ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΧΘΥΔΙΩΝ ΘΑΛΑΣΣΙΝΩΝ ΕΙΔΩΝ: Καλλιέργειες Τροχοζώων (Rotifers)

s Τμήμα Ιχθυοκομίας-Αλιείας ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΧΘΥΔΙΩΝ ΘΑΛΑΣΣΙΝΩΝ ΕΙΔΩΝ: Καλλιέργειες Τροχοζώων (Rotifers) Γιάννης Κλαδάς Ηγουμενίτσα, Ιούνιος 2006

1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 3 2.1 Βιολογικός κύκλος... 4 2.3 Στελέχη και πολυμορφισμός των τροχοζώων... 4 2.4 Τροφή... 5 2.4.1 Πλαγκτονικά μικροφύκη... 5 2.4.2 Μαγιά... 6 2.5 Το περιβάλλον της καλλιέργειας... 6 2.5.1 Θερμοκρασία... 6 2.5.2 Αλατότητα... 6 2.5.3 Φως... 6 2.5.4 ph... 7 2.5.5 Αμμωνία... 7 2.5.6 Οξυγόνο... 7 2.5.7 Ποιότητα νερού... 7 2.6 Παράσιτα... 8 2.7 Συνοπτική παρουσίαση των κυριότερων βιολογικών χαρακτηριστικών των τροχοζώων... 9 3 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 10 2

1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Tα τροχόζωα είναι μικροί πλαγκτικοί οργανισμοί που ανήκουν στο φύλο Rotifera. Τα είδη που χρησιμοποιούνται στις ιχθυοκαλλιέργειεs ανήκουν στο γένος Brachionus. Στις καλλιέργειες που γίνονται σε θαλασσινό νερό χρησιμοποιείται το είδος Brachionus plicatilis εξαιτίας της αντοχής του στο θαλασσινό περιβάλλον. Οι οργανισμοί αυτοί χαρακτηρίζονται από μεγάλη ικανότητα πληθυσμιακής αύξησης, όταν βρεθούν σε κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες, κάτι που συμβαίνει την άνοιξη και το φθινόπωρο. Τις περιόδους αυτές συνιστούν, το κύριο μέρος της βιομάζας των ελών (Brachionus calcyflorus) και των υφάλμυρων λεκανών (Brachionus plicatilis). Τα τροχόζωα χρησιμοποιούνται ως πρώτη ζωντανή τροφή (θήραμα), κατά την εξέλιξη του διατροφολογίου των νυμφών πολλών ειδών θαλασσινών ψαριών, καθώς ικανοποιούν τα εξής βασικά κριτήρια : οι τεχνικές καλλιέργειάς τους είναι πλήρως ελεγχόμενες και η μαζική παραγωγή τους δεν παρουσιάζει δυσκολίες, έχουν διαστάσεις τέτοιες ώστε να αντιστοιχούν στο άνοιγμα του στόματος των νυμφών στο τέλος του προνυμφικού τους σταδίου, εξαιτίας της αδιάκοπης κίνησής τους γίνονται εύκολα αντιληπτά από τις μικρής ηλικίας προνύμφες, οι οποίες δε διαθέτουν πλήρη αντίληψη του χώρου, η μετατόπιση τους κατά τη κίνησή είναι περιορισμένη, γεγονός το οποίο εξυπηρετεί τις προνύμφες που, σε αυτές τις ηλικίες, έχουν περιορισμένη κολυμβητική ικανότητα, είναι πιο εύπεπτα από τα νεαρά νυμφικά στάδια των ψαριών, συγκρινόμενα με άλλα θηράματα, όπως τα μικρά καρκινοειδή, μπορούν εύκολα να εμπλουτιστούν με απαραίτητα για τις νύμφες θρεπτικά συστατικά, κυρίως πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, ανοσοενισχυτικά και βιταμίνες. Η σπουδαιότητα των τροχοζώων, ως θηραμάτων στις νυμφικές καλλιέργειες, έγκειται και στο γεγονός ότι τα πεπτικά τους ένζυμα παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της πέψης των νεαρών νυμφών, οι οποίες τα χρησιμοποιούν εξαιτίας της έλλειψης των δικών τους πεπτικών ενζύμων