مرکز تخصصی خدمات آموزشی گروه پزشکی فرهنگ گستر نخبگان

فصل اول: اسیدهای آمینه و پروتئینها اسیدهای آمینه )انیمیشن 3 662 ( اسیدهای آمینه به عنوان واحدهای ساختمانی ساختار پپتیدها و پروتئین ها می باشند. در طبیعت در حدود 033 اسید آمینه وجود دارد که تنها 03 اسید آمینه از اين تعداد در ساختمان پپتیدها و پروتئین ها شرکت می کنند که به اين 03 اسید آمینه اسید آمینه استاندارد می گويند. اسیدآمینه دارای حداقل چهار گروه متصل به کربن α باشد لذا اين کربن يك کربن نامتقارن میباشد. )کربن متصل به گروه کربوکسیل را کربن α گويند( می- تمامی اسیدهای آمینه به جز اسید آمینه گاليسین به دلیل داشتن کربن α نامتقارن دارای فعالیت نوری می باشند. گروه های متصل به کربن α شامل: گروه کربوکسیل (COOH) يك گروه آمین ) 0 (NH يك اتم هیدروژن و زنجیره جانبی يا ريشه R می باشند. اختالف گروههای R از نظر ساختمان اندازه و بار الکتريکی روی حاللیت اسیدهای آمینه در آب اثر می گذارد. تمامی 03 اسید آمینه موجود در پروتئینها از نوع α آمینو اسید میباشند. بتا آمینواسیدها و گاماآمینواسیدها نیز وجود دارند که در ساختار پروتئین شرکت نمیکنند. - بتا و گاما آمینواسیدها بترتیب حاوی يك و دو گروه کربنی بیشتر در ساختار خود هستند و عامل آمین بر روی کربن بتا و گاما قرار دارد. اسیدهای آمینه به واسطه نحوه اتصال گروه آمین متصل به کربن α نامتقارن دارای دو ايزومر D و L می باشند. L-amino acid فرم رايج اسیدهای آمینه در پروتئین ها می باشد. تقسیم بندی اسیدهای آمینه)انیمیشن 111( 663 بر اساس ويژگی های گروه های R شامل: قطبیت و تمايل به داشتن میانکنش با مولکول آب در ph بیولوژيك اسیدهای آمینه در 5 گروه طبقه بندی می شوند: 1

1- اسیدهای آمینه غیرقطبي با زنجیره جانبي آلیفاتیک)نان پوالر non polar یا آلیفاتیک(: در اين گروه اسیدهای آمینه غیر قطبی و آبگريز با زنجیره آلیفاتیك قرار دارند که شامل : گاليسین آالنین پرولین والین لوسین ايزولوسین و متیونین می باشند. 2

زنجیره جانبی اين اسیدهای آمینه به علت غیرقطبی بودن تمايل دارند تا در داخل پروتئین ها بصورت مجتمع با يکديگر از طريق واکنش های متقابل هیدروفوب )آبگريز ) قرار گیرند گاليسین ساده ترين ساختمان اسید آمینه ای را دارد. گاليسین تنها اسید آمینه ای است که دارای کربن α- نامتقاارن مای باشاد زيارا زنجیاره جاانبی آن تنهاا ياك اتام هیدروژن میباشد. هرچند گاليسین در اين طبقه قرار دارد ولی از آنجا که زنجیره جانبی آن بسیار کوچك و انعطاف پذير است های همکاری را در ايجاد پیوند های هیدروفوب از خود نشان نمیدهد. والین لوسین و ايزولوسین سه اسیدآمینه شاخهدار هستند. ايزولوسین در ساختار خود دارای دو کاربن نامتقاارن مای- باشد. متیونین اسید آمینه گوگردار است که در ساختمان زنجیره جانبی خود يك تیواتر غیرقطبی دارد. پرولین در حقیقت يك آلفا ا ايمینو( -imino ) است که ب اه دلی ال آزاد نب اود ن عا م ال آ م این عا م ال ا ي م این در ي ا ك کانفورماسیون محکم و انعطاف ناپذيری قرار دارد که اين مساله نقش مهمی در تعیین سااختمان فااايی پاروتئینهاا برعهده دارد. 2- اسیدهای آمینه حلقوی (Aromatic) : اسیدهای آمینه فنیل آالنین تیروزين و تريپتوفان در اين طبقه قرار دارند. تمام اسیدهای آمینه زیر در شاخه جانبي خود گروه های حلقوی دارند بجز)ارشد 21-22( 4( آسیارتیك اسید 0( تريپتوفان 0( هیستیدين 1 (تیرورين پاسخ: گزينه 4 اين اسیدهای آمینه بطور نسبی غیرقطبی هستند. 3

