9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος Ι ΜΕΛΕΤΗ ΠΟΛΥΚΥΚΛΙΚΩΝ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΩΝ ΣΕ ΠΑΡΑΚΤΙΟΥΣ οργανοϊζηματογενεις ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥΣ Ντίλη Ν., Τριανταφυλλάκη Σ., Πετροχείλου Μ., Λαδάκης Μ., Δασενάκης Μ. Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, nikidil@hotmail.com, stellatriant@yahoo.co.uk, mpetrochil@yahoo.com, manosladakis@yahoo.com, edasenak@chem.uoa.gr Περίληψη Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων (ΠΑΥ), σε δείγματα οργανοϊζηματογενών σχηματισμών. Η μέθοδος η οποία χρησιμοποιήθηκε για την παραλαβή των ΠΑΥ από τα ιζήματα ήταν η εκχύλιση με συσκευή Soxhlet, ακολουθούμενη από καθαρισμό με χρωματογραφία προσρόφησης με silica gel και παραλαβή με διάλυμα n-c 6 : CH 2. Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός έγινε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), με ανιχνευτή φωτοδιόδων (PDA) και φθορισμομετρικό ανιχνευτή (FLD). Γενικά οι συγκεντρώσεις των ΠΑΥ είναι μεγαλύτερες τους χειμερινούς μήνες, ενώ ανάμεσα στις τρεις στιβάδες των σχηματισμών, αυτή με τις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις είναι το υπόστρωμα. Λέξεις κλειδιά: ΠΑΥ, Soxhlet, HPLC, FLD. DETERMINATION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS IN COASTAL ORGANOSEDIMENTARY FORMS Ntili N., Triantafyllaki S., Petrochilou M., Ladakis M., Dassenakis M. Chemistry Dptm, National and Kapodistrian University of Athens, edasenak@chem.uoa.gr, nikidil@hotmail.com, stellatriant@yahoo.co.uk, mpetrochil@yahoo.com, manosladakis@yahoo.com, edasenak@chem.uoa.gr Abstract The aim of this work was the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in organosedimentary forms. The technique used for the analysis of PAHs in the sediment samples was Soxhlet extraction, followed by silica gel clean-up and finally elution with n-c 6 : CH 2. The samples were analyzed by High Performance Liquid Chromatography with photodiode array and fluorescence detectors (HPLC PDA/FLD). Generally, the concentrations of PAHs were higher during the winter. Moreover, from the three layers of organosedimentary forms analysed, the sublayer contained the highest concentrations of PAHs. Keywords: PAH, Soxhlet, HPLC, FLD. 1. Εισαγωγή Οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες (ΠΑΥ) είναι οργανικές ενώσεις μεγάλου περιβαλλοντικού ενδιαφέροντος εξαιτίας της καρκινογόνου και μεταλλαξιογόνου δράσης τους και της συχνότητας με την οποία εμφανίζονται στο περιβάλλον. Προέρχονται από φυσικές πηγές (πυρκαγιές δασών, εκρήξεις ηφαιστείων) και ανθρώπινες δραστηριότητες (ατελής καύση ορυκτών καυσίμων, παραγωγή κωκ, βιομηχανικές διεργασίες, οχήματα). 