που δεν έχουν ακόμη αναπτυχθεί. Η καλλιέργεια τροχοζώων ξεκινά είτε με ώριμα άτομα, είτε με ξηρές κύστεις (αυγά διάπαυσης). Οι κύστεις, που διατίθενται στο εμπόριο από εξειδικευμένες εταιρίες ή εργαστήρια, επωαζόμενες στο νερό σε κατάλληλες συνθήκες, εκκολάπτονται. Τα τροχόζωα αναπαράγονται σε οποιουσδήποτε όγκους, σε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας και με έντονο αερισμό. Για την καλλιέργειά τους χρησιμοποιούνται ποικίλοι τύποι διατροφής, όπως φυτοπλαγκτικοί οργανισμοί και ζύμες (μαγιές) σε συνδυασμό με εμπλουτιστικά προϊόντα. Η έναρξη μιας μαζικής καλλιέργειας τροχοζώων γίνεται αρχικά με πολύ μικρούς πληθυσμούς, οι οποίοι αναπαράγονται παρθενογεννητικά, δίνοντας μετά από λίγες εβδομάδες, με παράλληλη παροχή τροφής και συμπλήρωση νερού, εκατομμύρια νέα άτομα. 3

2 ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ 2.1 Αναπαραγωγή Τα τροχόζωα μέσα σε κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες και με διαθέσιμη κατάλληλη τροφή αναπαράγονται παρθενογεννητικά με αποτέλεσμα ο πληθυσμός τους να αποτελείται μόνο από θηλυκά άτομα που φέρουν αυγά. Σε περίπτωση που διαταραχθούν οι συνθήκες αυτές: η γονιμότητα του πληθυσμού ελαττώνεται εμφανίζονται στον πληθυσμό αρσενικά άτομα, τα οποία είναι μικρά σε μέγεθος (σχήμα 1), κινούνται γρήγορα και ακατάπαυστα, δεν τρέφονται, και έχουν ως μοναδικό σκοπό την φυλετική αναπαραγωγή, η οποία οδηγεί στην παραγωγή αβγών διαρκείας. Κορώνα Βλεφαρίδες Mastax Στομάχι Ωοθήκη Ουροδόχος κύστη Πέος Αβγό Αδένας Ποδιού Πόδι Σχήμα 1. Μορφολογία θηλυκού και αρσενικού rotifer 2.3 Στελέχη και πολυμορφισμός των τροχοζώων Υπάρχουν 2 ποικιλίες («στελέχη») τροχοζώων, τα μεγαλόσωμα L-type (Brachionus plicatilis typicus) και των μικρόσωμα S-type (Brachionus plicatilis rotundiformis) 1. H σημαντικότερη διαφορά μεταξύ των δυο αυτών ποικιλιών τροχοζώων είναι η μορφή του άνω μέρους του κελύφους τους (lorica), η οποία αναδεικνύεται σε πρόσφατα θανατωμένα άτομα (π.χ. με αραιό διάλυμα φορμόλης). Στα μικρόσωμα τροχόζωα (S-type), τo πάνω μέρος του lorica χαρακτηρίζεται από κανονικά διατεταγμένες οξείες άκανθες, ενώ στα L-type οι άκανθες είναι ακανόνιστου σχήματος και με μεγαλύτερες γωνίες (σχήμα 2). 1 Σύμφωνα με πρόσφατες επιστημονικές δημοσιεύσεις (PAPAKOSTAS et al., 2005), θεωρούνται διαφορετικά είδη. 4

Σχήμα 2. Μορφολογικές διαφορές των δύο τύπων τροχοζώων. Αριστερά L-type rotifers, δεξιά S- type.διακρίνεται η θέση και το σχετικό μέγεθος του αβγού. Τα L-τύπου τροχόζωα έχουν περίπου τριπλάσιο βάρος από τα S- τύπου, ενώ το μήκος τους κυμαίνεται από 130-340μm έναντι 100-210μm των μικρόσωμων. Η γονιμότητα που χαρακτηρίζει τους πληθυσμούς των τροχοζώων τύπου S είναι πολύ μεγαλύτερη εκείνης του τύπου L. Η μέγιστη ημερήσια αύξηση των πληθυσμών των δυο τύπων (στις αντίστοιχα βέλτιστες συνθήκες θερμοκρασίας: 34 o C έναντι 25 o C) ανέρχεται στα 250% και 170% αντίστοιχα. Η μεγάλη γονιμότητα των S- τύπου τροχοζώων σε συνδυασμό με το μικρότερο μέγεθός τους τα καθιστά ελκυστικά για χρησιμοποίηση στις νυμφικές καλλιέργειες. Αυτό όμως σημαίνει ότι, δεδομένου του πολύ μικρότερου βάρους τους, οι ποσότητες (αριθμό ατόμων) που πρόκειται να χορηγηθούν για τη διατροφή των νυμφών θα πρέπει να είναι πολύ μεγαλύτερες. 