artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο

Ιανουάριος 2012 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο Εκδοση 1 24 (Αρ.Καταλόγου 4555263) 96 (Αρ.Καταλόγου 4555265) Διαγνωστικό προïόν in vitro ποσοτικού προσδιορισμού Για τη χρήση με όργανα Rotor-Gene Q 4555263, 4555265 1046960EL QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden R3 1046960EL Sample & Assay Technologies

Τεχνολογίες δείγματος και ανάλυσης της QIAGEN Η QIAGEN είναι ο πρωτεύων προμηθευτής τεχνολογιών δειγμάτων και εξετάσεων όσον αφορά την απομόνωση και ανάλυση κάθε βιολογικού δείγματος. Τα υψηλής ποιότητας προϊόντα μας και η άριστη εξυπηρέτηση εξασφαλίζουν επιτυχία από την προετοιμασία του δείγματος μέχρι τα αποτελέσματα. Η QIAGEN θέτει πρότυπα για: Απομόνωση του DNA, RNA και πρωτεϊνών Συστήματα εξετάσεων για νουκλεϊνικά οξέα και πρωτεΐνες Ερευνα microrna και RNAi Αυτοματοποίηση τεχνολογίας δειγμάτων και εξετάσεων Σκοπός μας είναι να σας δοθεί η δυνατότητα να έχετε έξοχες επιτυχίες και σημαντικές ανακαλύψεις. Για περισσότερες πληροφορίες επισκευθείτε την ιστοσελίδα www.qiagen.com.

Περιεχόμενα Περιεχόμενα του κιτ 4 Σύμβολα 4 Αποθήκευση 5 Προοριζόμενη χρήση 5 Περιορισμοί χρήσης προїόντος 5 Ποιοτικός έλεγχος 6 Πληροφορίες ασφάλειας 6 Εισαγωγή 7 Αρχή 7 Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες 7 Ειδικά χαρακτηριστικά 8 Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια 15 Σημαντικές σημειώσεις 16 Γενικά μέτρα ασφάλειας 16 Απομόνωση DNA 16 Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου 20 Ποσοτικοποίηση 20 Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση 22 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 32 Παραπομπές 35 Πληροφορίες παραγγελιών 36 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 3

Περιεχόμενα του κιτ artus M. tuberculosis RG PCR Kit (24) (96) Αρ. καταλόγου 4555263 4555265 Αριθμός αντιδράσεων 24 96 Μπλε M. tuberculosis RG Master 2 x 12 αντιδράσεις 8 x 12 αντιδράσεις Κίτρινο M. tuberculosis Mg-Sol* 400 µl 400 µl Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο M. tuberculosis RG/TM QS 1 (3 x 10 4 αντίγραφα/µl) M. tuberculosis RG/TM QS 2 (3 x 10 3 αντίγραφα/µl) M. tuberculosis RG/TM QS 3 (3 x 10 2 αντίγραφα/µl) M. tuberculosis RG/TM QS 4 (3 x 10 1 αντίγραφα/µl) 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Πράσινο M. tuberculosis IC 1000 µl 2 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1000 µl 1000 µl Εγχειρίδιο 1 1 * Διάλυμα μαγνησίου. Πρότυπο ποσοτικοποίησης. Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. Σύμβολα <N> Περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για <Ν> δοκιμασίες Ημερομηνία λήξης Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας 4 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Αριθμός υλικού Συστατικά Περιεχόμενα Αριθμός Περιορισμός θερμοκρασίας Κατασκευαστής Συμβουλευθείτε τις οδηγίες χρήσης Σημαντικές οδηγίες Αποθήκευση Τα υλικά του artus M. tuberculosis RG PCR Kit αποθηκεύονται στους -20 C και διατηρούνται μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναφέρεται στην ετικέττα. Επαναληπτική απόψυξη/ψύξη (>2x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί με τον τρόπο αυτό μειώνεται η ευαισθησία. Εάν τα αντιδραστήρια δεν χρησιμοποιούνται τακτικά, θα πρέπει να γίνεται επιμερισμός τους. Αποθήκευση στους 2 8 C δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. Προοριζόμενη χρήση Το artus M. tuberculosis RG PCR Kit είναι ένα σύστημα πολλαπλασιασμού νουκλεϊνικών οξέων in vitro για την ανίχνευση όλων των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. pinnipedii) σε δείγματα πτυέλου, BΚΕ, βρογχιακού εκκρίματος, ΕΝΥ, γαστρικού υγρού, υγρού περιτοναïκής παρακέντησης ανθρώπου. Το διαγνωστικό αυτό κιτ εξέτασης χρησιμοποιεί την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και είναι διαμορφωμένο για τη χρήση με τα όργανα Rotor-Gene Q. Περιορισμοί χρήσης προїόντος Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για διαγνωστικούς σκοπούς in vitro. Η χρήση πρέπει να γίνεται από ειδικά εκπαιδευμένο και καταρτισμένο προσωπικό στις διαγνωστικές διαδικασίες in vitro. Η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου είναι απολύτως απαραίτητη, για την επίτευξη άριστων αποτελεσμάτων της PCR. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 5

Προσοχή στις ημερομηνίες λήξης που αναγράφονται στη συσκευασία και στις ετικέττες των επιμέρους στοιχείων. Τα αντιδραστήρια των οποίων έχει παρέλθει η ημερομηνία λήξης δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αν και σπάνιες, οι μεταλλάξεις εντός των εξαιρετικά συντηρημένων περιοχών του βακτηριακού γονιδιώματος που καλύπτονται από τους εκκινητές και/ή τον ανιχνευτή του κιτ μπορούν να έχουν ως αποτέλεσμα χαμηλότερες ποσοτικές τιμές ή αδυναμία ανίχνευσης των βακτηρίων σε αυτές τις περιπτώσεις. Η εγκυρότητα και η απόδοση της σχεδίασης του προσδιορισμού αναθεωρούνται ανά τακτά διαστήματα. Ποιοτικός έλεγχος Σύμφωνα με το σύστημα πιστοποιητικού ποιοτικής διαχείρησης ISO της QIAGEN, ελέγχεται κάθε παρτίδα του artus M. tuberculosis RG PCR Kit υπό καθορισμένα κριτήρια ελέγχου, για την εξασφάλιση μιας ομοιόμορφης ποιότητας του προϊόντος. Πληροφορίες ασφάλειας Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs). Στην επιγραμμική συλλογή μας των φυλλαδίων δεδομένων ασφάλειας, στην ιστοσελίδα www.qiagen.com/support/msds.aspx μπορείτε να βρείτε για κάθε κιτ και κάθε περιεχόμενο του κιτ το εκάστοτε MSDS ως PDF αρχείο, το οποίο μπορείτε να διαβάζετε και να εκτυπώνετε. Καταστρέψτε τα απορρίματα δειγμάτων και ανάλυσης σύμφωνα με τους κανονισμούς σας ασφάλειας. Κλήση κινδύνου σε 24ωρη βάση Σε περίπτωση κινδύνου μπορείτε να πάρετε ιατρικές πληροφορίες όλο το 24ωρο στην αγγλική, γαλλική και γερμανική γλώσσα: Κέντρο πληροφοριών δηλητηριάσεων στο Mainz, Γερμανία Tel: +49-6131-19240 6 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Εισαγωγή To artus M. tuberculosis RG PCR Kit είναι ένα σύστημα έτοιμο προς χρήση για την ανίχνευση όλων των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti, M. pinnipedii) μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στα όργανα Rotor-Gene Q. To M. tuberculosis RG Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυμα για τον ειδικό πολλαπλασιασμό ενός τμήματος μεγέθους 159 bp, του μυκοβακτηριδιακού γονιδιώματος, καθώς και για την άμεση ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασμού στο κανάλι φθορισμού Cycling Green του Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.FAM του Rotor-Gene 3000. Πέραν αυτού, το artus M. tuberculosis RG PCR Kit περιέχει, για την ανίχνευση μιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστημα πολλαπλασιασμού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Yellow του Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q ή του Rotor-Gene 6000 ή στο κανάλι φθορισμού Cycling A.JOE του Rotor-Gene 3000. Το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis δεν επηρεάζεται αρνητικά (βλέπε Αναλυτική ευαισθησία, σελίδα 8). Μαζί παρέχονται εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4), με τη βοήθεια των οποίων μπορεί να πραγματοποιηθεί προσδιορισμός της ποσότητας του του παθογόνου παράγοντα. Ανατρέξτε σχετικά στην ενότητα Ποσοτικοποίηση, σελίδα 20. Αρχή Η διάγνωση παθογόνων οργανισμών με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεμένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασμού της PCR. Η μέτρηση των εντάσεων φθορισμού, κατά την εξέλιξη της PCR (που σημαίνει πραγματικού χρόνου), επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγμάτων μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης PCR.* Πληροφορίες σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες Η φυματίωση (ΤΒ) είναι, όπως παλιά, μία από τις σοβαρότερες μολυσματικές ασθένειες του κόσμου. Υπολογίζεται ότι περίπου δύο δισεκατομμύρια άνθρωποι, το ένα τρίτο του πληθυσμού της γης, έχει μολυνθεί με το Mycobacterium tuberculosis, τον παθογόνο παράγοντα της φυματίωσης. Κάθε χρόνο αναφέρονται περισσότερες από οκτώ εκατομμύρια νέες μολύνσεις και περίπου τρία εκατομμύρια θάνατοι. Η ασθένεια πλήττει κυρίως τις χώρες του τρίτου κόσμου ωστόσο και στις βιομηχανικές χώρες η φυματίωση έχει αρχίσει να ανακάμπτει λόγω της ανάπτυξης ανθεκτικών στελεχών και των εισαγομένων μολύνσεων. Οι ιδιαίτερα ευπαθείς ομάδες είναι οι άστεγοι, τα εξαρτημένα άτομα και τα άτομα με εξασθενημένο ανοσοποιητικό σύστημα. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 7

