολλαγόνο (ζελατίνη), κολλαγόνο τύπου: Ι, IV, V, VII, Χ, XI, ελαστίνη, ινονσυνδετίνη (fibronectin), λαμινίνη-5, αγγρεκάνη, μπρεβικάνη, νευροκάνη, ντεκορίνη, υαλοσυνδετίνη (vitronectin) προ-mmp-1 προ-mmp-2 προ-mmp-13 Ζελατινάση Β, (92- kda ζελατινάση) ΜΜΡ-9 20q11.2-q13.1 Αποδομημένο κολλαγόνο (ζελατίνη), κολλαγόνο τύπου: Ι, IV, V, VII, Χ, XI, ελαστίνη, ινονσυνδετίνη, λαμινίνη-5, αγγρεκάνη, υαλονεκτίνη προ-mmp-2 προ-mmp-9 προ-mmp-13 Μεμβρανικού τύπου ΜΜΡ ΜΤ1-ΜΜΡ ΜΜΡ-14 14q11-q12 Κολλαγόνο τύπου: Ι, II, III, ζελατίνη, ινονσυνδετίνη, υαλονεκτίνη, αγγρεκάνη προ-mmp-2 προ-μμρ-13 ΜΤ2-ΜΜΡ ΜΜΡ-15 16q13-q21 Πρωτεογλυκάνες προ-mmp-2 ΜΤ3-ΜΜΡ ΜΜΡ-16 8q21 Κολλαγόνο τύπου: III, ινονσυνδετίνη προ-mmp-2 ΜΤ4-ΜΜΡ ΜΜΡ-17 12q24.3 Ζελατίνη, ινώδες / ινωδογόνο προ-mmp-2 ΜΤ5-ΜΜΡ ΜΜΡ-24 20q11.2 Ινονσυνδετίνη, πρωτεογλυκάνες, ζελατίνη προ-mmp-2 ΜΤ6-ΜΜΡ, Λευκολυσίνη (Leukolysin) ΜΜΡ-25 16p13.3 Κολλαγόνο τύπου IV, ζελατίνη, ινονσυνδετίνη, πρωτεογλυκάνες θεϊκής δερματάνης και κερατάνης, λαμινίνη-1, ινώδες / ινωδογόνο προ-mmp-2 προ-mmp-9 23
Πρωτεάση Στρωμαλυσίνες Στρωμαλυσίνη-1 (πρωτεογλυκανάση, proteoglycanase) Στρωμαλυσίνη-2 Στρωμαλυσίνη-3 Ματριλυσίνες Αρίθμηση MMP ΜΜΡ-3 ΜΜΡ-10 ΜΜΡ-11 Θέση χρωμοσώματος (στον άνθρωπο) 11q23 11q22.3-q23 22q11.2 Υπόστρωμα εξωκυττάριου χώρου Αγγρεκάνη, λαμινίνη, λαμινίνη, ινονσυνδετίνη, περιοχές χωρίς τριπλή έλικα φυσιολογικών κολλαγόνων τύπου: II, III, IV, V, IX, Χ, XI, ζελατίνη, εντακτίνη, περλεκάνη, ντεκορίνη, tenascin, υαλονεκτίνη, ινώδες / ινωδογόνο, ελαστίνη Ζελατίνη, κολλαγόνο τύπου: I, III IV, V, ινονσυνδετίνη, πρωτεογλυκάνες ινονσυνδετίνη, λαμινίνη, αγγρεκάνη Ενεργοποίηση προ-mmp προ-mmp-1 προ-mmp-3 προ-mmp-7 προ-mmp-8 προ-mmp-9 προ-mmp-13 προ-mmp-1 προ-mmp-8 προ-mmp-10 Ματριλυσίνη (PUMP-1) ΜΜΡ-7 11q21-q22 ινονσυνδετίνη, λαμινίνη, περιοχές χωρίς τριπλή έλικα φυσιολογικών κολλαγόνων τύπου: IV, V, IX, Χ, XI, ζελατίνη, αγγρεκάνη, εντακτίνη, tenascin, υαλονεκτίνη, ινώδες / ινωδογόνο προ-mmp-1 προ-mmp-2 προ-mmp-7 προ-mmp-9 Ματριλυσίνη-2, (Endometase) Άλλες ΜΜΡ ΜΜΡ-26 11p15 Κολλαγόνο τύπου IV, ζελατίνη, ινονσυνδετίνη, ινώδες / ινωδογόνο προ-mmp-9 Μεταλλοελαστάση (ελαστάση των μακροφάγων) ΜΜΡ-12 11q22.2-q22.3 Ελαστίνη, ινονσυνδετίνη, λαμινίνη, πρωτεογλυκάνες, ινώδες / ινωδογόνο Στρωμαλυσίνη-4 (RASI) ΜΜΡ-19 12q14 Κολλαγόνο τύπου IV, ζελατίνη, λαμινίνη, ινονσυνδετίνη, tenascin, εντακτίνη, αγγρεκάνη, ινώδες/ ινωδογόνο Εναμελυσίνη (Enamelysin) ΜΜΡ-20 11q22.3 Αδαμαντινίνη (amelogenin), αγγρεκάνη ΧΜΜΡ (Xenopus) ΜΜΡ-21 Δεν έχει διευκρινισθεί CMMP (ορνίθια) -ανάλογο ανθρώπου ΜΜΡ- 22a,b/ ΜΜΡ-27 11q24 Δεν έχει διευκρινισθεί CA-MMP ΜΜΡ-23 1p36.3 Ζελατίνη Επίλυσίνη (Epilysin) ΜΜΡ-28 17q11.2 Δεν έχει διευκρινισθεί 24
Η ενεργοποίηση των MMP Όλες οι MMP παράγονται σε ανενεργό μορφή, απολύτως ανίκανη να διασπάσει οποιοδήποτε μόριο πρωτεΐνης. Είναι αναγκαία, λοιπόν, η ενεργοποίησή τους, ώστε να αποκτήσουν πρωτεολυτική ικανότητα. Η ενεργοποίηση αυτή μπορεί να γίνει με πρωτεϊνάσες ή in vitro με χημικές μεθόδους [63], όπως οξειδωμένη γλουταθειόνη, SDS, χαοτροπικά ιόντα και άλατα χρυσού. Χαμηλό ph και θερμική επεξεργασία μπορούν, επίσης, να οδηγήσουν σε ενεργοποίηση. Όλοι αυτοί οι παράγοντες για να επιτύχουν την ενεργοποίηση προκαλούν διαταραχή της αλληλεπίδρασης κυστεΐνης-ψευδαργύρου και «άνοιγμα» του «διακόπτη της κυστεΐνης» [64, 65]. Η πρακτική αξία του γεγονότος αυτού έγκειται στο ότι ένα φάρμακο που θα είχε παρόμοια δράση με το πεπτίδιο που περιέχει την κυστεΐνη θα μπορούσε να παρεμποδίσει την ενεργοποίηση της MMP. In vivo μετά τη διαταραχή της αλληλεπίδρασης αυτής, ακολουθεί ενεργοποίηση από μερικώς ενεργοποιημένα διαμεσολαβητικά μόρια των MMP ή από άλλες ενεργές MMP [66]. Άρα, το τελικό στάδιο της ενεργοποίησης πραγματοποιείται από μια MMP. Η Εικόνα 6 παρουσιάζει σχηματικά την ενεργοποίηση αυτή από πρωτεϊνάσες ή μη πρωτεολυτικούς παράγοντες. ΠΡΩΤΕΟΛΥΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ Πρωτεινάσες ΜΜP ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΗΤΕΣ ΠΡΟ ΜΜP ΧΗΜΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΜP ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΟΣ MMP XHMIKH ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ Εικόνα. 6. Οι δύο οδοί ενεργοποίησης των MMP. Διακρίνεται ο «διακόπτης κυστεΐνης». Παρατηρήστε το ότι και οι δύο οδοί καταλήγουν σε τελική ενεργοποίηση από MMP διαμεσολαβητές. Η πλασμίνη παράγεται από το πλασμινογόνο με τη δράση του ιστι- 25
κού παράγοντα ενεργοποίησης πλασμινογόνου και του παράγοντα ενεργοποίησης πλασμινογόνου της ουροκινάσης. Και οι δύο αυτοί παράγοντες ενεργοποίησης σχετίζονται με την κυτταρική μεμβράνη και άρα προκαλούν τοπική προ-mmp ενεργοποίηση. Η πλασμίνη έχει βρεθεί ότι ενεργοποιεί την προmmp-1, προmmp-3, προmmp-7, προmmp-9, προmmp-10 και προmmp-13 [67]. Ο έλεγχος της δραστηριότητας των MMP Η δραστηριότητα των ΜΜP ελέγχεται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Πολλές MMP ελέγχονται σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων. Αυξητικοί παράγοντες, κυτταροκίνες, χημικοί παράγοντες, στρες προάγουν την έκφραση των γονιδίων, ενώ ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας (transforming growth factor, TGF-β), τα ρετινοϊκά οξέα και τα γλυκοκορτικοειδή μειώνουν την έκφραση αυτή [68]. Τελευταίες μελέτες τονίζουν ότι όχι μόνο διαλυτά μόρια αλλά και αλληλεπιδράσεις κυττάρου-εξωκυτταρίου στρώματος και κυττάρου-κυττάρου έχουν ρόλο κλειδί στην επαγωγή των γονιδίων [69-71]. Οι προάγουσες τη φλεγμονή κυτταροκίνες TNF-α και IL-1 προάγουν την έκφραση της MMP-1 [72]. Η έκθεση σε UVB προάγει τη γονιδιακή έκφραση των MMP-1, MMP-9 και MMP-3 σε ανθρώπειους δερματικούς ινοβλάστες [73]. Οι περισσότερες MMP εκφράζονται με τη μορφή ζυμογόνων και η δραστηριότητά τους σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο ελέγχεται στον εξωκυττάριο χώρο μέσω συντονισμένου ελέγχου. Ένα σημαντικό στοιχείο του ελέγχου αυτού αποτελεί και η απενεργοποίηση των ενεργών ενζύμων από τους ειδικούς ιστικούς αναστολείς των MMP (TIMP). Οι ειδικοί ιστικοί αναστολείς των MMP (TIMP) Oι TIMP είναι πρωτεΐνες που αναστέλλουν ειδικά τις MMP και αποτελούν τους κύριους ενδογενείς ιστικούς ρυθμιστές της δραστηριότητας τους. Μέχρι σήμερα έχουν ανιχνευθεί 4 ομόλογες TIMP (TIMP-1 έως -4) [74]. Αποτελούνται από δύο διακριτά δομικά και λειτουργικά τμήματα. Το Ν-τελικό τμήμα από μόνο του είναι ικανός αναστολέας όλων των MMP μέσω αλληλεπιδράσεων με το καταλυτικό τους τμήμα [75]. Το C-τελικό τμήμα έχει τουλάχιστον δύο θέσεις για σύνδεση ενζύμου, μια για τη ζελατινάση Α και μια για τη στρωμαλυσίνη 1. Ο βαθμός αναστολής για κάθε ένζυμο αυξάνεται ανάλογα με την αλληλεπίδρασή του με το C-τελικό αυτό τμήμα (Εικόνα 7). Οι TIMP αναστέλλουν όλες τις μέχρι σήμερα γνωστές MMP με την εξαίρεση του TIMP-1 που δεν αναστέλλει την MT1-MMP [76]. Η αναστολή αυτή επιτυγχάνεται κατά μη αντιστρεπτό τρόπο, με το σχημα- 26
τισμό στοιχειομετρικού συμπλόκου 1:1 με τις ενεργείς MMP. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του TIMP-3 είναι ότι συνδέεται ισχυρά με τις θειούχες γλυκοζαμινογλυκάνες (GAG) [77]. Η έκφραση των TIMP αυξάνεται από κυτταροκίνες (ΙL-1, -6, -11), αυξητικούς παράγοντες (TGF-β), ορμόνες και ρετινοειδή [78, 79]. Η ισορροπία MMP/TIMP είναι ιδιαίτερα κρίσιμη για την εύρυθμη αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού και φαίνεται ότι η διαταραχή της εμπλέκεται σε πολλά νοσήματα. Εικόνα. 7. Τρισδιάστατο μοντέλο της αναστολής των MMP από TIMP. Απεικονίζεται η TIMP-2 και το καταλυτικό τμήμα της MT1-MMP. Αριστερά επάνω απεικονίζεται η TIMP-2 ενώ αριστερά κάτω το καταλυτικό τμήμα της MT1-MMP. Οι β-πτυχές ονομάζονται από A J και οι α-έλικες από 1-4. το σημείο τη αλληλεπίδρασης με το καταλυτικό τμήμα απεικονίζεται μέσα στο τετράγωνο. Ο καταλυτικός Zn απεικονίζεται ως μια ροζ σφαίρα. Τα καταλυτικά μόρια κυστεΐνης απεικονίζονται με Cys. Στα δεξιά της εικόνας φαίνεται το τελικό σύμπλοκο που σχηματίζεται με στοιχειομετρία 1:1. Οι MMP και TIMP στο δέρμα και τη νοσολογία του Ο ρόλος των MMP και των TIMP στο δέρμα είναι ιδιαίτερα σημαντικός. Θα αναφερθούν σημαντικά παραδείγματα για το ρόλο αυτό στη νοσολογία του δέρματος. Το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα του δέρματος (BCC) είναι ο πιο συχνός δερματικός όγκος στους ανθρώπους, κυρίως τους ηλικιωμένους και έχει άμεση αιτιολογική σχέση με την αθροιστική έκθεση στην ηλιακή ακτινο- 27
βολία και κυρίως στη UVB ακτινοβολία [80]. Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) είναι κακοήθης όγκος των κερατινοκυττάρων της ακανθωτής στοιβάδας της επιδερμίδας. Είναι ο δεύτερος συχνότερος δερματικός όγκος και έχει αποδεδειγμένα άμεση αιτιολογική σχέση με την αθροιστική έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία [81, 82]. Οι μέχρι τώρα μελέτες έχουν αποδείξει την εκτεταμένη καταστροφή μορίων του εξωκυττάριου στρώματος, όπως της ινωδονεκτίνης και της λαμινίνης, κατά τη διάρκεια της επιθηλιακής κυτταρικής διείσδυσης του όγκου [83]. Επίσης, έχει διαπιστωθεί η καταστροφή του φυσιολογικού στρώματος του κολλαγόνου και η αποδιοργάνωσή του από τις κολλαγονάσες, φαινόμενο που έχει ιδιαίτερη σημασία για τη διεισδυτική ικανότητα του όγκου [84]. Μεταλλοπρωτεάσες με δραστηριότητα υαλουρονιδάσης είναι, επίσης, αυξημένες. Συγκεκριμένα οι MMP-2 και MMP-9 δείχνουν αυξημένη έκφραση στο βασικοκυτταρικό καρκίνωμα [85]. Επίσης, οι TIMP, έχουν βρεθεί αυξημένες στο βασικοκυτταρικό καρκίνωμα. Σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, η κύρια αναστολή των MMP οφείλεται στην αυξημένη έκφραση του TIMP-1. Στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του TIMP-2 έχουν βρεθεί σε λιγότερο διεισδυτικά BCC σε σύγκριση με διεισδυτικά BCC και SCC [86]. Στο SCC εκφράζονται πολλές MMP σε όλα τα όργανα [87]. Το επίπεδο της ενεργής MMP-2 μπορεί να εξυπηρετήσει ως προγνωστικός παράγοντας της μεταστατικής δύναμης του όγκου στο SCC της στοματικής κοιλότητας [88]. Επίσης, η αυξημένη ενεργότητα των MMP-2 και -9 έχει συσχετιστεί με αυξημένη διεισδυτικότητα στο SCC και μικρότερο διάστημα ελεύθερο νόσου [89, 90]. Επίσης, το επίπεδο των MMP-2 και -9 είχε στατιστικώς σημαντική αυξημένη έκφραση στο δερματικό SCC σε σύγκριση με το BCC [91]. Γενικά, οι TIMP δείχνουν μια δραστηριότητα αυξητικών παραγόντων και αναστέλλουν τον ογκογενετικό και μεταστατικό φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων [92]. Μη επουλωμένα έλκη φαίνεται να αναπτύσσουν ένα μικροπεριβάλλον πλούσιο σε MMP, το οποίο μάλλον οδηγεί σε αποτυχία της επιτυχούς φυσιολογικής επούλωσης. Το μελάνωμα είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό παράδειγμα. Μεταναστευτικά ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν MMP που φαίνονται να είναι απαραίτητες για τον κατακερματισμό της βασικής μεμβράνης και του εξωκυτταρίου στρώματος [93]. Αναστολή της ενδογενούς MMP-2 σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος οδήγησε σε αυξημένη κυτταρική συνοχή [94]. Ο ρόλος των MMP και TIMP στη γήρανση του δέρματος παρόλα αυτά δεν έχει μελετηθεί επαρκώς και μένουν ακόμη πολλά αναπάντητα ερωτήματα που έχουν να κάνουν με τις διαφορές ενδογενούς και εξωγενούς δερματικής γήρανσης και με τη συμμετοχή των μορίων αυτών στην αναδιαμόρφωση του εξωκυτταρίου στρώματος. 28
Η σύγχρονη θεραπευτική σε συνάρτηση με MMP και TIMP Ο σχεδιασμός συνθετικών ειδικών αναστολέων για τις MMP είναι στόχος τόσο του παρόντος όσο και του μέλλοντος. Η δημιουργία συνθετικών αναστολέων των MMP τα τελευταία χρόνια έχει πραγματοποιηθεί και οι αναστολείς αυτοί βρίσκονται σε ποικίλα στάδια κλινικών δοκιμών. Δύο από αυτούς τους αναστολείς, η βατιμαστάτη και η μαριμαστάτη έχουν φθάσει ως το 3 στάδιο των κλινικών δοκιμών, αλλά δυστυχώς δεν προχώρησαν λόγω τοξικότητας. Η βατιμαστάτη είναι ένας χαμηλού μοριακού βάρους αναστολέας της δραστηριότητας των MMP. Φαίνεται να αναστέλλει την αύξηση του όγκου σε ποντίκια χωρίς θύμο με μελάνωμα [95]. Η μαριμαστάτη ανήκει στη δεύτερη γενεά των χαμηλού μοριακού βάρους αναστολέων της δραστηριότητας των MMP. Φαίνεται ότι και αυτή αναστέλλει την ανάπτυξη του μελανώματος στο προαναφερθέν ζωικό μοντέλο [96]. Οι κλινικές δοκιμές και η προσπάθεια για ανάπτυξη ειδικότερων αναστολέων είναι κάτι που θα απασχολήσει τη σύγχρονη φαρμακολογία στο μέλλον. 29
30
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΟΙ ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΟΓΛΥΚΑΝΕΣ Οι γλυκοζαμινογλυκάνες Οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAG) είναι όξινοι, γραμμικοί ετεροπολυσακχαρίτες που περιέχουν μια επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα, η οποία αποτελείται από μια Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη ή Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη και από ένα γλυκουρονικό ή ιδουρονικό οξύ (Εικόνα 8). Βρίσκονται κύρια στην επιφάνεια των κυττάρων και στο εξωκυττάριο στρώμα. ~1 nm ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΟ/ ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛΟΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΗ/ ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΙΝΗ Εικόνα 8. Η επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα από την οποία αποτελούνται οι GAG. Εξ αιτίας του καρβοξυλικού οξέος και των σουλφυδρυλικών ομάδων, οι GAG είναι ιδιαίτερα αρνητικά φορτισμένες. Η ιδιότητα αυτή προσδίδει στις GAG την ικανότητα να ελκύουν σύννεφα κατιόντων, κυρίων νατρίου, τα οποία τις επιτρέπει να κατακρατούν μεγάλες ποσότητες νερού. Αυτό προσδίδει στο εξωκυττάριο στρώμα τη δυνατότητα να αντέχει σε συμπιεστικές δυνάμεις, σε αντίθεση με το κολλαγόνο που προσδίδει αντοχή σε εκτατικές δυνάμεις. επίσης, ρυθμίζουν τη διάχυση των μακρομορίων στο συνδετικό ιστό. Οι GAG ανάλογα με τη σύστασή τους, τον τύπο του δεσμού μεταξύ των σακχάρων, το μήκος τους και τον αριθμό και τοποθεσία των σουλφυδρυλικών ομάδων διακρίνονται στο υαλουρονικό οξύ, την ηπαρίνη/θειική ηπαράνη, τη θειική χονδροϊτίνη, τη θειική δερματάνη και τη θειική κερατάνη (Εικόνα 9) Τα πολυμερή των GAG είναι ιδιαίτερα μεγάλα με μοριακό βάρος από 100000-10000000 σε σύγκριση με το κολλαγόνο με μοριακό βάρος 250000. Οι GAG αποτελούν τους πιο άφθονους πολυσακχαρίτες στον οργανισμό. Ανιχνεύονται σε διάφορους ιστούς με διαφορετική κατανομή. Τα χαρακτηριστικά τους και η κατανομή τους στους διάφορους ιστούς συνοψίζονται στον Πίνακα ΙΙ. 31
6 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ ΗΠΑΡΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ Εικόνα 9. Οι γλυκοζαμινογλυκάνες. Πίνακας ΙΙ. Οι GAG με τα χαρακτηριστικά και την ιστική κατανομή τους GAG ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ 4 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ 6 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΟΣ ΔΙΣΑΚΧΑΡΙΤΗΣ (Α-Β) n A B 4000-8*10 6 D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D- ΓΛΥΚΟΖΑΜΊΝΗ 5000-50000 D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D- ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΊΝΗ 5000-50000 D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D- ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΊΝΗ 15000-40000 D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-Dή L-ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΊΝΗ 5000-12000 D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-Dή L-ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΓΛΥΚΟΖΑΜΊΝΗ ΗΠΑΡΙΝΗ 6000-25000 D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-Dή L-ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΓΛΥΚΟΖΑΜΊΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ 4000-19000 D-ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ N-ΑΚΕΤΥΛ-D- ΓΛΥΚΟΖΑΜΊΝΗ ΕΝΩΣΗ ΜΕ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΟΧΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΝΑΙ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΣΤΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΔΕΡΜΑ, ΑΡΘΡΙΚΟ ΥΓΡΟ, ΥΑΛΟΕΙΔΕΣ ΥΓΡΟ, ΧΟΝΔΡΟΣ ΔΕΡΜΑ, ΟΣΤΑ, ΑΡΤΗΡΙΕΣ ΔΕΡΜΑ, ΟΣΤΑ, ΑΡΤΗΡΙΕΣ ΔΕΡΜΑ, ΑΓΓΕΙΑ, ΚΑΡΔΙΑ, ΚΑΡΔΙΑΚΕΣ ΒΑΛΒΙΔΕΣ ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ, ΑΡΤΗΡΙΕΣ, ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ, ΗΠΑΡ, ΔΕΡΜΑ, ΜΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΧΟΝΔΡΟΣ, ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΗΣ, ΟΣΤΑ Ο ρόλος των GAG είναι πολλαπλός και σχετίζεται άμεσα με τον ιστό στον οποίο ανιχνεύονται. Ήδη αναφέρθηκε ότι σχηματίζουν ένα ιδιαίτερα ενυδατωμένο κολλοειδές υπόστρωμα, το οποίο απορροφά δυνάμεις πιέσεως προσδίδοντας, έτσι, το χαρακτηριστικό της αντοχής σε πίεση και διαμορφώνοντας τις μηχανικές ιδιότητες του συνδετικού ιστού. Βοηθούν, επίσης, και στην οργάνωση του εξωκυττάριου χώρου συνδέοντας μεταξύ τους βασικά συστατικά, όπως το κολλαγόνο, τη λαμινίνη και την ινονεκτίνη. Ελέγχουν, επίσης, τη διάχυση των θρεπτικών ουσιών, των μεταβο- 32
λιτών, των ορμονών και των παραγόντων αύξησης. Τέλος, συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με άλλα κύτταρα και με το εξωκυττάριο στρώμα και ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική μετανάστευση και την κυτταρική διαφοροποίηση [97]. Το υαλουρονικό οξύ Το υαλουρονικό οξύ είναι η πιο απλή σε δομή γλυκοζαμινογλυκανή. Γενικά δεν συνδέεται με καμία άλλη πρωτεΐνη-πυρήνα για να σχηματίσει πρωτεογλυκάνες. Βρίσκεται σε ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις στο συνδετικό ιστό. Στην Εικόνα 10 φαίνεται σε τρισδιάστατο μοντέλο η δομή του. Εικόνα 10. Το τρισδιάστατο μοντέλο της δομής του υαλουρονικού οξέος στο εξωκυττάριο στρώμα. Το υαλουρονικό οξύ αποτελείται από επανάληψη των δισακχαριτών D-γλυκουρονικού οξεός και N-ακέτυλο-D-γλυκοζαμίνη. Έχει τη μοναδική ικανότητα να κατακρατά νερό προσφέροντας ενυδάτωση στη δερμίδα. Εμπλέκεται σε όλες τις φυσιολογικές βιολογικές διαδικασίες, ενώ αλλαγές στην ποσότητά του και στην ομοιοστασία του εμπλέκονται στην εμβρυογένεση, επούλωση, φλεγμονή, κληρονομικές παθήσεις, μετάσταση και άλλες πολύπλοκες διεργασίες [98-100]. Επιπλέον, το υαλουρονικό ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και κυτταρική μετανάστευση και αποτελεί μόριο-κλειδί στην οργάνωση του εξωκυτταρίου στρώματος του δέρματος [101, 102]. Τρεις συνθάσες του υαλουρονικού (HAS-1,-2,-3) είναι υπεύθυνες για τον πολυμερισμό του. Οι δύο πρώτες είναι υπεύθυνες για τον πολυμερισμό μεγάλων αλύσεων υαλουρονικού, ενώ η HAS-3 είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση μικρών αλύσεων [103]. Το υαλουρονικό καταβολίζεται από 3 υαλουρονιδάσες, τις HYAL-1, -2 και -3. Αυτές εκφράζονται σε ένα μεγάλο αριθμό ιστών. Οι ενεργοί υποδοχείς του υαλουρονικού Ο βιολογικός ρόλος του υαλουρονικού και οι βιολογικές του δράσεις 33