2.4 Τροφή Τα τροχόζωα τρέφονται με: πλαγκτικά μικροφύκη, ζωντανά, λυοφιλισμένα ή κατεψυγμένα, ζύμη (μαγιά, Saccharomyces cerevisiae), βακτήρια, εμπλουτισμένες μαγιές, ή με οποιοδήποτε συνδυασμό των ανωτέρω. 2.4.1 Πλαγκτονικά μικροφύκη Τα πλαγκτικά μικροφύκη χρησιμοποιούνται ως τροφή για τη συντήρηση των στελεχών (strains) των τροχοζώων και τις νέες καλλιέργειες σε μικρούς όγκους. Τα κύρια είδη που χρησιμοποιούνται είναι το Nannochloropsis sp., το Tetraselmis (Platymonas) suecica και το T.tetrathele. 5

Οι ημερήσιες ανάγκες ενός εκατομμυρίου τροχοζώων καλύπτονται με 1λίτρο Nannochloropsis sp. πυκνότητας 30-50 x10 6 κυττάρων/ml ή με 1λίτρο Tetraselmis suecica ή T.tetrathele πυκνότητας 1-2 x10 6 κυττάρων/ml 2. 2.4.2 Μαγιά Έχει αποδειχθεί, ότι, αν τα τροχόζωα τρέφονται μόνο με μαγιά, τότε, για την ομαλή αύξηση των πληθυσμών, είναι απαραίτητη η προσθήκη της βιταμίνης Β 12. Οι καθημερινές ανάγκες σε βιταμίνη Β 12 έχουν εκτιμηθεί σε 1,5x10-4 mg/ τροχόζωο τύπου L και 2x10-9 mg/ τροχόζωο τύπου S. Οι καθημερινές απαιτήσεις σε μαγιά ανά εκατομμύριο τροχοζώων εκτιμούνται σε 1g. Στην περίπτωση διανομής ξηρής μαγιάς η ποσότητα διαιρείται δια 3. Έχει αποδειχθεί ότι, σε συνθήκες μαζικής καλλιέργειας η μικτή διατροφή με μαγιά και φυτοπλαγκτόν ευνοεί την καλύτερη ανάπτυξη των πληθυσμών συγκρινόμενη από την διατροφή των τροχοζώων μόνον με μικροφύκη. Η διανομή της μαγιάς στις καλλιέργειες καθώς και όλων των προϊόντων, τα οποία έχουν ως βάση την μαγιά γίνεται μετά από προηγούμενη αραίωσή της στο νερό, σε δόση 50g προϊόντος ανά λίτρο νερού. 2.5 Το περιβάλλον της καλλιέργειας 2.5.1 Θερμοκρασία Οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης των δυο τύπων των τροχοζώων διαφέρουν. Τα τύπου- S τροχόζωα είναι θερμόφιλα και μπορούν να ανεχθούν αλλαγές θερμοκρασιών 15-35 0 C, με βέλτιστες θερμοκρασίες για την ανάπτυξη τους 30-35 0 C, ενώ τα τύπου-l μπορούν να ανεχθούν θερμοκρασίες από 5-25 0 C και αναπτύσσονται καλύτερα στους 25 0 C. 2.5.2 Αλατότητα Το είδος Brachionus plicatilis είναι ιδιαίτερα ευρύαλος οργανισμός. Ζει σε νερά αλατότητας συνήθως από 1 ο / οο ώς 30 ο / οο, αλλά επίσης και σε υπερύαλα νερά ώς και 100 ο / οο. Η μαζική παραγωγή των τροχοζώων πραγματοποιείται συνήθως σε αλατότητα 25 ο / οο. Σε απότομες όμως αλλαγές της αλατότητας τα τροχόζωα υφίστανται έντονο στρές, γεγονός που εκδηλώνεται με μείωση της κινητικότητάς τους και καταβύθισή τους (π.χ. σε περίπτωση απότομης μεταφοράς τους από νερό αλατότητας 40 ο / οο σε αλατότητα 20 ο / οο ). Αλλαγές στην αλατότητα του μέσου καλλιέργειας συνιστούν παράγοντα πρόκλησης αμφιγονικής αναπαραγωγής 2.5.3 Φως Στην καλλιέργεια των τροχοζώων το φως δεν παίζει ιδιαίτερο ρόλο, εκτός των περιπτώσεων κατά τις οποίες ο τύπος της τροφής που δίνεται στα τροχόζωα είναι ζωντανοί φυτοπλαγκτικοί οργανισμοί. 2 Οι αναφερόμενες συγκεντρώσεις αντιστοιχούν στο μισό περίπου των συγκεντρώσεων των ώριμων καλλιεργειών («στάσιμη» φάση) σε αυτά τα είδη του φυτοπλαγκτού 6

