ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ. Μαλαφούρης Αναστάσιος-Ελευθέριος. Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ. Αναστασία Λαγοπόδη

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Αξιολόγηση της δράσης των βιοπαραγόντων Bacillus cereus Σ76, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 επί των τήξεων από Sclerotium rolfsii σε τοµάτα και από Sclerotinia sclerotiorum σε ηλίανθο ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Μαλαφούρης Αναστάσιος-Ελευθέριος Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Αναστασία Λαγοπόδη ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014 1

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Αξιολόγηση της δράσης των βιοπαραγόντων Bacillus cereus Σ76, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 επί των τήξεων από Sclerotium rolfsii σε τοµάτα και από Sclerotinia sclerotiorum σε ηλίανθο ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Μαλαφούρης Αναστάσιος-Ελευθέριος Γεωπόνος Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Αναστασία Λαγοπόδη ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Αναστασία Λαγοπόδη, Επίκ. Καθηγήτρια Φυτοπαθολογίας, Τµήµα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, ασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος Α.Π.Θ. (Επιβλέπουσα) 2. Γεώργιος Καραογλανίδης, Επίκ. Καθηγητής Φυτοπαθολογίας-Μυκητολογίας, Τµήµα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, ασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος Α.Π.Θ. (µέλος) 3. Βαρβάρα Μαλιόγκα, Λέκτορας Φυτοπαθολογίας-Ιολογίας, Τµήµα Γεωπονίας, Σχολή Γεωπονίας, ασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος Α.Π.Θ. (µέλος) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014 2

Πρόλογος-Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος Σπουδών του τοµέα Φυτοπροστασίας κατά τα έτη 2011 2013, στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τµήµατος γεωπονίας, της Σχολής Γεωπονίας, ασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερµές µου ευχαριστίες στην επιβλέπουσα καθηγήτριά µου και Επίκ. Καθηγήτρια Φυτοπαθολογίας, κυρία Λαγοπόδη Αναστασία για την αµέριστη στήριξη και εµπιστοσύνη της στο πρόσωπό µου και στη δουλειά µου καθ όλη τη διάρκεια των µεταπτυχιακών σπουδών µου καθώς και για την υποµονή που επέδειξε στις συχνές και επίµονες ερωτήσεις µου πάνω στην επιστήµη της Φυτοπαθολογίας και όχι µόνο. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα κυρία Κάµου Ναταλί-Νεφέλη για την υπερπολύτιµη και πάντα πρόθυµη βοήθειά της στην εξοικείωσή µου µε τον εργαστηριακό εξοπλισµό του εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας και γενικά στην οποιαδήποτε τεχνική δυσκολία αντιµετώπισα δουλεύοντας εκεί. Ακόµη, ευχαριστώ τα άλλα δύο µέλη της τριµελούς εξεταστικής επιτροπής, κ. Γεώργιο Καραογλανίδη, Επικ. Καθηγητή Φυτοπαθολογίας-Μυκητολογίας του Τµήµατος Γεωπονίας και την κυρία Μαλιόγκα Βαρβάρα, Λέκτορα Φυτοπαθολογίας-Ιολογίας, του Τµήµατος Γεωπονίας για την κριτική ανάγνωση της διατριβής µου και τις ουσιαστικές παρατηρήσεις και υποδείξεις τους. Ευχαριστώ θερµά, επίσης, τον καθηγητή κ. Κωβαίο ηµήτριο, Κοσµήτορα της Σχολής Γεωπονίας, ασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Α.Π.Θ για τις πολύτιµες συµβουλές του κατά τη διάρκεια των σπουδών µου σε θέµατα γεωπονικού και ποδοσφαιρικού ενδιαφέροντος. 3

Θέλω, επίσης, να ευχαριστήσω όλα τα άτοµα του εργαστηρίου που συνέβαλλαν µε διάφορους τρόπους στην πραγµατοποίηση της διατριβής µου αλλά και αυτούς που µε την παρουσία τους και µόνο έκαναν πολύ πιο ευχάριστη τη δουλειά µου στο χώρο αυτό. Ευχαριστώ, ακόµη, θερµά όλους τους καθηγητές που συνάντησα κατά τη διάρκεια της παρουσίας µου και της φοίτησής µου στη σχολή που µε έκαναν να αγαπήσω τη Γεωπονική επιστήµη και ιδιαίτερα την επιστήµη της Φυτοπαθολογίας και ήταν πάντα πρόθυµοι να λύσουν κάθε απορία µου (δεν ήταν και λίγες!!!). Ευχαριστώ θερµά, επίσης: Το προσωπικό του εργαστηρίου Γεωργικών Φαρµάκων στο Αγρόκτηµα του Τµήµατος Γεωπονίας, για τη βοήθειά τους και την παραχώρηση εργαστηριακού εξοπλισµού και σκευών για την εκχύλιση υπερκειµένων φυγοκέντρησης βακτηριακών καλλιεργειών και τη συµπύκνωσή τους καθώς και την κ. Παπαδοπούλου-Μουρκίδου Ευθυµία, Καθηγήτρια Γεωργικών Φαρµάκων, για την ενθάρρυνσή της στη χρησιµοποίηση της κριτικής µου σκέψης σε κάθε επιστηµονικό έντυπο που έπεφτε στα χέρια µου. Την κυρία Πετρίδου Ευανθία, Επίκ. Καθηγήτρια του Τµήµατος Κτηνιατρικής του ΑΠΘ για την ταυτοποίηση ενός βακτηριακού στελέχους µε βιοχηµική µέθοδο. Τον κ. Μενεξέ Γεώργιο, Λέκτορα Στατιστικής και Βιοµετρίας του Τµήµατος Γεωπονίας για τη σηµαντικότατη βοήθειά του στην πραγµατοποίηση της στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσµάτων της µεταπτυχιακής διατριβής µου. 4

Τον κ. Ευθυµίου Κωσταντίνο, γιατί δεν αρνήθηκε ποτέ να µου προσφέρει τη βοήθειά του σε οποιαδήποτε δυσκολία προέκυπτε στο χώρο του εργαστηρίου. Την κυρία Κάµου Ναταλί-Νεφέλη, την κυρία Μοράκη Καλλιόπη και τον κ. Λώτο Λεωνίδα, για την υπερπολύτιµη βοήθειά τους στη µοριακή ταυτοποίηση των βακτηρίων. Την κυρία Κάµου Ναταλί-Νεφέλη, για την παραχώρηση όλων των βακτηριακών στελεχών που χρησιµοποίησα στη διατριβή µου. Τον κ. Μάργαρη Αναστάσιο, αγρότη-παραγωγό και τον κ. Ουλή Χρήστο, γεωπόνο για τον πολύτιµο χρόνο που σπατάλησαν βοηθώντας µε ενεργά, παρόλο το βεβαρυµένο φόρτο εργασίας τους, στην διενέργεια των πειραµάτων αγρού στο Καλαµάκι Ζακύνθου και στην Αµαλιάδα Ηλείας, αντίστοιχα. Τέλος, ένα τεράστιο ευχαριστώ αξίζουν τα µέλη της οικογένειας µου, Χρήστος, Ντενίζ, ιονύσης και Κώστας για την οικονοµική αλλά και ηθική τους στήριξη στην οκτάχρονη φοίτησή µου στη Γεωπονική Σχολή, για τις αξίες που µου έχουν µεταδώσει και γιατί πολύ απλά υπάρχουν δίπλα µου και µου δίνουν δύναµη και κίνητρο να ασχοληθώ µε ακόµα περισσότερα πράγµατα στο µέλλον. Μαλαφούρης Αναστάσιος-Ελευθέριος Ιανουάριος 2014 5

Περιεχόµενα Σελ Πρόλογος-Ευχαριστίες 3 Περίληψη 13 Abstract 15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 17 1. Ο ρόλος και οι µηχανισµοί της βιολογικής καταπολέµησης στην αντιµετώπιση των ασθενειών των φυτών 17 1.1. Αλληλεπιδράσεις οργανισµών στη ριζόσφαιρα 19 1.2. Αλληλεπιδράσεις µεταξύ ωφέλιµων µικροοργανισµών και εδαφογενών παθογόνων- Μηχανισµοί βιολογικής δράσης 24 1.3. Είδη του γένους Pseudomonas, Bacillus, Serratia και Enterobacter ως βιοπαράγοντες 25 2. Εδαφογενείς φυτοπαθογόνοι µύκητες και ωοµύκητες και ασθένειες που προκαλούν 39 2.1. Βιολογία του εδαφογενούς φυτοπαθογόνου µύκητα Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary και τρόποι αντιµετώπισης 43 2.2. Βιολογία του εδαφογενούς φυτοπαθογόνου µύκητα Sclerotium rolfsii Sacc. και τρόποι αντιµετώπισης 47 6