اسیدهای آمینه حلقوی آروماتیك تیروزين و تريپتوفان و به میزان کمتری فنیل آالنین نور را در منطقة فرا بنفش violet) (Ultra به صورت قابل مالحظهای جذب میکنند. اندازهگیری جذب نور در طول موج 083 نانومتر به وسیلة اسپکتروفتومتر روشی سريع برای تخمین زدن مقدار پروتئین يك محلول است. تمام اسیدهای آمینه در فرابنفش دور )کمتر از 003 نانومتر( نور را جذب میکنند. 3- اسیدهای آمینه قطبي بدون بار اين گروه از اسیدهای آمینه به دلیل داشتن گروههای عاملی که می توانند در آب پیوند هیدروژنی تشکیل دهند قطبی بوده لذا در آب قابلیت حل شدن دارند. اسیدهای آمینه اين گروه شامل اسیدهای آمینه سرين ترئونین سیستئین آسپاراژين و گلوتامین می باشند. 4

ترئونین شبیه ايزولوسین دارای يك مرکز نامتقارن اضافی است ولی فقط يك نوع ايزومر آن در پاروتئین هاا وجاود دارد. سیستئین دارای يك گروه سولفیدريل يا تیول (-SH) است قطبیت سرين و ترئونین به دلیل گروه هیدروکسیل در سیستئین به دلیل گروه تیول و در آساپاراژين و گلوتاامین باه واسطه گروههای آمیدی آنها می باشد. گروه های سولفیدريل)تیول( از دو اسید آمینه سیستئین ممکن است اکسید شده و پیونادهای دی ساولفیدی (S-S) را تشکیل دهند که اين پیوند نقش مهمی در پايداری ساختار پروتئین دارد. 4- اسیدهای آمینه با بار منفي)اسیدی( اسیدهای آمینه آسپارتات و گلوتامات در اين گروه قرار دارند که در ساختار خود عالوه بر گروه کربوکسیل متصل به کربن آلفا دارای يك گروه کربوکسیل در زنجیره جانبی خود می باشند. گروه کربوکسیل موجود در زنجیره جانبی در ph فیزيولوژيك يونیزه شده دارای بار منفی است. 5

اين دو اسید آمینه و به خصوص گلوتامات نقش مهمی در انتقال عامل آمین در متابولیسم اسیدهای آمینه دارند. 5- اسیدهای آمینه با بار مثبت )بازی( اين گروه از اسیدهای آمینه شامل اسیدهای آمینه لیزين آرژنین و هیستیدين میباشند. لیزين در اکثر پروتئینها خصوصا هیستونها به میزان زيادی يافت میشود. در کالژن پس از اتمام سنتز بعای از لیزينهای موجود اکسید شده تولید دلتا هیدروکسی لیزين میکند. آرژنین در ساختار پروتئینهايی مانند هیستون و پروتامین به فراوانی يافت میشود. آرژنین بسیار بازی است وگروه انتهايی اين اسید آمینه شامل 0 ازت میباشد که به آن گوانیدين (Guanidine) میگويند. هیستیدين در اکثر پروتئینها وجود دارد ولی مقدار آن در هموگلوبین نسبتا زياد است. کدام اسید آمینه در زنجیره جانبي خود گروه هیدروکسي ندارد )ارشد 22-23( 1 (هیستیدين 0 (سرين 0 (تیروزين 4 (تره اونین پاسخ: گزينه ( 1 به جز هیستیدين بقیه اسید آمینه الکلی هستند( هیستیدين تنها اسیدآمینهای است که در ph فیزيولوژيك نقش تامپونی دارد. در PH فیزیولوژیک کدام اسید آمینه ظرفیت ماکزیمم دارد )ارشد 28( 6

1 (آرژنین 0 (هیستیدين 0 (والین 4 (اسید گلوتامیك پاسخ: گزينه 0 اسیدهای آمینه غیر استاندارد اين اسیدهای آمینه مشتقات برخی از اسیدهای آمینه استاندارد میباشند. 4 ا هیدروکسی پرولین از پرولین و 5 - هیدروکسی لیزين از لیزين مشتق می شوند که در اثر عمال هیدروکسیالسایون پس از اتمام سنتز کالژن تولید می شوند. c متیل لیزين شکل متیله لیزين است که در ساختار میوزين پروتئین ماهیچه سیتوکروم N 6- وجود دارد. تریمتیال لیزين در پروتئین کالمدولین وجود دارد. گاما- کربوکسی گلوتامات در فاکتورهای انعقادی نظیر پروترومبین وجود دارد. دسموزين (Desmosine) مشتقی از چهار اسید آمینه لیزين است که در پروتئین رشاتهای االساتین (Elastin) وجاود دارد. سیستین از پیوند دیسولفیدی بین دو اسیدآمینه سیستئین ايجاد میشود. سلنوسیستئین در اثر جانشینی سلنیوم به جای گوگرد در ساختار اسید آمینه سیستئین ايجاد می شود. متیل هیستیدين در ساختار اکتین و میوزين و دیپپتید آنسرين وجود دارد. 7