2.5.4 ph Το εύρος επιβίωσης των τροχοζώων είναι σε τιμές ph 5 ως 9. Η βέλτιστη περιοχή του ph, αναφορικά με την πληθυσμιακή τους αύξηση, είναι από 6 ώς 8. Οι καλλιέργειες τροχοζώων σε πυκνά φύκη απαιτούν την προσθήκη μικρών ποσοτήτων CO 2 στο δίκτυο παροχής αέρα (περίπου 0,03%). 2.5.5 Αμμωνία Τα τροχόζωα παράγουν πάρα πολύ μεγάλες ποσότητες αμμωνίας μέσα στο μέσο καλλιέργειάς τους. Είναι γνωστό το ότι η τοξικότητα της αμμωνίας εξαρτάται από την αλατότητα, τη θερμοκρασία και το ph. Η θανατηφόρα δόση LC50 του N.NH 3,4 στους 23 0 C έχει εκτιμηθεί ότι είναι 17mg/l. Η γονιμότητα των πληθυσμών τροχοζώων μειώνεται αυξανόμενης της συγκέντρωσης της αμμωνίας του μέσου καλλιέργειας. ). Σε συγκέντρωση Ν.ΝΗ 3,4 της τάξης των 10 ppm η κινητικότητα των τροχοζώων μειώνεται κατά το ήμισυ. 2.5.6 Οξυγόνο Όταν οι πληθυσμοί διατρέφονται με μικροφύκη, το οξυγόνο πρέπει να είναι στα επίπεδα 5 έως 7mg/l και να εξελίσσονται κάτω από διαρκή φωτισμό. Ο συνεχής αερισμός είναι επαρκής για την οξυγόνωση του νερού. Οι πληθυσμοί των τροχοζώων (σε συγκεντρώσεις 150-400 rot/ml) σε καλλιέργειες με βασική τροφή τη μαγιά αναπτύσσονται κανονικά ακόμη και σε επίπεδα 2 ppm διαλυμένου οξυγόνου. Σε μικρότερες συγκεντρώσεις (0,7 ppm) σταματάει η παραγωγή αβγών. Καλλιέργειες εκτρεφόμενες με εμπλουτισμένη μαγιά ή άλλα σχετικά προϊόντα ως βασική τροφή, οι οποίες εξελίσσονται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις τροχοζώων/ml, απαιτούν σημαντικές δόσεις τροφής, οπότε και απαιτείται χρησιμοποίηση καθαρού οξυγόνου ώστε η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου να κρατηθεί στα επίπεδα των 5 ως 7 mg/l. 2.5.7 Ποιότητα νερού Η μαζική καλλιέργεια τροχοζώων γίνεται σε μεγάλες πυκνότητες, σε στάσιμους και καλά αεριζόμενους όγκους νερού. Σε τέτοιες συνθήκες συμβαίνουν τα εξής: βαθμιαία συσσώρευση του διοξειδίου του άνθρακα που οδηγεί σε μείωση του ph του νερού, εξαιτίας της αναπνοής των ατόμων του πληθυσμού και των άλλων μικροοργανισμών που συνυπάρχουν με τα τροχόζωα και της διάσπασης της τροφής που δεν καταναλώθηκε, συνεχής άνοδος της αμμωνίας, η οποία κυρίως οφείλεται στον καταβολισμό των τροχοζώων, στην τροφή που δεν καταναλώθηκε και εν μέρει στις θνησιμότητες και στο μεταβολισμό των συνοδευτικών μικροοργανισμών της καλλιέργειας. Η αύξηση της αμμωνίας πέραν ενός ορισμένου ορίου οδηγεί σε σταδιακή μείωση της γονιμότητας των πληθυσμών των τροχοζώων και στην εξαφάνιση του πληθυσμού. Χρειάζεται λοιπόν είτε καθημερινή αντικατάσταση ενός μέρους της καλλιέργειας με ποσότητα νέου νερού είτε συλλογή και συμπύκνωση του συνόλου του πληθυσμού και το ξεκίνημα νέας καλλιέργειας σε νέο νερό. Σε αυτές τις δυο μεθόδους βασίζονται και δυο βασικές τεχνικές παραγωγής των τροχοζώων: 7