ΚΕΦ. 1: Ταυτοποίηση των βακτηριακών στελεχών ΤοΖα4-8, ΤοΖα9-12 και ΤοΖα1-5-10 µε τη βοήθεια µοριακών και βιοχηµικών µεθόδων 54 1.1. Εισαγωγή 54 1.2. Υλικά και µέθοδοι 55 1.2.1. Ταυτοποίηση µέσω της αλληλούχησης της περιοχής ανάµεσα στο 16S rrna και 23S rrna 55 1.2.2. Ταυτοποίηση µέσω της βιοχηµικής µεθόδου api 20E 60 1.3. Αποτελέσµατα Συζήτηση 62 1.3.1. Ταυτοποίηση µέσω της αλληλούχησης της περιοχής ανάµεσα στο 16S rrna και 23S rrna. 62 1.3.2. Ταυτοποίηση µέσω βιοχηµικής µεθόδου api 20E 64 ΚΕΦ. 2: ράση ριζοβακτηρίων και µεταβολιτών τους επί εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων in vitro 66 2.1. Εισαγωγή 66 2.2. Υλικά και µέθοδοι 68 7

2.2.1. Αναστολή της ανάπτυξης εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων από τα στελέχη ριζοβακτηρίων σε διπλές καλλιέργειες in vitro 70 2.2.1.1. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων στο ίδιο τρυβλίο 70 2.2.1.2. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων σε διαφορετικά τρυβλία (αντικριστά) για τον έλεγχο της παρουσίας πτητικών ουσιών 71 2.2.1.3. Έλεγχος ικανότητας λύσης µυκηλιακών υφών- Βιοδοκιµή λύσης υφών 72 2.2.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici από τα βακτηριακά στελέχη Serratia marcescens ΤοΖα 4-8 και ΤοΖα 1-5-10 και Enterobacter cloacae ΤοΖα 9-12 73 2.2.2.1. ιαχωρισµός αντιµικροβιακών ουσιών από οργανικά εκχυλίσµατα καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων µε χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας Βιοδοκιµή TLC 73 2.2.2.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από οργανικά εκχυλίσµατα και από ακατέργαστα υπερκείµενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων Βιοδοκιµή microtiter 75 8

2.3. Αποτελέσµατα 78 2.3.1. Αναστολή της ανάπτυξης εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων από τα στελέχη ριζοβακτηρίων σε διπλές καλλιέργειες in vitro 78 2.3.1.1. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων στο ίδιο τρυβλίο 78 2.3.1.2. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων σε διαφορετικά τρυβλία (αντικριστά) για τον έλεγχο της παρουσίας πτητικών ουσιών 85 2.3.1.3. Έλεγχος ικανότητας λύσης µυκηλιακών υφών- Βιοδοκιµή λύσης υφών 89 2.3.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici από τα βακτηριακά στελέχη Serratia marcescens ΤοΖα 4-8 και ΤοΖα 1-5-10 και Enterobacter cloacae ΤοΖα 9-12 92 2.3.2.1. ιαχωρισµός αντιµικροβιακών ουσιών οργανικών εκχυλισµάτων καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων µε χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας Βιοδοκιµή TLC 92 2.3.2.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από οργανικά εκχυλίσµατα και από ακατέργαστα 9

υπερκείµενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων Βιοδοκιµή microtiter 94 2.4. Συζήτηση 96 ΚΕΦ. 3: ράση των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 επί εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων in planta 103 3.1 Εισαγωγή 103 3.2. Υλικά και Μέθοδοι 104 3.2.1. Επίδραση των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 στις τήξεις από το µύκητα Sclerotinia sclerotiorum σε φυτά ηλίανθου 104 3.2.2. Επίδραση των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 στις τήξεις από το µύκητα Sclerotium rolfsii σε φυτά τοµάτας 109 3.2.3. Επίδραση των βιοπαραγόντων Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και Bacillus cereus Σ76 στην ασθένεια που προκαλείται από τον µύκητα Sclerotium rolfsii σε φυτά τοµάτας στον αγρό ύστερα από τεχνητές µολύνσεις 111 10

3.2.4. Επίδραση των βιοπαραγόντων Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και Bacillus cereus Σ76 στην ασθένεια που προκαλείται από τον µύκητα Sclerotium rolfsii σε φυτά πιπεριάς (Capsicum annuum) στον αγρό ύστερα από φυσικές µολύνσεις 115 3.3. Αποτελέσµατα 116 3.3.1. Επίδραση των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 στις τήξεις από το µύκητα Sclerotinia sclerotiorum σε φυτά ηλίανθου 118 3.3.2. Επίδραση των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 στις τήξεις από το µύκητα Sclerotium rolfsii σε φυτά τοµάτας 118 3.3.3. Επίδραση των βιοπαραγόντων Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και Bacillus cereus Σ76 στην ασθένεια που προκαλείται από τον µύκητα Sclerotium rolfsii σε φυτά τοµάτας στον αγρό ύστερα από τεχνητές µολύνσεις 119 3.3.4. Επίδραση των βιοπαραγόντων Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και Bacillus cereus Σ76στην ασθένεια που προκαλείται από τον µύκητα Sclerotium rolfsii σε φυτά πιπεριάς (Capsicum annuum) στον αγρό ύστερα από φυσικές µολύνσεις 119 3.4. Συζήτηση 119 11

Βιβλιογραφία 124 12

Περίληψη Τα πολυάριθµα και δυσεπίλυτα προβλήµατα που έχουν προκύψει από την αποκλειστική, κατά περιπτώσεις, εφαρµογή χηµικών µέσων καταπολέµησης στη σύγχρονη γεωργία, οδήγησαν τη φυτοπροστασία σε πιο φιλικές προς το περιβάλλον και τους οργανισµούς µη-στόχους µεθόδους, µε αποκορύφωµα τη βιολογική καταπολέµηση. Η παρούσα διατριβή κινήθηκε στα πλαίσια της βιολογικής καταπολέµησης µε τη διερεύνηση της ανασταλτικής δράσης 11 βακτηριακών στελεχών, 8 πρόσφατα αναγνωρισµένων και 3 νέων in vitro. Από αυτά, 3 στελέχη δοκιµάστηκαν in planta εναντίον του Sclerotinia sclerotiorum σε ηλίανθο και του Sclerotium rolfsii σε τοµάτα. Τα 3 νέα ριζοβακτήρια ταυτοποιήθηκαν µοριακά µε τη µέθοδο της αλληλούχησης της ενδιάµεσης περιοχής µεταξύ του 16S και 23S rrna ως Serratia marcescens ΤοΖα4-8 και ΤοΖα1-5-10 και Enterobacter cloacae ΤοΖα9-12, ενώ για το τελευταίο χρησιµοποιήθηκε συµπληρωµατικά και η βιοχηµική µέθοδος api 20E. Τα 8 γνωστά βακτηριακά στελέχη δοκιµάστηκαν σε in vitro πειράµατα για τη δράση τους εναντίον 4 µυκήτων, των Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum και Verticillium dahliae ενώ τα 3 νέα εναντίον αυτών και επιπλέον του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Oι δοκιµές in vitro περιελάµβαναν πειράµατα διπλών καλλιεργειών σε τρυβλία για την παρατήρηση ζώνης αναστολής στη µυκηλιακή ανάπτυξη, ή αποικισµού των υφών από τα βακτήρια, πειράµατα διπλών καλλιεργειών για την παρουσία πτητικών ουσιών και βιοδοκιµές λύσης υφών. Στις δοκιµές in planta επιλέχθηκαν από το σύνολο των 11 βιοπαραγόντων τα στελέχη Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 και δοκιµάστηκαν στα παθοσυστήµατα ηλίανθος-sclerotinia sclerotiorum και τοµάτα-sclerotium rolfsii σε γλαστράκια και σπορεία αντίστοιχα. Στα πειράµατα µε τον ηλίανθο συµµετείχε και το 13