اسیدهای آمینه غیر پروتئیني اغلب اين اسیدهای آمینه مشتقاتی از ال ا آلفا اسیدهای آمینه موجود در پروتئینها هستند ولی هیچگاه در پروتئینها ديده نمیشوند. اسیدهای آمینه بتا گاما و دلتا نیز شناخته شدهاند. 1 ا نوع آلفا )( : مانند اورينیتین (Orinithine) و سیترولین (Citrullin) که از مشتقات آرژنین بوده در سیکل اوره بعنوان واسطه شیمیايی عمل میکنند. 0 ا نوع بتا )( : در اين اسیدهای آمینه عامل آمین روی کربن قرار دارد مانند ا آالنین که جزئی از ساختمان اسید ) B 5 میباشد. پانتوتنیك )ويتامین (- ا نوع گاما )( : در اين اسیدهای آمینه عامل آمین روی کربن قرار دارد مانند اسید گاما ا آمینو بوتیريك 0 acid) Aminobutyric که به عنوان يك واسطه شیمیايی جهت انتقال جريان عصبی عمل میکند نکته: کربن متصل به عامل کربوکسیل را آلفا مینامند و ساير کربنهای موجود در آمینواسید را به ترتیب فاصلهای که از کربن آلفا دارند با حروف بتا گاما و دلتا نشان میدهند. برخی از اسیدهای آمینه غیر پروتئینی دارای آرايش فاايی D میباشد. D-glutamic acid در ديوارة سلولی بسایاری از باکتريهاا يافات مای شاود D-Alanine در الرو ياا شافیره برخای از حشرات و D-Serine در کرم خاکی وجود دارند. یونیزاسیون اسیدهای آمینه اسیدهای آمینه دارای عوامل آمین و کربوکسیل هستند که بصورت محلول يونیزه می شوند. يونیزاسیون عامل NH 0 و COOH نسبت به ph محلول متغیر است و بار خالص هر اسید آمینه بستگی به ph محیط دارد. در ph خنثی اسیدهای آمینه فاقد گروه R قابل يونیزه شونده در محیط آبی دارای گروه های کربوکسیل و آمین به + - COO و NH بوده و اسیدهای آمینه به صورت يك مولکول دو قطبی می باشند. صورت 0 8

به مولکول که دارای بار )+( و )-( اصطالحا زويتريون (Zwittrion) میگويند که میتواند هم به عنوان اسید و هم به عنوان باز عمل کند.ترکیباتی که دارای چنین ماهیتی هستند آمفوتر و گاهی آمفولیت (ampholyte) خوانده می شوند. منحني تیتراسیون اسیدهای آمینه )انیمیشن 111( جهت رسم منحنی تیتراسیون اسیدهای آمینه محیط را اسیدی نموده و سپس اسید آمینه را با يك باز تیتر می کنند. با قرار دادن تغییرات ph در محور y و میزان باز مصرفی در محور x منحنی تیتراسیون شکل می گیرد. گاليسین و اسیدهای آمینه ای که فاقد گروه R قابل يونیزه شونده هستند تقريبا دارای منحنی مشابه يکديگر هستند. منحني تیتراسیون اسید آمینه گالیسین در ph اسیدی تا نقطه ای که )0304 = 1 ) pk قدرت اسیدی محیط بیشتر از قدرت اسیدی گروه COOH اسید آمینه است اين گروه يونیزه نمی شود. در حالیکه گروه آمین يك پروتون از محیط گرفته يونیزه می شود در نتیجه در اين نقطه بار گاليسین 1+ است. در ادامه تیتراسیون از قدرت اسیدی محیط نسبت به گروه COOH اسید آمینه کاسته می شود. در نتیجه اين گروه يونیزه می شود که در اين نقطه مجموع بار مثبت و منفی اسید آمینه صفر می شود و اسید آمینه هی بار خالصی ندارد. به ph ای که در آن مجموع بارهای مثبت ) 0 + (NH و منفی ) - (COO اسیدهای آمینه برابر صفر بوده و اسید آمینه در اين ph فاقد بار الکتريکی است ph ايزوالکتريك ) i (ph گويند. حضور کدام دسته از اسیدهای آمینه زیر باعث مي شود تا PH )28 ایزوالکتریک پروتئین باالتر باشد )ارشد Phe, Trp, Gly, Pro)0 Thr, Ile, Leu, Ala )1 Gly, Tyr, Arg, Lys)4 Gln, Cys, Glu, Asp)0 + با ادامه روند تیتراسیون گروه آمین نیز يونیزه شده و از حالت NH 0 به NH 0 تغییر می کند. در اين نقطه ) 0 (pk مجموع بار اسید آمینه 1- می باشد. 9

شکل منحنی تتراسیون و همچنین بارخااص در ph ه اای متف اا وت ب ا رای اس ای دهای آ مین اه ب اار دار مث ال گ لوتا م اات و هیستیدين متفاوت است. (ph i ) ایزوالکتریک ph در اين ph مجموع بارهای مثبت ) 0 + (NH و منفی ) - (COO اسیدهای آمینه برابر صفر است. 11