Η φυματίωση είναι μία χρόνια μολυσματική ασθένεια με κυκλική πορεία. Στο αρχικό στάδιο, η μόλυνση προσβάλλει κατά κύριο λόγο περιοχές των πνευμόνων και τα αντίστοιχα λεμφογάγγλια. Ωστόσο, ανάλογα με την ανοσολογική κατάσταση του ασθενούς ενδέχεται να πραγματοποιηθεί εγκατάσταση του Mycobacterium tuberculosis και σε άλλα όργανα. Η μετάδοση των παθογόνων παραγόντων γίνεται μέσω αερολυμάτων, μολονότι ένας κίνδυνος μετάδοσης υπάρχει μόνο από πρόσωπα με ανοικτή φυματίωση. Μία εξασθένηση της άμυνας του οργανισμού του πάσχοντος ενδέχεται να προκαλέσει επανενεργοποίηση του παθογόνου παράγοντα, ακόμη και μετά από σειρά ετών (μεταπρωτοπαθής φυματίωση). Ειδικά χαρακτηριστικά Αναλυτική ευαισθησία Για τον προσδιορισμό της αναλυτικής ευαισθησίας του artus M. tuberculosis RG PCR Kit δημιουργήθηκε μία πρότυπη σειρά αραιώσεων από 10 ως την ονομαστική τιμή 0,003 ισοδύναμα αντιγράφων/µl του M. tuberculosis και αναλύθηκε στο Rotor- Gene 6000 και Rotor-Gene 3000, αντίστοιχα, σε συνδυασμό με το artus M. tuberculosis RG PCR Kit. Οι έλεγχοι εκτελέσθηκαν σε τρεις διαφορετικές ημέρες με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η εξαγωγή του αποτελέσματος έγινε με τη βοήθεια ανάλυσης probit. Η γραφική της αξιολόγηση στο Rotor-Gene 6000 εμφανίζεται στην Εικόνα 1. Το αναλυτικό όριο ανίχνευσης του artus M. tuberculosis RG PCR Kit σε συνδυασμό με το the Rotor-Gene Q MDx/Q/6000 και το Rotor-Gene 3000 είναι 0,23 αντίγραφα/µl (p = 0,05) και 0,9 αντίγραφα/µl (p = 0,05), αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι 0,23 αντίγραφα/µl ή 0,9 αντίγραφα/µl μπορούν να ανιχνευθούν με πιθανότητα 95%. Εικόνα 1. Ανάλυση probit: M. tuberculosis (Rotor-Gene 6000). Αναλυτική ευαισθησία του artus M. tuberculosis RG PCR Kit σε συνδυασμό με το Rotor-Gene 6000. 8 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Ειδικότητα Η ειδικότητα του artus M. tuberculosis RG PCR Kit εξασφαλίζεται κατά κύριο λόγο με την επιλογή των εκκινητών και των ανιχνευτών καθώς και με την επιλογή αυστηρών συνθηκών αντίδρασης. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές έχουν ελεγχθεί με βάση την ανάλυση σύγκρισης αλληλουχίας, όσον αφορά τυχόν ομολογίες με άλλες αλληλουχίες αναφερόμενες σε τράπεζες γονιδίων. Με αυτόν τον τρόπο έχει ελεγχθεί και η δυνατότητα ανίχνευσης όλων των μελών του συμπλέγματος M. tuberculosis. Η εγκυρότητα της ειδικότητας αξιολογήθηκε με τη χρήση 90 διαφορετικών δειγμάτων (30 πτυέλου, 30 ΒΚΕ και 30 βρογχιακού εκκρίματος), τα οποία ήταν αρνητικά στον σύμπλεγμα M. tuberculosis. Αυτά δεν εμφάνισαν κανένα σήμα με τους ειδικούς για σύμπλεγμα M. tuberculosis εκκινητές και ανιχνευτές που περιέχονται στο M. tuberculosis RG Master. Για τον καθορισμό της ειδικότητας του artus M. tuberculosis RG PCR Kit, εξετάστηκαν οι ομάδες ελέγχου που αναφέρεται στον Πίνακα 1, για διασταυρωμένη αντίδραση. Κανένας από τους εξεταζόμενους παθογόνους παράγοντες δεν προκάλεσε αντίδραση. Πίνακας 1. Ειδικός έλεγχος του κιτ με δυνητικά διασταυρωμένης αντίδρασης παθογόνους παράγοντες Πρότυπο Ομάδα ελέγχου M. tuberculosis (Cycling Green ή Cycling A.FAM)) εσωτερικού ελέγχου (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Actinomyces israelii + Aeromonas hydrophila + Bordetella pertussis + Candida albicans + Chlamydia trachomatis + Chlamydia pneumoniae + Citrobacter freundii + Corynebacterium diphtheriae + Corynebacterium jeikeium + Cryptococcus neoformans + Eikenella corrodens + Enterobacter aerogenes + Enterobacter cloacae + Enterococcus faecalis + Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 9