ρυθμίζονται και επιτυγχάνονται μέσα από τη σύνδεση με τους δύο ενεργούς υποδοχείς του, τους CD44 και Rhamm. Ο CD44 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των λευκοκυττάρων, κυτταρική μετανάστευση, καρκινική μετάσταση και σε άλλες πολύπλοκες βιολογικές διαδικασίες [104, 105]. Ο RHAMM είναι, επίσης, ένας ενεργός υποδοχέας του υαλουρονικού, οι βιολογικές διεργασίες του οποίου δεν έχουν πλήρως διευκρινισθεί. Το μοριακό βάρος του υαλουρονικού Οι περισσότερες δράσεις του υαλουρονικού εξαρτώνται άμεσα από το μέγεθός του. Είναι γνωστό ότι το υαλουρονικό οξύ μεγάλου μοριακού βάρους έχει αντιφλεγμονώδεις δράσεις, είναι ανοσοκατασταλτικό και οργανώνει τον εξωκυττάριο χώρο [106, 107]. Από την άλλη πλευρά, το υαλουρονικό μικρού και μέσου μοριακού βάρους (0,3 0,5 x 10 6 Da) προάγει την καρκινογένεση, την καρκινική μετάσταση, τη φλεγμονή. Είναι γνωστό ότι το υαλουρονικό μέσου μοριακού βάρους προάγει τον TGF-β1, ο οποίος θεωρείται ισχυρός προφλεγμονώδης παράγοντας και κινητοποιεί πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως της MAP κινάσης, του ERK και της RAF- 1 κινάσης [106,107]. 34
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ΟΙ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ Οι πρωτεογλυκάνες Με εξαίρεση το υαλουρονικό οξύ, οι περισσότερες GAG είναι συνδεδεμένες σε πρωτεΐνες. Η σύνδεση αυτή γίνεται μέσω ενός ειδικού τρισακχαρίτη που περιέχει 2 γαλακτόζες και μια ξυλόζη και συνδέει την GAG με Ο-γλυκοσιδικό δεσμό σε μια σερίνη ή θρεονίνη της πρωτεϊνικής αλυσίδας (Εικόνα 11). Για αυτό το λόγο, οι πρωτεΐνες στις οποίες συνδέονται οι GAG είναι πλούσιες σε σερίνη και θρεονίνη, γεγονός που επιτρέπει τη σύνδεση των GAG σε πολλαπλά σημεία του πρωτεϊνικού κορμού. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζονται οι πρωτεογλυκάνες (proteoglycans, PG) που αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό κορμό από τον οποίο εκτείνονται κάθετα οι GAG (Εικόνα 12). ΣΕΡΙΝΗ ΞΥΛΟΖΗ ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΚΟΡΜΟΣ ΤΡΙΣΑΚΧΑΡΙΤΙΔΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ Εικόνα 11. Σχηματικό μοντέλο της σύνδεσης GAG και πρωτεΐνης κορμού. Διακρίνεται ο τρισακχαριτικός ειδικός δεσμός. Το υαλουρονικό οξύ έχει τη δυνατότητα να συνδέει μεταξύ τους πολλά μόρια πρωτεογλυκανών, σχηματίζοντας χαρακτηριστικά συσσωματώματα πρωτεογλυκανών με τεράστιο μοριακό βάρος (Εικόνα 12) 35
1 μm ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΜΑ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΚΟΡΜΟΣ ΣΥΝΔΕΤΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΘΕΙΙΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ (GAG) ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ (GAG) Εικόνα 12. Στην εικόνα φαίνονται η χαρακτηριστική δομή των πρωτεογλυκανών, αλλά και η δυνατότητα του υαλουρονικού οξέος να συνδέει μεταξύ τους πολλά μόρια πρωτεογλυκανών, σχηματίζοντας χαρακτηριστικά συσσωματώματα πρωτεογλυκανών. Στο δέρμα υπάρχουν διάφορες πρωτεογλυκάνες με διαφορετικά μοριακά βάρη που αποτελούνται από διάφορες γλυκοζαμιμογλυκάνες (Εικόνα 13). Ακολούθως, θα περιγραφούν συνοπτικά ορισμένες από αυτές με χαρακτηριστικές εικόνες, ενώ στον πίνακα III καταγράφονται κάποιες κοινές πρωτεογλυκάνες με τις ιδιότητες τους, όπως το μοριακό τους βάρος και η τοπογραφία τους. Αγκρεκάνη Η αγκρεκάνη αποτελείται από θειική χονδροϊτίνη και θειική κερατάνη. Συνήθως περισσότερα από 100 μονομερή αγκρεκάνης συνδέονται σε συσσωματώματα πολύ μεγάλου μοριακού βάρους με το υαλουρονικό οξύ. Συνδεκάνη Η συνδεκάνη είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με το Ν-άκρο της έξω από την κυτταρική μεμβράνη ενώ το C-άκρο της συνδέεται ενδοκυττάρια με ακτίνη (Εικόνα 14). 36
ΒΕΡΣΙΚΑΝΗ ΣΕΡΓΛΥΚΙΝΗ ΓΕΝΙΚΗ ΔΟΜΗ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΗΣ ΝΤΕΚΟΡΙΝΗ ΣΥΝΔΕΚΑΝΗ Εικόνα 13. Σχηματικά η δομή ορισμένων από τις πιο κοινές πρωτεογλυκάνες, καθώς και η γενική δομή μιας πρωτεογλυκάνης για συγκριτικούς λόγους. Η συνδεκάνη είναι συνδεδεμένη με την κυτταρική μεμβράνη. 37
ΘΕΙΙΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΣΤΡΩΜΑ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ Εικόνα 14. Η σχηματική δομή της συνδεκάνης. PG Πίνακας III. Κοινές πρωτεογλυκάνες με τις ιδιότητές τους Μ.Β. ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΚΟΡΜΟΥ ΤΥΠΟΣ GAG ΑΓΚΡΕΚΑΝΗ 210000 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ ΒΗΤΑ 36000 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΓΛΥΚΑΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ ΝΤΕΚΟΡΙΝΗ 40000 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ ΑΡΙΘΜΟΣ GAG ΑΛΥΣΕΩΝ ΤΟΠΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 130 ΧΟΝΔΡΟΣ, ΔΕΡΜΑ ΜΗΧΑΝΙΚΗ 1 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΚΑΙ ΣΤΡΩΜΑ 1 ΔΙΑΣΠΑΡΤΗ ΣΤΟ ΣΥΝΔΕΤΙΚΟ ΙΣΤΟ ΠΕΡΛΕΚΑΝΗ 600000 ΘΕΙΙΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ 2-15 ΒΑΣΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΣΥΝΔΕΚΑΝΗ 1 32000 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ 1-3 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΡΙΞΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕ TGF-β ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕ TGF-β ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ Ι ΔΟΜΙΚΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ ΜΕ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ, ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ FGF 38
Βερσικάνη Η βερσικάνη είναι μια μεγάλη πρωτεογλυκάνη που στο δέρμα βρίσκεται σε στενή συνοχή με τις ελαστικές ίνες [108]. Είναι μια από τις πιο σημαντικές πρωτεογλυκάνες της δερμίδας με δύο ισομερή, τη βερσικάνη 1 και τη βερσικάνη 0. Φαίνεται ότι η βερσικάνη έχει πολύ σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό, τη δομή και τη διάταξη των ελαστικών ινών. Ντεκορίνη Η ντεκορίνη είναι μια σημαντικότατη πρωτεογλυκάνη της δερμίδας. Συνδέεται με ίνες κολλαγόνου και ρυθμίζει την άθροιση των κολλαγόνων ινών και το σχηματισμό του πλέγματος αυτών. Έχει αποδειχθεί ότι ποντίκια με μειωμένη έκφραση της ντεκορίνης παρουσίασαν παθολογική μορφολογία κολλαγόνου, ευαίσθητο στο στρες δέρμα και μείωση της εκτατικής δύναμης του δέρματος [109]. Βητα-γλυκάνη Η βήτα-γλυκάνη φυσιολογικά βρίσκεται με μικρά ποσά στη δερμίδα. Από την άλλη, φαίνεται να έχει μεγάλη έκφραση σε μοντέλα επούλωσης. Περλεκάνη Η περλεκάνη είναι η μεγαλύτερη σε ποσότητα πρωτεογλυκάνη της βασικής μεμβράνης. Έρχεται σε αλληλεπίδραση με τα τμήματα της βασικής μεμβράνης, όπως το κολαγόνο IV, τη λαμινίνη 1 και τη β1-ιντεγκρίνη, για να σχηματίσει το στρώμα που είναι απραίτητο για εκλεκτικό φιλτράρισμα και αλληλεπίδραση με υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης [110]. Είναι πλέον αποδεδειγμένο ότι η περλεκάνη είναι απαραίτητη για το σχηματισμό της επιδερμίδας και υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της περλεκάνης στη βασική μεμβράνη και της φυσιολογικής ανάπτυξης της επιδερμίδας [111]. 39
40
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΓΙΑ ΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗΣ Πέρα από τις κλινικές μελέτες, τις μελέτες κοορτής και τις μοριακές μελέτες με δερματικά δείγματα από ανθρώπους, η επιστήμη έχει αναπτύξει πολλά πειραματικά μοντέλα για τη μελέτη της γήρανσης, τη συμμετοχή των μοριακών παραγόντων, τη διερεύνηση των αιτιολογικών παραγόντων αλλά και τη μελέτη θεραπευτικών παρεμβάσεων. Στο κεφάλαιο αυτό θα αναλυθούν με συντομία τα επικρατέστερα και σημαντικότερα μοντέλα. Το πειραματικό μοντέλο του Caenorhabditis elegans Ένα μεγάλο μέρος της μελέτης της γήρανσης έχει πραγματοποιηθεί με τη χρησιμοποίηση του νηματώδη σκώληκα C. Elegans ως πειραματικό μοντέλο [112-115]. Ο κύριος ρυθμιστής του χρονικού διαστήματος ζωής του νηματώδους αυτού σκώληκα είναι μια ορμονική οδός, κύρια η οδός ινσουλίνης/igf [116], η οποία επάγει τη μακροζωία όταν υπορυθμίζεται. Το αξιοπρόσεκτο είναι ότι ανάλογη καταστολή της σηματοδότησης αυτής συσχετίζεται και με αύξηση της ζωής σε μύγες και επίμυες. Άλλοι μηχανισμοί που επεκτείνουν τη ζωή του C.elegans περιλαμβάνουν την πυρηνική ορμονική σηματοδότηση υποδοχέων [117], την υπορύθμιση της μιτοχονδριακής λειτουργίας [118, 119] και τη σηματοδότηση από πολυδύναμα κύτταρα της γαμετικής σειράς [120]. Η παραγωγή σκωλήκων RNAi για την εξουδετέρωση της γονιδιακής λειτουργίας [121] επιτρέπει την ιδιαίτερα λειτουργική γονιδιωματική σάρωση [122] και έχει πρόσφατα εφαρμοστεί στη συστηματική σάρωση των γονιδίων για τη μακροβιότητα στο χρωμόσωμα 1. Η ανάλυση των ρυθμιστών της μακροβιότητας με την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών ακολουθούμενη από RNAi έχει οδηγήσει σε μια πιο ολιστική και αποδοτική προσέγγιση σε αυτό το ζήτημα [123]. Στα πλεονεκτήματα αυτού του πειραματικού μοντέλου συμπεριλαμβάνεται ακόμη το μικρό μέγεθος, το μικρό χρονικό διάστημα ζωής, η γνώση όλου του γονιδιώματος καθώς και η δυνατότητα για μελέτη πειραματικών θεραπευτικών παρεμβάσεων. Το πειραματικό μοντέλο της καλλιέργειας ινοβλαστών Οι καλλιέργειες ινοβλαστών είναι από τα πιο διαδεδομένα πειραματικά μοντέλα για τη μελέτη της δερμίδας και των αλλαγών της, καθώς οι ινοβλάστες αποτελούν τα κύρια κύτταρα παραγωγής κολλαγόνου. Ο ρόλος τους, όμως, δεν περιορίζεται μόνο σε αυτό, καθώς διαθέτουν σημαντικούς 41
υποδοχείς (οιστρογόνων, αυξητικών παραγόντων), αλληλεπιδρούν με τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τις κυτταροκίνες και γενικά έχουν ιδιαίτερη συμμετοχή στην αναδιαμόρφωση του ECM. Στη γήρανση οι καλλιέργειες ανθρωπίνων ινοβλαστών έχουν αποδειχθεί αξιόπιστο πειραματικό μοντέλο. Όταν ανθρώπειοι ινοβλάστες καλλιεργούνται in vitro υφίστανται πεπερασμένο αριθμό διαιρέσεων. Η «φάση Ι» είναι η πρωτογενής καλλιέργεια, η «φάση ΙΙ» αντιπροσωπεύει τους αθροιστικούς πληθυσμούς της άφθονης αύξησης μετά την πρωτογενή καλλιέργεια και η «φάση ΙΙΙ» είναι αυτή της πτώσεως της αύξησης που ορίζεται ως «όριο του Hayflick» ή ως «αναπαραγωγική γήρανση». Αυτά τα κύτταρα χαρακτηρίζονται από μεγάλο κυτταρικό μέγεθος, ενεργότητα β-γαλακτοσιδάσης σχετιζόμενη με τη γήρανση, απαλοιφές στο μιτοχονδριακό DNA, μειωμένη επαγωγή του πρωτο-ογκογονιδίου c-fos, μειωμένη επαγωγή των πρωτεϊνών του θερμικού σοκ και αυξημένη ενεργότητα των μεταλλοπρωτεασών που δρουν εκφυλιστικά στο εξωκυττάριο στρώμα [124]. Τέτοια χαρακτηριστικά των γηράσκοντων κυττάρων παρατηρούνται in vivo. Οι καλλιέργειες ινοβλαστών επιτρέπουν τη μελέτη της επίδρασης φαρμακολογικών ουσιών και του βιολογικού ρόλου των μορίων του εξωκυτταρίου στρώματος, καθώς και τις αλληλεπιδράσεων μεταξύ κυττάρων. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η χρησιμοποίησή του για τη διαπίστωση της επιδράσεως του ορμονολογικού προφίλ στη λειτουργία τους. Ορμονικά γηρασμένοι ινοβλάστες in vitro [125] έδειξαν μειωμένο πολλαπλασιασμό και μεταβολές στα επίπεδα mrna των γονιδίων που σχετίζονται με τη γήρανση, όπως του πρωτο-ογκογονιδίου c-myc [126] και της ινωδονεκτίνης [127, 128], σε σύγκριση με ορμονολογικά νεαρά κύτταρα. Τέτοιες κυτταροκαλλιέργειες αναμένεται στο μέλλον να χρησιμοποιηθούν ακόμη εντονότερα, καθώς όλο και μειώνεται η χρησιμοποίηση πειραματόζωων και άλλων πειραματικών μοντέλων. Τα πειραματόζωα Τα πειραματόζωα έχουν αποδειχθεί αξιόπιστο και πολύτιμο πειραματικό μοντέλο για την ιατρική επιστήμη. Άλλωστε, η ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών ουσιών απαραίτητα πρέπει να περιλαμβάνει και φάση δοκιμών σε πειραματόζωα. Μια προσπάθεια των τελευταίων ετών είναι η χρησιμοποίησή τους για την αναπαράσταση του μοντέλου μια νόσου, όπως για παράδειγμα της ρευματοειδούς αρθρίτιδας και του σκληροδέρματος. Το μεγάλο πλεονέκτημα είναι ότι με την τεκμηρίωση της αναπαράστασης της νόσου υπάρχει η δυνατότητα μελέτης μοριακών μηχανισμών, παθογένειας, ενδοκυττάριας σηματοδότησης αλλά και θεραπευτικών παρεμβάσεων για τη συγκεκριμένη νόσο. Για τη γήρανση, τα πειραματόζωα έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία 42
για την ανάπτυξη του μοντέλου της φωτογήρανσης. Το μοντέλο αυτό επιτεύχθηκε με την ακτινοβόλησή τους με UV ακτινοβολία. Πολλά πρωτόκολλα έχουν χρησιμοποιηθεί και πολλές θεραπευτικές παρεμβάσεις έχουν δοκιμασθεί. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι ότι τα αντηλιακά προϊόντα [129] έχουν βελτιωθεί στις φαρμακολογικές ιδιότητες τους με τη μελέτη τους σε ανάλογα μοντέλα. 43
44
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ UV ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΣΤΟ ΔΕΡΜΑ Γενικά Τα τελευταία χρόνια η έκθεση του ανθρωπίνου δέρματος στο ηλιακό και τεχνητό φως έχει δραματικά αυξηθεί. Η φυσική και τεχνητή έκθεση στο φως έχει ως μειονέκτημα την αυξημένη συχνότητα καρκίνου του δέρματος και UV-εξαρτώμενων νοσημάτων του, καθώς και πρώιμη φωτο-εξαρτώμενη γήρανση. Η UV ακτινοβολία θεωρείται ως μείζων προφλεγμονώδης και καρκινογόνος παράγοντας για τον άνθρωπο. Συνεπώς, η λεπτομερής κατανόηση της βιοχημικής βάσης της UV ευαισθησίας του δέρματος και των ενδογενών φωτο-προστατευτικών μηχανισμών του είναι απαραίτητη αν θέλουμε να πετύχουμε ικανή πρόληψη της ακτινικής βλάβης. Η ηλιακή ακτινοβολία Η ηλιακή ακτινοβολία αποτελείται από ένα συνεχές φάσμα ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας που χωρίζεται σε τρεις κύριες περιοχές μήκους κύματος, την υπεριώδη (ultraviolet, UV), την ορατή και την υπέρυθρη (Eικόνα 15). Η UV ακτινοβολία περιέχει τα μήκη κύματος από 200 μέχρι 400 nm, ενώ το ορατό φως κυμαίνεται σε μήκη κύματος από 400 μέχρι 700 nm. Η UV ακτινοβολία περαιτέρω χωρίζεται σε τρία τμήματα, καθένα από τα οποία έχει διακριτές βιολογικές επιδράσεις. Τα τρία αυτά τμήματα είναι η UVA (320 400 nm), η UVB (280 320 nm) και η UVC (200 280 nm). Η UVC δεν φτάνει στην επιφάνεια της γης λόγω της ύπαρξης της στρατοσφαιρικής ζώνης. Αντίθετα η UVA και UVB ακτινοβολία φτάνουν στην επιφάνεια της γης σε ποσά ικανά να παράγουν σημαντικές βιολογικές επιδράσεις στο δέρμα και στα μάτια. ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΑΚΤΙΝΕΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΟΡΑΤΟ ΦΩΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΑΠΌ ΟΖΟΝ-ΣΤΡΑΤΟΣΦΑΙΡΑ Εικόνα 15. Στην εικόνα σχηματικά παρουσιάζεται το φάσμα της ηλιακής ακτινοβολίας, ο διαχωρισμός της σε τμήματα και τα μήκη κύματος που καλύπτει. 45
Σε γενικές γραμμές οι βιολογικές δράσεις της υπεριώδους ακτινοβολίας μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε δύο κατηγορίες, τις βραχυπρόθεσμες και τις μακροπρόθεσμες. Οι βραχυπρόθεσμες δράσεις της UV ακτινοβολίας Οι βλάβες στο DNA και οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί Η UV ακτινοβολία με μήκος κύματος από 245 μέχρι 290 nm απορροφάται σε μέγιστο βαθμό από το DNA [130]. Είναι, λοιπόν, σε θέση να επάγει μεταλλαξιογόνα φωτοπροϊόντα ή βλάβες στο DNA, κυρίως ανάμεσα σε γειτονικές πυριμιδίνες, με τη μορφή των διμερών [131]. Αν αυτές δεν επιδιορθωθούν, οι UV-επαγόμενες DNA βλάβες μπορούν να οδηγήσουν σε μεταλλάξεις στην αλληλουχία του DNA. Συνήθως, αυτές οι μεταλλάξεις είναι της μορφής τη μετάβασης από C σε T και από CC σε TT, οι οποίες είναι γνωστές ως οι «UV χαρακτηριστικές βλάβες». Αυτές οι DNA μεταλλάξεις φαίνεται να είναι άμεσα σχετιζόμενες με τις ειδικές κλινικές βλάβες της φωτογήρανσης, όπως η παθολογική ρυτίδωση, η αύξηση στην ελαστίνη και η καταστροφή του κολλαγόνου. Όλα αυτά τα φαινόμενα έχουν παρατηρηθεί σε πειραματόζωα που έχουν εκτεθεί σε UVB [132-134]. H UVA, και σε μικρότερο βαθμό η UVB, έχει την ικανότητα να προκαλέσει βλάβες στο DNA και έμμεσα μέσω της παραγωγής των αντιδραστικών στοιχείων οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) [135]. Αυτά περιλαμβάνουν ανιόντα υπεροξειδίου, υπεροξείδια και ελεύθερες ρίζες οξυγόνου [136]. Τα ROS καταστρέφουν το κυτταρικό DNA καθώς και τα λιπίδια και τις πρωτεΐνες [136, 137]. Οι μεταλλάξεις από την UVA μπορεί, επίσης, να επάγουν το trans-ουροκανικό οξύ και οδηγούν σε παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου και εγκοπές στο DNA [138, 139]. Η 8-υδροξυ γουανίνη είναι, επίσης, ένα παράγωγο της UVA μετάλλαξης από την επαγωγή των ROS. Πρόσφατα αναγνωρίστηκε μια μετάλλαξη διαγραφής στο μιτοχονδριακό DNA, που ονομάζεται η «κοινή μεταγραφή» ( common deletion ), σε ινοβλάστες της δερμίδας σε φωτογηρασμένο δέρμα. Προκαλείται από την UVA μέσω της επαγωγή των ROS in vitro [140] και in vivo [141] και θεωρείται ως δείκτης της UVA βλάβης [142]. Το μιτοχόνδριο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την αερόβια παραγωγή ενέργειας, έχει το μεγαλύτερο ποσό παραγομένων ROS στο κύτταρο. Πολλά από τα γονίδια που εμπλέκονται σε αυτήν τη διαδικασία βρίσκονται στο μιτοχονδριακό DNA και οι μεταλλάξεις του γονιδιώματός του μπορεί να σχετίζονται με τις λειτουργικές αλλαγές που παρουσιάζονται στη γήρανση [143, 144]. Η επίδραση της UVB και UVA στη βλάβη του DNA παρουσιάζεται σχηματικά στην Εικόνα 16. 46
Όλα τα κύτταρα των θηλαστικών είναι εξοπλισμένα με πολλούς μηχανισμούς επιδιορθώσεως του DNA, οι οποίοι είναι ικανοί να προστατεύσουν το κύτταρο από τις καταστρεπτικές επιδράσεις των μεταλλάξεων αυτών με την αποκοπή των βλαβών [145]. Οι κυριότεροι από αυτούς τους μηχανισμούς είναι η άμεση επιδιόρθωση, η εκτομή βάσης, η επιδιόρθωση με την καταστροφή της διπλής έλικας και η επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (nucleotide excision repair, NER). UVB UVA ΕΝΔΟΓΕΝΗ ΧΡΩΜΟΦΟΡΑ ROS ΑΛΛΟΙ ΣΤΟΧΟΙ: ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΑ ΛΙΠΙΔΙΑ ΕΝΖΥΜΑ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Εικόνα. 16. O μηχανισμός πρόκλησης βλάβης στο DNA από την UVB και UVA σχηματικά. Η πρωτεΐνη p53, ο κυτταρικός κύκλος και η απόπτωση Παρά την ικανότητα του κυττάρου να επιδιορθώνει την UV-επαγόμενη DNA βλάβη, κάποιες βλάβες πάντα παραμένουν. Τα κύτταρα του δέρματος έχουν μηχανισμούς για την πρόληψη περαιτέρω βλάβης που μπορεί να οδηγήσει σε καρκινογένεση και χρόνια φλεγμονώδη φαινόμενα. Ένας από αυτούς τους μηχανισμούς είναι η παύση του κυτταρικού κύκλου, ακολουθούμενη από επιδιόρθωση του DNA. Ένας εξίσου σημαντικός μηχανισμός είναι ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος και η απόπτωση [146]. Η πρωτεΐνη p53 έχει πρωτεύοντα ρόλο και στους δύο αυτούς μηχανισμούς. Μετά από βλάβη του DNA από οξεία UV ακτινοβόληση, η μεταγρα- 47