چنانچه اسید آمینه در محیطی قرار بگیرد که ph آن محیط پايین تر از ph i باشد اسید آمینه دارای بار مثبت بوده + خاصیت اسیدی پیدا می کند ( فرمهای NH 0 وCOOH غالب می باشند(. چنانچه اسید آمینه در محیطی قرار بگیرد که ph آن محیط باالتر از ph i باشد اسید آمینه دارای بار منفی بوده خاصیت قلیايی پیدا می کند ( فرمهای NH 0 محاسبه ph i اسیدهای آمینه -1 و - COO غالب می باشند(. جهت محاسبه ph i اسیدهای آمینه Asp و Glu )دارای زنجیره جانبی اسیدی ) pk عوامل اسایدی را جماع و بار 0 تقسایم ph i COOH pk R pk1 2 COOH 2 اسیدهای آمینه Lys His و Arg )دارای زنجیره جانبی قلیايی( pk می کنیم. -0 جهت محاسبه ph i عوامل قلیايی را جمع و بر 0 تقسیم ph i pk NH pk 2 3 3 R 2 می کنیم. جهت محاسبه ph i اسیدهای آمینه ديگر )دارای زنجیره جانبی غیر يونی( pk عامل آمین را با عامل کربوکسیل جمع -0 و بر 0 تقسیم می کنیم. ph i pk ( ) 1 COOH pk2 NH 3 2 پپتیدها )انیمیشن 66 )3 6 63 2 6118 611 668 اتصال اسید های آمینه به دنبال يکديگر ايجاد يك توالی منظم از اسید آمینه را سبب می شود که به اين مولکول ايجاد شده پپتید گويند. برای اتصال دو اسید آمینه عامل کربوکسیل کربن آلفا از اسید آمینه اول و گروه آمین از اسید آمینه دوم وارد واکنش می شوند. با کم شدن يك مولکول آب از اين دو اسید آمینه يك پیوند کوواالن موسوم به پیوند پپتیدی bond) (peptide ايجاد می شود. 11

اگر دو سه يا چهار اسید آمینه به هم اتصال يابند به ترتیب دی تری تترا پپتید شکل می گیرد. اگر تعداد کمی اسید آمینه به هم متصل شوند به آن اولیگوپپتید (oligopeptide) گويند. اگر تعداد زيادی اسید آمینه به هم اتصال يابند ساختار حاصله را پلی پپتید (polypeptide) می خوانند. در ساختار يك پپتید يا پروتئین به هر يك از اسیدهای آمینه شرکت کننده يك باقیمانده آمینواسیدی (amino acid residue) گويند. برای نشان دادن ساختار پپتیدها روی صفحه قسمت آمین آزاد انتهايی (N-terminal) را در طرف چپ صفحه و قسمت کربوکسیل آزاد انتهايی ( C-terminal )را در طرف راست قرار میدهند. از پپتیدهای مهم می توان به تری پپتید گلوتاتیون دی پپتید کارنوزين و دی پپتید آسپارتام اشاره کرد. بعای از آنتی بیوتیکها مانند گرامیسیدين S و تیروسیدين A دارای سااختار پپتیادی هساتند و غالباا در سااختار آنهاا آمینو اسید از سری D نیز مشاهده میشود. گروهی از هورمونها نیز دارای ساختار پپتیادی هساتند کاه از آن جملاه مایتاوان باه هورماون ضاد ترشاا ادرار ياا وازوپرسین هورمون تحريك کنندة غده فوق کلیوی يا ACTH و برادی کینین موجود در پالسما )تنظیم کنندة فشاار خون( اشاره کرد. خصلت اسیدی و بازی پپتیدها اسیدهای آمینه حداقل دارای 0 گروه اسیدی (-COOH) و آمینی (-NH0) هستند. در ph اسیدی تمامی اسیدهای آمینه دارای بار مثبت هستند. در ph بار منفی می باشند. ايزوالکتريك اسیدهای آمینه بدون بار ( برآيند بارهای موجود صفر است( و در ph بازی دارای 12

( NH + 0 - های شديدا اسیدی که تمامی گروهها پروتونه هستند بار خالص همه اسیدهای آمینه مثبت است ph در. CHR-COOH ) اسیدهای آمینه لیزين آرژينین و هیستیدين در ph های شديدا اسیدی دارای بار 0+ هستند و ساير اسیدهای آمینه بار 1+ دارند. در ph های شديدا قلیايی همه اسیدهای آمینه دارای بار منفیاند ) - -CHR-COO.(NH 0 اسیدهای آمینه گلوتامات و آسپارتات که در زنجیره جانبی خود دارای گروه عاملی( - (-COO شديدا قلیايی دارای بار خالص هستند در ph های 0- هستند. در شرایط فیزیولوژیک دارای کدام بار الکتریکي +1)4 پپتیدی با ساختمان Val-Trp-Glu-Asp-Lys-Leu-Met است )ارشد 22-28( 0 (صفر -1)0-0)1 پاسخ: گزينه 0 )در ph فیزيولوژيك Asp و Glu اين بارها 1- است( دارای بار منفی و Arg Lys و His دارای بار مثبت است. در تست باال برايند تعیین توالي و نوع اسیدهای آمینه در پپتیدها برای تعیین تعداد و انواع اسیدهای آمینه تشکیل دهنده يك قطعه پپتیدی پلی پپتیدی يا پروتئین ابتدا بايد تمام پیوندهای پپتیدی هیدرولیز شود که توسط اسید باز يا آنزيم اين فرايند انجام می گیرد. هیدرولیز اسیدی بیشتر پروتئین ها در حاور اسیدهای قوی مثل HCl 6 نرمال و دماهای باال به طور کامل هیدرولیز می شوند.يکی از معايب بزرگ اين روش تخريب اسیدهای آمینه ای مثل Ser Thr Trp و يا تبديل اسیدهای آمینه مثل Gln و Asn به Glu و Asp می باشد. 13