Πίνακας 1. Συνέχεια Ομάδα ελέγχου M. tuberculosis (Cycling Green ή Cycling A.FAM)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Enterococcus faecium + Escherichia coli + Fusobacterium nucleatum ssp. polymorphum + Haemophilus influenzae + Haemophilus parainfluenzae + Klebsiella pneumoniae + Lactobacillus acidophilus + Mycobacterium avium ssp. avium + Mycobacterium celatum + Mycobacterium chelonae + Mycobacterium fortuitum + Mycobacterium gordonae + Mycobacterium intracellulare + Mycobacterium kansasii + Mycobacterium lentiflavum + Mycobacterium malmoense + Mycobacterium marinum + Mycobacterium scrofulaceum + Mycobacterium szulgai + Mycobacterium ulcerans + Mycobacterium xenopi + Neisseria gonorrhoeae + Neisseria meningitidis + Nocardia asteroides + Nocardia brasiliensis + Ο πίνακας συνεχίζεται στην επόμενη σελίδα 10 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Πίνακας 1. Συνέχεια Ομάδα ελέγχου M. tuberculosis (Cycling Green ή Cycling A.FAM)) Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (Cycling Yellow ή Cycling A.JOE)) Nocardia farcinia + Nocardia otitidiscaviarum + Peptostreptococcus productus + Porphyromonas gingivalis + Prevotella denticola + Propionibacterium acnes + Pseudomonas aeruginosa + Salmonella enteritidis + Salmonella typhi + Staphylococcus aureus + Staphylococcus epidermidis + Streptococcus agalactiae + Streptococcus pyogenes + Streptococcus mutans + Streptococcus pneumoniae + Streptomyces venezuelae + Veillonella parvula + Xanthomonas maltophilia + Ακρίβεια Τα δεδομένα ακριβείας, για το artus M. tuberculosis RG PCR Kit, συνελέχθηκαν μέσω των οργάνων Rotor-Gene και επιτρέπουν την εξακρίβωση της ολικής διακύμανσης (ολική διασπορά) του συστήματος ανάλυσης. H ολική διακύμανση προέρχεται από την μεταβλητότητα intra-assay (διασπορά δειγμάτων της ίδιας συγκέντρωσης μέσα σε ένα πείραμα), την μεταβλητότητα inter-assay (διασπορά λόγω της χρήσης διαφόρων συσκευών του ίδιου τύπου από διάφορα άτομα εντός ενός εργαστηρίου) και την μεταβλητότητα inter-batch (διασπορά μέσω της χρήσης διαφορετικών παρτίδων). Συγχρόνως υπολογίζεται κάθε φορά η τυπική απόκλιση, η διακύμανση και ο συντελεστής μεταβλητότητας για την PCR του συγκεκριμένου παθογόνου παράγοντα και προτύπου εσωτερικού ελέγχου. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 11

Τα δεδομένα αυτά συνελέχθηκαν, για το artus M. tuberculosis RG PCR Kit, βάσει του προτύπου ποσοτικοποίησης με τη χαμηλότερη συγκέντρωση (QS 4: 30 αντίγραφα/µl). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με τη μορφή οκταπλών προσδιορισμών. Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων έγινε βάσει των τιμών C T των καμπύλων πολλαπλασιασμού. (C T : threshold cycle, βλέπε Πίνακας 2, σελίδα 13) και των εξ αυτών δεδομένων ποσοτικών τιμών σε αντίγραφα/µl (βλέπε Πίνακας 3, σελίδα 13). Βάσει των αποτελεσμάτων αυτών η ολική διασπορά ενός τυχαίου δείγματος της αναφερομένης συγκέντρωσης ανέρχεται στο 1,26% (C T ) ή 14,64% (συγκέντρωση) και για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο 1,57% (C T ). Οι τιμές αυτές βασίζονται στο σύνολο των επιμέρους τιμών των εξεταζομένων μεταβλητοτήτων. Ανθεκτικότητα Ο έλεγχος της ανθεκτικότητας συμβάλλει στην εξέταση του συνολικού ποσοστού αποτυχίας του artus M. tuberculosis RG PCR Kit. Για αυτό το σκοπό αναμίχθηκαν 30 αρνητικά στο σύμπλεγμα M. tuberculosis δείγματα πτυέλου, ΒΚΕ (βρογχικό κυψελιδικό έκπλυμα) και βρογχικού εκκρίματος το καθένα με 3 αντίγραφα/µl όγκο έκλουσης του προτύπου DNA του M. tuberculosis (περίπου τριπλή συγκέντρωση των αναλυτικών ορίων ευαισθησίας). Μετά την εκχύλιση με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 16) και αναλύθηκαν με το artus M. tuberculosis RG PCR Kit. Το ποσοστό αποτυχίας για το M. tuberculosis ανήλθε, για το σύνολο των δειγμάτων, στο 0%. Η ανθεκτικότητα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου ελέγχθηκε επιπλέον μέσω της απομόνωσης και της ανάλυσης κάθε φορά 30 αρνητικών στο σύμπλεγμα M. tuberculosis δειγμάτων πτυέλου, ΒΚΕ και βρογχικού εκκρίματος (30 για κάθε είδος). Το συνολικό ποσοστό αποτυχίας ανήλθε στο 0 %. Δεν παρατηρήθηκαν αναστολές. Έτσι η ανθεκτικότητα του artus M. tuberculosis RG PCR Kit ανέρχεται στο 99%. 12 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Πίνακας 2 : Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των τιμών C T. Intra-assay μεταβλητότητα: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Intra-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-assay μεταβλητότητα: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Inter-batch μεταβλητότητα: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Ολική διακύμανση: M. uberculosis RG/TM QS 4 Ολική διακύμανση: Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Τυπική απόκλιση Διακύμανση Συντελεστής μεταβλητότητας [%] 0,10 0,01 0,32 0,13 0,02 0,45 0,24 0,06 0,78 0,29 0,08 0,95 0,39 0,15 1,28 0,66 0,43 2,16 0,38 0,15 1,26 0,48 0,23 1,57 Πίνακας 3. Αποτελέσματα ακριβείας βάσει των ποσοτικών τιμών (σε αντίγραφα/µl). Intra-assay μεταβλητότητα: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Inter-assay μεταβλητότητα: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Inter-batch μεταβλητότητα: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Ολική διακύμανση: M. tuberculosis RG/TM QS 4 Συντελεστής Τυπική απόκλιση Διακύμανση μεταβλητότητας [%] 1,97 3,90 6,56 3,93 15,43 13,00 5,51 30,41 18,09 4,44 19,69 14,64 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 13

Επαναληψιμότητα Τα δεδομένα της επαναληψιμότητας, επιτρέπουν μια τακτική αξιολόγηση της απόδοσης του artus M. tuberculosis RG PCR Kit καθώς και σύγκριση της απόδοσής του με άλλα προϊόντα. Τα δεδομένα αυτά αποκτώνται με τη συμμετοχή σε καθιερωμένα ειδικά προγράμματα. Διαγνωστική αξιολόγηση Το artus M. tuberculosis RG PCR Kit αξιολογείται αυτή τη στιγμή σε αρκετές μελέτες. 14 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Παρεχόμενος εξοπλισμόςκαι αντιδραστήρια Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. Κιτ απομόνωσης DNA (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 16) Πιπέτες (ρυθμιζόμενες)* Στείρα ρύγχη πιπετών με φίλτρο Αναδευτήρας Vortex* Επιτραπέζια φυγόκεντρος* με κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Οργανο Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q ή Rotor-Gene* με κανάλια φθορισμού για Cycling Green και Cycling Orange ή με κανάλια φθορισμού για Cycling A.FAM και Cycling A.JOE Λογισμικό Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q, έκδοση 1.7.94 ή μεταγενέστερη (Rotor-Gene 6000 software version 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94: Rotor-Gene 3000 software version 6.0.23) Σειρές σωληναρίων και καλλυμάτων, 0,1 ml, για τη χρήση με κεφαλή 72 υποδοχών (αριθ.κατ. 981103 ή 981106) Προαιρετικά: Σωληνάρια PCR, 0,2 ml, for για τη χρήση με κεφαλή 36 υποδοχών (αριθ.κατ. 981005 ή 981008) Μονάδα ψύξης (Loading Block 72 x 0,1 ml σωληναρίων, αριθ.κατ. 9018901 ή Loading Block 96 x 0,2 ml σωληναρίων, αριθ.κατ. 9018905) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα ελέγχονται, συντηρούνται και βαθμονομούνται τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 15