φή της p53 αυξάνεται και η πρωτεΐνη p53 ενεργοποιείται από τη φωσφορυλίωση της σερίνης 15 και της σερίνης 20 [147]. Η άθροιση αυτή της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης p53 επάγει μια βίαιη παύση του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση, η οποία επιτρέπει την επιδιόρθωση του DNA πριν αυτό αρχίσει τη διαδικασία της αντιγραφής στην S φάση [148]. Στο μοριακό αυτό δρόμο, ανακαλύφθηκε ότι η p21/waf1/cip1 αποτελεί αναστολέα της εξαρτώμενης από την κυκλίνη κινάσης (cyclin-dependent kinase, CDK), της οποίας η επαγωγή σχετίζεται άμεσα με την έκφραση της p53 [149]. Αν η βλάβη του DNA που προκλήθηκε από την UV ακτινοβολία είναι ιδιαίτερα σοβαρή και δεν μπορεί να επιδιορθωθεί, ενεργοποιούνται οι αποπτωτικοί μηχανισμοί για να καταστρέψουν τα προσβληθέντα κύτταρα. Η p53 έχει, επίσης, σημαίνοντα ρόλο και σε αυτούς τους αποπτωτικούς μηχανισμούς. Ως μεταγραφικός διαμεσολαβητής, επάγει την απόπτωση μέσω της αύξησης της έκφρασης γονιδίων που επάγουν την απόπτωση, όπως τα Bax και Fas/Apo-1 ή μέσω της καταστολής της έκφρασης γονιδίων που καταστέλουν την απόπτωση, όπως το Bcl-2 [150]. Όλα τα παραπάνω καταδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της p53 στην προστασία του γονιδιώματος, των κυττάρων και του δερματικού ιστού από τις UV επαγόμενες βλάβες. Δυστυχώς, συνέχιση της έκθεσης στη UV προκαλεί καταστολή της p53, με αποτέλεσμα καρκινογένεση και χρόνια φλεγμονώδη φαινόμενα που οδηγούν στους χαρακτηριστικούς δερματικούς φαινοτύπους [151]. Φλεγμονώδη φαινόμενα και μελάγχρωση από την UV Οι κύριες οξείες κλινικές επιδράσεις της UV ακτινοβολίας στο φυσιολογικό ανθρώπινο δέρμα είναι η φλεγμονή (κόκκινο δέρμα, ερύθημα) και η μελάγχρωση (αυξημένη μελανινογένεση). Οι ιστολογικές αλλαγές που ακολουθούν την έκθεση σε UV περιλαμβάνουν την πάχυνση της κερατίνης στοιβάδας, της επιδερμίδας και της δερμίδας, καθώς και ενδοκυττάριο και περιαγγειακό οίδημα στη δερμίδα και περιαγγειακή διήθηση. Το ερύθημα είναι η πιο χαρακτηριστική και καλά αναγνωρισμένη οξεία δερματική αντίδραση στη UV, ιδιαίτερα σε ανθρώπους που ανήκουν σε ανοιχτούς φωτότυπους. Τα μόρια που είναι υπεύθυνα για την απορρόφηση του φωτός και τα οποία ξεκινούν τα φλεγμονώδη αυτά φαινόμενα είναι τα χρωμοφόρα (chromophores), που επάγονται από την UVA, όπως φαίνεται στην Εικόνα 16. Παρόλα αυτά, το ερύθημα, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, φαίνεται αιτιοπαθογενετικά να έχει μεγαλύτερη σχέση με την απευθείας βλάβη του DNA [152], υποδεικνύοντας ότι ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας είναι η UVB. 48
Αγγειακές διαταραχές Η UV ακτινοβολία έχει αποδειχθεί ότι δημιουργεί ένα ευνοϊκό μικροπεριβάλλον για παθολογική αγγειογένεση, μέσω κυρίως της αύξησης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (vascular endothelial growth factor, VΕGF) [153, 154]. Επιπλέον, η θρομβοσπονδίνη-1, ένας αγγειογενετικός αναστολέας, φαίνεται να καταστέλλεται, ενώ ο αιμοπεταλιακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (platelet-derived endothelial growth factor, PD-ECGF), που είναι ένας επαγωγέας της αγγειογένεσης, αυξάνεται στα κερατινοκύτταρα μετά από έκθεση σε UVB [155]. Αυτές οι αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση φαίνεται να είναι υπεύθυνες για τις χαρακτηριστικές τηλλεαγγειεκτασίες που παρουσιάζονται σε φωτοεκτεθειμένο δέρμα. Ανοσοκαταστολή Η UV ακτινοβολία ενέχεται, επίσης, και στην τοπική και συστηματική ανοσοκαταστολή [156], η οποία ευθύνεται σε μεγάλο βαθμό για δερματική καρκινογένεση. Τα κύτταρα του Langerhans υπόκεινται σε πολλές λειτουργικές και μορφολογικές αλλοιώσεις μετά από έκθεση σε UV, με αποτέλεσμα τη λειτουργική τους ανεπάρκεια [157]. Αυτή η ανοσοκαταστολή μερικώς προκαλείται από βλάβες του DNA [158], καθώς και από παθολογική έκφραση κυτταροκινών. Έχει παρατηρηθεί αυξημένη έκφραση της ανοσοκατασταλτικής κυτταροκίνης IL-10 στη δερματική φλεγμονώδη διήθηση μετά από έκθεση στη UV [159, 160]. Συνολικά οι βραχυπρόθεσμες αυτές δράσεις της UV συνοψίζονται στην Εικόνα 17. ΕΡΥΘΗΜΑ, ΕΠΙΔΕΡΜΙΔΙΚΗ ΥΠΕΡΠΛΑΣΙΑ, ΜΕΛΑΓΧΡΩΣΗ ΒΛΑΒΗ ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΥΚΛΟΥ ΔΙΟΡΘΩΣΗ DNA ΟΞΕΙΑ ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗΣ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ DNA ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΚΑΙ ΔΙΟΡΘΩΣΗ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΟΛΗ Εικόνα. 17. Συνοπτικά οι βραχυπρόθεσμες δράσεις της UV. 49
Οι μακροπρόθεσμες δράσεις της UV ακτινοβολίας Η μακρόχρονη και επαναλαμβανόμενη έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία προκαλεί τη σταδιακή αποδιοργάνωση της αρχιτεκτονικής και της λειτουργίας του δέρματος. Φαίνεται ότι τα φαινόμενα αυτά προκαλούνται από αθροιστικές βλάβες στο DNA και από τις διαταραχές των χρόνιων φλεγμονωδών φαινομένων. Αυτές οι ακτινικές βλάβες μπορούν τελικά να οδηγήσουν στην ανάπτυξη δερματικών καρκίνων και φωτογήρανσης. Φωτογήρανση Η δερματική φωτογήρανση είναι το αποτέλεσμα της χρόνιας έκθεσης στην ηλιακή ακτινοβολία. Τα κλινικά συμπτώματα περιλαμβάνουν ξηρότητα, ανώμαλη μελάγχρωση, έμμονη υπερμελάχγρωση, ηλιακές εφηλίδες, ελάστωση, βαθιές ρυτίδες, ηλιακούς φαγέσωρες και τηλλεαγγεικτασίες. Αν και τα UVB φωτόνια είναι πολύ πιο ενεργητικά από τα UVA και ευθύνονται, κυρίως, για το ηλιακό έγκαυμα και τη φωτοκαρκινογένεση, σήμερα θεωρείται ότι και η UVA παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη φωτογήρανση [161]. Η UVA επάγει το σχηματισμό των ROS που επιδρούν στα μεμβρανικά λιπίδια και αμινοξέα. Η καταστροφή της μεμβράνης έχει ως αποτέλεσμα τη απελευθέρωση του αραχιδονικού οξέος και οδηγεί στην ενεργοποίηση δευτερογενών κυτταροπλασματικών και πυρηνικών διαμεσολαβητών που τέλος επάγουν τα γονίδια που επηρεάζει η UV. Το ανθρώπινο δέρμα που εκτίθεται επί 1 μήνα σε δόσεις UVA μικρότερες από την ελάχιστη ερυθηματώδη δόση παρουσιάζει επιδερμιδική υπερπλασία, πάχυνση της κερατίνης στοιβάδας και δερματική φλεγμονώδη διήθηση με εναπόθεση λυσοζύμης στις ελαστικές ίνες [162]. Η επίδραση της UV στο ECM Αθροιστικά δεδομένα από in vitro μελέτες δείχνουν ότι η UV ακτινοβολία μιμείται τις δράσεις των συνδετών των υποδοχέων μέσω της παραγωγής των ROS [163]. Μετά από έκθεση σε UV, οι υποδοχείς για τον επιδερμιδικό αυξητικό παράγοντα (epidermal growth factor, EGF), την IL- 1 και τον TNF-a ενεργοποιούνται στα κερατινοκύτταρα και τους ινοβλάστες [164]. Η μέχρι σήμερα υπόθεση είναι ότι οι ROS έχουν οξειδωτική δράση και, άρα, αναστέλλουν τις τυροσινο-φωσφατάσες, των οποίων ο ρόλος τους είναι η καταστολή αυτών των υποδοχέων [165, 166]. Αυτή η αυξημένη δραστηριότητα των υποδοχέων θεωρείται ότι οδηγεί σε ενεργοποίηση της σηματοδότησης μέσω κινασών στο δέρμα [167], αν και ο ακριβής μηχανισμός είναι ακόμη άγνωστος. Ένας πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας, η ενεργοποιός πρωτεΐνη 1 (activator protein 1, AP-1) τελικά ενεργοποιείται και υπερεκφράζεται. Η πρωτεΐνη αυτή ελέγχει 50
τη μεταγραφή των MMP, των οποίων ο ρόλος στην αποδόμηση του ECM έχει συζητηθεί προηγούμενα. Άρα οι ROS άμεσα συνεισφέρουν στην αποδόμηση των ιστών και παρεμβαίνουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια που εμπλέκονται στην έκφραση των υπεύθυνων γονιδίων για το μεταβολισμό του κολλαγόνου [168]. Όπως η AP-1, ο μεταγραφικός παράγοντας NF-κB, επίσης, ενεργοποιείται από την UV ακτινοβολία [169]. Τελικά επάγει τη μεταγραφή φλεγμονωδών κυττοκινών και δρα χημειοτακτικά για τα ουδετερόφιλα, που περιέχουν την ουδετεροφιλική κολλαγονάση MMP-8. επίσης, ο NF-κB επάγει την έκφραση της MMP-9 [170]. Η παραγωγή κολλαγόνου μειώνεται στο φωτογηρασμένο δέρμα [171]. Ο AP-1 και ο TGF-β ενέχονται, επίσης, σε αυτήν την UV-επαγόμενη καταστολή της σύνθεσης του κολλαγόνου. Ο AP-1 έχει δύο υποτμήματα, το συνεχώς εκφραζόμενο c-fos και το UV-επαγόμενο c-jun [172, 173]. Έχει βρεθεί ότι η υπερέκφραση του c-jun σε καλλιέργειες ινοβλαστών μειώνει την έκφραση του κολλαγόνου τύπου Ι [174]. Ένα ενδιαφέρον στοιχείο είναι ότι το καταστρεμένο κολλαγόνο μπορεί να καταστείλει τη σύνθεση νέου κολλαγόνου. Όταν δερματικοί ινοβλάστες επωάζονται με κολλαγόνο τύπου Ι καταβολισμένο από ΜMP in vitro, η σύνθεση του προκαλλαγόνου τύπου Ι μειώνεται [175]. Παρόμοια φαινόμενα έχουν παρατηρηθεί και in vivo [176]. Η άθροιση όλων αυτών των φαινόμενων σε μακρόχρονη βάση οδηγεί στους χαρακτηριστικούς φαινοτύπους της φωτογήρανσης. Στην Εικόνα 19 συνοψίζονται οι μακροπρόθεσμες δράσεις της UV ενώ στην Εικόνα 18 σχηματικά φαίνονται οι μηχανισμοί δράσης της. 51
ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΑΥΞΗΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΤΥΡΟΣΙΝΟ ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΠΥΡΗΝΑΣ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΠΑΓΩΓΗ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΕΠΑΓΩΓΗ ΠΡΟΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΕΠΑΓΩΓΗ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΩΝ ΚΥΤΟΚΙΝΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ Εικόνα 18. Οι δράσεις της UV. Η UV επάγει την παραγωγή των ROS που προκαλούν βλάβες στο DNA και καταστέλουν τις τυροσινο-φωσφατάσες. Αυτό οδηγεί σε ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης και τελικά σε ενεργοποίηση της AP-1. επίσης, η UV καταστέλλει την έκφραση των υποδοχέων των ρετινοειδών (RA). Τέλος, προκαλεί την ενεργοποίηση του NFκΒ. Όλα τα παραπάνω οδηγούν σε καταβολισμό του κολλαγόνου και παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκινών. ΚC: κερατινοκύτταρο, FB: ινοβλάστης. ΦΩΤΟΓΗΡΑΝΣΗ ΧΡΟΝΙΑ ΒΛΑΒΕΣ ΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΣΤΟΛΗ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ Εικόνα. 19. Οι μακροπρόθεσμες δράσεις της UV σχηματικά. 52
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Η ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΤΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ ΣΤΗ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Γενικά Το δέρμα είναι όργανο στόχος για πολλές ορμόνες και, πλέον, η συμμετοχή συγκεκριμένων ορμονών στη διαδικασία της γήρανσής του θεωρείται δεδομένη [177]. Μάλιστα το δέρμα σήμερα θεωρείται ως ένα ανεξάρτητο περιφερικό ενδοκρινικό όργανο [178]. Κυρίως οι ορμόνες του φύλου φαίνεται να έχουν ουσιαστική επίδραση τόσο στην ανάπτυξη όσο και στη δομή του και απαιτείται ένα ικανό επίπεδό τους ώστε να διατηρείται η δομική του ακεραιότητα και η λειτουργική του ικανοτητα [179]. Το ορμονολογικό προφίλ του ανθρώπου αλλάζει με την πάροδο της ηλικίας. Οι ορμονολογικές αλλαγές της γήρανσης οδηγούν σε ειδικούς δερματικούς φαινοτύπους, οι οποίοι φαίνεται να είναι εξαρτώμενοι και από το φύλο. Παρόλο που έχει διαπιστωθεί ότι τα δύο φύλα γερνάνε με διαφορετικό τρόπο και ότι η ενδογενής δερματική κυτταρική γήρανση εμπλέκει διαφορετικούς μοριακούς μηχανισμούς ανάλογα με το φύλο [180], οι διαφορές ανάμεσα στα δύο φύλα στο μοριακό επίπεδο δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Το γυναικείο φύλο φαίνεται να υφίσταται την ορμονο-εξαρτώμενη αυτή γήρανση περισσότερο. Πολλές γυναίκες παρατηρούν μια ξαφνική εμφάνιση συμπτωμάτων της δερματικής γήρανσης κατά την περίοδο της εμμηνόπαυσης, όπως αυξημένη ξηρότητα, μείωση της ελαστικότητας και αύξηση τη δερματικής χαλαρότητας [181]. Υπάρχει, βέβαια, άμεση σύνδεση των μακροσκοπικών κλινικών αυτών γεγονότων με φαινόμενα όπως η μείωση του κολλαγόνου και της ελαστίνης, αλλαγών στη βασική δομή του εξωκυτταρίου στρώματος, διαταραχών στην αναλογία κολλαγόνου Ι και ΙΙΙ και ανωμαλιών στην αγγείωση [182]. Άλλωστε, οι μακροσκοπικές αλλαγές του δέρματος αντανακλούν πάντα σε αλλαγές στο ιστοπαθολογικό επίπεδο, άρα στο επίπεδο του εξωκυτταρίου στρώματος και των μορίων του. Η περίοδος της εμμηνόπαυσης στις γυναίκες θεωρείται πλέον χρονικό σημείο κλειδί στη διαδικασία αυτή [183]. Οι περισσότερες γυναίκες στις αναπτυγμένες χώρες αναμένεται να διανύσουν το ένα τρίτο της ζωής τους όντας στη μετεμμηνοπαυσιακή περίοδο [184] και τα μακροσκοπικά «σημάδια» της γήρανσης φαίνεται να επηρεάζουν ιδιαιτέρα τον ψυχισμό τους. Με βάση την ίδια δημογραφική πηγή οι άνδρες αναμένεται να ζήσουν περίπου 20 έτη υπό το λεγόμενο PADAM (partial androgen deficiency of the aging man), δηλαδή υπό ένα ορμονολογικό προφίλ μερικής έλλειψης ανδρογόνων. Από όλες τις κατηγορίες των ορμονών αυτές που φαίνεται να έχουν 53
τη μεγαλύτερη εμπλοκή είναι τα οιστρογόνα. Η πρώτη παρατήρηση της αρνητικής επίδρασης της πτώσης των οιστρογόνων έγινε το 1940 από τον Albright [185], ο οποίος παρατήρησε ότι ηλικιωμένες γυναίκες με οστεοπορωτικά κατάγματα είχαν μια αυξημένη επίπτωση παθολογικών αλλαγών γήρανσης στο δέρμα. Καθώς ο πληθυσμός των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών συνεχώς αυξάνεται, το ενδιαφέρον της εμπλοκής των οιστρογόνων στη διαδικασία της γήρανσης μεγαλώνει. Ενώ, όμως, η συμμετοχή των οιστρογόνων σε όργανα και ιστούς όπως η καρδιά και ο οστίτη ιστός έχει διευκρινιστεί επαρκώς, η συμμετοχή τους στη δερματική γήρανση παραμένει μερικώς απροσδιόριστη [186]. Στο κεφάλαιο αυτό θα συζητηθούν τα μέχρι τώρα δεδομένα για τη συμμετοχή των οιστρογόνων και γενικά των ορμονών στη δερματική γήρανση, ενώ η θεραπευτική έρευνα με ανάλογα τοπικά σκευάσματα αποκατάστασης θα αναλυθεί στο κεφάλαιο της θεραπευτικής. Το δέρμα ως ένα περιφερικό ενδοκρινικό όργανο Είναι γνωστό ότι οι ορμόνες για να δράσουν απαιτούν και την παρουσία των ανάλογων υποδοχέων. Έχουν ανιχνευθεί οιστρογονικοί καθώς και υποδοχείς άλλων ορμονών σε κερατινοκύτταρα, ινοβλάστες, σμηγματογόνους αδένες, τριχικούς θυλάκους και αγγεία του δέρματος [187]. Οι υποδοχείς αυτοί ποικίλουν σε πυκνότητα ανάλογα με τη θέση, με τις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις να παρατηρούνται στο δέρμα του προσώπου. Μετά την ανάπτυξη των ειδικών αντισωμάτων κατά των οιστρογονικών υποδοχέων α και β (ER-α, - β), πραγματοποιήθηκαν μελέτες για τη διαπίστωση της παρουσίας τους στο δέρμα. Στο ενήλικο δερματικό ιστό από το μέτωπο διαπιστώθηκε η ισχυρή παρουσία του ER-β στην επιδερμίδα, τους δερματικούς ινοβλάστες και τους τριχικούς θυλάκους ενώ δεν διαπιστώθηκε ανάλογη παρουσία του ER-α [188]. Από την άλλη, η ύπαρξή του διαπιστώθηκε σε μεγάλο βαθμό σε δερματικό ιστό από το μέτωπο νεογνών [189], εύρημα που αποτελεί ένδειξη της συμμετοχής της ηλικίας στην έκφραση των υποδοχέων αυτών. Σήμερα έχει πλέον αποδειχθεί με τη χρησιμοποίηση της RT-PCR ότι οι ER-α και ER-β εκφράζονται σε ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οιστραδιόλη δρα στη δερμίδα μέσω άμεσης επίδρασης στη λειτουργία των ινοβλαστών [190]. Παρόλα αυτά, οι ακριβείς μηχανισμοί της οιστρογονικής αυτής δράσης δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Το σύμπλεγμα των οιστρογονικών υποδοχέων έχει την ικανότητα να επάγει αυξητικούς παράγοντες, όπως ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας (insulin-like growth factor type I, IGF-I), ο οποίος αποτελεί μιτωτικό παράγοντα για τα κερατινοκύτταρα [191]. Τα κύτταρα του Langerhans 54
επηρεάζονται από την προγεστερόνη, ενώ τα μελανινοκύτταρα διεγείρονται από τη 17β-οιστραδιόλη [192]. Το βέβαιο είναι ότι τα οιστρογόνα επάγουν μια σειρά αλλαγών στο συνδετικό ιστό της δερμίδας που περιλαμβάνει σημαντικές μεταβολές στο εξωκυττάριο στρώμα [193]. Στη συνέχεια αυτού του κεφαλαίου θα αναλυθεί η επίδραση των οιστρογόνων σε χαρακτηριστικές παραμέτρους της δερματικής γήρανσης. Η επίδραση των οιστρογόνων στο πάχος του δέρματος και στο κολλαγόνο Το κολλαγόνο είναι ένα από τα κυριότερα δομικά στοιχεία του συνδετικού ιστού της δερμίδας. Για πρώτη φορά το 1941 παρατηρήθηκε ότι μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με οστεοπόρωση είχαν δέρμα που χαρακτηρίζονταν από μεγάλου βαθμού ατροφία [194]. Οι κλινικές αυτές παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν από μετέπειτα μελέτες που έδειχναν μείωση του πάχους του δέρματος και της περιεκτικότητας σε κολλαγόνο στα χρόνια που ακολουθούσαν την εμμηνόπαυση [195]. Αργότερα με τη χρησιμοποίηση ηλεκτρονικού υπολογιστή και ανοσοϊστοχημείας σε δερματικά δείγματα, έγινε σαφές ότι η ραγδαία πτώση του κολλαγόνου της δερμίδας είχε άμεση συσχέτιση με τα πρώτα χρονιά από τη είσοδο στο μετεμμηνοπαυσιακό στάδιο [196]. Επίσης, αποδείχθηκε ότι οι μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες είχαν μειωμένα επίπεδα κολλαγόνου τύπου Ι and III, καθώς και μειωμένη αναλογία ΙII/I κολλαγόνου σε σύγκριση με προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Από την άλλη, σε δερματικές βιοψίες από γυναίκες που βρίσκονταν υπό αγωγή υποκατάστασης από το στόμα για 1 μήνα, παρατηρήθηκε αύξηση του δερματικού κολλαγόνου κατά 1,8 5,1% [197]. Η θεραπευτική αυτή προσέγγιση θα αναλυθεί στο κεφάλαιο για τη σύγχρονη θεραπευτική παρέμβαση στη δερματική γήρανση. Η επίδραση των οιστρογόνων στην περιεκτικότητα του δέρματος σε νερό Η ικανότητα του δέρματος να κατακρατά νερό είναι άμεσα συνυφασμένη με τα λιπίδια της κερατίνης στοιβάδας, τα οποία έχουν πρωταγωνιστικό ρόλο στη διατήρηση της λειτουργίας του δερματικού φραγμού [198] και, επίσης, στη ποσότητα και ποιότητα των γλυκοζαμινογλυκανών στη δερμίδα, οι οποίες έχουν την ιδιότητα να έλκουν κατιόντα και να κατακρατούν νερό [199]. Μια μεγάλη μελέτη κοορτής κατέδειξε ότι μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες χωρίς θεραπεία υποκατάστασης είχαν στατιστικώς σημαντικό βαθμό ξηρότητας δέρματος σε σύγκριση με γυναίκες υπό αγωγή υποκατάστασης [200]. Αργότερα, μελέτες κατέδειξαν ότι υπήρχαν ηλικιακό-εξαρτώμενες αλλαγές στα σφιγγολιπίδια της κερατίνης στοιβάδας [201], γεγο- 55
νός το οποίο υποδηλώνει την πιθανή επιρροή από το ορμονικό προφίλ της κάθε ηλικίας. Η επίδραση των οιστρογόνων στη ρυτίδωση του δέρματος Οι ρυτίδες είναι μακροσκοπικές αλλαγές του δέρματος που σχετίζονται με τη δερματική γήρανση και παρουσιάζονται κυρίως ως αποτέλεσμα της εξωγενούς γήρανσης σε φωτοεκτεθειμένες περιοχές. Επιπρόσθετα, μπορούν να προκληθούν και από πολλούς ενδογενείς παράγοντες, όπως κληρονομικότητα, φυλετικές διαφορές, ορμόνες. Ιστολογικές μελέτες για τις ρυτίδες έχουν καταδείξει αλλαγές στη σύσταση της δερμίδας με ατροφία του δερματικού κολλαγόνου, παθολογικές αλλαγές των ελαστικών ινών (ελάστωση) και εξεσημασμένη πτώση των GAG [202, 203]. Στην προαναφερθείσα μεγάλη μελέτη κοορτής έγινε σαφές ότι γυναίκες υπό αγωγή υποκατάστασης είχαν στατιστικώς σημαντικά μικρότερη πιθανότητα για ανάπτυξη ρυτίδων. Το αξιοπρόσεκτο με αυτήν τη μελέτη είναι ότι ελέγχθηκαν οι συγχυτικές μεταβλητές, όπως η ηλικία, ο δείκτης μάζας σώματος και η έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία [204]. Επίσης, μειωμένη ελαστικότητα δέρματος έχει παρουσιαστεί σε γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση [204]. Όλες οι παραπάνω μελέτες, όπως φαίνεται, περιορίστηκαν κυρίως στη μακροσκοπική μελέτη της γήρανσης. 56