هیدرولیز قلیايی هیدرولیز قلیايی پروتئین ها با جوشاندن در محیط NaOH غلیظ انجام می شود. هیدرولیز قلیايی فقط برای شناسايی اسید آمینه تريپتوفان انجام می گیرد که در هیدرولیز اسیدی ناپايدار است. هیدرولیز قلیايی نیز مانند هیدرولیز اسیدی دارای معايبی است که می توان به تجزيه اسیدهای آمینه سرين ترئونین آرژينین و سیستئین اشاره نمود. همچنین در اين روش اسیدهای آمینه دچار راسمیزاسیون (racemization) شوند. هیدرولیز آنزیمي )انیمیشن 6131 )132 6133 6131 در داخل سلول هیدرولیز پیوند پپتیدی به وسیله گروه خاصی از آنزيم ها به نام پپتیدازها (peptidases) صورت می گیرد که به عناوين پروتئاز (protease) و يا پروتئیناز (proteinase) نیز شناخته می شوند. هیدرولیز آنزيمی نسبت به هیدرولیز اسیدی آهسته تر صورت می گیرد. پپتیدازها به دو صورت وجود دارند: الف( اگزوپپتیدازها (Exopeptidases) که باعث هیدرولیز اسیدهای آمینه انتهايی شده و به دو گروه تقسیم می شوند : آمینوپپتیدازها (Aminopeptidases) باعث هیدولیز زنجیره پلی پپتیدی از سمت انتهای آمینو می شوند. کربوکسی پپتیدازها (Carboxypeptidases که هی د ولی ز ز نجی ره پ ل ای پپتی ا دی را از س ا مت ا نته اای ک ر بوک س ای ا نج اا م م ای -1-0 دهد. ب) اندوپپتیدازها (Endopeptidases) پیوندهای پپتیدی را در داخل يك زنجیر پلی پپتیدی هیدرولیز می کنند که به مهم ترين آنها در جدول زير آورده شده است: بعد از هیدرولیز پروتئین ها اسیدهای آمینه حاصله را می توان به وسیله کروماتوگرافی يا الکتروفورز از هم جدا نمود. آنزیم 14

تریپسین پیوند پپتیدی ازسمت کربوکسیل باقیمانده های آمینو اسیدی Lys و Arg باقیمانده بعدی ) n Pro (R نباشد. در صورتیکه کیموتریپسین انیمیشن 213 پیوند پپتیدی ازسمت کربوکسیل باقیمانده های آمینو اسیدی Trp Tyr Phe و Leu صورتیکه باقیمانده بعدی ) n Pro R) نباشد. در پپسین ترومبین پیوند پپتیدی ازسمت آمین باقیمانده های آمینو اسیدی Phe و Trp Tyr و Leu صورتیکه باقیمانده قبلی ) 1-n Pro R) نباشد. پیوند پپتیدی ازسمت کربوکسیل باقیمانده آمینو اسیدی Arg پیوند پپتیدی ازسمت کربوکسیل باقیمانده های آمینو اسیدیAsp و Glu در پروتئاز V2 االستاز ترومولیزین پیوند پپتیدی ازسمت کربوکسیل باقیمانده های آمینو اسیدی Ser Gly Ala صورتیکه باقیمانده بعدی ) n Pro R) نباشد و Val در پیوند پپتیدی ازسمت آمین باقیمانده های آمینو اسیدی Tyr Trp Phe Met Ile و Val در صورتیکه باقیمانده قبلی ) 1-n Pro R) نباشد. عالوه بر روش های آنزيمی ذکر شده از برومو سیانوژن( CNBr ) به عنوان يك روش شیمیايی که باعث هیدرولیز باقیمانده آمینو اسیدی Met از سمت کربوکسیل آن می شود نیز می توان استفاده نمود. ترکیب CNBr پیوند پپتیدی در محل کدام اسید آمینه در زنجیرة پلي پپتیدی را مي شکند )ارشد 28( Met )4 Gly)0 Val)0 Asn)1 پاسخ: گزينه 4 الزم به ذکر است اگر پروتئینی در ساختار خود دارای پیوندهای دی سولفیدی می باشد بايد ابتدا اين پیوندها تخريب شود که توسط اسید پرفرمیك acid) performic )پیوند دی سولفیدی اکسید شده و ايجاد دو باقیمانده اسید سیستئیك می کند. بتای اسیدهای آمینه دارای گروه آمینو آزاد با نین هیدرین کمپلکس رنگی ايجاد میکنند )بجز پرولین که گروه ايمینو دارد(. فلورسکامین نقشی مشابه با نین هیدروين ايفا میکند و حساسیت باالتری از آن دارد. از روش کروماتوگرافی اليه نازک )TLC( برای جداسازی اسیدهای آمینه از مايعات بدن استفاده میکنند که در تشخیص اولیه بیماریهای متابولیکی اسیدهای آمینه کاربرد دارد. از روشهای زير برای تعیین مقدار اسیدآمینه در مايعات بدن استفاده میشود: 1- کروماتوگرافی گازی 0- کروماتوگرافی با کارآيی زياد )HPLC( 0- کروماتوگرافی تعويض کاتیونی 4- الکتروفورز 5- اسپکترومتری جرمی.)MS( 15