καρβοξαµιδικό µυκητοκτόνο boscalid ως µέτρο σύγκρισης για τους βιοπαράγοντες. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι και τα τρία βακτήρια µείωσαν στατιστικώς σηµαντικά τα νεκρά φυτά και συνεπώς τη δράση του µύκητα στο παθοσύστηµα ηλίανθος-sclerotinia sclerotiorum ενώ αντίθετα, στο παθοσύστηµα τοµάτα-sclerotium rolfsii δεν υπήρξε στατιστικώς σηµαντική διαφορά σε σχέση µε το θετικό µάρτυρα. Τέλος, πραγµατοποιήθηκε έλεγχος παρουσίας αντιµυκητιακών ουσιών στα υπερκείµενα υγρών καλλιεργειών και των οργανικών εκχυλισµάτων των βιοπαραγόντων Enterobacter cloacae ΤοΖα9-12, Serratia marcescens ΤοΖα4-8 και ΤοΖα1-5-10. Η δράση των µεταβολιτών διαπιστώθηκε µε την αναστολή ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici σε βιοδοκιµές TLC και microtiter. 14

Abstract The numerous and intractable problems that have arisen from the exclusive, on occasions, application of chemical pest control means in modern agriculture, has led to more environmentally friendly plant protection methods, culminating in biological control. The present study was initiated in the direction of biological control, investigating the inhibitory effect of 11 bacterial strains, 8 recently recognized and 3 new in vitro. Τhree of these strains were tested in planta against Sclerotinia sclerotiorum on sunflower and Sclerotium rolfsii on tomato. The three new rhizobacteria were molecularly identified, sequencing of the inter spacer region between the 16S and 23S rrna, as Serratia marcescens ΤοΖa4-8 and ΤοΖa1-5-10 and Enterobacter cloacae ΤοΖa9-12. For the last strain the biochemichal method api 20E was additionally used. The anti-fungal activities of the eight previously reported bacterial strains was tested in vitro against 4 fungi Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Sclerotinia sclerotiorum and Verticillium dahliae while the 3 new against these fungi and Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, as well. The in vitro tests included dual cultures in petri dishes to reveal inhibition zones or hyphal colonization by bacteria, dual cultures to demonstrate the presence of volatile compounds produced by bacteria, and hyphal lysis bioassays. In in planta tests, two biocontrol agents Pseudomonas chlororaphis ToZa7 and Bacillus cereus S76 and the new strain Serratia marcescens ToZa1-5-10 were selected from the total of 11 biocontrol strains, and tested in sunflower-sclerotinia sclerotiorum and tomato-sclerotium rolfsii pathosystems, in pots and in sowing beds, respectively. Carboxamide fungicide boscalid was included in the experiments on sunflower, as a comparative measure to the activity of the bioagents. The results showed that all three bacteria 15

significantly reduced the number of dead plants in the sunflower-sclerotinia sclerotiorum pathosystem, while in the tomato-sclerotium rolfsii pathosystem there was no significant difference compared to the control treatment, by any bioagent. Finally, tests were performed in order to investigate the presence of antifungal metabolites in the supernatants and organic extracts of liquid cultures of the 3 new bioagents Enterobacter cloacae ToZa9-12, Serratia marcescens ToZa4-8 and ToZa1-5-10. The antifungal activity was determined by inhibition of growth of the fungus Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici in TLC and microtiter bioassays. 16

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Ο ρόλος και οι µηχανισµοί της βιολογικής καταπολέµησης στην αντιµετώπιση των ασθενειών των φυτών Η χρήση γεωργικών φαρµάκων για την αντιµετώπιση των µηκητολογικών, και όχι µόνο, ασθενειών των φυτών παραµένει µέχρι και σήµερα το κυριότερο µέσο καταπολέµησης παγκοσµίως. Είναι κοινώς αποδεκτό ότι η χηµική καταπολέµηση έχει λύσει πολυάριθµα και δυσεπίλυτα φυτοπαθολογικά προβλήµατα και συνεχίζει να αποτελεί ένα σηµαντικό όπλο των παραγωγών ανά τον κόσµο ενάντια στις ασθένειες που οφείλονται σε µύκητες και όχι µόνο. Παράλληλα, όµως, η µέθοδος αυτή έχει δηµιουργήσει πολλά και εξαιρετικά σοβαρά προβλήµατα όπως παρουσία τοξικών υπολειµµάτων στα τρόφιµα (Papadopoulou-Mourkidou, 1991) και στο περιβάλλον (Charizopoulos & Papadopoulou-Mourkidou, 1999), ανάπτυξη ανθεκτικότητας από τα παθογόνα (Deising et al., 2008) και αρνητική επίδραση στους οργανισµούς µη-στόχους (Fernando et al., 2007; Majumdar et al., 2011; Rakh et al., 2011). Παράλληλα, αποσταθεροποιεί τις µικροβιακές κοινότητες των εδαφών, κάτι που οδηγεί σε ξεσπάσµατα ασθενειών σε καλλιεργούµενα φυτά (Araujo et al., 2005). Η ανακάλυψη όλο και περισσότερων αρνητικών επιπτώσεων που προκαλούνται από τα χηµικά σκευάσµατα και η επιβολή αυστηρότερης νοµοθεσίας που διέπει τη χρήση τους, ανάγκασαν τους επιστήµονες αλλά και τις ίδιες τις φαρµακευτικές βιοµηχανίες να στρέψουν το ενδιαφέρον τους σε νέες, πιο φιλικές προς το περιβάλλον και την ανθρώπινη υγεία, µεθόδους όπως είναι αυτή της βιολογικής 17

καταπολέµησης µέσω ανταγωνιστικών µικροοργανισµών, των βιολογικών παραγόντων (Senthilkumar et al., 2009). Ως βιολογική καταπολέµηση ορίζεται η πρακτική αντιµετώπισης των διάφορων ασθενειών των φυτών µε µη παθογόνους µικροοργανισµούς (ωφέλιµους) που είναι ικανοί να καταστείλουν ή και να εξουδετερώσουν τους παθογόνους µε άµεση ή έµµεση δράση. Τέτοιοι ωφέλιµοι µικροοργανισµοί καλούνται βιολογικοί παράγοντες ή βιοπαράγοντες (biological control agents, BCAs) και βρίσκονται σε αφθονία σε φυσικά περιβάλλοντα που δεν επηρεάζονται σηµαντικά από την ανθρώπινη δραστηριότητα. Ρόλο βιοπαραγόντων µπορούν να παίξουν ιοί, µύκητες και βακτήρια τα οποία µέσω διαφόρων µηχανισµών, που θα συζητηθούν παρακάτω, καθυστερούν ή αναστέλλουν την πορεία και την εξέλιξη µιας ασθένειας (Πίνακας 1). Η βιολογική καταπολέµηση ασθενειών αφορά επεµβάσεις τόσο στη φυλλόσφαιρα όσο και στη ριζόσφαιρα. Ως φυλλόσφαιρα ορίζεται το σύνολο του υπέργειου τµήµατος του φυτού καθώς και οι οργανισµοί (επίφυτα) που ζουν σε αυτό (Andrews, 1992). Επιφυτικά βακτήρια έχουν βρεθεί σε φρούτα, λαχανικά, βλαστούς, ρίζες ακόµα και σε σπόρους και σπερµοβλάστες (ovules) (Chen et al., 1995). Σύµφωνα µε τους Barea et al., (2005), η ριζόσφαιρα είναι η επιφάνεια της ρίζας και η περιοχή του εδάφους που επηρεάζεται από αυτήν ενώ για τους Antoun και Kloepper (2001) θεωρείται η περιοχή των ριζών όπου λαµβάνουν χώρα εντατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ φυτών, εδάφους και µικροοργανισµών. Η ριζόσφαιρα αποτελεί µια οικοφωλιά (niche) πλούσια σε θρεπτικά στοιχεία και διάφορες χηµικές ενώσεις όπου οι µικροοργανισµοί αναπτύσσονται και αναπτύσσουν σχέσεις µεταξύ τους αλλά και µε το φυτό. 18