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ΤΑ ΜΟΡΙΑ ΤΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΣΤΗ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Οι γλυκοζαμινογλυκάνες στη δερματική γήρανση Οι GAG συντίθενται από επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαριτών και αυτές που κύρια βρίσκονται στο δέρμα είναι το υαλουρονικό οξύ και η θειική δερματάνη. Η σημασία των GAG στο δέρμα είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς έχουν την ικανότητα να συγκρατούν μεγάλες ποσότητες νερού και άρα η ενυδάτωση του δέρματος είναι άμεσα σχετιζόμενη με την ποσότητα και την κατανομή των GAG σε αυτό [206]. Τα μέχρι σήμερα δεδομένα αν και είναι λίγα και με πολλά μεθοδολογικά λάθη, καταδεικνύουν το γεγονός ότι ποσοτικά οι GAG αυξάνονται στο φωτογηρασμένο δέρμα σε σχέση με το ηλικιακά νέο ή το ενδογενώς γηρασμένο δέρμα [206, 207]. Αν και αυτό στην αρχή φαίνεται παράδοξο, καθώς αυξημένη ποσότητα GAG συνδέεται με πιο υγιές μακροσκοπικά δέρμα, περαιτέρω μελέτες με μικροσκόπιο σαρώσεως κατέδειξαν ότι στο φωτογηρασμένο δέρμα η κατανομή των GAG είναι παθολογική και περιορίζεται στην ελαστίνη ουσία της θηλώδους δερμίδας, σε αντίθεση με το ενδογενώς γηρασμένο ή ηλικιακά νέο δέρμα, τα οποία χαρακτηρίζονται από μια ομοιογενή κατανομή σε όλο το μήκος της δερμίδας [207]. Τέλος, φαίνεται να υπάρχει μια αύξηση της αναλογίας υαλουρονικού οξέος / θειικής δερματάνης στο φωτογηρασμένο δέρμα [208]. Η σημασία της στροφής αυτής της αναλογίας προς το υαλουρονικό οξύ δεν είναι ακόμη κατανοητή. Γεγονός είναι, ότι οι αλλαγές αυτές στην κατανομή των GAG συνδέονται άμεσα με τη μειωμένη ικανότητά τους στη σύνδεσή τους με νερό. Έτσι, αν και η δερμίδα του φωτογηρασμένου δέρματος περιέχει μεγαλύτερη ποσότητα νερού, αυτό έχει μειωμένη λειτουργική ικανότητα, καθώς τα μόριά του συνδέονται μεταξύ τους σε τετραεδρικές μορφές και όχι με τις PG και τα GAG [208]. Τα λιπίδια στη δερματική γήρανση Η ποσότητα και η κατανομή των λιπιδίων της επιδερμίδας είναι σημαντικότατη για τις μηχανικές, λειτουργικές και δομικές ιδιότητες του δέρματος, ενώ χαρακτηριστικές αλλαγές τους σχετίζονται με νοσήματα του δέρματος, όπως η ατοπική δερματίτιδα [209]. Αλλαγές παρατηρούνται και στη δερματική γήρανση [209-211]. Σε γενικές γραμμές η ποσότητα των λιπιδίων φαίνεται να μειώνεται με την ηλικία, αν και η μείωση αυτή δεν φαίνεται να είναι στατιστικώς σημαντική, ενώ υπάρχουν και δεδομένα που υποστηρίζουν ότι η μείωση αυτή είναι 57
πλασματική και αφορά μόνο συγκεκριμένες περιοχές [212, 213]. Τα λιπίδια, λοιπόν, της επιδερμίδας δεν φαίνεται να αποτελούν τμήμα του αιτιοπαθογενετικού μηχανισμού της δερματικής γήρανσης. Το νερό στη δερματική γήρανση Το νερό είναι ένα σημαντικότατο στοιχείο του εξωκυττάριου χώρου της δερμίδας, καθώς η παρουσία του στη σωστή αναλογία είναι απολύτως απαραίτητη για τη λειτουργία και δομή της δερμίδας και των μορίων της [214]. Φυσιολογικά, στο ηλικιακά νέο δέρμα το νερό είναι συνδεδεμένο με τις πρωτεΐνες της δερμίδας, γεγονός απαραίτητο για τη σωστή δομή και μηχανικές ιδιότητές τους, καθώς και για τη μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Αντίθετα, το νερό που δεν συνδέεται με πρωτεΐνες σχηματίζει τετραεδρικές μορφές νερού που είναι μη λειτουργικές [214]. Στην ενδογενή «φυσιολογική» γήρανση η ποσότητα του νερού, αλλά και η ικανότητά του να συνδέεται με μακρομόρια της δερμίδας δεν αλλάζει [215]. Αντίθετα, στο φωτογηρασμένο δέρμα η ποσότητα του νερού αυξάνεται, αλλά η ικανότητά του για σύνδεση με πρωτεΐνες και GAG μειώνεται δραματικά, με αποτέλεσμα μόρια νερού να συνδέονται μεταξύ τους σχηματίζοντας ανεπαρκείς λειτουργικά τετραεδρικές μορφές [215]. Αυτή η ανεπάρκεια αλληλεπίδρασης νερού και μακρομορίων της δερμίδας στο φωτογηρασμένο δέρμα φαίνεται να οδηγεί στη χαρακτηριστικά ξηρή και ρυτιδωμένη μακροσκοπική του εικόνα. Η ελαστίνη στη δερματική γήρανση Το δίκτυο των ελαστικών ινών του δέρματος που αποτελεί περίπου το 2-4% του όγκου της δερμίδας, παρέχει στο δέρμα την απαραίτητη ελαστικότητα και ευκαμψία. Το δίκτυο αυτό δείχνει χαρακτηριστικές αλλαγές που σχετίζονται με τη γήρανση, ιδιαίτερα στις ηλικίες μεταξύ 30 και 70 ετών. Στο φωτογηρασμένο, λοιπόν, δέρμα παρατηρείται μια ιδιαίτερη άθροιση ελαστίνης ουσίας. Η άθροιση αυτή νέας ελαστίνης ουσίας σε απάντηση της φωτογήρανσης είναι, επίσης, ιδιαίτερα εμφανής και από την προς τα άνω ρύθμιση της δραστηριότητας του επαγωγέα της ελαστίνης, καθώς και από την αυξημένη ποσότητα του mrna της ελαστίνης [216, 217]. Eπίσης, το φωτογηρασμένο δέρμα σε σύγκριση με το ενδογενώς γηρασμένο δέρμα χαρακτηρίζεται από αύξηση 2,6 φορές του mrna της ελαστίνης, 5,3 φορές της έκφρασης της ελαστίνης, και 5 φορές στη δραστηριότητα του επαγωγέα της ελαστίνης. Παρόλα αυτά, η αύξηση αυτή στη συνθετική δραστηριότητα δεν είναι ικανή από μόνη της να εξηγήσει την τεράστια άθροιση ελαστίνης στο φωτογηρασμένο δέρμα, όπως αυτή φαίνεται ιστολογικά [217]. Οι περισσότερες έρευνες αποδίδουν αυτό το γεγονός σε 58
μειωμένη αποδομή της ελαστίνης, φαινόμενο που οδηγεί σε άθροιση μερικώς αποδομημένων ελαστικών ινών. Πράγματι, στο φωτογηρασμένο δέρμα παρατηρείται μια αυξημένη εναπόθεση λυσοζύμης, α-1-αντιθρυψίνης και P αμυλοειδούς στις ελαστικές ίνες [218-220]. Τα μόρια αυτά, με κύριο τη λυσοζύμη, αποτρέπουν τον καταβολισμό τη ελαστίνης από την ανθρώπεια ελαστάση των λευκοκυττάρων (HLE, human leucocytic elastase), συνδεόμενα με κατεστραμμένα τμήματα του δικτύου της ελαστίνης και επηρεάζοντας την αλλλεπίδρασή τους με την ΗLE [221]. Eν τέλει, φωτογήρανση και ενδογενής γήρανση έχουν ως αποτέλεσμα την ανεπάρκεια στη δομή και λειτουργία των ελαστικών ινών [222]. Οι λεπτές ελαστικές ίνες της θηλώδους στοιβάδας της δερμίδας μειώνονται δραματικά και αντικαθίστανται από δομικά ανώμαλες που αν και συναθροίζονται σε μεγάλους αριθμούς δεν μπορούν να επιτελέσουν το λειτουργικό και δομικό τους ρόλο. Όλες αυτές οι αλλαγές οδηγούν στη χαρακτηριστική μακροσκοπική μείωση της ελαστικότητας του γερασμένου δέρματος [223]. Η ελαστίνη, λοιπόν, παρουσιάζει μια σειρά χαρακτηριστικών αλλαγών, όπως μειωμένο καταβολισμό, άθροιση ανωμαλιών στην υπάρχουσα ελαστίνη στην ενδογενή γήρανση, αυξημένη σύνθεση παθολογικής δομικά ελαστίνης και παθολογική κατανομή της ελαστίνης στην άνω δερμίδα στο φωτογηρασμένο δέρμα [223]. Όλοι αυτοί οι παράγοντες οδηγούν στο χαρακτηριστικό μακροσκοπικό φαινότυπο του φωτογηρασμένου δέρματος που ονομάζεται ηλιακή ελάστωση. Το κολλαγόνο στη δερματική γήρανση Το κολλαγόνο αποτελεί το 70-80% του ξηρού βάρους της δερμίδας και κάθε μόριό του αποτελείται από 3 πολυπεπτιδικές αλυσίδες [224]. Η ποσότητά του στη δερμίδα, η διαλυτότητά του, η ενεργότητα των ενζύμων που εμπλέκονται στον αναβολισμό και αποδόμησή του, το μέγεθος των μορίων του είναι όλοι παράγοντες που συνδέονται στενά με τις λειτουργικές και δομικές ιδιότητες του κολλαγόνου και που υφίστανται χαρακτηριστικές αλλαγές σε πολλά δερματικά νοσήματα, όπως και στη δερματική γήρανση. Σε γενικές γραμμές, λοιπόν, στο χρονολογικά ενδογενώς γηρασμένο δέρμα ο ρυθμός της σύνθεσης του κολλαγόνου, η ενεργότητα των ενζύμων που δρούνε στη μετα-μεταγραφική τροποποίηση, η διαλυτότητα του κολλαγόνου και το πάχος των ινών του στη δερμίδα είναι μεταβλητές που όλες μειώνονται [225]. Επίσης, η αναλογία του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ προς το κολλαγόνο τύπου Ι αυξάνεται σταδιακά με την αύξηση της ηλικίας [226], ενώ η συνολική ποσότητα κολλαγόνου και η συνοχή των ινών του μειώνονται. Στο φωτογηρασμένο δέρμα, από την άλλη, οι ίνες του κολλαγόνου 59
είναι πεπαχυμένες και παρουσιάζουν μεγαλύτερη διαλυτότητα. Κολλαγόνο τύπου VI Το κολλαγόνο τύπου VI είναι ένα σημαντικό κομμάτι της δερμίδας αλλά και άλλων «χαλαρών» εξωκυττάριων χώρων [227, 228] και παίζει ένα σπουδαίο φυσιολογικό ρόλο στην επικοινωνία, σύνδεση και οργάνωση των μορίων του εξωκυτταρίου στρώματος [229, 230]. Σε αντίθεση με τα περισσότερα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, το κολλαγόνο τύπου VI φαίνεται να παραμένει ανεπηρέαστο από τη διαδικασία της ενδογενούς και εξωγενούς γήρανσης. Πολύ μικρές διαφοροποιήσεις παρατηρήθηκαν στην κατανομή του στη δερμίδα στη φωτογήρανση σε σχέση με το ηλικιακά νέο και το ενδογενές γηρασμένο δέρμα. Αυτό φαίνεται να αντικατοπτρίζει μια ιδιαίτερη σταθερότητα του κολλαγόνου αυτού, παρά την επαγωγή των μεταλλοπρωτεϊνασών στη φωτογήρανση [231, 232]. Το ίδιο σταθερά παραμένουν και τα επίπεδα του mrna των α αλύσεων του κολλαγόνου τύπου VI [233]. Είναι, λοιπόν, απίθανο το κολλαγόνο του τύπου αυτού να έχει ένα σημαντικό ατιοπαθογενετικό ρόλο στη γήρανση, ενώ η σταθερότητά του ίσως να σημαίνει ότι το μόριο αυτό είναι απαραίτητο για τη συνολική συνοχή της δερμίδας. Κολλαγόνο τύπου I και ΙΙΙ Η δερμίδα περιέχει κύρια κολλαγόνο τύπου Ι (85%- 90%) και κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ (10%-15%). Οι ινοβλάστες της δερμίδας συνθέτουν τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες των κολλαγγόνων Ι και ΙΙΙ ως πρόδρομα μόρια που ονομάζονται προκολλαγόνο [234]. Το προκολλαγόνο Ι και ΙΙΙ, λοιπόν, ως πρόδρομα όρια του ώριμου κολλαγόνου αντικατοπτρίζουν τα επίπεδα της βιοσυνθετικής δραστηριότητας του κολλαγόνου. Στην ενδογενή γήρανση το κολλαγόνο τύπου I και ΙΙΙ μειώνεται με την ηλικία και οι λεπτές ίνες κολλαγόνου που χαρακτηρίζουν την παιδική ηλικία γίνονται πυκνές και πιο τυχαία κατανεμημένες [235]. Η μείωση αυτή που χαρακτηρίζει την ενδογενή γήρανση, είναι πολύ μεγαλύτερη στη φωτογήρανση και συμβαίνει με επιταχυνόμενους ρυθμούς [236]. Μάλιστα ο βαθμός αυτής της μείωσης φαίνεται να σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα της φωτογήρανσης. Η μείωση αυτή φαίνεται να είναι το αποτέλεσμα της μειωμένη παραγωγής προκολλαγόνου και της αυξημένης ενζυματικής αποδόμησης από τη δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών [237, 238]. Η AP-1 είναι κύρια υπεύθυνη για τη μείωση της έκφρασης του προκολλαγόνου Ι στο μεταγραφικό επίπεδο [239]. Άλλες μελέτες έχουν καταδείξει ότι στο φωτογηρασμένο δέρμα υπάρχει μια μεγάλη πτώση στα επί- 60
πεδα του προκολλαγόνου Ι και ΙΙΙ [240, 241]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η συσσώρευση των αποδομημένων προιόντων κολλαγόνου στη φωτογηρασμένη δερμίδα μπορεί να επηρεάσει αρνητικά την παραγωγή προκολλαγόνου από τους ινοβλάστες [242, 243]. Οι MMP έχουν σημαντικότατο ρόλο στη φωτογήρανση και ο ρόλος τους αυτός θα αναλυθεί παρακάτω. Κολλαγόνο τύπου VIΙ Το κολλαγόνο τύπου VII, επίσης, εμπλέκεται στους μηχανισμούς της γήρανσης και του σχηματισμού ρυτίδων. Το κολλαγόνο αυτό είναι ένα από τα σημαντικότερα στοιχεία της σύνδεσης επιδερμίδας και δερμίδας και ο ρόλος του στο σχηματισμό και διατήρηση του δερματοεπιδερματικού φραγμού είναι σημαντικότατος [244]. Στο φωτογηρασμένο δέρμα ο αριθμός των αγκυρωτικών ινιδίων και του κολλαγόνου VII κατά μήκος του δερματοεπιδερμιδικού φραγμού μειώνεται σημαντικά, με αποτέλεσμα την αυξημένη ευθραστότητα του φωτογηρασμένου δέρματος [245]. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού (MMP) στη δερματική γήρανση Ήδη από τις προαναφερθείσες μεταβολές και χαρακτηριστικές αλλαγές στο κολλαγόνο και την ελαστίνη, αντιλαμβανόμαστε ότι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες έχουν σημαντικό αιτιοπαθογενετικό ρόλο, τόσο στην ενδογενή όσο και στην εξωγενή γήρανση, καθώς στα κύρια υποστρώματά τους περιλαμβάνονται οι διάφοροι τύποι του κολλαγόνου. Άλλωστε, η συνδυασμένη δράση της ΜΜP-1, -2, -3 και -9 μπορεί να αποδομήσει πλήρως το κολλαγόνο της δερμίδας και τα τμήματα του δικτύου της ελαστίνης. Οι MMP στην ενδογενή δερματική γήρανση Στο ηλικιακά νέο δέρμα η δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι σχετικά χαμηλή με την MMP-1 και MMP-3, δύο μεταλλοπρωτεϊνάσες κλειδιά στην αναδιαμόρφωση του εξωκυτταρίου στρώματος, να εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Αντίθετα, τα επίπεδα των ΤIMP1 και 3 είναι υψηλά, αναστέλλοντας περαιτέρω την αποδημητική ικανότητα των MMP-1 και 3 [246]. Στο ενδογενές γηρασμένο δέρμα από την άλλη, αυτό το φαινόμενο αναστρέφεται και παρατηρείται μια αύξηση στην έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών και μια μείωση στην έκφραση των ειδικών ιστικών αναστολέων τους, με αποτέλεσμα την ανατροπή της ισορροπίας MMP:TIMP και τον αυξημένο καταβολισμό των μορίων του εξωκυτταρίου στρώματος [247, 61
248]. Οι MMP στην εξωγενή δερματική γήρανση Όπως αναφέρθηκε προηγούμενα, η βασική έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών στο «φυσιολογικό» δέρμα είναι σχετικά χαμηλή. Αντίθετα, έχει αποδειχθεί ότι στη φωτογήρανση, υπό την επίδραση της UV ακτινοβολίας, η έκφρασή τους αυξάνεται δραματικά, τόσο in vivo, όσο και σε κυτταροκαλλιέργειες. Δύο φαίνεται να είναι οι κύριοι παράγοντες για τη φωτοεπαγόμενη αύξηση της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών. Η πυρηνική πρωτεΐνη AP-1 υπό την επίδραση της UV αυξάνεται δραματικά και ενεργοποιείται. Η πρωτεΐνη αυτή ελέγχει τη μεταγραφή των μεταλλοπρωτεϊνασών και τελικό αποτέλεσμα της αύξησης της είναι η αύξηση των MMP. Όπως η AP-1, ο μεταγραφικός παράγοντας NF-kB, επίσης, ενεργοποιείται από την επίδραση της UV μέσω ενός σιδηρο-εξαρτωμένου μηχανισμού και έχει την ικανότητα να πολλαπλασιάζει την UV επαγωγή ένζυμων μέσω της αύξησης της μεταγραφής των φλεγμονωδών κυτοκινών. Μέσω αυτού του μηχανισμού αυξάνεται η δράση της MMP-8 και MMP-9 [249]. Έτσι, φαίνεται ότι υπάρχει μια δοσοεξαρτώμενη σχέση μεταξύ έκθεσης στη UV και επαγωγής των MMP [250]. H ακτινοβόληση του δέρματος με μια μόνο δόση UV έχει αποδειχθεί ότι είναι ικανή να αυξήσει τη δραστηριότητα των MMP και αυτό έχει συσχετιστεί με σημαντική αποδόμηση των κολλαγόνων ινών. Έτσι, η φωτογήρανση χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα των MMP-1, -2, - και -9. Σε συνάρτηση με την αύξηση της δραστηριότητας των MMP, στη φωτογήρανση φαίνεται να αυξάνεται και ένας ειδικός ιστικός αναστολέας τους, κύρια ο TIMP1, ο οποίος βοηθάει στην εξισορρόπηση της αποδομητικής δράσης των MMP. Παρόλα αυτά, φαίνεται ότι στη φωτογήρανση ενισχύεται ένα πιο αποδομητικό περιβάλλον, με αποτέλεσμα την καταστροφή των κολλαγόνων ινών και του δικτύου της ελαστίνης. Συγκεκριμένα, η MMP-1 επάγεται στη φωτογήρανση και καταβολίζει το δερματικό κολλαγόνο σε μικρότερα τμήματα, τα οποία μπορούν να καταβολιστούν περαιτέρω από τις MMP-2 και -9. Τα αποδομημένα αυτά τμήματα κολλαγόνου στη δερμίδα ενισχύουν μοριακές σηματοδοτήσεις που ως αποτέλεσμα έχουν τη μειωμένη σύνθεση του προκολλαγόνου 1 από τους ινοβλάστες [251, 252]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε στο φωτογηρασμένο δέρμα αυξημένη έκφραση της MMP-8 από τα ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα, αλλά η σημασία της ενεργοποίησης αυτής δεν έχει αποσαφηνισθεί πλήρως [250]. 62
Οι πρωτεογλυκάνες (PG) στη δερματική γήρανση Οι κύριες πρωτεογλυκάνες που εντοπίζονται στο ανθρώπινο δέρμα είναι η ντεκορίνη και η βερσικάνη. Αν και οι πρωτεογλυκάνες της δερμίδας βρίσκονται σε πολύ μικρές ποσότητες σε σχέση με το κολλαγόνο, όλα τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι είναι σημαντικά μόρια για τη φυσιολογία του δέρματος. Η μικρή πρωτεογλυκάνη ντεκορίνη συνδέεται με το κολλαγόνο Ι [253, 254] και διαταραχή της έχει ως αποτέλεσμα την παθολογική διαμόρφωση των κολλαγόνων ινών και τη μείωση της αντοχής του δέρματος [255]. Συγκεκριμένα, η ντεκορίνη φαίνεται να αποτελεί ένα λειτουργικό συνδέτη που επιτρέπει την αλληλεπίδραση μεταξύ των διάφορων τύπων κολλαγόνου [256]. Σε αντίθεση με τις ίνες της ελαστίνης, το κολλαγόνο Ι και η ντεκορίνη φαίνεται να μειώνονται δραματικά στο φωτογηρασμένο δέρμα [257, 258]. Επίσης, μια αποδομημένη μορφή της ντεκορίνης, η οποία φαίνεται να αποτελεί ένα καταβολικό προϊόν της, αυξάνεται συνεχώς στη δερμίδα με την πάροδο της ηλικίας, αλλά και της φωτογήρανσης. Το καταβολικό αυτό προϊόν έχει εξαιρετικά μειωμένη ικανότητα να συνδέεται με το κολλαγόνο τύπου Ι [258]. Η βερσικάνη, μια μεγάλη πρωτεογλυκάνη, φαίνεται να υπερρυθμίζεται ταυτόχρονα με τη δυστροφική ελαστίνη, με αποτέλεσμα μια σχετική αύξηση στο φωτογηρασμένο δέρμα [258]. Σε γενικές γραμμές, δεν έχει πλήρως διερευνηθεί ο ρόλος των πρωτεογλυκανών στη δερματική γήρανση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα μελετηθεί η έκφραση των πρωτεογλυκανών τόσο στην ενδογενή όσο και στην εξωγενή δερματική γήρανση. 63
64
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Η ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΣΤΗ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ Η δερματική γήρανση, όπως αναλύθηκε προηγούμενα, έχει ιδιαίτερα μεγάλη επίπτωση στο γενικό πληθυσμό. Η φαρμακολογία και θεραπευτική ανέκαθεν έκαναν προσπάθειες για την αναστροφή αυτού του φαινομένου. Τις τελευταίες δεκαετίες, με τη σύγχρονη εξέλιξη των μοριακών τεχνικών αλλά και με τα αναπτυχθέντα πειραματικά μοντέλα οι μελέτες αυτές κορυφώθηκαν. Πολλές φαρμακευτικές ουσίες με «θαυματουργές» ικανότητες που δεν υπάκουγαν σε κανένα νόμο της τεκμηριωμένης ιατρικής (evidence based medicine) χρησιμοποιήθηκαν κατά καιρούς, υποσχόμενες αναστροφή του φαινομένου της γήρανσης. Από την άλλη, ο γιατρός του σήμερα έχει στη θεραπευτική του «φαρέτρα» φάρμακα που αποδεδειγμένα έχουν ευνοϊκή επίδραση στη γήρανση, ενώ η προσπάθεια για εύρεση όλο και πιο ειδικών και αποδοτικών θεραπειών συνεχώς αυξάνεται. Στο κεφάλαιο αυτό θα αναλυθούν οι σημαντικότερες θεραπευτικές προσεγγίσεις, καθώς και οι μελλοντικές προοπτικές στη θεραπευτική της δερματικής γήρανσης. Ορμόνες του φύλου και δερματική γήρανση Ο ρόλος των ορμονών του φύλου στη δερματική γήρανση περιγράφηκε ανωτέρω. Έχει, επίσης, αναφερθεί η διαφορά στη δερματική γήρανση σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες υπό αγωγή υποκατάστασης σε σύγκριση με γυναίκες χωρίς αγωγή υποκατάστασης. Ακολούθως, περιγράφονται οι κλινικές μελέτες που έχουν γίνει μέχρι στιγμής καθώς και οι μελλοντικές προοπτικές που ανοίγονται. Συστηματική αγωγή υποκατάστασης. Η συστηματική αγωγή ορμονικής υποκατάστασης αποτελείται από δύο μέρη, τα οιστρογόνα και τα προγεσταγόνα. Τα οιστρογόνα, χορηγούμενα ως μονοθεραπεία, έχουν ως αποτέλεσμα την ανεπιθύμητη υπερπλασία του ενδομήτριου. Για να αποφευχθεί αυτό το γεγονός, συνθετικά παράγωγα προγεστερόνης και τεστοστερόνης, γνωστά ως προγεσταγόνα, συνδυάζονται με ένα οιστρογονικό παράγωγο, το οποίο χορηγείται σε κυκλική ή συνεχής αγωγή. Τα ευεργετικά αποτελέσματα της θεραπείας ορμονικής υποκατάστασης στο δέρμα έχουν καταγραφεί, με το πάχος της δερμίδας να αποτελεί εικόνα της ποσότητας του κολλαγόνου του συνδετικού ιστού [259-262]. Μια μεγάλη αναδρομική πολυκεντρική μελέτη κατέληξε στο συμπέρασμα 65