و 0 مرکز تخصصی خدمات آموزشی گروه پزشکی فرهنگ گستر نخبگان تعیین توالي اسیدهای آمینه برای تعیین توالی باقیمانده های آمینو اسیدی از دو روش مرسوم استفاده می شود. الف( روش سنگر يا فلئورودی نیترو بنزن( FDNB ) )انیمیشن 121( 6132 فردريك سنگر( sanger (Fredrick در سال 1550 برای اولین بار موفق به تعیین توالی هورمون انسولین شد. سنگر برای اين فرايند از ترکیب 1 -فلئورو- 4 -دی نیتروبنزن( FDNB ) استفاده کرد که با انتهای آمینی باقیمانده آمینو اسیدی پلی پپتید ترکیب و نشانه گذاری می شود. در اثر مجاورت با اسید و هیدرولیز کامل پلی پپتید اسیدهای آمینه آزاد و همچنین اسید آمینه انتهايی نشانه گذاری شده در محیط ايجاد می گردد که می توان آن را شناسايی نمود. از اين روش فقط می توان برای شناسايی اسیدهای آمینه انتهايی استفاده نمود )قسمت الف شکل زير(. به کمک کدام واکنش به سادگي مي توان اولین اسید آمینه در یک زنجیره پلي پپتیدی را شناخت )ارشد 21-22( 0( ادمن 1 (سانگر پاسخ: گزينه 1 0( نین هیدرين 4( دنسیل کلرايد 16

ب ) روش ادمن( Edman ) يا فنیل ايزو تیوسانات با کمك روش ادمن کل يك پپتید را می توان تعیین توالی نمود.در اين روش در شرايط قلیايی ماليم فنیل ايزوتیوسیانات (phenylisothiocyanate) با عامل آمین انتهای پپتید واکنش داده و تشکیل (PTC) فنیل تیوکربامويل (phenylthiocarbamyl) می دهد. در اين هنگام پیوند پپتیدی مجاور فنیل تیوکربامويل توسط اسید انیدريدتری فلئوراستیك acid) (trifluoroacetic تجزيه میشود که نتیجه آن يك مشتق آنیلینوتیازولینون (anilinothiazolinone) است که در خود دارای اسید آمینه انتهای پپتید است.در اثر اين تجزيه پپتید کوتاهی شکل می گیرد که می تواند همین مراحل را تکرار کند. آنیلینوتیازولینون در محیط اسیدی به مشتق پايدار ديگری به نام فنیل تیوهیدانتوئین (phenylthiohydantoin) تبديل می شود که مورد شناسايی قرار می گیرد. در حال حاضر تعیین توالی انواع پپتیدها با روش ادمن در دستگاهی به نام سکوئناتور (sequenator) به طور اتوماتیك و با دقت بسیار بااليی انجام می گیرد. پروتئین ها )انیمیشن 111-3 1-112-113-11 -61-8 ( در اثر اتصال تعداد زيادی اسید آمینه پلی پپتیدهايی با وزن مولکولی باال ايجاد می شود که به آن پروتئین (Protein) می گويند. نکته: چنانچه پلی پپتیدی دارای وزن بیش از 13333 باشد به آن پروتئین و اگر کمتر از 13333 باشد به آن پلی پپتید گويند. ساختار پروتیئن structure) (Protein )انیمیشن 11( ساختار اول structure) (Primary )انیمیشن 6 ( ساختار اول پروتئینها ترتیب قرار گرفتن اسیدهای آمینه در يك رشته پروتئینی را نشان میدهد. اين ساختار میتواند شامل پیوندهای دی سولفیدی (- S -) S - نیز باشد. اتصال بین اتم کربن گروه کربونیل و اتم نیتاروژن گاروه پپتیادی (- CO -) NH - دارای خاصایت پیونادهای دوگاناه است و آزادی چرخش در اطراف اين پیوند وجود ندارد. دو آرايش فاايی سیس و ترانس برای پیوند پپتیدی مسطا امکان پذير است. 17