16 από τις παραπάνω ενώσεις περιλαμβάνονται από την EPA (US Environmental Protection Agency) στη λίστα των κυριότερων ρύπων. (EPA 1996, UNEP/WHO 1995). Στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν οι 16 αυτοί ΠΑΥ σε παράκτιους οργανοϊζηματογενείς σχηματισμούς οι οποίοι παρατηρούνται ορισμένες φορές σε παράκτια περιβάλλοντα με αβαθή ήρεμα και θερμά νερά. Οι οργανοϊζηματογενείς αυτές δομές προέρχονται από παγίδευση ή/ και συγκόλληση καθιζάνοντος λεπτόκοκκου υλικού λόγω της ανάπτυξης και μεταβολικής δραστηριότητας φωτοσυνθετικών μικροοργανισμών, κυρίως κυανοβακτηρίων. Η επαναλαμβανόμενη αυτή διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας στιβάδας που αποτελείται -245-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume Ι από επάλληλες στρώσεις κυανοβακτηρίων συνολικού πάχους της τάξης των χιλιοστών του μέτρου. Κάτω από τη στιβάδα αυτή, επικρατούν ανοξικές συνθήκες λόγω έλλειψης οξυγόνου και αποσύνθεσης παλαιοτέρων στιβάδων κυανοβακτηρίων. Η υποκείμενη αυτή στιβάδα έχει πάχος περί τα 5 cm, είναι μαύρου χρώματος και έχει έντονη οσμή υδροθείου. Η τρίτη στιβάδα είναι το υπόστρωμα, το οποίο αποτελεί το υπόβαθρο του ιζήματος. (Λεοντάρης, 1992) (Εικ. 1). Εικ. 1: Η δομή των οργανοϊζηματογενών σχηματισμών. 2. Μεθοδολογία 2.1 ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΕΣ Δειγματοληψίες έγιναν τη θερινή και χειμερινή περίοδο στην Αττική, στις περιοχές Άγιος Νικόλαος Αναβύσσου και Μαρίκες Ραφήνας και στο νομό Λασιθίου, στις περιοχές Καραβόπετρα Σητείας (Κρητικό πέλαγος) και Μαύρος Κόλυμπος Ιεράπετρας (Λιβυκό πέλαγος). Οι παραπάνω περιγραφέντες οργανοϊζηματογενείς σχηματισμοί εντοπίζονται επί των ακτολίθων των περιοχών αυτών. Τα δείγματα, συλλέχθηκαν προσεκτικά με σπάτουλα έτσι ώστε να μην διαταραχθεί η στρωμάτωση και ακολούθησε διαχωρισμός των στιβάδων με τη βοήθεια νυστεριού. Τα διαχωρισμένα δείγματα τοποθετήθηκαν στην κατάψυξη για να λυοφιλοποιηθούν στη συνέχεια. 2.2 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΤΩΝ ΠΑΥ Η εκχύλιση των ΠΑΥ έγινε με τη βοήθεια συσκευής Soxhlet. Χρησιμοποιήθηκαν 2gr από κάθε δείγμα και η εκχύλιση έγινε με 150ml CH 2 : 50ml n-c 6. Πριν την εκχύλιση προστέθηκε γνωστή ποσότητα 6-μεθυλοχρυσενίου, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. Η εκχύλιση διαρκούσε 16 20 ώρες. Στο εκχύλισμα έγινε αλλαγή του διαλύτη σε n-c 6 και συμπύκνωση στο 0,5ml περίπου με τη χρήση περιστροφικού συμπυκνωτήρα. Ο καθαρισμός του δείγματος πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία προσρόφησης, με 3gr silica gel 60 (0,063 0,200mm). Αρχικά, έγινε έκπλυση του δείγματος με 10ml n-c 6, ενώ η παραλαβή των ΠΑΥ από τη στήλη έγινε με διάλυμα n-c 6 : CH 2 1:1, οπότε και τελικά παρελήφθησαν 7ml διαλύματος. Τέλος, το εκχύλισμα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού σε ήπιο ρεύμα αζώτου και οι ΠΑΥ επαναδιαλυτοποιήθηκαν με 300μl ακετονιτριλίου HPLC. Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν n-εξάνιο, διχλωρομεθάνιο και ακετονιτρίλιο HPLC. (EPA Method 3630C, Chen et al., 2004, Martinez et al., 2004, Song et al., 2002). -246-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος Ι 2.3 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), με ανιχνευτή φωτοδιόδων (PDA) και φθορισμομετρικό ανιχνευτή (FLD). Με τον ανιχνευτή φωτοδιόδων έγινε κυρίως ο ποιοτικός προσδιορισμός των ΠΑΥ στο δείγμα, ενώ για τον ποσοτικό προσδιορισμό χρησιμοποιήθηκε κυρίως ο φθορισμομετρικός ανιχνευτής, λόγω λιγότερων παρεμποδίσεων. Για το διαχωρισμό, εφαρμόστηκε ισοκρατική έκλουση (με ακετονιτρίλιο και νερό HPLC) και χρονικός προγραμματισμός μήκους κύματος φθορισμού. Σχεδιάστηκαν καμπύλες αναφοράς για κάθε προσδιοριζόμενη ουσία, ενώ η διόρθωση των αποτελεσμάτων ως προς το ποσοστό ανάκτησης έγινε με τη βοήθεια εσωτερικού προτύπου, του 6-μεθυλοχρυσενίου. (Miege et al., 2003, Rodriguez et al., 2000, Telli-Karakoc et al., 2002). Οι 16 ΠΑΥ οι οποίοι προσδιορίστηκαν είναι οι: ακεναφθένιο (ace), ακεναφθυλένιο (acy), ανθρακένιο (ant), βενζο(a)ανθρακένιο (baa), βενζο(g,h,i)περυλένιο (bzp), βενζο(a)πυρένιο (bap), βενζο(b) φλουορανθένιο (bbf), βενζο(k)φλουορανθένιο (bkf), διβένζο(a,h)ανθρακένιο (dba), ινδενο(1,2,3-cd) πυρένιο (ind), ναφθαλένιο (nap), πυρένιο (pyr), φαινανθρένιο (phe), φλουορανθένιο (flu), φλουορένιο (fla) και χρυσένιο (chr). Ο μόνος ΠΑΥ που δεν ανιχνεύτηκε με το φθορισμομετρικό ανιχνευτή ήταν το ακεναφθυλένιο, το οποίο φθορίζει ελάχιστα. Τα όρια ανίχνευσης του φθορισμομετρικού ανιχνευτή κυμαίνονται από 1,6 ng/ml, τιμή που αντιστοιχεί στο βενζο[k]φλουορανθένιο, μέχρι 2,9 ng/ml, τιμή που αντιστοιχεί στο ινδενο[1,2,3-cd] πυρένιο. 3. Αποτελέσματα Παρακάτω δίδονται πίνακες με τις ελάχιστες και τις μέγιστες τιμές των 16 ΠΑΥ που βρέθηκαν στις περιοχές δειγματοληψίας σε κάθε στιβάδα κατά τη διάρκεια ενός έτους (Πίν. 1, Πίν. 2), όπου το όριο ανίχνευσης αναφέρεται ως LOD και το όριο ποσοτικοποίησης ως LOQ. Πίνακας 1: Ελάχιστες και μέγιστες συγκεντρώσεις (ppb) κατά τη διάρκεια ενός έτους στις τρεις στιβάδες. ΠΑΥ Ανάβυσσος Ραφήνα (θερινή περίοδος) επιφανειακή ανοξική υπόστρωμα επιφανειακή ανοξική υπόστρωμα nap <LOD <LOD <LOD-14,4 <LOD <LOD <LOD acy <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD flu <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD ace 3,0-20,7 <LOD-14,3 <LOD-7,6 4,5 3,1 1,4 phe 10,4-76,4 7,8-67,4 7,4-30,1 9,8 9,3 14,3 ant <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD fla <LOD-6,6 6,2-53,0 5,9-9,3 6,7 6,8 10,2 pyr 8,4-10,5 7,3-48,0 7,1-8,3 6,7 6,7 7,1 baa <LOD-1,4 1,5-9,1 <LOQ-2,4 1,8 1,3 2,1 chr <LOD-6,1 <LOD-5,9 <LOD-8,7 4,1 1,5 7,2 bbf <LOD-1,5 <LOD-1,3 1,4-2,8 2,3 2,9 2,8 bkf <LOD-1,3 1,3-13,1 <LOD-1,5 1,4 1,6 2,6 bap 1,6-2,1 1,7-6,5 <LOD-1,4 1,5 1,8 3,2 dba <LOQ <LOD-1,2 <LOD <LOD <LOQ <LOD ind 3,9-4,8 4,6-8,2 <LOD-2,9 10,0 4,5 9,2 bzp <LOD-2,7 2,2-10,6 3,6-4,1 4,0 4,6 5,7-247-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume Ι Πίνακας 2: Ελάχιστες και μέγιστες συγκεντρώσεις (ppb) κατά τη διάρκεια ενός έτους στις τρεις στιβάδες. ΠΑΥ Καραβόπετρα Μαύρος Κόλυμπος επιφανειακή ανοξική υπόστρωμα επιφανειακή ανοξική υπόστρωμα nap <LOD-1,7 3,2-6,4 <LOD-3,4 <LOD <LOD-1,4 <LOD-4,8 acy <LOD-40,9 <LOD-17,6 <LOD <LOD <LOD <LOD-10,0 flu <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD ace 2,1-4,9 2,7-20,6 <LOD-2,8 4,5-4,8 3,5-10,6 