Πίν. 1. Παραδείγµατα βιολογικής καταπολέµησης µε τη χρήση βιοπαραγόντων (Kennedy & de Luna, 2005) Παθογόνο Φυτό ξενιστής Βιοπαράγοντας Pythium spp Τεύτλο Καλαµπόκι Αγγουριά Actinoplanes sp Burkholderia cepacia PHQM 100 Pseudomonas aureofaciens 63-28, Serratia plymuthica, Pythium oligandrum, Trichoderma longibrachiatum CECT 2606 Phytophthora sp Πιπεριά Trichoderma harzianum 2413 Rhizoctonia solani Ρύζι Σιτάρι Pseudomonas fluorescens VO61 Bacillus sp Gaeumannomyces Σιτάρι Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 graminis Fusarium sp Verticillium dahliae Αγγουριά Τοµάτα Ρεπανάκι Μελιτζάνα Πιπεριά Paenibacillus sp Pseudomonas spp, Fusarium oxysporum Fo47, Fusarium solani, Fusarium spp Pseudomonas putida WCS417 Talaromyces flavus Pythium oligandrum 1.1. Αλληλεπιδράσεις οργανισµών στη ριζόσφαιρα Στη περιοχή της ριζόσφαιρας βρίσκονται πολλών ειδών οργανισµοί από διάφορα βασίλεια όπως βακτήρια, µύκητες, νηµατώδεις, πρωτόζωα, φύκη και διάφορα µικρά αρθρόποδα (έντοµα, ακάρεα κ.α.) (Lynch, 1990; Raaijmakers, 2001). Οι ρίζες εκτός από µηχανική στήριξη και απορρόφηση νερού και θρεπτικών στοιχείων, προσφέρουν και άλλα στο φυτό αφού συνθέτουν, συσσωρεύουν και εκκρίνουν ένα ευρύ φάσµα χηµικών ενώσεων (Walker et al., 2003; Ahemad & Kibret, 2013) οι οποίες προσελκύουν ή απωθούν τους οργανισµούς αυτούς µε αποτέλεσµα να δηµιουργούνται σχέσεις µεταξύ αυτών και των φυτών (Πίνακας 2). Οι σχέσεις αυτές µπορεί να είναι ουδέτερες (neutral), ζηµιογόνες (harmful) ή επωφελείς (beneficial). Πολλά µέλη αυτής της βιοκοινότητας έχουν ουδέτερη 19

επίδραση στο φυτό, αποτελούν, όµως, µέρος του συγκροτήµατος τροφικού πλέγµατος που χρησιµοποιεί µεγάλο ποσοστό του άνθρακα που δεσµεύεται από το φυτό µέσω της φωτοσύνθεσης και ακολούθως εναποτίθεται σταδιακά στη ριζόσφαιρα (αποδοµητές της οργανικής ύλης). Ο Marschner (1995) αναφέρει ότι περίπου το 5-21% του δεσµευµένου από τη φωτοσύνθεση άνθρακα µεταφέρεται στη ριζόσφαιρα µέσω των ριζικών εναποθέσεων. Μικροοργανισµοί που επηρεάζουν δυσµενώς την υγεία και την ανάπτυξη των φυτών θεωρούνται οι φυτοπαθογόνοι µύκητες, ωοµύκητες, βακτήρια και νηµατώδεις ενώ στους ωφέλιµους περιλαµβάνονται τα αζωτοδεσµευτικά βακτήρια, οι ενδο- και εκτοµυκόρριζες, τα ριζοβακτήρια που ενισχύουν την ανάπτυξη των φυτών (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR) και οι ανταγωνιστές (µύκητες και βακτήρια) των παθογόνων (Barea et al., 2005; Raaijmakers et al., 2009). Ο αριθµός και η ποικιλία των ζηµιογόνων και των επωφελών µικροοργανισµών έχει σχέση µε την ποσότητα και την ποιότητα των ριζικών εναποθέσεων ή εκκρίσεων (rhizodeposits ή root exudates) και µε το αποτέλεσµα των µικροβιακών αλληλεπιδράσεων στη ριζόσφαιρα (Somers et al., 2004). Οι χηµικές ουσίες που εκκρίνονται από τις ρίζες των φυτών ποικίλουν και συνήθως είναι αµινοξέα, οργανικά οξέα, σάκχαρα, βιταµίνες, νουκλεοσίδια, ένζυµα, ανόργανα ιόντα, διάφορα αέρια (Dakora & Phillips, 2002), ταννίνες, αλκαλοειδή, φωσφατίδια, φυτοορµόνες, φθορίζουσες ουσίες και διάφορες διεγερτικές και ανασταλτικές για τους µικροοργανισµούς ενώσεις (Kennedy & de Luna, 2005) (Πίνακας 2). Οι ουσίες αυτές µετατρέπουν τη ριζόσφαιρα σε ένα ευνοϊκό ή αποτρεπτικό περιβάλλον για την ανάπτυξη µικροοργανισµών και η σύνθεση τους εξαρτάται από τη φυσιολογική κατάσταση τόσο του φυτού όσο και των µικροοργανισµών που επικρατούν (Kang et al., 2010). 20

Πίν. 2. Ριζικές εκκρίσεις διαφόρων φυτικών ειδών (Dakora & Philips, 2002, Somers et al., 2004) Αµινοξέα Αλανίνη, ασπαραγίνη, γλουταµίνη, ορνιθίνη, σερίνη, θρεονίνη, τρυπτοφάνη κ.α. Οργανικά οξέα Οξικό, αλδονικό, βουτυρικό, κιτρικό, οξαλικό, µυρµηγκικό, φουµαρικό, πυρουβικό, ηλεκτρικό κ.α. Σάκχαρα Γλυκόζη, φρουκτόζη, γαλακτόζη, ριβόζη, ξυλόζη, ραµνόζη, αραβινόζη Βιταµίνες Βιοτίνη, θειαµίνη, παντοθενικό οξύ, ριβοφλαβίνη, νιασίνη Νουκλεοσίδια Αδενίνη, γουανίνη, κυτιδίνη, ουριδίνη Ένζυµα Φωσφατάσες, ινβερτάσες, αµυλάσες, πρωτεάσες Ανόργανα ιόντα και αέρια Ανθρακικά, OH -, H +, CO 2, H 2 ιάφορα Αυξίνες, φλαβονόνη, γλυκοσίδια, σαπωνίνη, σκοπολετίνη (κουµαρίνη) Η περιοχή της ριζόσφαιρας στην ουσία απαρτίζεται από τρία µέρη: τη ριζόσφαιρα (το έδαφος γύρω από τη ρίζα), την επιφάνεια της ρίζας και την ίδια τη ρίζα (Barea et al., 2005). Η επιφάνεια της ρίζας (rhizoplane) παίζει σηµαντικότατο ρόλο στη βιολογική καταπολέµηση καθώς εκεί κατά κύριο λόγο λαµβάνει χώρα ο αποικισµός και η εγκατάσταση των ωφέλιµων µικροοργανισµών. Η ίδια η ρίζα αποτελεί µέρος του συστήµατος επειδή ορισµένοι µικροοργανισµοί, τα ενδόφυτα (endophytes), έχουν την ικανότητα να αποικίζουν τους ιστούς της (Barea et al., 2005). Η επιτυχής εγκατάσταση και ο αποικισµός της ριζόσφαιρας είναι προαπαιτούµενο για την αποτελεσµατικότητα του βιολογικού ελέγχου, ανεξάρτητα από τους µηχανισµούς που εµπλέκονται (Weller, 1988; Lugtenberg & Dekkers, 1999; Chin-A-Woeng et al., 2000; Raaijmakers et al., 2009). Ο αποικισµός της ριζικής επιφάνειας και της ριζόσφαιρας εξαρτάται από παράγοντες που αφορούν στους οργανισµούς, το φυτό και το περιβάλλον (Kennedy & de Luna, 2005). Το πρώτο στάδιο του αποικισµού περιλαµβάνει την αναγνώριση του φυτού από τους µικροοργανισµούς. Αυτό επιτυγχάνεται µε τη χηµειόταξη (chemotaxis), δηλαδή την ενεργό κίνηση των µικροοργανισµών προς κάποιο χηµικό ερέθισµα (rhizodeposits, root exudates) που δέχονται από τις ρίζες. 21