Σημαντικές σημειώσεις Γενικά μέτρα ασφάλειας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαμβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σημεία: Χρησιμοποίηση στείρων ρυγχών πιπέτας με φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγματα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασμού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Πλήρη απόψυξη όλων των υλικών σε θερμοκρασία δωματίου(15 25 C), πριν αρχίσετε μια διαδικασία. Μετά την απόψυξη, ανάμιξη των υλικών (με επαναληπτική αναρρόφηση με πιπέτα ή με γρήγορο στροβιλισμό) και σύντομη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται μεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή μονάδα ψύξης (72/96 well loading block). Απομόνωση DNA Πριν από την απομόνωση του DΝΑ, δείγματα μεγάλου όγκου πρέπει πρώτα να συμπυκνωθούν και ισχυρά όξυνα δείγματα πρέπει να ουδετεροποιηθούν. Κατά την εξέταση πτυέλου προτείνουμε μία απολύμανση με NALC-NaOH*. Γαστρικό υγρό θα πρέπει να ουδετεροποιηθεί με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού άλατος.* Μετά από μια τελική φυγοκέντρηση, το βακτηριακό ίζημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση του DNA που ακολουθεί. The QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, αριθ.κατ. 51304) είναι επικυρωμένο για τον καθαρισμό μυκοβακτηριακού DNA από πτύελο, BΚΕ, βρογχιακό έκκριμα, ΕΝΥ, γαστρικό υγρό ήυγρό περιτοναïκής παρακέντησης ανθρώπου για τη χρήση με το artus M. tuberculosis RG PCR Kit. Το artus M. tuberculosis RG PCR Kit δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται με μεθόδους απομόνωσης με βάση τη φαινόλη. Η χρήση του φορέα RNA έχει μεγάλη σημασία για την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης και επομένως για την απόδοση του DNA/RNA. Παρακαλούμε λάβετε υπόψη ότι Η προσθήκη του φορέα (RNA Homopolymer Poly[rA],* δεν συμπεριλαμβάνεται στο QIAamp DNA Mini Kit) συνιστάται ιδιαίτερα για την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων από σωματικά υγρά χωρίς κύτταρα ή υλικά με μικρή περιεκτικότητα σε DNA και RNA (π.χ. ΕΝΥ). Στη περίπτωση αυτή, προετοιμάστε τον φορέα RNA κατά τον ακόλουθο τρόπο. * Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφαλείας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφαλείας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. 16 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Αναμίξτε το λυοφιλοποιημένο φορέα RNA (RNA Homopolymer Poly[rA], δεν συμπεριλαμβάνεται στο QIAamp DNA Mini Kit) με το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (μη χρησιμοποιείτε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) του κιτ εκχύλισης (Ρυθμιστικό διάλυμα AE του QIAamp DNA Mini Kit) και παρασκευάστε ένα διάλυμα με συγκέντρωση 1 µg/µl. Διαμοιράστε το διάλυμα αυτό του φορέα RNA σε ένα ανάλογο αριθμό ποσοτήτων που αντιστοιχεί στις ανάγκες σας και φυλάξτε αυτές στους 15 to 30 C. Αποφύγετε την επαναληπτική απόψυξη (> 2 x) των ποσοτήτων φορέα RNA. Χρησιμοποιήστε 1 µg φορέα RNA ανά100 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης. Εάν, για παράδειγμα, το πρωτόκολλο εκχύλισης προβλέπει 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, προσθέστε 2 µl φορέα RNA (1 µg/µl) κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Ρυθμιστικό διάλυμα AL του QIAamp DNA Mini Kit). Πριν από την έναρξη κάθε εκχύλισης, απομόνωσης πρέπει να παρασκευασθεί ένα πρόσφατο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA (και εάν είναι απαραίτητο προτύπου εσωτερικού ελέγχου, βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, σελίδα 20) σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα επεξεργασίας με πιπέτα στον Πίνακα 4. Πίνακας 4. Πιπετικό σχήμα για τη χρήση με το QIAamp DNA Mini Kit Αριθμός δειγμάτων 1 12 Ρυθμιστικό διάλυμα AL (Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης)* π.χ., 200 µl π.χ., 2400 µl Φορέας RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Συνολικός όγκος 202 µl 2424 µl Ογκος ανά εκχύλιση 200 µl 200 µl για κάθε ένα * Περιέχει υδροχλωρική γουανιδίνη: Βλέπε στο εγχειρίδιο του κιτ για πληροφορίες ασφαλείας. Για την εκχύλιση, χρησιμοποιείτε το πρόσφατα παρασκευασμένο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και φορέα RNA αμέσως. Αποθήκευση του μίγματος δεν είναι δυνατή. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του artus M. tuberculosis RG PCR Kit μπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία απομόνωσης (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, σελίδα 20). Για την εξασφάλιση μιας αποτελεσματικής μη μολυσματικής επαφής με τα μυκοβακτηρίδια, εκτελέστε τον καθαρισμό του σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα, τα οποία διαφοροποιούνται από τα πρωτόκολλα των QIAamp DNA Mini και Blood Mini εγχειριδίων. Όλα τα στάδια επεξεργασίας με πιπέτα, πριν από την επώαση στους 95 C, πρέπει να εκτελούνται σε θάλαμο ασφάλειας της κλάσης II, λόγω των δυνητικά μολυσματικών δειγμάτων. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 17