در آرايش فاايی ترانس دو اتم کربن α در دو سمت مخالف پیوند پپتیدی قرار دارند. در آرايش سیس اين دو گروه در يك سمت پیوند پپتیدی قرار دارند. تقريبا تمام پیوند های پپتیدی در پروتئین ها به صورت ترانس هستند. پیوند بین گروه آمین و اتم کربن α و همچنین کربن α با کربن گروه کربونیل پیوندهای کامال ساده می باشند. دو واحد پپتیدی انعطاف پذير مجاور هم می توانند حول اين پیوندها بچرخند و جهت گیريهای مختلفی به خود بگیرند. آزادی چرخش حول دو پیوند هر آمینواسید تاخوردن پروتئینها در جهات مختلف را امکان پذير می سازد. زاويه چرخش حول پیوند بین نیتروژن واتم کربن α فی φ و زاويه چرخش حول پیوند کربن α و کربن گروه کربونیل را سای ψ نامیده می شود. زوايای چرخشی از صفر تا ±183 قابل فرض می باشد. از آنجايیکه زنجیره های جانبی قادر به ايجاد ممانعت فاايی با يکديگر هستند اين زوايا محدود می باشند. راماچاندران مقادير مجاز برای زوايای φ و ψ را در يك صفحه دوبعدی بصورت نقشه ای ترسیم کرد که با نام خود وی معروف است. شکل زير نقشه راماچاندران برای پلی L- آالنین را نشان می دهد. 18

چنانچه در شکل مشاهده می شود زوايايی از φ و ψ که در محدوده پر رنگ واقع شده اند معرف ساختمان هايی هستند که در آنها زنجیره های جانبی با يکديگر تداخلی ندارند و نواحی بدون رنگ نواحی هستند که اگر زوايای φ و ψ در آن محدوده واقع شوند ممانعت فاايی میان زنجیره های جانبی خواهیم داشت. ساختار دوم Structure) (Secondary )انیمیشن 1 ( ساختارهای منظم و تکراری شامل مارپی α و صفحه چین دار β می باشند. عامل اصلی تشکیل اين ساختارها پیوند هیدروژنی است. مارپیچ (α-helix) α α يکی از شايع ترين اشکال ساختار ثانويه در ساختمان پروتئین های کروی و رشته ای می باشد. -1 مارپی اسکلت پلی پپتیدی حول يك محور فرضی به طور محکم پیچیده می شود کاه در آن سااختار باین گاروه کربونیال باقیمانده i و گروه آمین چهار باقیمانده بعد خود يعنی باقیمانده 4+i پیوند هیدروژنی برقرار می شود. 19

برای نزديك شدن اين دو باقیمانده زنجیره پلی پپتیدی حول يك محور فرضی در جهت عقربه های ساعت و يا در خالف جهت عقربه های ساعت پی می خورند. در صورت حاور اسیدهای آمینه با ساختار L مارپی در جهت عقربه های ساعت يا به عبارتی بصورت راسات گارد ايجاد پی می کند و در صورت وجود اسیدهای آمینه فرم D يك مارپی به صورت چاپ گارد و در جهات خاالف عقربه های ساعت ايجاد می شود. شکل طبیعی ساختمان مارپی α بصورت راست گرد می باشد و فرم چپ گرد ماارپی α در پپتیادهای مصانوعی باا اسیدهای آمینه در فرم D وجود دارد. (n) ارتفااع دارد تعاداد 0/6 باقیماناده آمینواسایدی 5/4Å کاه (p) در يك دور کامل مارپی α در ساختمان مارپی قرار دارد. ارتفاع يك باقیمانده آمینواسیدی به موازت محور طولی مارپی ( d( برای مارپی α برابر 1/5Å مایباشاد. d را می توان از فرمول زير محاسبه نمود: d p n در ساختمان مارپی α گروه های R ريشه های اسیدآمینه به سمت خارج ساختمان مارپی قرار می گیرد. زاويه مجاز برای ريشه های اسیدآمینه های موجود در ساختمان ماارپی α بصاورت 44- = ψ باشد. و 54-= φ درجاه مای مارپی α به علت سهولت در ايجاد مارپی به عنوان فراوان ترين ساختمان در بین پروتئین ها مای باشاد بطوريکاه در حدود 05 درصد اسیدهای آمینه موجود در يك پلی پتید در ساختمان α حاور دارند. 21

در کنار پايداری اين ساختار عواملی نیز وجود دارد که می تواند برهم زننده اين نظم مناسب باشند که شامل: 1- تاثیر زنجیره های جانبی اسیدهای آمینه: وجود تعداد زيادی اسیدهای آمینه باردار مثل Glu در کنار هم می توانند به دلیل داشتن با منفی در ph=4 ايجاد دافعه کند.همچنین در مورد اسیدهای آمینه ای مثل Lys يا Arg که در ph=4 دارای بار مثبت هستند نیز صادق باشد. 0- شکل و يا حجم گروه های : R α می شوند. حجم و شکل اسیدهای آمینه ای مثل Asn Thr Leu و يا سرين نیز سبب ناپايداری مارپی 0- میانکنش بین گروه های R با فاصله 0 يا 4 باقیمانده از هم: باقیمانده های دارای بار مثبت يا منفی در ساختمان مارپی α در فاصله 0 و گاهی 4 اسیدآمینه از يکديگر قرار می گیرند.در غیر اينصورت به علت ايجاد دافعه بین آنها مارپی α تشکیل نمی شود.باقیمانده های آمینواسیدی دارای بار مثبت اغلب به 21