Η κίνηση αυτή είναι ενεργοβόρα, δηλαδή καταναλώνεται ενέργεια από το µικροοργανισµό και συντελείται µε τη βοήθεια µαστιγίων (flagella) ή άλλων οργάνων κίνησης. Οι µικροοργανισµοί µπορούν να µεταφερθούν και παθητικά πάνω στην επιφάνεια της ρίζας µε τη βοήθεια του νερού ή µέσω της επιµήκυνσης των µεριστωµατικών κυττάρων της ριζικής κορυφής (root apex) (Weller, 1988; Kennedy & de Luna, 2005). Το επόµενο στάδιο είναι αυτό της προσκόλλησης (adherence) στην επιφάνεια της ρίζας. Η προσκόλληση επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια ειδικών προσφυτικών πρωτεϊνών (adhesins), βλεφαρίδων (fimbriae, pili), ινιδίων (fimbrils), του συστήµατος έκκρισης πρωτεϊνών τύπου ΙΙΙ, των λιποπολυσακχαριτών (LPS) και της πλευρικής αντιγονικής αλυσίδας -Ο των λιποπολυσακχαριτών των Gram- βακτηρίων. Σχηµατίζονται συναθροίσεις οι οποίες αναφέρονται ως µικροαποικίες, συµπλάσµατα ή βιοφίλµ (microcolonies, symplasmata, biofilms) και αναπτύσσονται κατά µήκος των αυλακιών επαφής των κυττάρων της επιδερµίδας (κυρίως των επιµηκών και όχι των οριζοντίων) αλλά και σε σηµεία δηµιουργίας δευτερογενών ριζών. Οι αποικίες αυτές συνήθως καλύπτονται από έναν πολυσακχαρίτη (mucilage ή mucigel). Συγκεκριµένα, στις αδεσίνες (adhesins) συµπεριλαµβάνονται όλες εκείνες οι πρωτεϊνικές κατασκευές που βρίσκονται στην επιφάνεια των βακτηριακών κυττάρων και βοηθούν στην προσκόλλησή τους στις διάφορες επιφάνειες. Οι κατασκευές αυτές χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: στις κροσσωτές (fimbrial, περιλαµβάνονται οι βλεφαρίδες) και στις µη-κροσσωτές (non-fimbrial) αδεσίνες. Πολλά βακτήρια έχουν την ικανότητα να εκφράζουν πολλές διαφορετικές αδεσίνες στην επιφάνειά τους και αυτό, ίσως, υποδηλώνει προσαρµογή σε διαφορετικά περιβάλλοντα (Gerlach & Hensel, 2007). 22

Το τύπου ΙΙΙ σύστηµα έκκρισης πρωτεϊνών βρίσκεται σε πολλά Gramβακτήρια που παρουσιάζουν µια στενή σχέση µε ευκαρυωτικούς οργανισµούς (Cornelis, 2010). ρουν σα µοριακές σύριγγες οι οποίες εγχέουν βακτηριακές πρωτεΐνες µέσα στα ευκαρυωτικά κύτταρα (Tampakaki et al., 2010; Mavrodi et al., 2011). Tα συστήµατα αυτά των φυτοπαθογόνων βακτηρίων κωδικοποιούνται από τις συστοιχίες γονιδίων (οπερόνια) hrp/hrc (Tampakaki et al., 2010) τα οποία φαίνεται να είναι και υπεύθυνα για τη µεταφορά προϊόντων των αµολυσµατικών γονιδίων avr στο ανθεκτικό φυτό ξενιστή ώστε να διεγερθεί αντοχή, συνήθως, µέσω της αντιδράσεως υπερευαισθησίας (HR, Hypersensitive Response). Η λειτουργία του συστήµατος αυτού έχει µελετηθεί κατά κύριο λόγο σε φυτοπαθογόνα βακτήρια ενώ σε σαπροφυτικά στελέχη και αποικιστές τις ριζόσφαιρας δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόµα (Mavrodi et al., 2011). Τα βακτήρια της ριζόσφαιρας, συνήθως, περιβάλλονται από πολυσακχαρίτες (EPS) οι οποίοι συνδέουν τα κύτταρα µεταξύ τους, µε αποτέλεσµα να µεσολαβούν στο σχηµατισµό µικροαποικιών. Οι EPS προστατεύουν τα προκαρυωτικά κύτταρα από ξήρανση, αντιβακτηριακούς παράγοντες και εχθρούς, τα βοηθούν στη συγκέντρωση θρεπτικών συστατικών και ιόντων (Weller, 1988), στον αποικισµό της ριζικής επιφάνειας και ρυθµίζουν αντιδράσεις του ξενιστή (ISR) (Newman et al., 1995; Van Loon et al., 1998). Τα βακτήρια, επίσης, για να ανταπεξέλθουν στις εναλλαγές του περιβάλλοντος όπου διαβιούν, έχουν αναπτύξει την ικανότητα να τροποποιούν την δοµή των µορίων που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων τους. Ανάµεσα στα επιφανειακά µόρια που υπόκεινται δοµικές αλλαγές είναι οι λιποπολυσακχαρίτες (LPS). Οι LPS συνιστούν το κύριο δοµικό στοιχείο της εξωτερικής µεµβράνης των Gramβακτηρίων. Το εκτιθέµενο µέρος τους, το οποίο αναφέρεται ως αντιγονική αλυσίδα Ο του LPS, είναι αυτό που συνεισφέρει στην παραλλακτικότητα του 23

κυτταρικού τοιχώµατος των Gram- βακτηρίων (Lerouge & Vanderleyden, 2001) και παίζει σηµαντικό ρόλο στην προσκόλληση και στον αποικισµό της ριζικής επιφάνειας (Dekkers et al., 1998). Τέτοιες κατασκευές, πιθανώς, να βοηθούν ένα εισαχθέν βακτήριο να µην εκτοπιστεί από έναν εγχώριο µικροοργανισµό (Weller, 1988). Τρίτο και τελευταίο στάδιο επιτυχούς αποικισµού της ριζόσφαιρας είναι η κατανάλωση θρεπτικών ουσιών (nutrition) που είναι διαθέσιµα εκεί. Ένας µικροοργανισµός πρέπει να έχει την ικανότητα να καταναλώνει αλλά και να συνθέτει οργανικές ενώσεις (οργανικά οξέα, αµινοξέα, βιταµίνες) ώστε να µπορέσει να αποικίσει επιτυχώς τη ριζόσφαιρα. 1.2. Αλληλεπιδράσεις µεταξύ ωφέλιµων µικροοργανισµών και εδαφογενών παθογόνων- Μηχανισµοί βιολογικής δράσης Οι βιοπαράγοντες µπορούν να επηρεάσουν αρνητικά την πυκνότητα του πληθυσµού, τη δυναµική (χρονική και γεωγραφική) και τις µεταβολικές δραστηριότητες των εδαφογενών φυτοπαθογόνων µέσω άµεσων και έµµεσων επιδράσεων (Raaijmakers et al., 2009). Οι άµεσοι µηχανισµοί δράσης περιλαµβάνουν: αναστολή της ανάπτυξης του παθογόνου µέσω αντιµικροβιακών ουσιών (antibiosis), ανταγωνισµό για θέσεις αποικισµού, θρεπτικά συστατικά που προµηθεύονται από σπέρµατα και ρίζες και σίδηρο µέσω της παραγωγής σιδηροφόρων, αποδόµηση των παραγόντων παθογένειας των παθογόνων όπως οι τοξίνες και παρασιτισµό, υπερπαρασιτισµό 24