ότι γυναίκες υπό μακρόχρονη θεραπεία υποκατάστασης είχαν στατιστικώς σημαντικά λιγότερες ρυτίδες από γυναίκες χωρίς αγωγή. Άλλες μελέτες απέδειξαν ότι γυναίκες υπό αγωγή υποκατάστασης είχαν υψηλότερο πόσο κολλαγόνου από γυναίκες χωρίς αγωγή. Όλες οι μελέτες καταδεικνύουν την ευεργετική επίδραση της ορμονικής θεραπείας υποκατάστασης, τόσο στη φωτογήρανση, όσο και στην ενδογενή δερματική γήρανση του δέρματος. Φυσικά όλα τα παραπάνω δεδομένα δεν μπορούν να τεκμηριώσουν σε καμία περίπτωση τη θεραπευτική χρήση τη ορμονικής υποκατάστασης αποκλειστικά και μόνο για τη γήρανση του δέρματος. Από την άλλη, τα αποτελέσματα αυτά είναι άκρως ενδιαφέροντα. Τα τελευταία χρόνια έχει αυξηθεί η προσπάθεια παραγωγής σκευασμάτων τοπικών ή άλλης φαρμακολογικής μορφής, ώστε να διατηρηθούν μόνο τα ευεργετικά αποτελέσματα της αγωγής υποκατάστασης στο δέρμα. Τοπική αγωγή Σε μια ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα μελέτη, εξετάστηκε η επίδραση μιας τοπικά εφαρμοζόμενης οιστρογονικής κρέμας σε 54 γυναίκες [263]. Τα κριτήρια αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας ήταν μετρήσεις του δερματικού πάχους με υπέρηχο. Μετά από 24 εβδομάδες θεραπείας παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά στις μελετώμενες μεταβλητές σε σχέση με την ομάδα στην οποία χορηγούνταν το placebo. Ακόμη και για τις μικρές δερματικές ρυτίδες, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική μείωση. Από την άλλη, δεν παρατηρήθηκε καμία ανεπιθύμητη ενέργεια. Δύο ακόμη μελέτες ήρθαν να προσθέσουν ανάλογα θετικά αποτελέσματα [264, 265]. Αν και η τοπική εφαρμογή αναλογών σκευασμάτων φαίνεται μια εύκολη εναλλακτική της συστηματικής αγωγής υποκατάστασης, απομένει να διευκρινιστεί επακριβώς το ακριβές δοσολογικό σχήμα, ώστε να επιτευχθεί το μέγιστο σε απόδοση χωρίς την πιθανότητα συστηματικών ανεπιθύμητων ενεργειών. Οι φυτοορμόνες Οι οιστρογονικές επιδράσεις ορισμένων φυτών είναι γνωστές από το 1927 [266]. Τα φυτοοιστρογόνα μπορούν να κατηγοριοποιηθούνε σε 3 κατηγορίες, τις ισοφλαβόνες, τις κουμεστάνες και τις λιγνάνες. Η πιο καλά μελετημένη κατηγορία ουσιών είναι οι ισοφλαβόνες, οι οποίες καταδεικνύουν ομοιότητα με το οιστρογονικό μόριο των θηλαστικών. Η δομική τους λοιπόν ομοιότητα με το μόριο της 17-β-οιστραδιόλης εξηγεί και τις οιστρογονικές επιδράσεις τους, καθώς και την αλληλεπίδραση αυτών των ουσιών με τους οιστρογονκούς υποδοχείς [267]. Η βιολογική δράση των ισοφλαβονοειδών είναι σημαντικά μικρότερη από τα συνθετικά οιστρογόνα [268]. Όταν τα φυτοοιστρογόνα χορηγούνται τοπικά δεικνύουν δράση 66
παρόμοια με αυτήν των οιστρογόνων, καθώς επάγουν τη σύνθεση κολλαγόνου και μειώνουν την ενζυματική καταβολή του [269]. Τα φυτοοιστρογόνα, λοιπόν, τοπικά ή συστηματικά, μπορεί να αποτελέσουν μια αποτελεσματική μέθοδο στην αντιμετώπιση της δερματικής γήρανσης, παρόλα αυτά, απαιτούνται περαιτέρω δεδομένα από τυχαιοποιημένες κλινικές δοκιμές, για τη μακρόχρονη δράση τους και τα ανεπιθύμητα αποτελέσματα της συστηματικής χορήγησής τους. Οι κυτταροκίνες Σε κυτταροκαλλιέργειες ινοβλαστών έχουν μελετηθεί οι κυτταροκίνες IL- 1 και IL-4 και τα αποτελέσματα είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά. IL-1 Έχει αναφερθεί ότι η φυσική IL- 1,η ανθρώπειος ανασυνδυασμένη hril-lα και β καθώς και το συνθετικό IL-1β 163-171 πεπτίδιο διέγειραν την παραγωγή των γλυκοζαμινογλυκανών και κύρια του υαλουρονικού οξέος σε ανθρώπινους ινοβλάστες in vitro [270]. Η σημαντική συμμετοχή του υαλουρονικού οξέος στη γήρανση του δέρματος αναφέρθηκε ανωτέρω. Παρόλα αυτά παραμένει να διερευνηθεί το πώς αυτά τα ιδιαίτερα ενθαρρυντικά αποτελέσματα θα μεταφραστούν σε ενεργείς φαρμακολογικές ουσίες και θα περάσουν στην κλινική πράξη. IL-4 Η ιντερλευκίνη 4 (IL-4) είναι μια πλειοτροπική κυττοκίνη που εκφράζεται από τα κύτταρα της φλεγμονής. Διάφορες μελέτες έχουν καταδείξει την ικανότητά της να διεγείρει σε καλλιέργειες δερματικών ινοβλαστών τη σύνθεση του κολλαγόνου [271, 272].. Η σύνθεση της ινωδονεκτίνης φαίνεται και αυτή να επηρεάζεται θετικά [273]. Σε πιο πρόσφατη μελέτη αποδείχθηκε η αύξηση των GAG από την IL-4 σε φυσιολογικούς δερματικούς ινοβλάστες ενώ η ντεκορίνη ήταν η κύρια πρωτεογλυκάνη του εξωκυτταρίου στρώματος που αυξήθηκε [274]. Όλα τα παραπάνω δεδομένα αναδεικνύουν την IL-4 ως ικανή να ρυθμίσει το κολλαγόνο αλλά και τις πρωτεογλυκάνες και γλυκοζαμινογλυκάνες. Παρόλα αυτά υπάρχουν και εδώ οι ίδιοι προβληματισμοί που εκφράστηκαν και για την IL-1. Η laser φωτοανάπλαση Η χρήση των laser στις δερματικές παθήσεις είναι ευρέως διαδεδομένη. Τα τελευταία χρόνια, όμως, άρχισε με μεγάλο ρυθμό η χρησιμοποίησή τους και για τη δερματική γήρανση, τόσο την ενδογενή, όσο και την εξωγενή. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχουν αρκετές κλινικές δοκιμές και 67
τεκμηριωμένες μελέτες. Μια αρκετά αξιόλογη μελέτη κατέδειξε τις ευνοϊκές επιδράσεις, τόσο τις βραχυπρόθεσμες, όσο και τις μακροπρόθεσμες, τη φωτοανάπλασης στη δερμίδα και το συνδετικό ιστό [275]. Η εν λόγω κλινική μελέτη κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η θεραπευτική αυτή παρέμβαση οδήγησε σε μακροπρόθεσμη κλινική βελτίωση των ρυτίδων, αναστροφή των μελαγχρωματικών βλαβών τη φωτογήρανσης, ανανέωση της φυσιολογικής αγγείωσης του συνδετικού ιστού της δερμίδας, καθώς και αύξηση της ποσότητας του κολλαγόνου, ενώ ήταν μη στατιστικώς σημαντικά οι ανεπιθύμητες ενέργειες. Παρόλα αυτά, η εκτεταμένη χρήση των laser εγείρει διάφορους προβληματισμούς και επισημαίνει την ανάγκη για διεξαγωγή περισσοτέρων τεκμηριωμένων κλινικών δοκιμών. Επεμβατικές μέθοδοι Κατά καιρούς έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες επεμβατικές θεραπευτικές μέθοδοι, όπως η δερμοαπόξεση, τα χημικά peeling με φαινόλη και ανάλογα παράγωγα, καθώς και επεμβατικά laser. H χρησιμοποίησή τους φαίνεται ότι οδηγεί σε παραγωγή νέου κολλαγόνου [276]. Σε όλες αυτές τι μεθόδους τα αποτελέσματα μπορούν να είναι ιδιαίτερα εντυπωσιακά, αλλά συνοδεύονται με αυξημένο κίνδυνο μολύνσεων, ανάπτυξης ουλών, μόνιμου ερυθήματος και διαταραχών της μελάγχρωσης του δέρματος. Συνεπώς, εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη για πιο εξευγενισμένες μεθόδους συνεχίζει. Η L-φουκόζη και οι πλούσιοι σε φουκόζη πολυσακχαρίτες (FROP-s - fucose-rich polysaccharides) Αρκετές μελέτες με ενδιαφέροντα αποτελέσματα έχουν πραγματοποιηθεί για το ρόλο των παραπάνω μορίων στη δερματική γήρανση. Αρχικά αποδείχθηκε ότι η L-fucose και οι πλούσιοι σε φουκόση πολυσακχαρίτες είχαν τη δυνατότητα να επηρεάσουν τους μοριακούς μηχανισμούς της δερματικής γήρανσης, καθώς φάνηκε ότι υπορύθμιζαν τη δραστηριότητα των MMP-2 και MMP-9 [277]. Στη συνέχεια, σε θεραπεία με L-fucose άτριχων επίμυων, καταδείχθηκε ο ρόλος τους στη βελτίωση της κολλαγονογένεσης και στην αύξηση των ελαστικών ινών in vivo [278],. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και in vitro σε καλλιέργειες ανθρώπινων ινοβλαστών [279]. Πιο πρόσφατη μελέτη κατέδειξε την ευεργετική τους επίδραση στη βιοσύνθεση των GAG [280]. Τα ρετινοειδή Τα ρετινοειδή είναι η πιο καλά μελετημένη κατηγορία φαρμάκων για 68
τη θεραπεία της δερματικής γήρανσης. Στην πραγματικότητα είναι η μόνη κατηγορία φαρμάκων που αποδεδειγμένα με μεγάλο αριθμό κλινικών δοκιμών και μοριακών μελετών έχουν αποτέλεσμα. Αν και η μελέτη τους έχει ένα μακρύ ιστορικό, η προσπάθεια για ανεύρεση πιο ειδικών ρετινοειδών με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα συνεχίζεται με μεγάλο ρυθμό. Ακολούθως, θα περιγράφουν τα μέχρι σήμερα δεδομένα, καθώς και οι μελλοντικές προοπτικές για έρευνα. Γενικά Ο όρος ρετινοειδή χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να περιγράψει τη βιταμίνη Α (all-trans retinol) και τους μεταβολίτες της, όπως το all-trans retinoic acid (tretinoin) [281]. Αυτά αποτέλεσαν και τη πρώτη γενεά των ρετινοειδών. Τα σύγχρονα συνθετικά ρετινοειδή, η λεγόμενη τρίτη γενεά, όπως η αδαπαλένη και η ταζαροτένη, είναι δομικά ανόμοια με την τρετινοινη ή τη ρετινόλη, αλλά εξακολουθούν να παρουσιάζουν δράση ρετινοειδούς. Τα ρετινοειδή έχουν σημαντική δράση στη δερματική κυτταρική διαφοροποίηση, όπως υποδεικνύεται από τη χαρακτηριστική υπερκεράτωση που παρατηρείται στην υποβιταμίνωση A [282]. Οι υποδοχείς των ρετινοειδών στο δέρμα Τα ρετινοειδή έχουν την ικανότητα να συνδέονται με ειδικούς πυρηνικούς υποδοχείς που ανήκουν στη στεροειδική/θυρεοειδική υπεροικογένεια των ειδικών συνδετικών μεταγραφικών παραγόντων, μια οικογένεια που περιλαμβάνει υποδοχείς για τα γλυκοκορτικοειδή, οιστρογόνα, θυρεοειδικές ορμόνες και τη βιταμίνη D [283]. Οι υποδοχείς των ρετινοειδών μπορούν να χωριστούν σε δύο υποκατηγορίες, τους υποδοχείς των ρετινοϊκών οξέων (retinoic acid receptors, RAR) που είναι οι RAR α, β and γ και συνδέονται με την τρετινοΐνη και το 9-cis retinoic acid και τους Χ υποδοχείς των ρετινοειδών (retinoid X receptors, RXR) που είναι οι RXR α, β και γ, οι οποίοι συνδέονται αποκλειστικά με το 9-cis ρετινοϊκό οξύ [284]. Φαίνεται, λοιπόν, ότι οι RARs and RXRs δρουν ως διμερή, με τους RXR να αποτελούν το κυρίαρχο και απαραίτητο στοιχείο. Πράγματι, οι RXR σχηματίζουν διμερή και με άλλους υποδοχείς της υπεροικογένειας, κυρίως με τους υποδοχείς των θυρεοειδικών ορμονών. Μόνο μετά από σύνδεση των ρετινοειδών με τους υποδοχείς τους μπορούν τα ρετινοειδή να επάγουν τη γονιδιακή δραστηριότητα στα κύτταρα στόχους. Ο πιο αξιόπιστος κυτταρικός «μάρτυρας» της δράσης των ρετινοειδών είναι η επαγωγή και αύξηση του mrna της κυτταρικής συνδετικής πρωτεΐνης των ρετινοειδών (cellular retinoic acid binding protein, CRABP-II) [285]. Έχει βρεθεί στον άνθρωπο και στους επίμυες ότι οι 3 RAR υποδοχείς κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια [286-289]. Επί- 69
σης, έχει βρεθεί ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν τους RXR υποδοχείς βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα [290-292]. Μοριακές και βιολογικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι ο RAR-γ και ο RXR-α είναι οι κύριοι υποδοχείς που εκφράζονται στο φυσιολογικό ανθρώπινο δέρμα [293, 294]. Οι ίδιες μελέτες κατέδειξαν ότι τα σχετικά επίπεδα των RAR και RXR πρωτεϊνών ήταν παρόμοια με τα σχετικά επίπεδα του mrna τους. Στο ενήλικο ανθρώπινο δέρμα το επίπεδο του RAR-γ αποτελούσε το 87% των RAR πρωτεϊνών [295], ενώ το υπόλοιπο 12 14% ήταν RAR-α. επίσης, δεν ανιχνεύθηκε καθόλου RAR-β. Από την άλλη, ο RXR-α αποτελεί το 90% των RXR πρωτεϊνών που εκφράζονται στο ανθρώπινο δέρμα, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν ούτε RXR-β ούτε RXR-γ πρωτεΐνες. Επιπλέον το κύριο διμερές που ανιχνεύεται σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από κύτταρα ανθρωπίνου δέρματος είναι το ετεροδιμερές RARγ/RXR-α [296]. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι το ετεροδιμερές αυτό είναι ο κύριος υποδοχέας ρετινοειδών που ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων των ρετινοειδών στο ανθρώπινο ενήλικο δέρμα. Μια πρόσφατη μελέτη έρχεται να επιβεβαιώσει το γεγονός αυτό, αποδεικνύοντας ότι ο RΑR-γ έχει ρόλο κλειδί στη θεραπεία της φωτογήρανσης, ενώ δεν φαίνεται να είναι τόσο σημαντικός ο ρόλος του RXR-α [297]. Άλλες μελέτες τονίζουν ότι ο RAR-γ φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντικός σε ζωικά μοντέλα για τα μελέτη της φαρμακολογικής δράσης των ρετινοειδών [298, 299]. O μηχανισμός δράσης των ρετινοειδών στη φωτογήρανση Ο ακριβής μηχανισμός δράσης με τον οποίο τα ρετινοειδή παράγουν την κλινική βελτίωση του φωτοεκτεθειμένου δέρματος δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος, πιθανόν εξαιτίας της περιορισμένης μας γνώσης για τους παθογενετικούς μηχανισμούς της φωτογήρανσης. Αυτό που είναι, όμως, γνωστό είναι ότι η ρυτίδωση σχετίζεται με απώλεια κολλαγόνου Ι [300], ΙΙΙ [301] και VII [302] στη θηλώδη δερμίδα. Δέρμα που ακτινοβολήθηκε με UVB χαρακτηρίζεται από μειωμένο κολλαγόνο στον ECM και από αύξηση των MMP, ιδιαίτερα των κολλαγονασών. In vivo μελέτες έχουν αποδείξει την ικανότητα των ρετινοειδών να αποκαθιστούν το κολλαγόνο και να προλαμβάνουν τον περεταίρω καταβολισμό του στο φωτοεκτεθειμένο δέρμα. Θεραπεία με τρετινοΐνη, πριν από την έκθεση σε UVB, αναστέλλει την UVR-επαγόμενη έκφραση του AP-1, με μια διαδικασία που είναι γνωστή ως υπερκαταστολή. Αποτέλεσμα αυτού είναι να μην παρατηρείται UVB-επαγόμενη αύξηση των MMP και, άρα, να διατηρείται η ακεραιότητα του ECM [303]. Αυτές οι μελέτες μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα ρετινοειδή προκαλούν τα αντιφωτογηραντικά τους αποτελέσματα μέσω δύο μηχανισμών: πρώτον, αναστέλλοντας την παραγωγή των MMP μέσω 70
της υπορύθμισης μεταγραφικών τους παραγόντων και, δεύτερον, αποκαθιστώντας τα επίπεδα του κολλαγόνου στο φωτογηρασμένο δέρμα. Η αδαπαλένη Σχετικά πρόσφατα, ένα νέο RAR-β/-γ εκλεκτικό ρετινοειδές, η αδαπαλένη, αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία της ακμής και της ψωρίασης. Η αδαπαλένη είναι ένα ναφθοεικό αριτινοειδές με υψηλή χημική και φυσική σταθερότητα, και η εκλεκτικότητά της για τους RAR υποδοχείς είναι RAR-β>RAR-γ>>RAR-α [304]. Οι μέχρι τώρα φαρμακολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η αδαπαλένη είναι πιο ανεκτή από τα υπόλοιπα ρετινοειδή που είναι RAR-παναγωνιστές. Μια πιλοτική μελέτη με καθημερινή τοπική εφαρμογή γέλης αδαπαλένης (0.1% and 0.3%) για 4 εβδομάδες έδειξε στατιστικώς σημαντική διαφορά στη μείωση της ακτινικής κερατώσεως, μιας βλάβης που έχει άμεση συσχέτιση με τη μακρόχρονη έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία [305]. 71
72
ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 73
74
1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ασθενείς Δεκαέξι ενήλικες, 10 άρρενες (μέση ηλικία 73 έτη) και 6 θήλυ (μέση ηλικία 67 έτη), και 10 παιδιά άρρενα (μέση ηλικία 5,21) συμμετείχαν στη μελέτη αυτή. Όλες οι γυναίκες ήταν μετεμμηνοπαυσιακές. Κριτήρια αποκλεισμού Ως κριτήρια αποκλεισμού για την εισαγωγή των ασθενών στη μελέτη αποτέλεσαν: η προ- η πέρι-εμμηνοπαυσιακή περίοδος για τις γυναίκες, η χρήση τοπικών ή συστηματικών ρετινοϊδών κατά το προηγούμενο εξάμηνο, η θεραπεία ορμονικής υποκατάστασης, η συστηματική σκληροδερμία, ο συστηματικός και δισκοειδής ερυθυματώδης λύκος και η ψωρίαση, δηλαδή η λήψη φαρμάκων ή παθήσεις που έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τα μόρια του εξωκυτταρίου στρώματος στη δερμίδα. Λήψη ανθρώπειων δειγμάτων Από τους ενήλικες συλλέχτηκαν φωτοεκτεθειμένα δείγματα με 6 mm punch βιοψίας από το μακροσκοπικά υγιές φωτογηρασμένο δέρμα και φωτοπροστατεύμενα δείγματα με 4 mm punch βιοψίας πίσω από το λοβό του ωτός, ακριβώς στη σύζευξη κρανιακού δέρματος και λοβού ωτός. Επίσης, από τα παιδία συλλέχτηκαν δείγματα φωτοπροστατευμένα από την ακροποσθία με 4 mm punch βιοψίας κατά τη διάρκεια χειρουργείου για φίμωση. Γραπτή συγκατάθεση μετά από ενημέρωση για το πρωτόκολλο συλλέχθηκε από τους ενήλικες ασθενείς, αλλά και από τους γονείς των ανήλικων παιδιών. Η διακήρυξη του Ελσίνκι ακολουθήθηκε πιστά καθόλη τη διάρκεια του πρωτοκόλλου και των πειραμάτων. Ανάπτυξη κυτταροκαλλιεργειών Ανάπτυξη κυτταροκαλλιέργειας πρωτογενών ινοβλαστών δέρματος από ακροποσθία Πρωτογενείς ινοβλάστες απομονώθηκαν από την ακροποσθία παιδιών σε χειρουργείο για φίμωση. Το δέρμα κόπηκε σε μικρά τεμάχια 4x4 mm. Με τη χρήση ειδικών χειρουργικών εργαλείων απομακρύνθηκε το υποδόριο λίπος και τα τεμάχια επωάστηκαν ολονύχτια σε διάλυμα 0,25% τρυψίνης. Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν για δύο ώρες στους 37 o C σε περιβάλλον με 5% CO 2. Αυτό το βήμα επέτρεψε το διαχωρισμό της δερμίδος από την επιδερμίδα. Στη συνέχεια τα δείγματα με τη δερμίδα μεταφέρθηκαν σε τρυβλία Petri καλυμμένα με 100% FCS και αφέθηκαν να «στεγνώσουν» για 3-4 ώρες, με επώαση στους 37 o C, σε περιβάλλον 5% 75
CO 2. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 8 ml από θρεπτικό μέσο που περιείχε Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM)/Ham s F12 (Gibco BRL, Invitrogen), 10% fetal calf serum (FCS) (Biochrom AG), 100 UI/ml penicillin/streptomycin, (Sigma) και 1 mm CaCl 2 (Sigma, Munich, D), Κάθε 2 μέρες περίπου το θρεπτικό υλικό ανανεωνόταν. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεγαλώσουν και στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκαν σε καλλιεργητικές φιάλες 75 ml. Ανάπτυξη κυτταροκαλλιέργειας πρωτογενών ινοβλαστών δέρματος από ενήλικες γυναίκες από τη μέγιστη φωτοπροστατευμένη περιοχή Η μέγιστη φωτοπροστατευμένη περιοχή, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, είναι η περιοχή στην έσω πλευρά του βραχίονα κοντά στη μασχάλη. Από αυτή την περιοχή έγινε λήψη ολικού πάχους δέρματος από 3 γυναίκες υγιείς που δεν έπαιρναν φάρμακα, ηλικίας 30, 50 και 76 ετών. Η διαδικασία για την απομόνωση των κυττάρων και το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν ίδια με αυτή για την ανάπτυξη πρωτογενών ινοβλαστών δέρματος από την ακροποσθία. Ανάπτυξη κυτταρικής σειράς SZ95 σμηγματοκυττάρων Η κυτταρική σειρά SZ95 των σμηγματοκυττάρων είναι μια κυτταρική σειρά που προέρχεται από σμηγματογόνους αδένες από την περιοχή του προσώπου. Είναι πλήρως χαρακτηρισμένη και ομοιάζει πλήρως μορφολογικά, φαινοτυπικά και λειτουργικά με τα φυσιολογικά ανθρώπεια σμηγματοκύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με θρεπτικό υλικό που περιέχει Sebomed,10% FCS ελέυθερο στεροειδών, 50 μg/ml γενταμικίνης, 5 ng/ml epidermal growth factor (EGF), 1 mm CaCl 2, 10-6 M ρετινόλης, 10-7 M λινελαϊκού οξέος και 0,1% ανθρώπινης λευκωματίνης, ελεύθερης πρωτεασών. Πειραματικός σχεδιασμός για τη μελέτη της ενδογενούς γήρανσης στους πρωτογενείς ινοβλάστες Για τη μελέτη της ενδογενούς γήρανσης χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς ινοβλάστες που απομονώθηκαν από τη μέγιστη φωτοπροστατευμένη περιοχή από γυναίκες-δότες διαφορετικών ηλικιών. Όλα τα πειράματα έγιναν με κύτταρα που βρισκόταν σε ανακαλλιέργεια μικρότερη από 5. Όλα τα πειράματα διενεργήθηκαν σε καλλιεργητικές φιάλες 75 και 25 ml. Συνοπτικά, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε θρεπτικό υλικό που περιείχε 0,1% FCS, για 24 ώρες, ώστε να επιτευχθεί συγχρονισμός των κυττάρων στην ίδια φάση του κυτταρικού κύκλου. Στη συνέχεια, και ενώ τα κύτταρα ήταν σε πληρότητα περίπου 70-80%, το θρεπτικό υλικό ανανεώθηκε με 10% FCS και τα κύτταρα αφέθηκαν να μεγαλώσουν για 48 ώρες. Στο πέρας του 76