η συνεχής καλλιέργεια η οποία συνίσταται στην καθημερινή αντικατάσταση του 25% του όγκου του νερού με ταυτόχρονη συγκομιδή του αντίστοιχου αριθμού των τροχοζώων με προορισμό τη διατροφή των νυμφών και η καλλιέργεια σε παρτίδες (batch) η οποία συνίσταται στην ολική αλλαγή του νερού στο μέγιστο της πληθυσμιακής έκρηξης, μετά βεβαίως την αφαίρεση της ποσότητας των τροχοζώων που προορίζονται για τη διατροφή των νυμφών. Τα τελευταία χρόνια, έχει επικρατήσει η μέθοδος καλλιέργειας σε παρτίδες λόγω της αστάθειας των συνεχών καλλιεργειών, καθώς η αργή, αλλά συνεχής επιβάρυνση τους με παράσιτα έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της γονιμότητάς τους. Αντίθετα, με την εφαρμογή της δεύτερης μεθόδου, όλο το μέσο καλλιέργειας αντικαθίσταται, συνήθως ανά τετραήμερο, και η πληθυσμιακή αύξηση είναι περισσότερο προβλέψιμη και εξασφαλισμένη. Επιπλέον, τα τροχόζωα καλλιεργούνται σε πολύ μεγαλύτερες πυκνότητες (διπλάσιες ως τετραπλάσιες) και έτσι γίνεται καλύτερη αξιοποίηση των διαθέσιμων όγκων. Επίσης, λόγω των ευνοϊκών συνθηκών για την ανάπτυξη ανεπιθύμητων μικροοργανισμών σε αυτού του τύπου καλλιέργειες, πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη φροντίδα για την καθαρότητα του χώρου με συχνούς καθαρισμούς και απολυμάνσεις του εξοπλισμού και των δαπέδων 2.6 Παράσιτα Τα βακτήρια και τα πρωτόζωα επηρεάζουν σημαντικά την αύξηση των καλλιεργούμενων τροχοζώων. Η πυκνότητα σε βακτήρια του μέσου καλλιέργειας των τροχοζώων που διατρέφονται με μαγιά ή συνθετικές τροφές, είναι της τάξης των 10 4 ώς 10 5 βακτηρίδια/ml. Τα βλεφαριδοφόρα παράσιτα μιας καλλιέργειας τροχοζώων αντιπροσωπεύονται κυρίως από τα είδη Uronema sp. και Eupelotes sp. (σχήμα 3). Σχήμα 3. Βλεφαριδοφόρα παράσιτα των καλλιεργειών rotifers. Πάνω αριστερά Uronema sp., κάτω αριστερά Eupelotes sp., δεξιά Vorticella sp. Το Uronema που εμφανίζεται πρώτο δεν αντέχει τον ανταγωνισμό (για βακτηριακό φαγητό) με το Eupelotes και γρήγορα εξαφανίζεται. Η παρουσία του Eupelotes συνοδεύεται με πολύ μεγάλη μείωση της παραγωγικότητας των τροχοζώων. Τέλος, το εδραίο βλεφαριδοφόρο Vorticella εμφανίζεται συνήθως δυο μήνες μετά την έναρξη των καλλιεργειών και γίνεται αντιληπτό από την προσκόλλησή του με μίσχο σε αιωρούμενα συσσωματώματα ή στην επιφάνεια των τροχοζώων. Η παρουσία του συνδέεται με 8