1,5-6,1 phe 12,6-13,5 11,0-11,9 <LOD-17,3 15,9-23,1 14,6-18,8 20,1-30,5 ant <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD fla 6,6-7,2 6,4-6,8 <LOD-6,9 9,2-21,8 10,7-36,5 5,4-52,8 pyr 5,9-6,9 5,4-10,9 <LOD-6,4 6,8-12,1 7,2-21,6 3,5-27,5 baa <LOQ <LOD <LOD 1,0-1,9 <LOD-4,1 <LOD-3,6 chr <LOD <LOQ <LOD 3,3-5,7 17,2-25,5 <LOD-66,6 bbf <LOQ <LOQ <LOD <LOD-2,1 3,5-7,5 1,2-21,3 bkf <LOD-1,0 <LOQ <LOQ <LOD-1,6 1,8-3,5 1,0-10,8 bap 0,7-1,1 <LOQ <LOD 0,8-1,5 1,1-2,2 0,8-4,4 dba <LOQ <LOQ <LOD <LOD <LOQ <LOD-0,9 ind <LOD <LOQ <LOD 1,8-1,8 2,7-5,2 <LOD-7,4 bzp <LOQ <LOQ <LOQ 1,6-2,9 2,7-4,0 1,3-8,9 4. Συμπεράσματα - Συζήτηση Οι ΠΑΥ είναι ενώσεις που επηρεάζονται σε πολύ μεγάλο βαθμό από τις καιρικές συνθήκες και από την ύπαρξη μικροοργανισμών. Οι κύριες διεργασίες που οδηγούν στην απομάκρυνσή τους από την υδάτινη στήλη είναι η φωτόλυση, η εξάτμιση, η υδρόλυση, η βιοαποδόμηση, η βιοσυσσώρευση, η φωτοοξείδωση, η προσρόφηση στα αιωρούμενα σωματίδια και η καταβύθιση αυτών στο ίζημα. Κάθε μια από τις παραπάνω διεργασίες επιδρά με διαφορετικό βαθμό σε κάθε ΠΑΥ. Σε γενικές γραμμές, οι μικρού μοριακού βάρους ΠΑΥ, δηλαδή αυτοί με τον μικρότερο αριθμό δακτυλίων, φωτολύονται ευκολότερα από τους μεγαλύτερους, ενώ οι δεύτεροι προσροφώνται ισχυρότερα στα αιωρούμενα σωματίδια, τους μικροοργανισμούς και τα ιζήματα. (Neff, 1979, ATSDR, 1995). Τοιουτοτρόπως, στα ιζήματα που μελετήθηκαν ανιχνεύτηκαν κυρίως οι μεσαίου και μεγαλύτερου μοριακού βάρους ΠΑΥ, αφού οι μικρότεροι παραμένουν στο νερό όπου κατά ένα μεγάλο βαθμό φωτολύονται, βιοαποδομούνται ή και εξατμίζονται. Περαιτέρω, από τις τρεις στιβάδες των σχηματισμών, αυτή που παρουσίασε τις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις ΠΑΥ είναι το υπόστρωμα. Η στιβάδα αυτή είναι η λιγότερο εκτεθειμένη, άρα και αυτή που επηρεάζεται λιγότερο από τις καιρικές συνθήκες. Οι μικρότερες συγκεντρώσεις γενικά εμφανίζονται στην επιφανειακή στιβάδα, παρά το ότι αυτή επηρεάζεται άμεσα από τη θαλάσσια ρύπανση, αφού εκεί λαμβάνει χώρα η φωτοδιάσπαση και η επαναδιαλυτοποίηση των ΠΑΥ στο νερό. Στην Εικόνα 2 1 παρουσιάζεται η κατανομή των ΠΑΥ στις στιβάδες του οργανοϊζηματογενούς σχηματισμού της περιοχής της Ραφήνας, στη δειγματοληψία του Αυγούστου. -248-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος Ι Εικ. 2: Κατανομή των ΠΑΥ στις τρεις στιβάδες του οργανοϊζηματογενούς σχηματισμού. Στην Εικόνα 3 παρουσιάζονται οι συγκεντρώσεις των ΠΑΥ στην επιφανειακή στιβάδα των οργανοϊζηματογενών σχηματισμών της περιοχής του Μαύρου Κόλυμπου, τη θερινή και τη χειμερινή περίοδο. Όπως ήταν αναμενόμενο, τη θερινή περίοδο οι συγκεντρώσεις ήταν γενικά μικρότερες, λόγω αυξημένης ηλιοφάνειας και θερμοκρασίας. Εικ. 3: Συγκεντρώσεις των ΠΑΥ στην επιφανειακή στιβάδα των δειγμάτων του Μαύρου Κόλυμπου τη θερινή και τη χειμερινή περίοδο. Παράλληλα με τα ιζήματα, προσδιορισμοί τον ΠΑΥ έγιναν, για συγκριτικούς λόγους, και στο θαλασσινό νερό των περιοχών που μελετήθηκαν. Στα δείγματα αυτά βρέθηκαν πολύ μικρές συγκεντρώσεις (της τάξης των ppt) των ΠΑΥ μικρού και μεσαίου μοριακού βάρους το χειμώνα, ενώ οι συγκεντρώσεις ήταν ακόμα μικρότερες το καλακαίρι. (Ντίλη, 2006). Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει την άποψη ότι οι οργανοϊζηματογενείς σχηματισμοί συσσωρεύ- -249-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume Ι ουν τους ΠΑΥ μεσαίου και μεγάλου μοριακού βάρους, αφού αυτοί προσροφώνται ευκολότερα στα αιωρούμενα σωματίδια και καταβυθίζονται στο ίζημα. 5. Ευχαριστίες Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο και Εθνικούς Πόρους (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές ATSDR, 1995. Agency for Toxic Substances and Disease Registry, Department of Health & Human Services, Toxicological Profile for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Chen, B., Xuan, X, Zhu, L., Wang, J., Gao, Y., Yang, K., Shen, X. & Lou, B., 2004. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in surface waters, sediments and soils of Hangzhoo City, China. Water Research 38: 3558-3568. EPA METHOD 3630C, Dec. 1996. Silica Gel Cleanup, Revision 3. Martinez, E.,Gros, M., Lacorte, S. & Barcelo, D., 2004. Simplified procedures for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water, sediments and mussels. Journal of Chromatography A, 1047: 181-188. Miege, C., Dugay, J. & Hennion, M.C., 2003. Optimization, validation and comparison of various extraction techniques for the trace determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in sewage sludges by liquid chromatography coupled to diode-array and fluorescence detection. Journal of Chromatography A, 995: 87-97. Neff, J.M., 1979. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in the Aquatic Environment: Sources, Fates and Biological Effects. Applied Science Publishers Ltd., Essex, England. 262 p. Rodriguez, J.J.S. & Sanz, C.P., 2000. Fluorescence techniques for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in marine environment: an overview. Analysis, 28, N 8, EDP Sciences, Viley-VCH. Song, Y.F., Jing, X., Fleischmann, S. & Wilke, B.-M., 2002. Comparative study of extraction methods for the determination of PAHs from contaminated soils and sediments. Chemosphere 48 (2002) 993 1001. Telli-Karakoc, F., Tolun, L., Henkelmann, B., Klimm, C., Okay, O. & Schramm, K.W., 2002. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and polychlorinated diphenyls (PCBs) distributions in the Bay of Marmara Sea: Izmit Bay. Environmental Pollution 119: 383-397. UNEP/WHO, 1995. Assessment of the state of pollution in the Mediterranean Sea by carcinogenic, mutagenic and teratogenic substances. MAP Technical Reports Series No. 92. UNEP, Athens, 238 pp. Λεοντάρης, Σ.Ν., 1992. Εισαγωγή στην ωκεανογραφία, Αθήνα. Ντίλη, Ν., 2006. Μελέτη Πολυκυκλικών Αρωματικών Υδρογονανθράκων σε παράκτιους οργανοϊζηματογενείς σχηματισμούς με τη χρήση χρωματογραφικών τεχνικών, Ερευνητική εργασία διπλώματος ειδίκευσης, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα. -250-