χρονικού αυτού ορίου τα κύτταρα πλύθηκαν 2 φορές με PBS και αποθηκεύτηκαν στους -20 o C για να συνεχιστεί αργότερα η περαιτέρω επεξεργασία τους. Ανάπτυξη παρακρινούς μοντέλου για τη μελέτη της επίδρασης της 17- β-οιστραδιόλης Για τη μελέτη της επίδρασης της 17-β-οιστραδιόλης στην παραγωγή του υαλουρονικού οξεός δημιουργήθηκε ένα μοντέλο παρακρινούς δράσης. Χρησιμοποιήθηκαν τόσο πρωτεγενείς ινοβλάστες από ακροποσθία, όσο και σμηγματοκύτταρα από την κυτταρική σειρά SZ95 [339]. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε θρεπτικό υλικό με Sebomed,10% FCS ελέυθερο στεροειδών, 50 μg/ml γενταμικίνης, 5 ng/ml EGF, 1 mm CaCl 2, 10-6 M ρετινόλης, 10-7 M λινελαϊκού οξέος και 0,1% ανθρώπινης λευκωματίνης, ελεύθερης πρωτεασών, ώστε να μην υπάρχει ορμονική επίδραση από τις στεροιδικές ορμόνες του FCS. Όλοι οι ινοβλάστες που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα ήταν από ανακαλλιέργεια μικρότρερης από 5, ενώ όλα τα σμηγματοκύτταρα μικρότρερης από 30. Το πειραματικό μοντέλο παρακρινούς δράσης, εν συντομία, ήταν ως εξής. Τα σμηγματοκύτταρα αφέθηκαν σε θρεπτικό υλικό με 0,1% FCS (ελεύθερου πρωτεασών) ώστε να συγχρονιστούν στην ίδια φάση του κυτταρικού κύκλου. Στη συνέχεια, η μία ομάδα κυττάρων τοποθετήθηκε φυσιολογικό θρεπτικό υλικό (ομάδα ελέγχου). Στη δεύτερη ομάδα προστέθηκε στο φυσιολογικό θρεπτικό υλικό 17-β-οιστραδιόλη σε συγκέντρωση που προσομοιάζει τη μέση συγκέντρωση ορού σε γυναίκες ηλικίας 20 ετών (1000 pmol/l) [339]. Στην τρίτη ομάδα προστέθηκε στο φυσιολογικό θρεπτικό υλικό 17-β-οιστραδιόλη σε συγκέντρωση που προσομοιάζει τη μέση συγκέντρωση ορού σε γυναίκες ηλικίας 60 ετών (74 pmol/l) [339] Σε όλες τις περιπτώσεις τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 o C. Μετά το πέρας του χρονικού αυτού ορίου το αντίστοιχο θρεπτικό υλικό μεταφέρθηκε σε ινοβλάστες οι οποίοι επωάσθηκαν για 48 ώρες, στους 37 o C. Από τις 3 ομάδες αυτές των ινοβλαστών (ελέγχου, 17-β-οιστραδιόλης 20 και 60 ετών) στο πέρας των 48 ωρών συλλέχθηκε το απαραίτητο υλικό για τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Απομόνωση, καθαρισμός, κλασματοποίηση και ταυτοποίηση των GAG από πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών και από ανθρώπινα δείγματα Οι GAG απομονώθηκαν, καθαρίστηκαν και ταυτοποιήθηκαν από τα ανθρώπινα δείγματα αλλά και από τις κυτταροκαλλιέργειες των ινοβλαστών όπως περιγράφεται παρακάτω [125]. 77
Συλλογή δειγμάτων Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε καλλιεργητικές φιάλες των 75 ml. Από τις κυτταροκαλλιέργειες συλλέχθηκαν ξεχωριστά 20 ml από το θρεπτικό υλικό των κυττάρων του κάθε δοχείου και ξεχωριστά το κυτταρικό στρώμα (κύτταρα και εναποτεθείσα εξωκυττάρια ουσία) αφού ξεπλύθηκε δύο φορές με 10 ml παγωμένο PBS. Απολιπίδωση των δειγμάτων Το πρώτο βήμα στην πορεία της απομόνωσης των GAG είναι η απομάκρυνση των λιπιδίων και γλυκολιπιδίων από τα δείγματα με χρήση 4 όγκων διαλύματος χλωροφορμίου / μεθανόλης (1:2) (Panreac, Merck), ανάδευση και επώαση στους 4 C για 18 h. Κατά τη διαδικασία αυτή απενεργοποιούνται όλα τα υδρολυτικά ένζυμα και, έτσι, ελαχιστοποιείται η διάσπαση των GAG. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των δειγμάτων (3.200 x g, 20 min, 4 C), απόρριψη του υπερκείμενου διαλύματος, επαναδιαλυτοποίηση του ιζήματος σε 10 ml αιθανόλης (Panreac) με στόχο την απομάκρυνση των οργανικών διαλυτών και φυγοκέντρηση των δειγμάτων κάτω από τις ίδιες συνθήκες (3.200 x g, 20 min, 4 C). Το ίζημα που προέκυψε ξηράνθηκε σε θερμοκρασία 37 C για 4-6h [99]. Ενζυμική διάσπαση πρωτεϊνών Ακολούθησε η πλήρης ενζυμική διάσπαση των πρωτεϊνών. Για το σκοπό αυτό το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος προνάσης (0,1 M Tris-HCl, ph 8,0, που περιείχε 1 mm CaCl 2 ) και υποβλήθηκε σε πρωτεϊνική πέψη με την προσθήκη 30 μl από διάλυμα προνάσης 30 mg/ml, έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,1 KU προνάσης (Streptomyces griseus, Calbiochem, Lucerne, Switzerland). Ακολούθησε επώαση για 72h, στους 37 C, προσθέτοντας την ίδια ποσότητα προνάσης σε διαστήματα 24h. Να σημειωθεί πως το διάλυμα της προνάσης είχε προεπωασθεί για 30 min, στους 37 C, προκειμένου να εξαλειφθεί η δράση γλυκοσιδασών που ενδεχόμενα υπήρχαν ως προσμίξεις στο παρασκεύασμα της προνάσης [101]. Ενζυμική διάσπαση νουκλεϊνικών οξέων Το επόμενο στάδιο ήταν η ενζυμική διάσπαση των νουκλεϊνικών οξέων. Για το σκοπό αυτό η συγκέντρωση των δειγμάτων ρυθμίστηκε σε 150 mm NaCl και 10 mm MgCl 2 και η ενζυμική διάσπαση του DNA επιτεύχθηκε με την προσθήκη 400 KU DNase I (EC 3.1.21.1, Calbiochem) και επώαση για 16h, στους 37 C. Στο τέλος της επώασης η συγκέντρωση του CaCl 2 ρυθμίστηκε σε 1 mm και ακολούθησε προσθήκη προνάσης ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,1 KU και επώαση του μίγματος στους 78
37 C, για 24h [99]. β-απόσπαση τελικού αμινοξέος Σε αυτό το στάδιο, στόχος είναι να απομακρυνθεί το αμινοξύ που συνδέει τις GAG στον πρωτεϊνικό κορμό. Για το λόγο αυτό, το ph των δειγμάτων ρυθμίστηκε σε 10,0-11,0 με την προσθήκη 10 mm NaOH, και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε β-απόσπαση παρουσία 1 M NaBH 4 (Merck) για 16h, στους 45 C, απουσία οξυγόνου σε περιβάλλον αζώτου. Μετά το πέρας της επώασης τα δείγματα εξουδετερώθηκαν με χρήση 1/10 του συνολικού όγκου του κάθε δείγματος κρυσταλλικού οξικού οξέος, το οποίο προστέθηκε στάγδην στους 4 C [99]. Απομόνωση των ολικών GAG Ακολούθησε καταβύθιση των GAG με προσθήκη 4 όγκων διαλύματος αιθανόλης 95% (v/v) που περιείχε 2,5% (w/v) οξικό νάτριο και παραμονή των δειγμάτων στους 4 C για 18h. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (3.200 x g, 20 min, 4 C), απορρίφθηκε το υπερκείμενο και το ίζημα αποξηράνθηκε για 4-6 h στους 37 C. Τέλος, το ίζημα που περιείχε το σύνολο των απομονωμένων GAG διαλυτοποιήθηκε σε 300μl ddh 2 O, φυγοκεντρήθηκαν στις 4.000 x g για 1 λεπτό (eppendorf centrifuge, 5415C). Το υπερκείμενο από κάθε δείγμα αποθηκεύτηκε στους 4 C [101]. Ποσοτικός προσδιορισμός ουρονικών οξέων στα δείγματα των απομονωμένων ολικών γλυκοζαμινογλυκανών Η συγκέντρωση των ουρονικών οξέων στα δείγματα των απομονωμένων ολικών GAG μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά σύμφωνα με τη μέθοδο των Bitter και Muir [99]. Αναλυτικότερα, 20 μl από το διάλυμα των ολικών GAG που απομονώθηκαν από το κυτταρικό στρώμα ή από το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό, αραιώθηκαν μέχρι τα 250 μl. Ακολούθησε προσθήκη 1,25 ml παγωμένου διαλύματος 0,025 Μ Na 2 B 4 O 7.10 H 2 O (Mallinckrodt) διαλυμένο σε πυκνό θειικό οξύ (Merck), με μεγάλη προσοχή και αφού τα δείγματα είχαν τοποθετηθεί σε πάγο. Τα δείγματα αναδεύτηκαν με προσοχή και τοποθετήθηκαν για 10 λεπτά σε βράζων υδατόλουτρο. Αμέσως μετά, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε πάγο και προστέθηκαν 50 μl φρέσκου διαλύματος 0,125 % w/v καρβαζόλης (Merck) διαλυμένης σε 100% αιθανόλη (Merck). Ακολούθησε ανάδευση και μεταφορά των δειγμάτων για 15 λεπτά σε βράζων υδατόλουτρο. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύτηκαν και μετρήθηκε η απορρόφηση του ροζ χρώματος που αναπτύχθηκε στα 530 nm σε φασματοφωτόμετρο (Shimazdu Corporation, Japan, UV-120-01). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και η συγκέντρωση των ουρονικών οξέων στα 79
δείγματα υπολογίστηκε με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης που δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ως πρότυπο, διάλυμα γλυκουρονικού οξέος (0,5-20 μg) (Fluka) [101]. Ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης Ο διαχωρισμός και η ταυτοποίηση των επιμέρους GAG των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης (M.A.L.T.A. Chemetron SRL, Milano, Italy). Για το λόγο αυτό, από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε όγκος διαλύματος που να περιέχει 4 μg ουρονικών οξέων. Τα δείγματα συμπυκνώθηκαν με φυγοκέντρηση σε κενό (Speed Vac Plus, SC110A, Refrigerator Vapor Trap-RVT4104, Savant Instrumments Inc., Holbrook, NY) και επαναδιαλύθηκαν σε 4 μl ddh 2 O. Ακολούθησε τοποθέτηση των δειγμάτων σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης, οι οποίες είχαν πρώτα ξεπλυθεί αρχικά με αποσταγμένο νερό και στη συνέχεια είχαν παραμείνει για τουλάχιστον 20 λεπτά στο ρυθμιστικό διάλυμα της ηλεκτροφόρησης [99]. Η τοποθέτηση των δειγμάτων έγινε σε απόσταση 10 mm από την αρχή της κυτταρίνης. Χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm πυριδίνης (Carlo Erba)/ 470 mm φορμικού οξέος (Merck), ph 3.0 για την ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιήθηκε σε ειδική συσκευή ηλεκτροφόρησης (Apelex, France), υπό συνεχές ρεύμα 100V, σε θερμοκρασία δωματίου, για 70 min. Να σημειωθεί ότι καθώς οι GAG έχουν όλες αρνητικό φορτίο, η τοποθέτηση των δειγμάτων έγινε έτσι, ώστε η κίνηση των δειγμάτων να γίνεται από την κάθοδο προς την άνοδο της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Ακόμα, σε κάθε μεμβράνη οξικής κυτταρίνης τοποθετήθηκαν πρότυπα διαλύματα GAG: ΗΑ (από βόειο τραχεία), HS (από βόειο εντερικό βλεννογόνο, ChSC (από χόνδρο καρχαρία) και DS (από χοίρειο δέρμα) (όλα από Sigma-Aldrich), έτσι ώστε να γίνει ο χαρακτηρισμός των γλυκοζαμινογλυκανών που υπάρχουν σε κάθε δείγμα. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης οι μεμβράνες οξικής κυτταρίνης χρωματίσθηκαν με 0,2% (w/v) Alcian blue (Sigma), σε 0,1% (v/v) οξικό οξύ (Mallinckrodt U.S.P), για 10 min, και ξεπλύθηκαν με 0,1% (v/v) οξικό οξύ για 20 min. Η ένταση της χρώσης υπολογίσθηκε με τη βοήθεια προγράμματος επεξεργασίας εικόνας σε ηλεκτρονικό υπολογιστή (1D Image Analysis Software, version 3.0 of Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, New York) [99]. Ταυτοποίηση των γλυκοζαμινογλυκανών με ειδικά ένζυμα Η ταυτοποίηση των GAG πραγματοποιήθηκε με πέψη των δειγμάτων με ειδικά ένζυμα που διασπούν τις GAG. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε ποσότητα διαλύματος ολικών GAG που περιείχε 4 μg ουρονικών οξέων, αφού προηγουμένως αποξηράνθηκε με φυγοκέντρηση σε κε- 80
νό. Τα δείγματα επωάστηκαν σε τελικό όγκο 10 μl, όπως περιγράφεται παρακάτω [99]. Υαλουρονιδάση (Hyaluronidase, Seikagaku) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm οξικού νατρίου/οξικού οξέος, ph 6,0 που περιείχε 0,15 Μ NaCl και επωάστηκαν με 5,0 U υαλουρονιδάσης (hyaluronate lyase, EC 4.2.2.1, Streptomyces hyalurolyticus, Seikagaku, Tokyo,Japan ), για 17h, στους 60 C. Χονδροϊτινάση ABC (Chondroitinase ABC, Sigma) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm Tris-HCl, ph 8,0, που περιείχε 50 mm οξικό νάτριο και επωάστηκαν με 5x10-3 U χονδροϊτινάσης ABC (chondroitin ABC lyase, EC 4.2.2.4, Proteus vulgaris, Sigma-Aldrich) για 17h, στους 37 C. Χονδροϊτινάση B (Chondroitinase B, Seikagaku) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,05 M Tris- HCl, ph 8,0 και επωάστηκαν με 1,5 x10-3 U χονδροϊτινάσης B (chondroitinase B, Flavobacterium heparinum, Seikagaku Corp., Tokyo, Japan), για 17h, στους 30 C. Ηπαρινάση Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm Tris- HCl, ph 7,0, που περιείχε 3 mm CaCl 2 και επωάστηκαν με 4x10-4 U ηπαρινάσης (heparin lyase I, EC 4.2.2.7, Flavobacterium heparinum, Seikagaku, Tokyo), για 17h, στους 30 C. Ηπαριτινάση (Heparitinase, Seikagaku) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mm οξικού νατρίου/οξικού οξέος, ph 7,0, που περιείχε 3,0 mμ CaCl 2 και επωάστηκαν με 1,5 x10-3 U ηπαριτινάσης (heparan sulfate lyase, heparitinase, EC 4.2.2.8, Flavobacterium heparinum, Seikagaku, Tokyo), για 17h, στους 43 C. Κερατανάση Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris- HCl, ph 7,4, και επωάστηκαν με 0,05 U κερατανάσης (keratan sulphate Endo-β-D-galactosidase, EC 3.2.10.3, Pseudomonas species, Sigma-Aldrich), για 17h, στους 37 C. Οι χρόνοι επώασης καθώς και οι συγκεντρώσεις των ενζύμων που χρησιμοποιήθηκαν, ήταν αυτοί που χρειάστηκαν για πλήρη πέψη των αντίστοιχων υποστρωμάτων τους, όπως προσδιορίστηκε από μια προκαταρκτική μελέτη. Στις αρχικές αυτές μελέτες, 10 μg CS-A (από βόειο τραχεία), CS-B (από χοίρειο δέρμα), CS-C (από χόνδρο καρχαρία), HA (από βόειο τραχεία), θειική κερατάνη (από βόειο κερατοειδή), HS (από βόειο εντερικό βλεννογόνο) και ηπαρίνη (όλα από Sigma-Aldrich) επωάστηκαν με τα προαναφερθέντα ένζυμα στις κατάλληλες συνθήκες επώα- 81
σης. Υποστρώματα που επωάσθηκαν με τα αντίστοιχα ρυθμιστικά διαλύματα χωρίς την παρουσία ενζύμου αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Ο βαθμός πέψης εκτιμήθηκε ύστερα από ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης και πηκτές πολυακρυλαμιδίου και υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman.Kodak, Rochester, NY) [99]. Προσδιορισμός του μοριακού βάρους του υαλουρονικού οξέος σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και γέλη αγαρόζης Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου Η διερεύνηση της μοριακής μάζας των GAG που απομονώθηκαν από το κυτταρικό στρώμα και από το υπερκείμενο των καλλιεργειών των ινοβλαστών αλλά και από τα ανθρώπινα δείγματα πραγματοποιήθηκε με πηκτές πολυακρυλαμιδίου συγκέντρωσης 4% σε ακρυλαμίδιο (Sigma) Για το λόγο αυτό παρασκευάστηκε το διάλυμα της πηκτής σύμφωνα με τον πίνακα ΙV [99]. Πίνακας ΙV VΤ =12 ml 30% ακρυλαμίδιο 1,6 ml Η 2 Ο 9,2 ml SGB (10x) 1,2 ml APS 10% 50 μl TEMED 8 μl VT: τελικός όγκος, SGB 10x (Sugar Gel Buffer): ρυθμιστικό διάλυμα 0,9 M Tris (AppliChem), 0,9 M H3BO3 (Mallincrodt,USA), 20 mm EDTA (Riedel-de-Haen) Tris, ph 8,3. Στη συνέχεια ποσότητα που περιείχε 4 μg ουρονικών οξέων από κάθε δείγμα αποξηράνθηκε με υπερφυγοκέντρηση σε κενό και διαλύθηκε σε SGB 1X. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση, με ρυθμιστικό διάλυμα SGB 1X, με σταθερή τάση 200V για 1h. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, οι πηκτές χρωματίστηκαν με διάλυμα 0,5% (w/v) Alcian blue 8GX (Sigma), σε 25% (v/v) ισοπροπυλικής αλκοόλης (Carlo Erba) και 1% (v/v) οξικού οξέος (Merck), για 12h. Το ίδιο διάλυμα χωρίς τη χρωστική χρησιμοποιήθηκε για τον αποχρωματισμό. Η ένταση χρώσης υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, 82
Eastman Kodak, Rochester, NY). Για την εκτίμηση της μοριακής μάζας των GAG, χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα HA μεγέθους 225 kda και CS μεγέθους 29 και 57 kda, το μοριακό βάρος των οποίων έχει προσδιοριστεί με αναλυτική υπερφυγοκέντριση (analytical ultracentrifugation) [101]. Ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης Τα ολικά GAG (4 μg ουρονικών οξέων) απομονώθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. Πραγματοποιήθηκε γέλη αγαρόζης 0,5 %, στην οποία ηλεκτροφορήθηκαν τα δείγματα μαζί με μάρτυρες γνωστού μοριακού βάρους. Η γέλη χρώσθηκε με 0,005% (w/v) Stains-All διαλυμένο σε 50% (v/v) αιθανόλης, ολονύχτια, υπό φωτοπροστατευμένες συνθήκες, σε θερμοκρασία δωματιόυ. Η ένταση χρώσης υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY) [99]. Ποσοτικός προσδιορισμός υαλουρονικού οξέος με ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA) Ο ποσοτικός προσδιορισμός του υαλουρονικού οξέος στα δείγματα αλλά και στο θρεπτικό υλικό που απομονώθηκε από τα κύτταρα πραγματοποιήθηκε με ένζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδο ELISA (Corgenix, Inc, Broomfield, Colorado 80020, USA). Τα δείγματα, καθώς και πρότυπα διαλύματα ΗΑ, αραιώθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (Reaction Buffer) ώστε ο όγκος τους να είναι 100 μl και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια μικροτιτλοποίησης που ήταν επικαλυμμένα με την προσδένουσα πρωτεΐνη του ΗΑ (Hyaluronic Acid Binding Protein, HABP). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Τα πλακίδια μικροτιτλοποίησης αφέθηκαν για επώαση για 1h σε θερμοκρασία δωματίου, έτσι ώστε τα μόρια του ΗΑ που υπήρχαν στα δείγματα να μπορέσουν να συνδεθούν με την HABP. Κατόπιν, τα πλακίδια μικροτιτλοποίησης ξεπλύθηκαν 4 φορές με PBS, ώστε να απομακρυνθούν τα μόρια που δεν συνδέθηκαν με την HABP. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 100 μl διαλύματος υπεροξειδάσης ραπανιού συνδεδεμένης με HABP με στόχο να δημιουργηθούν σύμπλοκα με τα ήδη δεσμευμένα στα πλακίδια μόρια ΗΑ και τα δείγματα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση τα πλακίδια μικροτιτλοποίησης ξεπλύθηκαν και πάλι 4 φορές με PBS και προστέθηκαν 100 μl διαλύματος χρωμογόνου υποστρώματος (τετραμεθυλβενζινιδίνη και υπεροξείδιο του υδρογόνου) για να παραχθεί μπλε χρώμα, η ένταση του οποίου είναι ανάλογη της ποσότητας του ΗΑ που υπήρχε στα δείγματα. Μετά την προσθήκη τα δείγματα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου 83
και στη συνέχεια προστέθηκαν 100 μl 0,36 N θειικού οξέος ώστε να σταματήσει η αντίδραση. Οι μετρήσεις της απορρόφησης πραγματοποιήθηκαν στα 450 nm (με μήκος κύματος αναφοράς τα 650 nm) σε κατάλληλη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακιδίων ELISA (ELISA Reader, das SRL, Roma). Με τις μετρήσεις των πρότυπων διαλυμάτων του HA κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη με τη βοήθεια της οποίας υπολογίστηκε η ποσότητα του HA που υπήρχε σε κάθε δείγμα. Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Ο προσδιορισμός της γονιδιακής έκφρασης των ενζύμων που συνθέτουν (HAS-1, HAS-2 και HAS-3) και αποδομούν (HYAL-1, HYAL-2 και HYAL-3) το ΗΑ, των υποδοχέων του ΗΑ, CD44 και RHAMM) καθώς και διαφόρων πρωτεογλυκανών, όπως η αγκρεκάνη, περλεκάνη, διγλυκάνη, ντεκορίνη, βερσικάνη και συνδεκάνη πραγματοποιήθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Απομόνωση RNA από πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών και ανθρώπεια δείγματα Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν σε καλλιεργητικές φιάλες των 25 ml. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, αποκολλήθηκαν από τον πυθμένα με τη βοήθεια πλαστικού στυλεού, και συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση σε 900 x g για 10 λεπτά. Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini kit (Qiagen, Basel, Switzerland). Εν συντομία ακολουθήθηκαν τα εξής βήματα [99]: 1. Διάσπαση κυττάρων με ρυθμιστικό διάλυμα λύσις κυττάρων (RLT) που περιείχε β-μερκαπτοαιθανόλη (Genaxis Biotechnology) 2. Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στις 14.000 rpm 3. Μεταφορά υπερκείμενου και προσθήκη 1 όγκου αιθανόλης 70% (v/v) 4. Μεταφορά του διαλύματος σε RNeasy mini στήλη 5. Φυγοκέντρηση για 15 δευτερόλεπτα στις 10.000 rpm 6. Απόρριψη διηθήματος και προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος RW1 για ξέπλυμα της στήλης 7. Φυγοκέντρηση για 15 δευτερόλεπτα στις 10.000 rpm 8. Απόρριψη διηθήματος και προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος RPE για ξέπλυμα της στήλης 9. Φυγοκέντρηση για 15 δευτερόλεπτα στις 10.000 rpm 10. Απόρριψη διηθήματος και προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος RPE για επανάληψη σταδίου 8 11. Φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στις 10.000 rpm, για να ξηρανθεί η στήλη 12. Προσθήκη ddh 2 O ελεύθερο RNασών πάνω στη στήλη για έκλουση του 84