Μεταφέρετε μεταξύ 250 µl και 500 µl του με NALC-NaOH επεξεργασμένου δείγματος σε σωληνάρια 1,5 ml με βιδωτό κάλυμμα. Η χρησιμοποίηση σωληναρίων με βιδωτά καλύμματα είναι απολύτως απαραίτητη. Τα σωληνάρια πρέπει πάντοτε να είναι καλά κλεισμένα. Φυγοκεντρήστε για 10 λεπτά στις 17.000 x g (13.000 στρ./λεπτό) σε μία επιτραπέζια φυγόκεντρο. Παραλάβετε προσεκτικά το υπερκείμενο υγρό με πιπέτα και και απομακρύνετέ το. Μην έρχεστε σε επαφή με το εσωτερικό του καλύμματος των σωληναρίων. Εάν συμβεί αυτό, παρακαλούμε αλλάξτε αμέσως τα δυνητικά μολυσμένα γάντια. Προσθέστε 180 µl μίγμα λυσοζύμης (20 mg/ml λυσοζύμη:* 20 mm Tris Cl (ph 8.0):* 2 mm EDTA:* 1,2 % Triton *) και αναμίξτε το ίζημα με τη χρήση πιπέτας. Επωάστε το δείγμα στους 37 C, το λιγότερο για μία ώρα, σε μονάδα θέρμανσης ή σε θερμοαναμικτήρα. Γενικά δεν απαιτείται η χρήση λουτρό ύδατος. Φυγοκεντρήστε για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Μετά από κάθε βήμα επώασης, φυγοκεντρήστε το σωληνάριο, για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Προσθέστε 20 µl πρωτεïνάσης K και 200 µl ρυθμιστικού διαλύματος AL (με φορέα RNA και προαιρετικά, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου:βλέπε παραπάνω και Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, σελίδα 20). Μην έρχεστε σε επαφή με το εσωτερικό του καλύμματος. Εάν συμβεί αυτό, παρακαλούμε αλλάξτε αμέσως τα δυνητικά μολυσμένα γάντια. Αναμίξτε καλά με αναδευτήρα. Επωάστε στους 56 C για 30 λεπτά σε μονάδα θέρμανσης. Γενικά δεν απαιτείται η χρήση λουτρό ύδατος. Φυγοκεντρήστε για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Μετά από κάθε βήμα επώασης, φυγοκεντρήστε το σωληνάριο, για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. * Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφαλείας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφαλείας (MSDSs) που διατίθενται από τους προμηθευτές προїόντων. 18 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Επωάστε στους 95 C για 15 λεπτά (ο χρόνος επώασης δεν πρέπει να υπερβαίνεται, γιατί το DNA μπορεί να υποβιβασθεί). Παρακαλούμε λάβετε υπόψη ότι τα δείγματα δεν είναι πλέον μολυσματικά, μόνο μετά το τέλος της επώασης στους 95 C. Αφήστε το δείγμα να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Φυγοκεντρήστε για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Μετά από κάθε βήμα επώασης, φυγοκεντρήστε το σωληνάριο, για μικρό χρονικό διάστημα, για την απομάκρυνση σταγόνων από το εσωτερικό του καλύμματος. Ακολουθήστε το Πρωτόκολλο: DNA Purification from Tissues του QIAamp DNA Mini και Blood Mini Handbook ( Τρίτη έκδοση, Απρίλιος 2010) αρχίζοντας με τη προσθήκη αιθανόληςστο βήμα 6 και εκτελέστε την τεική έκλουση του DNA χρησιμοποιώντας 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος AE. Σιγουρευτείτε ότι το υγρό της πιπέτας δεν έρχεται σε επαφή με τα τοιχώματα μιας στήλης QIAamp Mini spin. Μην έρχεστε σε επαφή με το εσωτερικό του καλύμματος μιας στήλης QIAamp Mini spin. Εάν συμβεί αυτό, παρακαλούμε αλλάξτε αμέσως τα δυνητικά μολυσμένα γάντια. Μη χρησιμοποιείτε το ίδιο ρύγχος πιπέτας για διαφορετικά δείγματα, καθώς και για την προσθήκη των ρυθμιστικών διαλυμάτων AW1 και AW2 ή του ρυθμιστικού διαλύματος εκχύλισης AE. Έτσι αποφεύγεται μία διασταρωμένη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων καθώς και μία μόλυνση ενός ρυθμιστικού διαλύματος. Χρησιμοποιείτε κάθε σωληνάριο συλλογής των 2 ml μόνο μία φορά. Εάν δεν έχετε στη διάθεση σας αρκετή ποσότητα σωληναρίων συλλογής, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε επίσης σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης των 2 ml, των οποίων το κάλυμμα μπορεί να απομακρυνθεί. Συνιστούμε επιτακτικά την εκτέλεση της απαιτούμενης φυγοκέντρησης του βήματος 10 του πρωτοκόλλου για την απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Συνιστούμε την αύξηση του χρόνου της φυγοκέντησης αυτής σε 3 λεπτά. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 19

Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (M. tuberculosis IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την απομόνωση του DNA, όσο και μία ενδεχομένη αναστολή της PCR. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία απομόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Mini Kit, το DNA εκλούεται σε 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος AE. Συνεπώς, αρχικά προστίθενται 10 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου Η ποσότητα του προστιθέμενου προτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται μόνο από τον όγκο έκλουσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και ο φορέας RNA (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 16) επιτρέπεται να προστεθούν μόνο στο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και υλικού δείγματος ή κατευθείαν στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου δεν επιτρέπεται να προστεθεί απευθείας στο υλικό δείγματος. Κατά την προσθήκη στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης λάβετε υπόψη ότι το μίγμα προτύπου εσωτερικού ελέγχου και ρυθμιστικού διαλύματος λύσης/φορέα RNA πρέπει να χρησιμοποιείται αμέσως μετά την παρασκευή του (αποθήκευση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου ή στο ψυγείο μπορεί να οδηγήσει, μετά από μερικές ώρες, σε απώλεια του προτύπου εσωτερικού ελέγχου και μείωση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης). Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου και το φορέα RNA με την πιπέτα απευθείας στο υλικό δείγματος. Προαιρετικά, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο μιας ενδεχομένης αναστολής της PCR. Για το σκοπό αυτό, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο M. tuberculosis RG Master και M. tuberculosis Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 23). Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4) χρησιμοποιούνται όπως τα δείγματα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισμό και εισάγονται στον ίδιο όγκο (10 µl). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης στα όργανα Rotor- Gene Q, πρέπει να χρησιμοποιηθούν και τα τέσσερα παρεχόμενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και να ορισθούν ως πρότυπα στο στο πλαίσιο διαλόγου Edit Samples με τις καθορισμένες συγκεντρώσεις (βλέπε το εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου). Η πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται όπως αναφέρεται παραπάνω μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τις επόμενες εκτελέσεις, παρεχόμενη όταν στην τρέχουσα εκτέλεση περιλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο μιας συγκεκριμένης συγκέντρωσης. Για το σκοπό αυτό είναι απαραίτητη η εισαγωγή της ρυθμισμένης πρότυπης καμπύλης (βλέπε, εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου). Ωστόσο, αυτή η ποσοτική μέθοδος μπορεί να οδηγήσει σε αποκλίσεις στα αποτελέσματα λόγω της μεταβλητότητας μεταξύ διαφορετικών εκτελέσεων PCR. 20 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Για την εξασφάλιση ακριβούς ποσοτικοποίησης, συνιστάται επιτακτικά η προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο M. tuberculosis RG Master και M. tuberculosis Mg-Sol για τη χρήση για τα πρότυπα ποσοτικοποίησης. Για την εφαρμογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο M. tuberculosis RG Master και M. tuberculosis Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 23) και χρησιμοποιήστε αυτό το master mix για κάθε πρότυπο ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis RG/TM QS 1 4). Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/µl. Για τη μετατροπή των τιμών που έχουν καθοριστεί με βάση την πρότυπη καμπύλη σε αντίγραφα /ml υλικού δείγματος πρέπει να εφαρμόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσμα (αντίγραφα/ml) = Αποτέλεσμα (αντίγρ/µl) x Όγκος έκλουσης (µl) Όγκος δείγματος (ml) Παρακαλούμε προσέξτε ότι στον παραπάνω αναφερόμενο τύπο, κατά κανόνα, τοποθετείται ο αρχικός όγκος δείγματος. Αυτό λαμβάνεται υπόψη όταν ο όγκος δείγματος μεταβάλλεται πριν την απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (π.χ. μείωση λόγω φυγοκέντρησης ή αύξηση λόγω συμπληρώματος για τον απαιτούμενο όγκο προς απομόνωση). artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 21

Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση Σημαντικές υποδείξεις πριν από την εκκίνηση Πριν αρχίσετε τη διαδικασία, διαβάστε Σημαντικές σημειώσεις, σελίδες 16-20. Αφιερώστε χρόνο για να εξοικειωθείτε με το όργανο Rotor-Gene Q προτού ξεκινήσετε το πρωτόκολλο. Σιγουρευτείτε ότι σε κάθε ανάλυση PCR συμπεριλαμβάνεται τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης καθώς και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δημιουργία μιας πρότυπης καμπύλης, χρησιμοποιήστε και τα τέσσερα πρότυπα ποσοτικοποίησης που παρέχονται για κάθε ανάλυση PCR (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4). Τι πρέπει να γίνει πριν από την εκκίνηση Βεβαιωθείτε ότι η μονάδα ψύξης (εξάρτημα του Rotor-Gene Q) έχει προψυχθεί περίπου στους 2 8 C. Πριν από κάθε χρήση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης, να αναμιγνύονται καλά (με επαναληπτική αναρρόφηση και έγχυση με πιπέτα ή με σύντομο στροβιλισμό) και τελικά να φυγοκεντρούνται για σύντομο χρονικό διάστημα. Εκτέλεση 1. Τοποθετήστε τον αριθμό σωληναρίων PCR στις υποδοχές της μονάδας ψύξης. 2. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου για την επιτήρηση της διαδικασίας απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2a. Εάν χρησιμοποιείτε το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου επιλεκτικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, ακολουθήστε το βήμα 2b. Συνιστάται επιτακτικά η προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο M. tuberculosis RG Master και M. tuberculosis Mg-Sol για τη χρήση για τα πρότυπα ποσοτικοποίησης. Για τα πρότυπα ποσοτικοποίησης, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου κατευθείαν στο M. tuberculosis RG Master και M. tuberculosis Mg-Sol, όπως περιγράφεται στο βήμα 2b του πρωτοκόλλου (σελίδα 23) και χρησιμοποιήστε αυτό το master mix για κάθε πρότυπο ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis RG/TM QS 1 4). 2a. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου έχει ήδη προστεθεί στην απομόνωση (βλέπε Πρότυπο εσωτερικού ελεγχου, σελίδα 20). Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον Πίνακα 5. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. 22 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Πίνακας 5. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου για την επιτήρηση της απομόνωσης του DNA και τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR). Αριθμός δειγμάτων 1 12 M. tuberculosis RG Master 13 µl 156 µl M. tuberculosis Mg-Sol 2 µl 24 µl M. tuberculosis IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 15 µl 180 µl 2b. Το εσωτερικό πρότυπο ελέγχου πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο μίγμα του M. tuberculosis RG Master και M. tuberculosis. Στην περίπτωση αυτή ετοιμάστε ένα master mix σύμφωνα με τον Πίνακα 6. Το μίγμα αντίδρασης περιέχει τυπικά όλα τα συστατικά που χρειάζονται για την PCR εκτός από το δείγμα. Πίνακας 6. Παρασκευή του master mix (χρήση του εσωτερικού προτύπου ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο πιθανής αναστολής της PCR) Αριθμός δειγμάτων 1 12 M. tuberculosis RG Master 13 µl 156 µl M. tuberculosis Mg-Sol 2 µl 24 µl M. tuberculosis IC 0,5 µl 6 µl Συνολικός όγκος 15,5 µl* 186 µl* * Η αύξηση του όγκου μέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά την προετοιμασία της αντίδρασης PCR, είναι αμελητέα. Η ευαισθησία του συστήματος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 3. Εισάγετε με πιπέτα σε κάθε σωληνάριο PCR 15 μl του master mix. Στη συνέχεια εισάγετε 10 µl από το έκλουμα του DNA του δείγματος και αναμίξτε καλά με πολλαπλή αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. Αντίστοιχα πρέπει να προστεθούν ως θετικό πρότυπο ελέγχου 10 µl από ένα τουλάχιστον πρότυπο ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4) και ως αρνητικό πρότυπο ελέγχου 10 µl νερό (Water, PCR grade). artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 23

Πίνακας 7. Παρασκευή αντίδρασης PCR Αριθμός δειγμάτων 1 12 Master mix 15 µl 15 µl για κάθε ένα Δείγμα 10 µl 10 µl για κάθε ένα Συνολικός όγκος 25 μl 25 μl για κάθε ένα 4. Κλείστε τα σωληνάρια PCR. Λάβετε υπόψη ότι στην κεφαλή θα πρέπει να τοποθετείται ένας δακτύλιος ασφάλειας (εξάρτημα του Rotor-Gene), για να εμποδίζεται το τυχαίο άνοιγμα των σωληναρίων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. 5. Για την ανίχνευση του συμπλέγματος M. tuberculosis δημιουργήστε ένα προφίλ θερμοκρασίας σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα εργασίας. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων PCR Εικόνα 2, 3, 4 Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start Εικόνα 5 Πολλαπλασιασμός του DNA Εικόνα 6 Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού Εικόνα 7 Εκκίνηση της διαδικασίας Εικόνα 8 Όλες οι προδιαγραφές αφορούν το λογισμικό Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q, έκδοση 1.7.94, το λογισμικό Rotor-Gene 6000, εκδόσεις 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94 και το λογισμικό Rotor-Gene 3000, έκδοση 6.0.23. Παακαλούμε βρείτε περαιτέρω πληροφορίες πάνω στον προγραμματισμό των οργάνων Rotor-Gene στο εγχειρίδιο του χρήστη του οργάνου. Στις απεικονίσεις αυτές οι ρυθμίσεις πλαισιόνονται με έντονο μαύρο. Για τα όργανα Rotor-Gene Q περιλαμβάνονται απεικονίσεις. Οπου απαιτούνται διαφορετικές τιμές για το Rotor-Gene 3000, οι διαφορές αυτές περιγράφονται στο κείμενο. 24 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

6. Αρχικά, ανοίξτε το πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 2). Ελέγξτε το πλαίσιο Locking Ring Attached και πατήστε Next. Εικόνα 2. Πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard. 7. Επιλέξτε 25 για τον όγκο αντίδρασης της PCR και πατήστε Next (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Ρύθμιση γενικών παραμέτρων. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 25

8. Πατήστε το κουμπί Edit Profile στο επόμενο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (Εικόνα 4), και προγραμματείστε το προφίλ θερμοκρασίας όπως φαίνεται στις εικόνες 4 6. Εικόνα 4. Επεξεργασία του προφίλ Εικόνα 5. Αρχική ενεργοποίηση του ενζύμου hot-start 26 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Εικόνα 6. Πολλαπλασιασμός του DNA. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr, JOE. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 27

9. Η περιοχή ανίχνευσης των καναλιών φθορισμού πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με τις εντάσεις φθορισμού στα σωληνάρια της PCR. Πατήστε Gain Optimisation στο πλαίσιο διαλόγου New Run Wizard (βλέπε Εικόνα 4) για να ανοίξετε το πλαίσιο διαλόγου Auto-Gain Optimisation Setup. Ορίστε τη θερμοκρασία ένδειξης στους 64 για να αντιπαραθέσετε τη θερμοκρασία υβριδισμού στο πρόγραμμα πολλαπλασιασμού (Εικόνα 7). Εικόνα 7. Ρύθμιση της ευαισθησίας των καναλιών φθορισμού. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr και JOE. 28 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

10. Οι τιμές gain που εξάγονται από τη βαθμονόμηση του καναλιού αποθηκεύονται αυτόματα και εμφανίζονται στο τελευταίο παράθυρο μενού του προγραμματισμού (βλέπε Εικόνα 8). Πατήστε Start Run. Εικόνα 8. Εκκίνηση της διαδικασίας. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, το λογισμικό καθορίζει τις φθορίζουσες χρωστικές ουσίες ως FAM/Sybr και JOE. 11. Μετά το τέλος της διαδικασίας, αναλύστε τα δεδομένα. Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσματα (11a, 11b και 11c). Παραδείγματα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις PCR εμφανίζονται στις εικόνες 9 και 10. 11a. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ανιχνεύεται ένα σήμα. Το αποτέλεσμα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγμα περιέχει DNA του συμπλέγματος M. tuberculosis. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήματος στο κανάλι Cycling Yellow είναι άνευ σημασίας, δεδομένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του DNA του συμπλέγματος M. tuberculosis (θετικό σήμα στο κανάλι Cycling Green) ενδέχεται να οδηγούν σε μειωμένο έως ανύπαρκτο σήμα φθορισμού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Yellow (Ανταγωνισμός). Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM για θετικό σήμα και Cycling A.ROX για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 29