فاصله 0 باقیمانده از اسیدهای آمینه دارای با منفی قرار می گیرند تا امکان ايجاد يك جفت آنیونی فراهم شود.همین مسئله در ارتباط با اسیدهای آمینه آروماتیك که امکان واکنش های آب گريز را دارند نیز صادق است. -4 باقیمانده های Pro و : Gly وجود باقیمانده های Pro و Gly باعث از بین رفتن مارپی α می شود.در ساختمان اسیدآمینه پرولین به دلیل اينکه اتم نیتروژن بخشی از يك حلقه محکم بوده و محدوديت زاويه (N-C α ) φ دارد ايجاد يك پیچیدگی شديد در مارپی α می کند که باعث از بین رفتن و شکستن اين ساختمان می شود. پرولین معموال در دور اول مارپی α می تواند قرار گیرد. Gly نیز به علت انعطاف پذيری بااليی که دارد بیشتر تمايل به ايجاد اشکال فنری شکل دارد 5- وجود باقیمانده های باردار در دو انتهای مارپی : α وجود دوقطبی های حقیقی ايی که در دو انتهای ساختمان مارپی α وجود دارد باعث افزايش طول مارپی می گردد.اين دوقطبی ها که بصورت مثبت در انتهای آمین و منفی در انتهای کربوکسیل رشته پلی پپتیدی موجود در مارپی α می باشد باعث می شود که چهار باقیمانده آمینواسیدی در هر انتها در ساختار مارپی α شرکت نکنند. قرار گرفتن باقیمانده های آمینواسیدی با بار منفی در انتهای کربوکسیل و همچنین باقیماناده هاای آمینواسایدی مثبات در انتهای آمین می تواند باعث ناپايداری مارپی α گردد. 22

اسیدهای آمینه ای مثل آالنین و لوسین تمايل بسیاری به حاور در اين فرم را دارند گلیسین آساپاراژين و پارولین بارای حاور در ساختمان مارپی α از خود تمايل زيادی نشان نمی دهند. کدام دسته از اسیدهای آمینه زیر تمایل بیشتری برای مشارکت درساختار دوم مارپیچ آلفا دارند )ارشد )22-28 1 (گاليسین و پرولین 0( گلوتامیك اسید و متیونین 0 (گاليسین و گلوتامیك اسید 4 (پرولین و میتونین 23

پاسخ: گزينه 0 α کمتر دیده مي شود )ارشد 81-82 ( Leu)4 کدام اسید آمینه در ساختمان مارپیچ Glu)0 Gly)0 Lys)1 پاسخ: گزينه 0 های ديگری نیز می تواند در ساختمان پروتئین ها تشکیل شود. ساختمان سایر مارپیچ ها عالوه بر مارپی α مارپی ساختمان مارپی ها را بصورت n m نمايش می دهند که در آن n معرف تعداد باقیمانده های موجود در يك دور کامل و m تعداد اتم های موثر در ايجاد آن دور کامل می باشد. ساختمان مارپی α به صورت 0/6 10 بیان می شود. ساير مارپی ها شامل: ريبون ( 0/0 4 4 ) Ribbon 030 : با توجه به زوايای چرخشی غیرمجاز برای اين ساختار اين ساختار در پروتئین ديده نمی شود. :) 0 13 helix ( مارپی راست گرد 0 13 ارتفاع مارپی در اين ساختار 6 Å می باشد که نسبت به مارپی α دارای ساختاری بلندتر وهمچنین باريکتر می باشد. زوايای چرخشی اين ساختار در ناحیه نزديك به ساختار مارپی α قرار دارد. فقط در موارد کمی در انتهای يك مارپی α و بخش بعدی يك زنجیره پلی پپتیدی به عنوان يك دور( turn ) دياده می شوند. 24

: ) π helix ( مارپی π 4/4 16 نیز خوانده می شود به دلیل پهن و گسترده بودن فقط در انتهای تعداد کمی از مارپی اين مارپی که به نام مارپی های α ديده می شود. 2- صفحات چین دار )β-sheet( β در ساختمان کونفورماسیون β رشته های پلی پپتیدی )که به آنها رشته های β گفته می شود( به صورت يك ساختار زيگزاگی و نه بصورت مارپیچی پهلو به پهلوی يکديگر قرار می گیرند. در نتیجه ايجاد پیوندهای هیدروژنی بین گروهای CO و NH 0 زنجیره پلی پپتیدی که به موازات هم قرار دارند صفحه β تشکیل می شود. نکته مهم: داوطلبین محترم توجه فرمایید که با تهیه این جزوات دیگر نیاز به خرید هیچ گونه کتاب مرجع دیگری نخواهید داشت. برای اطالع از نحوه دریافت جزوات کامل با شماره های زیر تماس حاصل فرمایید. 906/33090936-33090966-90630006393 )رشت( 966/66666990 )الهیجان( 966/20620926 25