mrna 13. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 10.000 rpm. 14. Συλλογή του mrna και αποθήκευση του στους -80 ο C. Η ποιότητα του απομονωμένου RNA ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,0 % (w/v) Αντίστροφη μεταγραφή Δύο μg από το ολικό RNA που απομονώθηκε, υποβλήθηκαν σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας M-MLV Reverse Transcriptase σύμφωνα με το παρακάτω πρωτόκολλο (Promega, Madison, WI, USA) [99]: 1. Σε αποστειρωμένο, ελεύθερο RNασών, σωληνάκι κατάλληλο για PCR προστέθηκε το ολικό RNA και οι εκκινητές της αντίδρασης, oligo(dt) 15 σε αναλογία 0,5 μg εκκινητών για κάθε μg RNA. Ο όγκος συμπληρώθηκε μέχρι τα 15 μl με ddh 2 O ελεύθερο RNασών. 2. Το μίγμα θερμάνθηκε για 5 λεπτά στους 70 o C ώστε να αποδιαταχθεί η δευτεροταγής δομή του RNA-καλουπιού και τοποθετήθηκε άμεσα σε πάγο για να μην επαναδημιουργηθεί η δευτεροταγής δομή. 3. Προστέθηκαν 5μL M-MLV 5X Reaction Buffer (250 mm Tris-HCl, ph:8,3, 375 mm KCl, 15 mm MgCl 2, 50 mm DTT), 1,25 μl 10 mm datp, 1,25 μl 10 mm dctp, 1,25 μl 10 mm dgtp, 1,25 μl 10 mm dttp, 25 U ανασυνδυασμένου αναστολέα ριβονουκλεάσης RNasin (για απενεργοποίηση τυχόν RNασών) και τέλος 200 U M-MLV RT 4. Το μίγμα αναδεύτηκε ήπια και επωάστηκε για 60 λεπτά στους 42 o C 5. Ακολούθησε απενεργοποίηση των ενζύμων με επώαση στους 70 o C για 15 λεπτά και το cdna αποθηκεύτηκε στους -80 o C. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μία μέθοδος που χρησιμοποιεί cdna ως εκμαγείο και με τη βοήθεια μιας σειράς νουκλεοτιδίων κατάλληλων αλληλουχιών, εκκινητές (primers), επιμηκύνεται το γονίδιο ενδιαφέροντος. Για να πραγματοποιηθεί η επιμήκυνση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη του ενζύμου DNA πολυμεράση, καθώς και περίσσεια νουκλεοτιδίων (datp, dttp, dctp, dgtp). Χρησιμοποιήθηκε η Go Taq Flexi DNA polymerase (Promega). Τα βήματα που ακολουθήθηκαν για την PCR συνοπτικά ήταν τα ακόλουθα: 1. Σε θερμοάντοχο αποστειρωμένο πλαστικό σωληνάκι για PCR προστέθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: 5 μl 5X Green GoTaq Flexi Buffer (ph : 8,5), 1,5 μl διαλύματος 25 mm MgCl 2, 0,5 μl διαλύματος 40 mm dntps (περιέχει 10mM από κάθε datp, dttp, dctp, dgtp), 0,5 μl 50 pm από κάθε εκκινητή (εμπρόσθιο και αντίστροφο), κατάλληλη 85
ποσότητα cdna (1-2 μl), 0,2 μl DNA πολυμεράση και συμπληρώθηκε ο όγκος έως 25 μl με ddh 2 O (ελεύθερο RNασών). 2. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν στη συσκευή PTC-100 Thermal Controller (MJ Research Inc., Watertown, MA) με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: 3. μετουσίωση δειγμάτων για 2 λεπτά στους 95 ο C, 4. μετουσίωση δειγμάτων για 30 δευτερόλεπτα στους 95 ο C 5. αναδιάταξη των εκκινητών σε θερμοκρασίες από 55 έως 65 C, ανάλογα με το γονίδιο που θέλουμε να μελετήσουμε, για 30 δευτερόλεπτα, 6. επιμήκυνση του εκάστοτε DNA κομματιού στους 72 C για 1 λεπτό 7. επανάληψη των σταδίων 4, 5 και 6 για 17 έως 42 κύκλους ανάλογα με το κομμάτι του DNA που θέλουμε να αναπαραχθεί, 8. τελική επιμήκυνση και απενεργοποίηση αντίδρασης στους 72 C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 1,0 έως 2,0 % (w/v), ανάλογα με το μέγεθος του προϊόντος και έγιναν ορατά με τη βοήθεια βρωμιούχου αιθιδίου στο υπεριώδες φως. Η ένταση από κάθε ζώνη ποσοτικοποιήθηκεμε πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY) και σταθμίστηκε βάσει της έκφρασης του γονιδίου της β-ακτίνης. Οι συνθήκες των αντιδράσεων ρυθμίστηκαν έτσι, ώστε η συγκέντρωση των τελικών προϊόντων να βρίσκεται στην εκθετική φάση παραγωγής τους και χαμηλότερα από το σημείο κορεσμού τους. Πίνακας V. Λεπτομέρειες εκκινητών για την RT-PCR Εκκινητές Αλληλουχία Κύκλοι HAS-1 HAS-2 HAS-3 HYAL-1 HYAL-2 HYAL-3 CD44 RHAMM Συνδεκάνη Θερμοκρασία Αναδιάταξης Μέγεθος προϊόντος (bp) For: GCGATACTGGGTAGCCTTCA Rev: GGTTGTACCAGGCCTCAAGA 30 57 o C 131 For: ACAGACAGGCTGAGGACGAC Rev: GCTGTGATTCCAAGGAGGAG 28 57 o C 126 For: GTCATGTACACGGCCTTCAA Rev: CCTACTTGGGGATCCTCCTC 35 59 o C 130 For: GTGCTGCCCTATGTCCAGAT Rev: ATTTTCCCAGCTCACCCAGA 35 59 o C 132 For: TCTACCATTGGCGAGAGTG Rev: AGCAGCCGTGTCAGGTAAT 27 57 o C 119 For: GATCTGGGAGGTTCCTGTCC Rev: AGAGCTGGAGAGGCTCAGGT 30 57 o C 110 For: ATGGACAAGTTTTGGTGGCA Rev: GTCCCAGCTCCCTGTAATGG 22 57 o C 1546 For: GTCACCTTCAGTTTCTGGAGCTGG Rev:GCAACATCAATAACAACAAGACGA 32 55 o C 2265 For:CCTTGACAACAGCTCCATTG Rev: GCGATACACCAACAGCAGGA 25 57 o C 418 86
Ντεκορίνη Αγκρεκάνη Διγλυκάνη Βερσικάνη V1 ΒερσικάνηVο Περλεκάνη β-ακτίνη For:ATGATTGTCATAGAACTGGGC Rev: ATTGTTGTTATGAAGGTAGAC 18 57 o C 383 For: CACAGGTGAAGACTTTGT Rev: TGCTGTGCCTCCTCAAA 40 57 o C 446 For: CCTTTGAGCAGAGAGGCTTC Rev:CGATGGCCTGGATTTTGTTG 25 57 o C 680 For: GCGCCACCCTGTGAC Rev: CAGTGGTAACGAGATGCTTC 25 57 o C 386 For:GACCTCAGGCGCTTTC Rev:CAGTGGTAACGAGATGCTTC 29 57 o C 351 For: GGGCATACGATGGCTTGTCT Rev:GGAGAGAGAATGTGGGGCTG 28 57 o C 662 For: ACACTGTGCCCATCTACGAGG Rev: AGGGGCCGGACTCGTCATACT 20 57 o C 621 HAS-1: συνθετάση υαλουρονικού οξέος 1, HAS-2: συνθετάση υαλουρονικού οξέος 2, HAS-3: συνθετάση υαλουρονικού οξέος 3, HYAL-1: υαλουρονιδάση 1, HYAL-2: υαλουρονιδάση 2, HYAL-3: υαλουρονιδάση 3, RHAMM: receptor for hyaluronan-mediated motility Προσδιορισμός δραστικότητας των ΜΜP με ζυμογραφία ζελατίνης [101] Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώνεται η ύπαρξη των ζελατινασών τόσο σε μορφή προενζύμου, όσο και σε ενεργοποιημένη μορφή. Χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 2 μg πρωτεΐνης από το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό των κυτταροκαλλιεργειών. Παρασκευάστηκαν πηκτές πολυακρυλαμιδίου, συγκέντρωσης 8% (w/v) σε ακρυλαμίδιο, με τη διαφορά ότι προσθέτουμε και 1 mg/ml ζελατίνη κολλαγόνου τύπου Ι που αποτελεί υπόστρωμα για τις MMP-2 και MMP-9. Αρχικά παρασκευάστηκε το διάλυμα της πηκτής διαχωρισμού (separating gel) σύμφωνα με τον Πίνακα VI και τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή παρασκευής πηκτών πολυακρυλαμιδίου της BioRad. Πίνακας VI. Πηκτές πολυακρυλαμιδίου για ζυμογραφία ζελατίνης Πηκτή διαχωρισμού Πηκτή στοίβαξης (4%) (8%) V Τ =5 ml V Τ =10 ml V Τ =2.5 ml V Τ =5 ml 30% ακρυλαμίδιο 1,330 ml 2,662 ml 0,333 ml 0,670 ml Η 2 Ο 2,140 ml 4,280 ml 1,490 ml 2,970 ml Ζελατίνη 2% (w/v) 0,250 ml 0,500 ml - - LGB 1250 ml 2,500 ml - - UGB - - 0,625 ml 1,250 ml APS 10% 25 μl 50 μl 50 μl 100 μl TEMED 4 μl 8 μl 5 μl 10 μl όπου V T : τελικός όγκος, LGB: ρυθμιστικό διάλυμα 0,5Μ Tris-HCl, 0,4% SDS, ph 6,8, UGB: ρυθμιστικό διάλυμα 1,5 Μ Tris-HCl, 0,4% SDS, ph 8,8, APS: υπερθειικό αμμώνιο, T.E.M.E.D: N,N,N N -τετραμεθυλενεδιαμίνη. 87
Στη συνέχεια αφού στερεοποιήθηκε η πηκτή διαχωρισμού, παρασκευάστηκε η πηκτή στοίβαξης των δειγμάτων (stacking gel) και τοποθετήθηκε πάνω στη στερεοποιημένη πηκτή διαχωρισμού. Για να δημιουργηθούν κατάλληλες υποδοχές (wells) για την τοποθέτηση των δειγμάτων στην πηκτή στοίβαξης, χρησιμοποιήθηκε ένα κομμάτι ειδικού πλαστικού με σχήμα χτένας, ώστε όταν στερεοποιηθεί η πηκτή στοίβαξης να διαμορφωθούν αυτές οι κατάλληλες υποδοχές για την τοποθέτηση των δειγμάτων. Για το λόγο αυτό ποσότητα που να περιέχει 2 μg ολικής πρωτεΐνης από το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό των κυτταροκαλλιεργειών αναμείχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα (0,0625 Μ Tris-HCl, ph 6,8, 2,125 % (w/v) SDS, 30% γλυκερόλη και 0,025% (w/v) μπλε της βρωμοφαινόλης) και τοποθετήθηκαν με προσοχή στις κατάλληλες υποδοχές της πηκτής στοίβαξης (wells). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (25 mm Tris, 192 mm γλυκίνη, 0,05 % SDS, ph 8,0), με σταθερή τάση 150V, για 2h. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, απομακρύνθηκε η πηκτή στοίβαξης και για την απομάκρυνση του SDS, η πηκτή ξεπλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-HCl, 5 mm CaCl 2, 200mM NaCl, ph 7,5, το οποίο περιέχει 2,5% Τriton X-100, και στη συνέχεια επωάσθηκαν για 20h στους 37 ο C στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0,1% Triton X-100 (Sigma). Μετά την επώαση η πηκτή χρωματίστηκε με διάλυμα 0,5% (w/v) Coomasie Brilliant Blue G-250 (Sigma) σε 25% (v/v) ισοπροπυλικής αλκοόλης και 2,5% (v/v) οξικού οξέος, για 12h. Διάλυμα 30% (v/v) ισοπροπυλικής αλκοόλης και 10% (v/v) οξικού οξέος, χρησιμοποιήθηκε για τον αποχρωματισμό της πηκτής. Στις θέσεις που είχαν ηλεκτροφορηθεί οι MMP-2 και MMP-9, λόγω τοπικής αποδόμησης του υποστρώματος της ζελατίνης, εμφανίστηκαν διαφανείς ζώνες λύσεως. Το μοριακό βάρος που αντιστοιχεί στις διαφανείς ζώνες λύσης λόγω ενζυμικής δραστηριότητας υπολογίσθηκε με ηλεκτροφόρηση και σύγκριση με καθαρή μορφή prommp-2 (72,0 kda), ενεργό MMP-2 (64,0 kda), prommp-9 (92,0 kda) και ενεργό MMP-9 (78,0 kda) του εμπορίου (Anawa Trading, Wangen), καθώς και με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους: μυοσίνη (250 kda), φωσφορυλάση (148 kda), αλβουμίνη βόειου ορού (98 kda), αφυδρογονάση του L-γλουταμινικού (64 kda), αλκοολική δεϋδρογονάση (50 kda), καρβονική ανυδράση (36 kda), μυογλοβίνη (22 kda), λυσοζύμη (16 kda), απροτινίνη (6 kda), ινσουλίνη β-αλυσίδα (4 kda)( SeeBlue Plus2 Prestained, Invitrogen, USA). Η σύγκριση μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών δειγμάτων των ζωνών λύσης που εμφανίσθηκαν μετά τη ζυμογραφία με αρνητική χρώση, ύστερα από το χρωματισμό των πρωτεϊνών με Coomasie Brilliant Blue R 88
250, ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY) [562,563]. Ο υπολογισμός της δραστηριότητας των ζελατινασών έγινε αρχικά σε αυθαίρετες μονάδες (arbitrary units) και ακολούθως εκφράσθηκε ως % των επιπέδων του μάρτυρα. Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο spss 12.0 (Chicago, IL, USA) for Windows. Οι μεταβλητές ελέγχθησαν για την κανονική τους κατανομή. Για τη σύγκριση των μεταβλητών που ακολουθούσαν την κανονική κατανομή χρησιμοποιήθηκε το Student s t-test, ενώ για αυτές που δεν ακολουθούσαν την κανονική κατανομή το Wilcoxon signed ranks test. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση ενώ στατιστική σημαντική διαφορά θεωρήθηκε αυτή με p-value κάτω από 0,05. 89
90
2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.1. ΕΞΩΓΕΝΗΣ ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ ΓΗΡΑΝΣΗ 2.1.1. ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ Έκφραση των γλυκοζαμινογλυκανών στο φωτοεκτεθειμένο και φωτοπροστατευμένο δέρμα Ο διαχωρισμός των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών στην ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης αποκάλυψε 2 κύριους πληθυσμούς γλυκοζαμινογλυκανών (G1, G3) και 2 μικρότερους (G2, G4), οι οποίοι «μετανάστευσαν» στην ηλεκτροφόρηση το ίδιο με τους μάρτυρες για υαλουρονικό, θειική δερματάνη, θειική ηπαράνη και θειική χονδροϊτίνη, αντίστοιχα (Εικόνα 20Α). Η ανάλυση πυκνομετρίας αποκάλυψε ότι τα επίπεδα του υαλουρονικού και της θειικής δερματάνης ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένα στο φωτοεκτεθειμένο σε σύγκριση με το φωτοπροστατευμένο δέρμα (p<0,01) (Εικόνα 20Β). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ δερματικών δειγμάτων μεταξύ αρρένων και θηλέων. Για την επιπλέον ποσοτικοποίηση του υαλουρονικού, η σχετική συγκέντρωσή του στις ολικές γλυκοζαμινογλυκάνες μετρήθηκε με ELISA. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 20Γ, η σχετική ποσότητα του υαλουρονικού στο φωτοεκτεθειμένο δέρμα ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερη (297.3 ± 4.0) σε σύγκριση με το φωτοπροστατευμένο δέρμα (162.8 ± 3.9 ng/μg ουρονικών οξέων). Το μοριακό βάρος του υαλουρονικού ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένο στο φωτοεκτεθειμένο σε σχέση με το φωτοπροστατευμένο δέρμα Η ανάλυση του μοριακού βάρους των γλυκοζαμινογλυκανών με ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου έδειξε ότι το υαλουρονικό στο φωτοπροστατευμένο δέρμα ήταν αποκλειστικά μεγάλου μοριακού βάρους (Εικόνα 20Δ). Σε αντίθεση, το μοριακό βάρος του υαλουρονικού του φωτοεκτεθειμένου δέρματος έδειξε μοριακό βάρος μεγαλύτερο από 225 kda, αλλά μικρότερο από αυτό του υαλουρονικού στο φωτοπροστατευμένο δέρμα. Η ανάλυση αυτή καταδεικνύει ότι το υαλουρονικό οξύ στο φωτοεκτεθειμένο δέρμα είναι καταβολισμένο, αν και αυξημένο σε ποσότητα. 91
Εικόνα 20. Η έκφραση των γλυκοζαμινογλυκανών (GAG) στο φωτοεκτεθειμένο και φωτοπροστατευμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). Αντιπροσωπευτική εικόνα της ηλεκτροφόρησης των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών στο φωτοεκτεθειμένο (ΕΚ) και φωτοπροστατευμένο (ΠΡ) δέρμα σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης (Α). Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων από την ηλεκτροφόρηση της οξικής κυτταρίνης. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζεται σε τυχαίες μονάδες η ποσοτικοποίηση των GAG με ειδικό λογισμικό. Οι τιμές είναι εκφρασμένες ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (Β). Ποσοτικοποίηση της σχετικής ποσότητας του υαλουρονικού από ELISA. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζεται η τιμή της ποσότητας του υαλουρονικού σε ng/μg ουρονικών οξέων. Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. (Γ). Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από την ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου (Δ). (***) 0.005 > P > 0.001, G1 G4: GAG πληθυσμοί: HA: υαλουρονικό οξύ, HS:θειική ηπαράνη, DS: θειική δερματάνη, CS: θειική χονδροιτίνη Γονιδιακή έκφραση των συνθετασών του υαλουρονικού οξέος και των υαλουρονιδασών στο φωτο-εκτεθειμένο και φωτο-προστατευμένο δέρμα Εφόσον η ποσότητα του υαλουρονικού ήταν σημαντικά αυξημένη 92
στο φωτο-εκτεθειμένο σε σχέση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα, μελετήσαμε τη γονιδιακή έκφραση των HAS και ΗΥΑLs στα δερματικά δείγματα. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι οι HAS1, HAS2 και HAS3 εκφράζονταν τόσο στο φωτο-εκτεθειμένο, όσο και στο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η γονιδιακή έκφραση της HAS1 ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη (p=0,008) στο φωτο-εκτεθειμένο δέρμα (0,741) σε σύγκριση με το φωτοπροστατευμένο δέρμα (1,469). Η γονιδιακή έκφραση των HAS2 και HAS3 ήταν, επίσης, μειωμένη στο φωτο-εκτεθειμένο δέρμα, χωρίς όμως να φτάνει επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των δειγμάτων από άρρενες και θήλεα (Εικόνα 21). Εικόνα 21. Γονιδιακή έκφραση των συνθετασών του υαλουρονικού στο φωτο-προστατευμένο και φωτο-εκτεθειμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση των HAS με RT-PCR. (B) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων για την HAS1. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζεται ο λόγος HAS1/β-ακτίνη (χωρίς μονάδες). Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. (**): 0,01 > P > 0,005, EΚ: φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτο-προστατευμένο 93
Οι υαλουρονιδάσες HYAL1, HYAL2 και HYAL3, επίσης, εκφράζονταν και στους δύο τύπους δέρματος, με κύριες τις HYAL1 και HYAL2 (Εικόνα 22). Και οι 3 ισομορφές των υαλουρονιδασών έδειξαν αυξημένη γονιδιακή έκφραση στο φωτο-εκτεθειμένο σε σχέση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα. Παρόλα αυτά, η αύξηση αυτή δεν έφτασε τα επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας. (p=0,158, 0,392 και 0,530, αντίστοιχα για τις HYAL1,HYAL2 και HYAL3). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των δειγμάτων από άρρενες και θήλεα. Εικόνα 22. Γονιδιακή έκφραση των υαλουρονιδασών στο φωτο-προστατευμένο και φωτο-εκτεθειμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση των HYAL με RT-PCR. (B) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων για τις HYAL1, HYAL2 και HYAL3. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει το λόγο HYALs/β-ακτίνη (τυχαίες μονάδες). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. EΚ: φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτο-προστατευμένο 94
Γονιδιακή έκφραση των υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM H γονιδιακή ανάλυση των δύο υποδοχέων του υαλουρονικού αποκάλυψε ότι και ο CD44 και ο RHAMM εκφράζονταν τόσο στο φωτο-εκτεθειμένο, όσο και στο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων απέδειξε ότι η γονιδιακή έκφραση και των δύο υποδοχέων ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη στο φωτο-εκτεθειμένο σε σύγκριση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα (P= 0,002 και P=,0.030 αντίστοιχα για CD44 και RHAMM). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των δειγμάτων από άρρενες και θήλεα (Εικόνα 23). Εικόνα 23. Γονιδιακή έκφραση των λειτουργικών υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM στο φωτο-προστατευμένο και φωτο-εκτεθειμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση των CD44 και RHAMM με RT-PCR. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζονται οι λόγοι CD44/β-ακτίνη (Β) και RHAMM/β-ακτίνη (Γ) χωρίς μονάδες. Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. (B, Γ) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. (***): 0,005 > P > 0,001, (*): 0,05 > P > 0,01, EΚ: φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτο-προστατευμένο 95
2.1.2. ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ Μειωμένη γονιδιακή έκφραση της περλεκάνης και ντεκορίνης στο φωτο-εκτεθειμένο δέρμα Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι η έκφραση της περλεκάνης και ντεκορίνης ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη (p=0,006 και 0,021, αντίστοιχα) στο φωτο-εκτεθειμένο σε σύγκριση με το φωτοπροστατευμένο δέρμα (Εικόνα 24, Πίνακας VII). Δεν παρουσιάστηκαν διαφορές μεταξύ των δερματικών δειγμάτων αρρένων και θηλέων. Εικόνα 24. Γονιδιακή έκφραση της περλεκάνης και ντεκορίνης στο φωτοπροστατευμένο και φωτο-εκτεθειμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση της περλεκάνης και ντεκορίνης με RT-PCR. (B, Γ) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζονται οι λόγοι περλεκάνη/β-ακτίνη και ντεκορίνη/β-ακτίνη χωρίς μονάδες. Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. (**) = p μεταξύ 0,01-0,005. (*) = p μεταξύ 0.05-0.01, EΚ: φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτο-προστατευμένο. 96
Αυξημένη γονιδιακή δραστηριότητα της βερσικάνης 1, βερσικάνης 0 και αγγκρεκάνης στο φωτο-εκτεθειμένο δέρμα Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι η έκφραση της βερσικάνης 1, βερσικάνης 0 και αγγκρεκάνης ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη (p=0,02, 0,026 και 0,048, αντίστοιχα) στο φωτο-εκτεθειμένο σε σύγκριση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα (Εικόνα 25, Πίνακας VII). Δεν παρουσιάστηκαν διαφορές μεταξύ των δερματικών δειγμάτων αρρένων και θηλέων. Εικόνα 25. Γονιδιακή έκφραση της βερσικάνης 0, βερσικάνης 1 και αγγκρεκάνης στο φωτο-προστατευμένο και φωτο-εκτεθειμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση της βερσικάνης 0, βερσικάνης 1 και αγγκρεκάνης με RT-PCR. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζονται οι λόγοι βερσικάνη 1/β-ακτίνη, βερσικάνη 0 και αγγκρεκάνη/β-ακτίνη χωρίς μονάδες. Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. (B, Γ, Δ) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. (*) = p μεταξύ 0,05-0,01, EΚ: φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτο-προστατευμένο 97
Γονιδιακή έκφραση της διγλυκάνης και συνδεκάνης-3 στο φωτοεκτεθειμένο και φωτο-προστατευμένο δέρμα Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι η έκφραση της διγλυκάνης και συνδεκάνης-3 δεν έδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές (p=0,317 και 0,688, αντίστοιχα) στο φωτο-εκτεθειμένο σε σύγκριση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα (Εικόνα 26, Πίνακας VII). Δεν παρουσιάστηκαν διαφορές μεταξύ των δερματικών δειγμάτων αρρένων και θηλέων. Εικόνα 26. Γονιδιακή έκφραση της διγλυκάνης και συνδεκάνης-3 στο φωτοπροστατευμένο και φωτο-εκτεθειμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση της διγλυκάνης και συνδεκάνης-3 με RT-PCR. Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. (B, Γ) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. EΚ: φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτοπροστατευμένο 98