11b. Στο κανάλι φθορισμού Cycling Green δεν ανιχνεύεται κανένα σήμα. Τον ίδιο χρόνο, εμφανίζεται ένα σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι Cycling Yellow. Στο δείγμα δεν υπάρχει ανιχνεύσιμο DNA όλα τα μέλη του συμπλέγματος M. tuberculosis. Συνεπώς, το δείγμα μπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis είναι αρνητική, το ανιχνευμένο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.JOE για θετικό σήμα και Cycling A. FAM για το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου. 11c. Δεν ανιχνεύεται σήμα σε κανένα από τα κανάλια Cycling Green ή Cycling Yellow. Δεν υπάρχει δυνατότητα διαγνωστικής αξιολόγησης. Υποδείξεις σχετικά με τις πηγές σφαλμάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων, σελίδα 32. Σημειώστε ότι στο Rotor-Gene 3000, τα σχετικά κανάλια είναι Cycling A.FAM και Cycling A.JOE. Εικόνα 9. Ανίχνευση των προτύπων ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green. NTC: No template control (αρνητικό πρότυπο). 30 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Εικόνα 10. Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow με ταυτόχρονο πολλαπλασιασμό των προτύπων ποσοτικοποίησης (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4). NTC: No template control (αρνητικό πρότυπο). artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 31

Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Στον οδηγό αυτό αντιμετώπισης προβλημάτων θα βρείτε χρήσιμες υποδείξεις οι οποίες μπορούν να σας βοηθήσουν στην επίλυση τυχόν προβλημάτων που μπορούν να εμφανισθούν. Για περισσότερες πληροφορίες βλέπε επίσης τη σελίδα συχνών ερωτήσεων στο κέντρο τεχνικής σας υποστήριξης: www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx.h επιστήμονες της τεχνικής εξυπηρέτησης της QIAGEN απαντά ευχαρίστως στις ερωτήσεις σας σχετικά με το περιεχόμενο και τα πρωτόκολλα του εγχειριδίου αυτού ή τεχνολογίες δείγματος και μεθόδου (πληροφορίες επαφής, βλέπε οπίσθιο εξώφυλλο ή επισκευθείτε την ιστοσελίδα www.qiagen.com). Παρατηρήσεις και προτάσεις Κανένα σήμα με θετικά πρότυπα ελέγχου (M. tuberculosis RG/TM QS 1-4) στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM a) Το κανάλι φθορισμού που επιλέξατε για την ανάλυση των δεδομένων της PCR, δεν ανταποκρίνεται στα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου. Για την ανάλυση των δεδομένων διαλέξτε το κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM για την αναλυτική PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis και το κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE για την PCR του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. b) O προγραμματισμός του προφίλ θερμοκρασίας του οργάνου Rotor-Gene είναι εσφαλμένος c) Εσφαλμένη διάταξη της αντίδρασης της PCR d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus M. tuberculosis RG PCR Kit έχει λήξει Συγκρίνετε το προφίλ θερμοκρασίας με τα περιεχόμενα του πρωτοκόλλου (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 22). Ελέγξτε τα στάδια εργασίας σας με τη βοήθεια του σχήματος επεξεργασίας με πιπέτα (βλέπε Πρωτόκολλο: PCR και Αξιολόγηση, σελίδα 22) και επαναλάβετε την PCR, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. 32 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Παρατηρήσεις και προτάσεις Ασθενές ή ανύπαρκτο σήμα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Yellow ή Cycling A.JOE με ταυτόχρονη απουσία ενός σήματος στο κανάλι Cycling Green ή Cycling A.FAM για την ειδική PCR του συμπλέγματος M. tuberculosis a) Οι συνθήκες της PCR δεν συμφωνούν με το πρωτόκολλο Ελέγξτε τις συνθήκες της PCR (βλέπε ανωτέρω) και επαναλάβετε την PCR με διορθωμένες ρυθμίσεις, εάν είναι απαραίτητο. b) Έγινε αναστολή της PCR Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε τη διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Βεβαιωθείτε ότι κατά την απομόνωση του DNA το επιπλέον προτεινόμενο βήμα φυγοκέντρησης, για την απόλυτη απομάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης έχει εκτελεστεί πριν από την εκχύλιση (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 16). c) Υφίσταται απώλεια DNA κατά την εκχύλιση d) Οι συνθήκες αποθήκευσης, για ένα ή περισσότερα υλικά του κιτ, δεν συμφωνούν με τις αναφερόμενες οδηγίες του κεφαλαίου Αποθήκευση (σελίδα 5) e) Το artus M. tuberculosis RG PCR Kit έχει λήξει Εάν το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει προστεθεί στην απομόνωση, μπορεί η απουσία του σήματος του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να σημαίνει απώλειες DNA κατά την εκχύλιση. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε μία διαδικασία απομόνωσης που συνιστάται από εμάς (βλέπε Απομόνωση DNA, σελίδα 16) και τηρείτε πιστά τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. Ελέγξτε τόσο τις συνθήκες αποθήκευσης όσο και την ημερομηνία λήξης (βλέπε ετικέττα του κιτ) των αντιδραστηρίων και χρησιμοποιήστε ένα νέο κιτ, εάν είναι απαραίτητο. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 33

Παρατηρήσεις και προτάσεις Σήματα με τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου στο κανάλι φθορισμού Cycling Green ή Cycling A.FAM της αναλυτικής PCR a) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την προετοιμασία της PCR Επαναλάβετε την PCR με νέα αντιδραστήρια κατ επανάληψη. Εάν είναι δυνατόν, κλείστε τα σωληνάρια της PCR αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος που είναι προς εξέταση. Εισάγετε με πιπέτα τα θετικά πρότυπα ελέγχου κατά κανόνα στο τέλος. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. b) Υφίσταται μία επιμόλυνση κατά την εκχύλιση Επαναλάβετε την εκχύλιση και την PCR των εξεταζόμενων δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση νέων αντιδραστηρίων. Βεβαιωθείτε ότι οι χώροι εργασίας και τα μηχανήματα απολυμαίνονται συχνά. 34 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Παραπομπές Η QIAGEN διατηρεί μία μεγάλη ενημερωμένη επιγραμμική βάση δεδομένων επιστημονικών δημοσιευμάτων σχετικά με τη χρήση των προїόντων της QIAGEN. Επιλεκτικές αναλυτικές αναζητήσεις σας επιτρέπουν να βρείτε το άρθρο που χρειάζεστε είτε κατά την αναζήτηση με μία απλή κωδική λέξη είτε ειδικότερα βάσει της εφαρμογής, ερευνητικού πεδίου, τίτλου, κ.τ.λ. Για μία πλήρη λίστα παραπομπών, επισκευθείτε την QIAGEN Reference Database online στην ιστοσελίδα www.qiagen.com/refdb/search.asp ή ελάτε σε επαφή με την τεχνική υπηρεσία της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 35