και αρπακτικότητα µέσω της παραγωγής εξωκυτταρικών, λυτικών ενζύµων όπως οι χιτινάσες και οι β-1,3 γλουκανάσες (Fravel, 1988; Chet et al., 1990; Keel & Defago, 1997; Chin-A-Woeng et al., 1998; Whipps, 2001; Ajouz et al., 2011). Ο έµµεσος µηχανισµός δράσης περιλαµβάνει τη διέγερση της επαγώµενης διασυστηµατικής αντοχής (Induced Systemic Resistance, ISR) από τα PGPR (Chin-A-Woeng et al., 1998; Whipps, 2001; Pieterse et al., 2003; Ajouz et al., 2011), η οποία προστατεύει το φυτό χωρίς να είναι αναγκαία η άµεση αλληλεπίδραση βιοπαράγοντα και παθογόνου (Van Loon et al., 1998; Ramamoorthy et al., 2001). Κανένας από τους παραπάνω µηχανισµούς δεν αναιρεί τον άλλον και πολλές φορές ένας βιοπαράγοντας χρησιµοποιεί παραπάνω από ένα µηχανισµό έτσι ώστε να είναι αποτελεσµατικός (Whipps, 2001). Αντιβίωση και αντιµικροβιακοί µεταβολίτες Τα τελευταία 30 χρόνια, πολυάριθµες µελέτες έχουν δείξει ότι πολλά προϊόντα του δευτερογενούς µεταβολισµού αρκετών ανταγωνιστικών βακτηρίων της ριζόσφαιρας παίζουν σηµαντικότατο ρόλο στον έλεγχο διαφόρων φυτοπαθογόνων (Weller, 1988; Whips, 1997). Τα αντιβιοτικά, γενικά, ορίζονται ως οργανικές χηµικές ενώσεις, χαµηλού µοριακού βάρους που παράγονται από µικροοργανισµούς. Σε χαµηλές συγκεντρώσεις, είναι επιβλαβή για την ανάπτυξη των µεταβολικών δραστηριοτήτων άλλων µικροοργανισµών (Fravel, 1988; Thomashow et al., 1997; Raaijmakers et al., 2002). Τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν αποµονωθεί πολυάριθµες αντιβιοτικές ουσίες από βιοπαράγοντες οι οποίοι αντιπροσωπεύουν διάφορα γένη βακτηρίων (Raaijmakers et al., 2002) (Πίνακας 3). Στους αντιµικροβιακούς ή αντιµυκητιακούς µεταβολίτες (Antifungal factors, AFF) περιλαµβάνονται οι DAPG (ακετυλοφλορογλουσινόλες), πυρρολνιτρίνη, πυολουτεορίνη, φεναζίνες και υδροκυάνιο (HCN) σε περιπτώσεις φθοριζουσών 25

ψευδοµονάδων (Ellis et al., 2000; Raaijmakers et al., 2002; De La Fuente et al., 2004), θειοτροποσίνη, τροπολόνη (Compant et al., 2010), σουµπντυλένιο Α (Thasana et al., 2010), κυκλικά λιποπεπτίδια, αµµωνία, βουτυρολακτόνες, 2,4- διακέτυλοφλωρογλουκινόλη, κανοζαµίνη, ολιγοµυκίνη Α, ωοµυκίνη Α, βισκοσιναµίδη, ξανθοβασίνη και σβιτερµυκίνη Α όπως και µεταβολίτες από άλλες χηµικές οµάδες που δεν έχουν χαρακτηριστεί ακόµα (Keel & Defago, 1997; Whipps, 2001; Raaijmakers et al., 2009), από ψευδοµονάδες και άλλα βακτήρια (Πίνακας 3). Η συγκέντρωση στην οποία αυτές οι ενώσεις είναι τοξικές στους παθογόνους οργανισµούς εξαρτάται από τη χηµική ένωση και το στόχο. Έχει αποδειχθεί ότι πολλά αντιβιοτικά που παράγονται από βιοπαράγοντες έχουν ευρύ φάσµα δράσης. Παράδειγµα αποτελεί η πυρρολνιτρίνη, η οποία παράγεται από βακτηριακά στελέχη των γενών Pseudomonas και Burkholderia και έχει αποτελεσµατική δράση εναντίον Βασιδιοµυκήτων, Αδηλοµυκήτων και Ασκοµυκήτων όπως Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Verticillium dahliae και Sclerotinia sclerotiorum (Raaijmakers et al., 2002), ενώ έχει βρεθεί ότι παρουσιάζει αποτελεσµατικότητα εναντίον παθογόνων µυκήτων και βακτηρίων του ανθρώπου (Nishida et al., 1965). Επίσης, η σβιτερµυκίνη Α, που παράγεται από τα βακτήρια B. cereus και B. thuringiensis, επηρεάζει την ανάπτυξη και τη δράση πολλών µικροοργανισµών, συµπεριλαµβανοµένων αρκετών φυτοπαθογόνων όπως είδη των γενών Phytophthora και Pythium (Silo-Suh et al., 1994,1998). Ενδιαφέρον είναι να αναφερθεί ότι στα έντοµα η σβιτερµυκίνη Α φαίνεται να δρα συνεργιστικά µε τη Bt τοξίνη του B. thuringiensis µε αποτέλεσµα να αυξάνεται η εντοµοκτόνος δράση της (Broderick et al., 2000). Σε φυτοπαθογόνους µύκητες οι µεταβολίτες αυτοί µπορεί να επηρεάζουν την αλυσίδα µεταφοράς ηλεκτρονίων των συµπλόκων της αναπνοής (φεναζίνες, 26

πυρρολνιτρίνη), µεταλλοένζυµα όπως την πλούσια σε χαλκό οξειδάση του κυτοχρώµατος c (υδροκυάνιο), την ακεραιότητα της µεµβράνης (βιοεπιφανειοδραστικά) ή την κυτταρική µεµβράνη και τα ζωοσπόρια (DAPG, βιοεπιφανειοδραστικά), όµως οι τρόποι δράσης τους δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως (Raaijmakers et al., 2009). Είναι ξεκάθαρο ότι οι περισσότεροι βακτηριακοί βιοπαράγοντες, συµπεριλαµβανοµένων και αυτών που παράγουν αντιβιοτικές ουσίες, είναι ασταθείς στην απόδοσή τους για να µπορέσουν να χρησιµοποιηθούν επιτυχώς ως µια κοινή πρακτική στον τοµέα της γεωργίας. Η ασυνέπειά τους οφείλεται σε πολλούς παράγοντες, συµπεριλαµβανοµένης της µεταβαλλόµενης έκφρασης γονιδίων που έχουν σχέση µε την καταστολή ασθενειών (Raaijmakers et al., 2002). Η παραγωγή αντιβιοτικών από βιοπαράγοντες και συγκεκριµένα από στελέχη του γένους Pseudomonas, διαµορφώνεται από ένα ευρύ φάσµα ενδογενών παραγόντων που περιλαµβάνει ένα διττό (Gac/GacS) ρυθµιστικό σύστηµα µε έναν περιβαλλοντικό αισθητήρα (πιθανώς µια µεµβρανική πρωτεΐνη) και έναν παράγοντα απόκρισης που βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα του βιοπαράγοντα (Gaffney et al., 1994; Keel and Defago, 1997; Whipps, 2001; Raaijmakers et al., 2002). Μετάλλαξη σε οποιοδήποτε από αυτά τα γονίδια προκαλεί παρόµοιες πολλαπλές συνέπειες στην παραγωγή αντιβιοτικών (Laville et al., 1992; Sacherer et al., 1994; Corbell & Loper, 1995). Ουσίες, που δεν έχουν ακόµα διευκρινισθεί, εκκρίνονται µέσω του εκκριτικού συστήµατος τύπου ΙΙΙ των βακτηρίωνβιοπαραγόντων και φαίνεται να είναι υπεύθυνες για τη µειωµένη παθογένεια που εµφανίζουν ορισµένα παθογόνα (Rezzonico et al., 2005). Απενεργοποίηση των γονιδίων hrcv προκάλεσε την ανικανότητα του Pseudomonas fluorescens KD να µειώσει τη δράση της πολυγαλακτουρονάσης του Pythium ultimum in vitro 27