Πίνακας VII. Γονιδιακή έκφραση των πρωτεογλυκανών στο φωτοεκτεθειμένο και φωτο-προστατευμένο δέρμα Γονίδιο Έκθεση στον ήλιο Μέσος όρος SEM Περλεκάνη ΕΚ 0,536 0,070 ΠΡ 0,665 0,081 Ντεκορίνη ΕΚ 0,576 0,041 ΠΡ 0,790 0,083 Βερσικάνη 1 ΕΚ 0,655 0,037 ΠΡ 0,550 0,034 Βερσικάνη 0 ΕΚ 0,890 0,062 ΠΡ 0,738 0,047 Αγγκρεκάνη ΕΚ 0,639 0,044 ΠΡ 0,526 0,047 Διγλυκάνη ΕΚ 0,737 0,061 ΠΡ 0,661 0,057 Συνδεκάνη-3 ΕΚ 0,541 0,080 ΠΡ 0,567 0,072 ΕΚ:φωτο-εκτεθειμένο, ΠΡ: φωτο-προστατευμένο 2.1.3. ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ Ζελατινολυτική δραστηριότητα της MMP-9 H MMP-9 στην ανενεργή της μορφή (pro-mmp-9) βρέθηκε να έχει στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερη ζελατινολυτική δραστηριότητα στο φωτο-εκτεθειμένο σε σχέση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα. Αντίθετα, στην ενεργή της μορφή δεν εκφράστηκε και στις δύο κατηγορίες δερματικού ιστού (Εικόνα 27). Ζελατινολυτική δραστηριότητα της MMP-2 Η MMP-2 τόσο στην ανενεργή, όσο και στην ενεργή μορφή της παρουσίασε στατιστικώς σημαντικά αυξημένη ζελατινολυτική δραστηριότητα στο φωτο-εκτεθειμένο σε σχέση με το φωτο-προστατευμένο δέρμα (Εικόνα 27). 99
Εικόνα 27. Ζελατινολυτική δραστηριότητα των MMP-2 και MMP-9 στο φωτο-εκτεθειμένο και φωτο-προστατευμένο δέρμα από 16 ασθενείς (Ν=16). (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα της ζελατινολυτικής δραστηριότητας των MMP-2 και MMP-9 σε ζυμογραφία ζελατίνης. (Β) Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζεται σε τυχαίες μονάδες η ποσοτικοποίηση των MMPs με ειδικό λογισμικό. Οι τιμές είναι εκφρασμένες ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (*) = p μεταξύ 0.05-0.01, (***) = p <0.001. Οι σκουρόχρωμες στήλες απεικονίζουν το φωτο-εκτεθειμένο και οι ανοιχτόχρωμες στήλες το φωτο-προστατευμένο. 2.2. ΕΝΔΟΓΕΝΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΕΙΑ ΔΕΡΜΑΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ 2.2.1. ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ 2.2.2. ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΕΣ Το υαλουρονικό οξύ μειώνεται σημαντικά στην ενδογενή γήρανση Η μέτρηση της συγκέντρωσης του υαλουρονικού οξέος στα ολικά GAG έδειξε ότι η σχετική ποσότητα του υαλουρονικού στο ενήλικο φωτοπροστατευμένο δέρμα (160±19 ng/μg ουρονικών οξέων) ήταν στατιστικώς 100
σημαντικά μειωμένη (p<0,0001) σε σύγκριση με το νεανικό φωτοπροστατευμένο δέρμα (310±27 ng/μg ουρονικών οξεων) (Εικόνα 28Α). Εικόνα 28. Το υαλουρονικό οξύ μειώνεται δραματικά στο ενήλικο φωτοπροστατευμένο δέρμα αλλά παραμένει υψηλού μοριακού βάρους σε δείγματα από 16 ενήλικές και 10 παιδιά. Στον κάθετο άξονα παρουσιάζεται η τιμή της ποσότητας του υαλουρονικού σε ng/μg ουρονικών οξέων. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. (Α) Ποσοτικοποίηση της μέτρησης της σχετικής ποσότητας υαλουρονικού οξέος με ELISA. (***) = p <0.005. (B) Ανάλυση σε γέλη αγαρόζης 0.5% των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών (4μg ουρονικών οξέων). Το μοριακό βάρος του υαλουρονικού παραμένει σταθερό στην ενδογενή δερματική γήρανση Η μελέτη του υαλουρονικού οξέος σε γέλη αγαρόζης (Εικόνα 28Β) έδειξε ότι το μοριακό βάρος του υαλουρονικού οξέος δεν έχει στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ ενήλικου και νεανικού φωτο-προστατευμένου δέρματος και ήταν μεταξύ 250-1,000 kda. Η ενδογενής γήρανση χαρακτηρίζεται πτώση των HAS-1 και HAS-2 και αύξηση της HAS-3 Για να διερευνηθεί αν η πτώση του υαλουρονικού στο ενήλικο δέρ- 101
μα είναι αποτέλεσμα μειωμένης έκφρασης των συνθετασών του αναλύσαμε την έκφραση των 3 συνθετασών του υαλουρονικού με RT-PCR. Οι 3 συνθετάσες του υαλουρονικού (HAS-1, -2, -3) εκφράζονταν και στο νεανικό και στο ενήλικο δέρμα. Η γονιδιακή έκφραση των HAS-1 (p=0,028) και HAS-2 (p=0,007) βρέθηκε στατιστικώς σημαντικά μειωμένη και η γονιδιακή έκφραση της HAS-3 (p=0,0001) στατιστικώς σημαντικά αυξημένη στο ενήλικο δέρμα σε σύγκριση με το νεανικό φωτο-προστατευμένο δέρμα (Πίνακας VIII, Εικόνα 29). Εικόνα 29. Γονιδιακή έκφραση των 3 συνθετασών του υαλουρονικού στο νεανικό και ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα σε δείγματα από 16 ενήλικες και 10 παιδιά.. (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση της HAS-1, HAS 2 και HAS-3 με RT-PCR. (B, Γ, Δ) Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. (*) = p μεταξύ 0.05-0.01, (**)= p μεταξύ 0,01-0,005, (***) = p<0,005. Η ενδογενής γήρανση χαρακτηρίζεται από πτώση των υαλουρονιδασών 1, 2 και 3 Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των υαλουρονιδασών έδειξε ότι και οι 3 υαλουρονιδάσες εκφράζονταν στο νεανικό και φωτοπροστατευμένο δέρμα. Η ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι και οι 3 υαλουρονιδάσες ήταν μειωμένες στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρ- 102
μα σε σύγκριση με το νεανικό. Στατιστικώς σημαντική πτώση έδειξαν μόνο οι HYAL-2 (p=0,0001) και HYAL-3 (p=0,001) και όχι η HYAL-1 (p=0,071) (Πίνακας VIII, Εικόνα 30). Εικόνα 30. Γονιδιακή έκφραση των 3 υαλουρονιδασών στο νεανικό και ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση της HYAL-1, HYAL-2 και HYAL-3 με RT-PCR. (B, Γ, Δ) Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. (**)= p μεταξύ 0,01-0,005. Η ενδογενής γήρανση χαρακτηρίζεται από μειωμένη γονιδιακή έκφραση των υποδοχέων του υαλουρονικού Η γονιδιακή ανάλυση των υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM έδειξε ότι και οι δύο υποδοχείς εκφράζονται και στο νεανικό και στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι και ο CD44 (p= 0,003) και ο RHAMM (p=0,008) χαρακτηρίζονταν από στατιστικώς σημαντική πτώση στο ενήλικο φωτοπροστατευμένο δέρμα σε σχέση με το νεανικό (Πίνακας VIII, Εικόνα 31). 103
Εικόνα 31. Γονιδιακή έκφραση των ενεργών υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM στο νεανικό και ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση των CD44 και RHAMM με RT-PCR. (B, Γ) Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. (**) = p μεταξύ 0,01-0,005, (***) = p<0,005 Γονιδιακή ανάλυση των πρωτεογλυκανών στο νεανικό και ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα Η αγγκρεκάνη και οι βερσικάνες 0 και 1 εκφράζονταν και στο νεανικό και στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων έδειξε στατιστικώς σημαντική αύξηση της αγγκρεκάνης (p=0,01) και στατιστικώς σημαντική πτώση των βερσικανών 0 (p=0,03) και 1 (p=0,0001) στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Η ντεκορίνη και η διγλυκάνη επίσης εκφράζονταν και στις δύο κατηγορίες ενώ η έκφραση και των δύο παρουσίασε στατιστικώς σημαντική μείωση (p=0,012 για την ντεκορίνη και 0,001 για την διγλυκάνη) στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Η περλεκάνη, που κύρια βρίσκεται στην βασική μεμβράνη, επίσης χαρακτηριζόταν από στατιστικώς σημαντική μείωση της γονιδιακής έκφρα- 104
σης (p=0,003) στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. Τέλος, η συνδεκάνη-3, η οποία είναι μια πρωτεογλυκάνη που κύρια βρίσκεται στην κυτταρική επιφάνεια, χαρακτηριζόταν από στατιστικώς σημαντική μειωμένη έκφραση στο ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα (p=0,0001) (Πίνακας IX, Εικόνα 32). Εικόνα 32. Γονιδιακή έκφραση των πρωτεογλυκανών στο νεανικό και ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα. (Α) Αντιπροσωπευτική ανάλυση των πρωτεογλυκανών με RT-PCR. (B-Η) ) Η έντονη μαύρη γραμμή αντιπροσωπεύει τη διάμεση τιμή, ενώ το έγχρωμο «κουτί» παρουσιάζει το 50% των τιμών. Οι γραμμές που εκτείνονται από το «κουτί» αντιπροσωπεύουν την μικρότερη και μεγαλύτερη τιμή. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων. (*) = p μεταξύ 0,05-0,01, (***) = p <0,005. 105
Πίνακας VIII. Γονιδιακή έκφραση των ενζύμων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό του υαλουρονικού και των υποδοχέων του υαλουρονικού σε νεανικά και ενήλικα φωτοπροστατευμένα δερματικά δείγματα Γονίδιο Ηλικιακή ομάδα Μέσος όρος ± SEM HAS-1 Νεανικό Ενήλικο 1,45 ± 0,31 0,60 ± 0,08 HAS-2 Νεανικό Ενήλικο 1,43 ± 0,20 0,67 ± 0,06 HAS-3 Νεανικό Ενήλικο 0,27 ± 0,02 0,52 ± 0,05 HYAL-1 Νεανικό Ενήλικο 0,88 ± 0,10 0,65 ± 0,04 HYAL-2 Νεανικό Ενήλικο 1,89 ± 0,14 1,27 ± 0,06 HYAL-3 Νεανικό Ενήλικο 0,50 ± 0,04 0,28 ± 0,03 CD44 Νεανικό Ενήλικο 0,75 ± 0,07 0,40 ± 0,02 RHAMM Νεανικό Ενήλικο 0,28 ± 0,03 0,15 ± 0,02 HYAL: υαλουρονιδάση, HAS: συνθετάση του υαλουρονικού 106
Πίνακας ΙΧ. Γονιδιακή έκφραση των προτεογλυκανών στο νεανικό και ενήλικο φωτο-προστατευμένο δέρμα Πρωτεογλυκάνη Gene expression Mean ± SEM (ελληνικά) p ΑΓΓΚΡΕΚΑΝΗ Νεανικό Ενήλικο 0,20 ± 0,03 0,48 ± 0,08 0,01 ΒΕΡΣΙΚΑΝΗ 0 Νεανικό Ενήλικο 0,26 ± 0,05 0,13 ± 0,01 0,03 ΒΕΡΣΙΚΑΝΗ 1 Νεανικό Ενήλικο 1,28 ± 0,13 0,35 ± 0,02 0,0001 ΝΤΕΚΟΡΙΝΗ Νεανικό Ενήλικο 0,29 ± 0,04 0,17 ± 0,01 0,012 ΔΙΓΛΥΚΑΝΗ Νεανικό Ενήλικο 0,44 ± 0,07 0,15 ± 0,02 0,001 ΠΕΡΛΕΚΑΝΗ Νεανικό Ενήλικο 0,54 ± 0,08 0,27 ± 0,03 0,003 ΣΥΝΔΕΚΑΝΗ-3 Νεανικό Ενήλικο 0,51 ± 0,03 0,14 ± 0,01 0,0001 2.3. ΕΝΔΟΓΕΝΗΣ ΓΗΡΑΝΣΗ ΣΤΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΟΓΕΝΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ 2.3.1. ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ Το υαλουρονικό οξύ μειώνεται σημαντικά στην ενδογενή γήρανση Η μέτρηση της συγκέντρωσης του υαλουρονικού οξέος στα ολικά GAG του θρεπτικού υλικού έδειξε ότι η σχετική ποσότητα του υαλουρονικού στο θρεπτικό υλικό από τους πρωτογενείς ινοβλάστες που προέρχονταν από το φωτο-προστατευμένο δέρμα υγιών γυναικών 50 και 76 ετών (DS50, 107
DS76) ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με αυτό που προέρχονταν από φωτο-προστατευμένο δέρμα υγιούς γυναίκας 30 ετών (DS30) (p<0,0001) (Εικόνα 33Α, Γ). Μεταξύ των ηλικιακών ομάδων 50 και 76 η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικώς σημαντική. Από την άλλη πλευρά, το περικυττάριο υαλουρονικό οξύ και στις 3 κατηγορίες κυττάρων παρέμεινε σταθερό (Εικόνα 33 Δ). Εικόνα 33. Το υαλουρονικό οξύ μειώνεται δραματικά στην ενδογενή δερματική γήρανση αλλά παραμένει υψηλού μοριακού βάρους. (Α) Ποσοτικοποίηση της μέτρησης της σχετικής ποσότητας υαλουρονικού οξέος στο θρεπτικό υλικό με ELISA (ng/μg ουρονικών οξέων). Το γράφημα παρουσιάζει το μέσο όρο και τυπικό σφάλμα τουμέσου όρου από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (B) Ανάλυση σε γέλη αγαρόζης 0.5% των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών (8μg ουρονικών οξέων).(γ) Αντιπροσωπευτική εικόνα της ηλεκτροφόρησης των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών στο θρεπτικό υλικό (4μg ουρονικών οξέων) σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης. (Δ) Αντιπροσωπευτική εικόνα της ηλεκτροφόρησης των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών στον περικυττάριο χώρο σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης (4 μg ουρονικών οξέων). (***) = p<0,0001, ΗΑ: υλουρονικό οξύ, DS30: 30 ετών, DS50: 50 ετών, DS76: 76 ετών, ChSB: Θειική χονδροιτίνη, HS: Θειική ηπαράνη, ChC: Θειική δερματάνη 108
Το μοριακό βάρος του υαλουρονικού παραμένει σταθερό στην ενδογενή δερματική γήρανση Η μελέτη του υαλουρονικού οξέος σε γέλη αγαρόζης (Εικόνα 33Β) έδειξε ότι το μοριακό βάρος του υαλουρονικού οξέος δεν έχει στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των 3 ηλικιακών ομάδων και παραμένει υψηλού μοριακού βάρους, ανεξαρτήτως της ηλικίας (Εικόνα 33Β). Η ενδογενής γήρανση χαρακτηρίζεται πτώση των συνθετασών του υαλουρονικού οξέος Για να διερευνηθεί αν η πτώση του υαλουρονικού είναι αποτέλεσμα μειωμένης έκφρασης των συνθετασών του διερευνήθηκε η έκφραση των 3 συνθετασών του υαλουρονικού με real time PCR. Οι 3 συνθετάσες του υαλουρονικού (HAS-1, -2, -3) έδειξαν στατιστικώς σημαντική πτώση στο DS50 και DS76 σε σύγκριση με το DS30 (p<0.0001). Αντίθετα δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των DS50 και DS 76 (Εικόνα 34). Εικόνα 34. Γονιδιακή έκφραση των 3 συνθετασών του υαλουρονικού στην ενδογενή γήρανση. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει το % της ομάδας ελέγχου ενώ το γράφημα το μέσο όρο και τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης με real time PCR. (***)= p<0,0001. Η ενδογενής γήρανση χαρακτηρίζεται από σταθερά επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης των υαλουρονιδασών 1, 2 και 3 Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των υαλουρονιδασών έδειξε ότι και οι 3 υαλουρονιδάσες εκφράζονταν και στις 3 ηλικιακές ομάδες. Η ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι και οι 3 υαλουρονιδάσες παραμένουν σταθερές στη γονιδιακή τους δραστηριότητα και στις 3 ηλικιακές ομάδες (Εικόνα 35). 109
Η ενδογενής γήρανση χαρακτηρίζεται από μειωμένη γονιδιακή έκφραση των υποδοχέων του υαλουρονικού Η γονιδιακή ανάλυση των υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM έδειξε ότι και οι δύο υποδοχείς παρουσιάζουν μια ηλικιακοεξαρτώμενη μείωση της γονιδιακής τους έκφρασης η οποία είναι στατιστικώς σημαντική. Η πτώση αυτή ήταν φανερή τόσο στη σύγκριση της ηλικιακής ομάδας των 30 ετών με τις άλλες δύο όσο και στη σύγκριση του DS50 με την ηλικιακή ομάδα των 76 ετών (Εικόνα 36). Εικόνα 35. Γονιδιακή έκφραση των 3 υαλουρονιδασών στην ενδογενή γήρανση. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει το % της ομάδας ελέγχου ενώ το γράφημα το μέσο όρο και τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης με real time PCR. 110
Εικόνα 36. Γονιδιακή έκφραση των δύο ενεργών υποδοχέων CD44 και RHAMM του υαλουρονικού στην ενδογενή γήρανση. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει το % της ομάδας ελέγχου ενώ το γράφημα το μέσο όρο και τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης με real time PCR. (***) = p<0,0001, (**) = 0,0001<p<0,001. 2.4. Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ 17-Β-ΟΙΣΤΡΑΔΙΟΛΗΣ ΣΤΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΠΑΡΑΚΡΙΝΟΥΣ ΔΡΑΣΗΣ 2.4.1. ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ Η ομοιοστασία του υαλουρονικού οξέος επηρεάζεται από την παρακρινή δράση της 17-β-οιστραδιόλης Η μέτρηση της συγκέντρωσης του υαλουρονικού οξέος στις ολικές GAG του θρεπτικού υλικού των ινοβλαστών έδειξε ότι η σχετική ποσότητα του υαλουρονικού στο θρεπτικό υλικό από πρωτογενείς ινοβλάστες υπό την επίδραση 17-β-οιστραδιόλης στα επίπεδα που προσομοιάζουν τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 20 ετών ήταν στατιστικώς σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με αυτήν από πρωτογενείς ινοβλάστες υπό την επίδραση 17-β-οιστραδιόλης στα επίπεδα που προσομοιάζουν τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 60 ετών (p<0,0001) (Εικόνα 37Α). Η ανάλυση και ηλεκτροφόρηση των γλυκοζαμινογλυκανών σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης έδειξε το ίδιο αποτέλεσμα (Εικόνα 37Β). 111
Εικόνα 37. Το υαλουρονικό οξύ αυξάνεται υπό την επίδραση της 17-βοιστραδιόλης που προσομοιάζει τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 20 ετών. (Α) Ποσοτικοποίηση της μέτρησης της σχετικής ποσότητας υαλουρονικού οξέος στο θρεπτικό υλικό με ELISA. Οι τιμές είναι εκφρασμένες ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από τις τιμές 3 ανεξάρτητων πειραμάτων (B) Αντιπροσωπευτική εικόνα της ηλεκτροφόρησης των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών στο θρεπτικό υλικό (4 μg ουρονικών οξέων) σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης. Ν: ινοβλάστες μάρτυρες, E20: επίδραση με 17-β-οιστραδιόλη που προσομοιάζει τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 20 ετών, E60: επίδραση με 17-β-οιστραδιόλη που προσομοιάζει τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 60 ετών, (***) = p <0,0001, ΗΑ: υλουρονικό οξύ, ChSB: Θειική χονδροϊτίνη, ChC: Θειική δερματάνη. Η γονιδιακή έκφραση των συνθετασών του υαλουρονικού επηρεάζεται από την παρακρινή δράση της 17-β-οιστραδιόλης Για να διερευνηθεί αν η αύξηση του υαλουρονικού είναι αποτέλεσμα αυξημένης έκφρασης των συνθετασών του διερευνήθηκε η έκφραση των 3 συνθετασών του υαλουρονικού με real time PCR. Οι 3 συνθετάσες του υαλουρονικού (HAS-1, -2, -3) έδειξαν στατιστικώς σημαντική αύξηση στους πρωτογενείς ινοβλάστες υπό την επίδραση 17-β-οιστραδιόλης στα επίπεδα που προσομοιάζουν τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 20 ετών σε σύγκριση με αυτή στους πρωτογενείς ινοβλάστες υπό την επίδραση 17-β-οιστραδιόλης στα επίπεδα που προσομοιάζουν τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 60 ετών (p<0,0001) (Εικόνα 38). 112
Εικόνα 38. Γονιδιακή έκφραση των 3 συνθετασών του υαλουρονικού στην ενδογενή γήρανση. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει τις τιμές % της ομάδας ελέγχου. Το γράφημα παρουσιάζει το μέσο όρο των τιμών από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης με real time PCR. (***)= p<0,0001. Η γονιδιακή έκφραση στων υαλουρονιδασών παραμένει ανεπηρέαστη υπό την επίδραση της παρακρινούς δράσης της 17-β-οιστραδιόλης Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των υαλουρονιδασών έδειξε ότι και οι 3 υαλουρονιδάσες παραμένουν σταθερές στη γονιδιακή τους δραστηριότητα και δεν επηρεάζονται από την επίδραση της παρακρινούς δράσης της 17-β-οιστραδιόλης. (Εικόνα 39). Εικόνα 39. Γονιδιακή έκφραση των 3 υαλουρονιδασών στην ενδογενή γήρανση. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει το % της ομάδας ελέγχου ενώ τα γραφήματα τον μέσο όρο και τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης με real time PCR. 113
Η γονιδιακή έκφραση των λειτουργικών υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM επηρεάζεται από την επίδραση της παρακρινούς δράσης της 17-β-οιστραδιόλης Η γονιδιακή ανάλυση των υποδοχέων του υαλουρονικού CD44 και RHAMM έδειξε ότι και οι δύο υποδοχείς παρουσιάζουν μια στατιστικώς σημαντική αύξηση στους πρωτογενείς ινοβλάστες υπό την επίδραση 17-βοιστραδιόλης στα επίπεδα που προσομοιάζουν τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 20 ετών σε σύγκριση με αυτή στους πρωτογενείς ινοβλάστες με την επίδραση 17-β-οιστραδιόλης στα επίπεδα που προσομοιάζουν τα επίπεδα υγιούς γυναίκας 60 ετών (Εικόνα 40). Εικόνα 40. Γονιδιακή έκφραση των δύο υποδοχέων CD44 και RHAMM του υαλουρονικού στην ενδογενή γήρανση. Ο κάθετος άξονας παρουσιάζει το % της ομάδας ελέγχου ενώ τα γραφήματα το μέσο όρο και τυπικό σφάλμα του μέσου όρου από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης με real time PCR. (***)= p<0,0001, (**)= 0,0001<p<0,001. 114