την επιδείνωση της ποιότητας του μέσου καλλιέργειας, αλλά το ίδιο το παράσιτο δε θεωρείται ως αιτία του φαινομένου. 2.7 Συνοπτική παρουσίαση των κυριότερων βιολογικών χαρακτηριστικών των τροχοζώων Στον πίνακα Α παρουσιάζονται τα βιολογικά χαρακτηριστικά των τροχοζώων που χρησιμοποιούνται στις νυμφικές καλλιέργειες των θαλασσινών ειδών ψαριών. Πίνακας Α. Συστηματική κατάταξη και βιολογικά χαρακτηριστικά των τροχοζώων Brachionus plicatilis σε καλλιέργειες. Φύλο Κλάση Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος L-τύπου τροχόζωο (Brachionus plicatilis typicus) Rotifera Monogononta Plioma Brachionidae Brachionus Brachionus plicatilis S- τύπου τροχόζωο (Brachionus plicatilis rotundiformis) Μέγεθος 220 ώς 300 μm 95 ώς 160 μm Βάρος 0,33μg 0,22μg Βέλτιστες θερμοκρασίες 18 ώς 22 o C 30 ώς 35 o C Όρια ανοχής 5 ώς 25 o C 15 ώς 35 o C Όγκος: (a=μήκος) V=0,12a 3 Μέγιστο μέγεθος σωματιδίων τροφής (tm): tm = 0,09a -0,033 Διάρκεια ζωής και αριθμός παραγομένων αβγών ανά θερμοκρασία (περίπτωση L-type τροχοζώων) 15 o C 15 ημέρες 23 αβγά 20 o C 10 ημέρες 23 αβγά 25 o C 7 ώς10 19 ώς 23 ημέρες αβγά Όρια ανοχής ph : Μεταξύ 5 και 9 Όρια N.NH 3,4 : Διαλυμένο στο νερό οξυγόνο: LC 50 = 17 mg/l μεταξύ 5 και 7 mg/l όταν τρέφονται με μικροφύκη μπορούν να ανεχθούν ώς 2 mg/l όταν τρέφονται με συνθετική τροφή μπορούν να ανεχθούν πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις για μερικές ώρες 9

3 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ HIRATA, H., 1974. An attempt to apply an experimental micro cosm for the mass culture of marine rotifer Brachionus plicatilis MULLER. MEM. Fac. Fish Kagoshina univ. vol 23: 163-172 HIRΑΥΑΜΑ, Κ., 1985. Biological aspects of the rotifer Brachionus plicatilis as a food organism for mass culture of seedling. International rotifer symposium, Edinburgh, August 1985 HIRΑΥΑΜΑ, Κ., 1987. A consideration of why mass culture of the rotifer Brachionus plicatilis with Baker s yeast is unstable. Hydrobiologia 147: 269-270 MAEDA, M.,1991. Environmental Management for Mass Culture of the rotifer, Brachionus plicatilis. In Rotifer and Microalgae Culture Systems. Proceedings of a U.S.-Asia Workshop. Honolulu, HI, 1991. The Oceanic Institute Eds: 125-133 PAPAKOSTAS S., S.DOOMS, A.TRIANTAFYLLIDIS, D.DELOOF, I.KAPPAS, K.DIERCKENS, T.DE WOLF, P.BOSSIER, O.VADSTEIN, S.KUI, P.SORGELOOS & ABATZOPOULOS T.J., 2006. Evaluation of DNA methodologies in identifying Brachionus species used in European hatcheries. Aquaculture 255 (2006) 557 564 POISSON, F., 1990. Biology et état actuel des techniques de production de masse des rotifères du gendre Brachionus. Thèse pour l obtention de D.E.S., Académie de Montpellier, Université des Sciences et Techniques du Languedoc. 102p SUANTIKA G., P.DHERT, M.NURHUDAH & SORGELOOS P., 2000. High-density production of the rotifer Brachionus plicatilis in a recirculation system: consideration of water quality, zootechnical and nutritional aspects. Aquaculture Engineering 21 (2000) 201-214 YU, J.P. & K. HIRAYAMA, 1986. The effect of un-ionized ammonia on the population growth of the rotifer in mass culture. Bull. Jap. Soc. Of Sci. fish. 52 (9): 1509-1513 10