Πίν. 3. Παραδείγµατα αντιβιοτικών παραγόµενων από βιοπαράγοντες (Raaijmakers et al., 2002) Αντιβιοτικό Βιοπαράγοντας Παθογόνο-στόχος Φυτό-ξενιστής, προέλευση Pseudomonas spp. Gaeumannomyces graminis, Σιτάρι, Καπνός, Thielaviopsis basicola, Ζαχαρότευτλο, Pythium ultimum, Septoria Βαµβάκι tritici, Rhizoctonia solani 2-4 diacetylphloroglucinol (DAPG) Phenazines Pseudomonas spp. Gaeumannomyces graminis, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium splendens Oomycin A Pyoluteorin Pyrrolnitrin DDR Viscosinamide Σιτάρι, Καλαµπόκι, Ρύζι, Τοµάτα, Ρεβύθι Pseudomonas fluorescens Hv37a Pythium ultimum Κριθή Pseudomonas fluorescens Rhizoctonia solani, Pf-5 Pythium ultimum Βαµβάκι Pseudomonas fluorescens Thielaviopsis basicola, Q8r1-96 Pythium ultimum Καπνός Pseudomonas fluorescens BL915 Burkholderia cepacia B37w Enterobacter agglomerans Serratia spp. Pseudomonas borealis MA342 Pseudomonas fluorescens DR54 Rhizoctonia solani Fusarium sambucinum Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani Verticillium dahliae, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solani Pyrenophora teres, Tilletia caries Rhizoctonia solani, Pythium ultimum Βαµβάκι Πατάτα Αµπέλι Ελαιοκράµβη Σιτάρι Κριθή Ζαχαρότευτλο Butyrolactones Pseudomonas aureofaciens 63-28 Pythium ultimum, Pyrenophora teres Ελαιοκράµβη N-BBS Pseudomonas sp. Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani Έδαφος AFA Serratia violaceusniger YCED-9 Pythium ultimum Μαρούλι Pantocin A and B Pseudomonas agglomerans EH318 Erwinia herbicola Μηλιά Xanthobaccines Stenotrophomonas SB- K88 Pythium ultimum Ζαχαρότευτλο AFC-BC11 Burkholderia cepacia BC11 Rhizoctonia solani Έδαφος, Βαµβάκι Kanosamine Bacillus cereus UW85 Phytophthora medicaginis Μηδική Zwittermycin A Bacillus cereus UW85 Phytophthora medicaginis Μηδική 28

και να µειώσει την αποτελεσµατικότητά του απέναντι στο παθογόνο σε καλλιέργειες αγγουριάς (Rezzonico et al., 2005). Τα γονίδια αυτά επαναρυθµίζονται µε την παρουσία του παθογόνου και όχι του φυτού κάτι που υποδεικνύει ότι στόχος του εκκριτικού συστήµατος τύπου ΙΙΙ αυτού του στελέχους είναι οι Ωοµύκητες (Raaijmakers et al., 2009). Μερικοί αβιοτικοί παράγοντες, όπως η θερµοκρασία (Shanahan et al., 1992), η εδαφική υγρασία (Georgakopoulos et al., 1994) και το ph (Ownley et al., 1992), φαίνεται να επηρεάζουν την παραγωγή αντιβιοτικών από τους βιοπαράγοντες in situ και in vitro (Raaijmakers et al., 2002). στοιχεία Ανταγωνισµός (antagonism) για θέσεις αποικισµού (niches) και θρεπτικά Στη ριζόσφαιρα, όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, υπάρχει ανταγωνισµός µεταξύ των µικροοργανισµών για χώρο πάνω στη ριζική επιφάνεια και για θρεπτικά συστατικά, κυρίως γι αυτά που εκκρίνονται από τα σπέρµατα ή τις ρίζες των φυτών (rhizodeposits) (Raaijmakers et al., 2009). Οι βιοπαράγοντες ανταγωνίζονται τα παθογόνα ώστε να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν. Η ταχύτητα κίνησης προς το χηµικό ερέθισµα αλλά και ο γρήγορος πολλαπλασιασµός κάνει ένα βιοπαράγοντα ανταγωνιστικό ως προς τις θέσεις αποικισµού (οικοφωλεές) αφού τις ίδιες αυτές θέσεις (µεσοκυττάρια κενά στην επιφάνεια της ρίζας) χρησιµοποιούν και εδαφογενείς φυτοπαθογόνοι µύκητες (Bolwerk et al., 2003). Στέρηση από τα παθογόνα θρεπτικών στοιχείων και κυρίως άνθρακα και σιδήρου έχει ως αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή η ολοκλήρωση του κύκλου της µόλυνσης. Στην περίπτωση των βακτηριακών βιοπαραγόντων ο ανταγωνιστικός 29

αποικισµός της ριζόσφαιρας εξηγείται εν µέρει από το γεγονός ότι η παραγωγή αρκετών ανταγωνιστικών χαρακτηριστικών (συµπεριλαµβανοµένων και των αντιβιοτικών) σχετίζεται µε τη ρύθµιση της κυτταρικής πυκνότητας, όρος γνωστός και ως quorum sensing (Pierson et al., 1998). Το quorum sensing είναι ένα είδος διακυτταρικής επικοινωνίας µεταξύ βακτηρίων στην οποία µεσολαβούν µικρά, διάχυτα µόρια σήµατα (αυτοδιεγέρτες) (Walker et al., 2003). Ένα ανταγωνιστικό χαρακτηριστικό είναι οι σιδηροφόροι. Ο σίδηρος (Fe) είναι ουσιώδης για κάθε οργανισµό (Andrews et al., 2003; Braun & Hantke, 2011) καθώς βρίσκεται στα σύµπλοκα πρωτεϊνών σιδήρου-θείου (Fe-S) και στο µόριο της αίµης (Andrews et al., 2003) και τα βακτήρια δε θα µπορούσαν να αποτελούν εξαίρεση. Κάτω από συνθήκες ανεπάρκειας σιδήρου τα ωφέλιµα βακτήρια προσλαµβάνουν τα διαθέσιµα ιόντα σιδήρου σχηµατίζοντας χηλικές ενώσεις µε υψηλή συγγένεια προς το σίδηρο (σιδηροφόρους), στερώντας τον έτσι από τους παθογόνους οργανισµούς (Neilands, 1995). Ο ανταγωνισµός για σίδηρο, όπως επίσης, και για άνθρακα καταγράφονται ως σηµαντικοί µηχανισµοί βιολογικής δράσης για αρκετούς βιοπαράγοντες (βακτήρια και µύκητες) (Lemanceau et al., 1992; Alabouvette et al., 2006) µε αυτόν του σιδήρου να είναι ιδιαίτερα σηµαντικός σε ασβεστούχα εδάφη (ph>7) όπου το υψηλό ph οδηγεί σε χαµηλή διαθεσιµότητα σιδήρου (Raaijmakers et al., 2009). Οι σιδηροφόροι των ανταγωνιστικών βακτηρίων έχουν µεγαλύτερη χηµική συγγένεια µε το σίδηρο από αυτούς των παθογόνων µε αποτέλεσµα σε συνθήκες ανταγωνισµού να υποφέρουν οι δεύτεροι από έλλειψη σιδήρου. Τέτοιες περιπτώσεις βιολογικής δράσης έχουν αναφερθεί από τους Bakker et al. (1993), Duijff et al. (1994) και Raaijmakers et al. (1995), σε έρευνες για την καταστολή των αδροµυκώσεων του γαρύφαλλου και του ρεπανιού που προκαλούνται από τους παθογόνους µύκητες Fusarium oxysporum f.sp. dianthi και Fusarium oxysporum f.sp. raphani, αντίστοιχα, µε τη χρήση του βιοπαράγοντα Pseudomonas putida WCS358. Μερικά παραδείγµατα σιδηροφόρων που 30

παράγονται από βακτήρια αποτελούν οι pyoverdines (Ahemad & Kibret, 2013), pseudobactins (Neilands, 1995), enterobactins και ferrichromes (Andrews et al., 2003). ενζύµων Παρασιτισµός, υπερπαρασιτισµός και αρπακτικότητα µε τη χρήση λυτικών Η παραγωγή εξωκυτταρικών ενζύµων που λύουν τα κυτταρικά τοιχώµατα είναι αρκετά συνηθισµένη τακτική µεταξύ ανταγωνιστικών µικροοργανισµών (Adesina et al., 2007) αλλά δε συµβάλλει πάντα στο βιολογικό έλεγχο (Sharifi- Tehrani et al., 1998). Τα εξωκυτταρικά αυτά λυτικά ένζυµα δρουν µε διαφορετικό τρόπο από τα αντιβιοτικά. Πολλά από αυτά µπορούν να επιδράσουν στο κυτταρικό τοίχωµα των παθογόνων και αυτό τεκµηριώνεται για κυτταρινάσες, χιτινάσες και πρωτεάσες που παράγονται από διάφορα βακτήρια (Raaijmakers et al., 2009). Τεχνικές απενεργοποίησης των γονιδίων που εµπλέκονται στη βιοσύνθεσή τους έχουν χρησιµοποιηθεί για να παρέχουν αποδείξεις για τη συνεισφορά τους στη βιολογική καταπολέµηση in planta (Kobayashi et al., 2002). ιάφορα άλλα τέτοια ένζυµα των Πρωτεοβακτηρίων στοχεύουν παράγοντες παθογένειας, όπως για παράδειγµα την τοξίνη φουζαρικό οξύ που παράγεται από παθογόνα στελέχη Fusarium oxysporum µε αποτέλεσµα την προστασία των φυτών της τοµάτας από την ασθένεια της αδροµύκωσης (Toyoda et al., 1988). Ο υπερπαρασιτισµός παρατηρείται κυρίως από ανταγωνιστικούς µύκητες σε εδαφογενή παθογόνα. Οι µύκητες που δρουν ως υπερπαράσιτα είναι, συνήθως, είδη της οικογένειας Trichoderma και Gliocladium και επηρεάζουν διάφορα παθογόνα όπως: Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae και Gaeumannomyces graminis (Harman et al., 2004). Ο υπερπαρασιτισµός από 31