Πληροφορίες παραγγελιών Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. artus M.tuberculosis RG PCR Kit (24) artus M.tuberculosis RG PCR Kit (96) Για 24 αντιδράσεις: Master, διάλυμα Mg, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) Για 96 αντιδράσεις : Master, διάλυμα Mg, 4 πρότυπα ποσοτικοποίησης, πρότυπο εσωτερικού ελέγχου, νερό (PCR grade) 4555263 4555265 QIAamp DNA Mini Kit για την απομόνωση γονιδιακού, μιτοχονδριακού, βακτηριακού, παρασιτικού ή ιικού DNA QIAamp DNA Mini Kit (50) Rotor-Gene Q MDx και εξαρτήματα Rotor-Gene Q MDx 5plex Platform Rotor-Gene Q MDx 5plex System Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Για 50 αντιδράσεις: QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN πρωτεϊνάση Κ, αντιδραστήρια, ρυθμιστικά διαλύματα, σωληνάρια συλλογής (2 ml) Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία. Δεν περιλαμβάνεται η εγκατάσταση και η κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Melt υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία. Δεν περιλαμβάνεται η εγκατάσταση και η κατάρτιση 51304 9002022 9002023 9002032 36 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Melt υψηλής ανάλυσης με 5 κανάλια (πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση 9002033 Rotor-Gene Q MDx 6plex Platform Rotor-Gene Q MDx 6plex System Rotor-Gene Q MDx 2plex Platform Rotor-Gene Q MDx 2plex System Όργανο PCR πραγματικού χρόνου με 6 κανάλια (μπλε, πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), συμπεριλαμβανομένων φορητού υπολογιστή, λογισμικού, παρελκομένων: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία. Δεν περιλαμβάνεται η εγκατάσταση και η κατάρτιση Όργανο PCR πραγματικού χρόνου με 6 κανάλια (μπλε, πράσινο, κίτρινο, πορτοκαλί, κόκκινο, βαθυκόκκινο), συμπεριλαμβανομένων φορητού υπολογιστή, λογισμικού, παρελκομένων: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία. Δεν περιλαμβάνεται η εγκατάσταση και η κατάρτιση Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο), φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση 9002042 9002043 9002002 9002003 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012 37

Προϊόν Περιεχόμενα Αριθ. Κατ. Rotor-Gene Q MDx 2plex HRM Platform Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Melt υψηλής ανάλυσης με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία. Δεν περιλαμβάνεται η εγκατάσταση και η κατάρτιση 9002012 Rotor-Gene Q MDx 2plex HRM System Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10000) Κυκλοποιητής PCR πραγματικού χρόνου και αναλυτής Melt υψηλής ανάλυσης με 2 κανάλια (πράσινο, κίτρινο) και κανάλι HRM, φορητός υπολογιστής, λογισμικό, παρελκόμενα: περιλαμβάνεται εγγύηση 1 έτους στα εξαρτήματα και στην εργασία, εγκατάσταση και κατάρτιση Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης με πιπέτα ενός καναλιού σε 72 x 0,1 ml σωληνάρια Εξάρτημα από αλουμίνιο για εγκατάσταση με το χέρια αντίδρασης σε μία πρότυπη σειρά 8 x 12 με τη χρήση 96 x 0,2 ml σωληναρίων 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 1000 αντιδράσεις 10 x 250 σειρές με 4 σωληνάρια και πώματα για 10.000 αντιδράσεις 1000 λεπτά σωληνάρια για 1000 αντιδράσεις 10 x 1000 λεπτά σωληνάρια για 10000 αντιδράσεις 9002013 9018901 9018905 981103 981106 981005 981008 Για πρόσφατες πληροφορίες αδείας χρήσης και ειδικές αποποιήσεις προϊόντων, ανατρέξτε στο αντίστοιχο εγχειρίδιο του QIAGEN kit ή του χρήστη. Αυτά είναι διαθέσιμα στην ιστοσελίδα www.qiagen.com ή μπορούν να ζητηθούν από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN ή τον τοπικό σας αντιπρόσωπο. 38 artus M. tuberculosis RG PCR Kit Εγχειρίδιο 01/2012

Η αγορά του προϊόντος αυτού επιτρέπει στον αγοραστή τη χρήση του για την εκτέλεση διαγνωστικών εξετάσεων του ανθρώπου στη διαγνωστική in-vitro. Καμμιά γενική πατέντα ή άλλη άδεια κάθε είδους δεν παρέχεται επί τουπαρόντος εκτός αυτής του ειδικού δικαιώματος της χρήσης από τον αγοραστή. Εμπορικές ονομασίες: QIAGEN, QIAamp, artus, HRM, Rotor-Gene (QIAGEN Group); FAM, JOE (Life Technologies); SYBR (Molecular Probes, Inc.). Συμφωνία περιορισμένης αδείας Η χρήση του προїόντος αυτού σημαίνει ότι κάθε αγοραστής ή χρήστης του artus M. tuberculosis RG PCR Kit συμφωνεί με τους ακόλουθους όρους: 1. Το artus M. tuberculosis RG PCR Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σύμφωνα με το εγχειρίδιο artus M. tuberculosis RG PCR Kit και μόνο με τα αντιδραστήρια που περιέχονται στο κιτ. Η QIAGEN δεν παραχωρεί καμμία άδεια υπό την πνευματική της ιδιοκτησία για τη χρήση ή συσσωμάτωση των περιεχομένων στο κιτ αυτό αντιδραστηρίων με αντιδραστήρια που δεν συμπεριλαμβάνονται εντός του ίδιου κιτ εκτός εάν αναφέρεται στο εγχειρίδιο του artus M. tuberculosis RG PCR Kit και στα περιλαμβανόμενα πρωτόκολλα διαθέσιμα στην ιστοσελίδα www.qiagen.com. 2. Διαφορετικά από τις κατηγορηματικές κρατικές άδειες, η QIAGEN δεν παρέχει καμμία εγγύηση ότι αυτό το κιτ και/ή η χρήση του δεν παραβιάζει τα δικαιώματα τρίτων προσώπων. 3. Το κιτ αυτό και τα αντιδραστήριά του διατίθενται για μία χρήση και δεν μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, ανακαινισθούν ή μεταπωληθούν. 4. Ειδικότερα η QIAGEN αποποιεί οποιαδήποτε άλλες άδειες, που διατυπώνουν ή υπονοούν οτιδήποτε άλλο από τις σαφείς αυτές συνθήκες. 5. Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνεί να μην επιτρέπει σε κανένα άλλο να λαμβάνει οποιαδήποτε μέτρα που θα μπορούσαν να οδηγήσουν ή να διευκολύνουν πράξεις που απαγορεύονται παραπάνω. Η QIAGEN μπορεί να επιβάλλει τις απαγορεύσεις αυτής της συμφωνίας περιορισμένης αδείας σε οποιοδήποτε δικαστήριο και να ανακτήσει όλα της τα προανακριτικά και του δικαστηρίου έξοδα συμπεριλαμβανομένων και των δικηγορικών αμοιβών, σε κάθε πράξη που επιβάλλει αυτή η συμφωνία περιορισμένης αδείας ή οτιδήποτε από τα δικαιώματα της πνευματικής της ιδιοκτησίας που έχουν σχέση με το κιτ και/ή τα αντιδραστήριά του. Για νεότερη ενημέρωση που αφορούν τους όρους αδείας, μπορείτε να δείτε στην ιστοσελίδα www.qiagen.com 2009 12 QIAGEN, όλα τα δικαιώματα είναι κατωχυρωμένα.

www.qiagen.com Australia Orders 1-800-243-800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800-28-10-10 Fax 0800-28-10-19 Technical 0800-28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Brazil Orders 0800-557779 Fax 55-11-5079-4001 Technical 0800-557779 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 86-21-3865-3865 Fax 86-21-3865-3965 Technical 800-988-0325 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Offers 01-60-920-928 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800 555 049 Fax 1800 555 048 Technical 1800 555 061 Italy Orders 800-789-544 Fax 02-334304-826 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-6890-7300 Fax 03-5547-0818 Technical 03-6890-7300 Korea (South) Orders 080-000-7146 Fax 02-2626-5703 Technical 080-000-7145 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 Mexico Orders 01-800-7742-639 Fax 01-800-1122-330 Technical 01-800-7742-436 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 1800-742-4362 Fax 65-6854-8184 Technical 1800-742-4368 Spain Orders 91-630-7050 Fax 91-630-5145 Technical 91-630-7050 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1046960EL 139313476 Sample & Assay Technologies