Trichoderma περιλαµβάνει έκκριση χιτινασών και κυτταρινασών οι οποίες κατά τη δράση τους στο παθογόνο απελευθερώνουν µικρά µόρια τα οποία µε τη σειρά τους, χηµειοτροπικά, προσελκύουν τον ανταγωνιστή προς αυτό (Zeilinger et al., 1999). Μετά την επαφή ακολουθεί περιέλιξη των υφών του βιοπαράγοντα σε αυτές του παθογόνου, περαιτέρω ενζυµατική διάσπαση του κυτταρικού τοιχώµατος µε τη χρήση των προαναφερθέντων ενζύµων και, τελικά, διείσδυση και κατανάλωση του πρωτοπλάσµατος του παθογόνου (Woo et al., 2006). Με παρόµοιο τρόπο δρουν και τα διάφορα είδη του γένους Gliocladium όπως το Gliocladium virens (Di Pietro et al., 1993). Προαγωγή της ανάπτυξης των φυτών και πρόκληση επαγόµενης διασυστηµατικής αντοχής (ISR) από τα PGPR Τα ριζοβακτήρια που ενισχύουν την ανάπτυξη των φυτών (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR) πρέπει να διακρίνονται από α) τον ικανό αποικισµό τους στη ριζική επιφάνεια, β) την ικανότητά τους να επιβιώνουν, να αναπαράγονται και να ανταγωνίζονται µε άλλους µικροοργανισµούς, χαρακτηριστικά τα οποία πρέπει να έχουν όλοι οι ωφέλιµοι µικροοργανισµοί της ριζόσφαιρας και γ) την ειδική ικανότητά τους να προάγουν την ανάπτυξη των φυτών (Kloepper, 1994). Σύµφωνα µε το Vessey (2003), ριζοβακτήρια που αναπτύσσονται πάνω, µέσα ή γύρω από φυτικούς ιστούς και διεγείρουν την ανάπτυξη των φυτών µέσω µιας πληθώρας µηχανισµών είναι γνωστά ως PGPR. Οι Somers et al. (2004), εναλλακτικά, κατέταξαν τα PGPR µε βάση τις λειτουργικές τους δραστηριότητες όπως βιολίπανση (biofertilization), φυτοδιέγερση (phytostimulation), βιοθεραπεία (bioremediation) και βιοέλεγχος (biocontrol) (Antoun & Prevost, 2005). Επίσης, στις περισσότερες περιπτώσεις, ένα µόνο 32

PGPR κατέχει πολλές από τις παραπάνω ιδιότητες µαζί µε το βιολογικό έλεγχο (Kloepper, 2003; Vessey, 2003). Τα PGPR προωθούν την ανάπτυξη των φυτών, περισσότερο µεταβάλλοντας το σύνολο της µικροβιακής κοινότητας της ριζόσφαιρας παρά µέσω διαφόρων ουσιών που παράγουν (Kloepper & Schroth, 1981a). Γενικά, τα PGPR λειτουργούν είτε µε άµεσο τρόπο διευκολύνοντας την απορρόφηση θρεπτικών συστατικών και ρυθµίζοντας την παραγωγή φυτοορµονών είτε έµµεσα µέσω των µηχανισµών του βιολογικού ελέγχου (Glick, 2012) που αναφέρθηκαν παραπάνω. Οι άµεσοι µηχανισµοί δράσης είναι η µετατροπή του αζώτου (nitrogen fixation), η διαλυτοποίηση του φωσφόρου (phosphate solubilization), παραγωγή σιδηροφόρων (siderophore production), παραγωγή φυτοορµονών (phytohormone production), απαµίνωση του ACC (1-Aminocyclopropane-1-carboxylate, πρόδροµη ένωση του αιθυλενίου) µέσω του ενζύµου απαµινάση του ACC (ACC deamisase) σε περιπτώσεις καταπόνησης του φυτού οπότε και παράγονται υψηλά επίπεδα της αέριας αυτής φυτοορµόνης (Lugtenberg & Dekkers, 1999; Kang et al., 2010; Ahemad & Kibret, 2013). Κάποια στελέχη PGPR µπορούν να καταστείλουν ασθένειες επάγοντας διασυστηµατική αντοχή (Jetiyanon & Kloepper, 2002) χωρίς να προκαλούν ορατά συµπτώµατα στον ξενιστή. Αυτού του είδους η αντοχή ονοµάζεται επαγόµενη διασυστηµατική αντοχή (Induced Systemic Resistance, ISR) (Van Loon et al., 1998). Η ISR που προκαλείται από τα PGPR έχει αποδειχθεί αποτελεσµατική εναντίον µυκήτων, βακτηρίων και ιών σε αρκετά είδη φυτών σε συνθήκες κάτω από τις οποίες τα ριζοβακτήρια και τα παθογόνα ήταν χωρικά διαχωρισµένα και δεν αλληλεπιδρούσαν άµεσα µεταξύ τους (Somers et al., 2004). Για την πρόκληση της ISR, βακτηριακοί καθοριστικοί παράγοντες είναι οι λιποπολυσακχαρίτες 33

(LPS) και ιδιαίτερα η αντγονική αλυσίδα Ο του LPS, οι σιδηροφόροι, το σαλικυλικό και το ιασµονικό οξύ (salicylic acid, SA- jasmonic acid, JA) (Van Loon et al., 1998; Ramamoorthy et al., 2001; Somers et al., 2004). Σε αντίθεση µε τον άµεσο βιολογικό έλεγχο που ρυθµίζεται από τη συνεχή παρουσία και δράση του βιοπαράγοντα, για τη δράση της ISR αυτός δε χρειάζεται να είναι παρόν καθ όλη τη διάρκεια ζωής του φυτού ξενιστή αφού άπαξ και διεγερθεί η αντοχή, συνήθως, διατηρείται µέχρι το φυσιολογικό θάνατο του φυτού (Van Loon et al., 1998). Η ISR προκαλεί, αρχικά, δοµικές αλλαγές στα τοιχώµατα των κυττάρων των φυτών-ξενιστών και στη συνέχεια, βιοχηµικές και φυσιολογικές αλλαγές στο φυτό µέσω παραγωγής και συσσώρευσης δευτερογενών µεταβολιτών (Ramamoorthy et al., 2001). Οι δοµικές αλλαγές περιλαµβάνουν ενίσχυση των κυτταρικών τοιχωµάτων µε εναποθέσεις λιγνίνης (Anderson & Guerra, 1985; Benhamou et al., 1998), καλλόζης και συσσώρευση φαινολικών ουσιών στο σηµείο εισβολής των παθογόνων (Benhamou et al., 1996; M Piga et al., 1997; Van Loon et al., 1998). Τέτοιες ραγδαίες αντιδράσεις παθητικής άµυνας στο σηµείο προσβολής και εισόδου των παθογόνων µυκήτων σκοπό έχουν να καθυστερήσουν την είσοδο αυτών στα κύτταρα έτσι ώστε το φυτό-ξενιστής να έχει το χρόνο που χρειάζεται για τη δηµιουργία ενεργητικών αντιδράσεων άµυνας (Ramamoorthy et al., 2001). Οι δευτερογενείς µεταβολίτες που παράγονται και συσσωρεύονται στα σηµεία εισόδου των παθογόνων αµέσως µετά τη µόλυνση περιλαµβάνουν τις PR πρωτεΐνες, τις φυτοαλεξίνες και διάφορους άλλους παράγοντες όπως τις περοξυδάσες, την PAL κ.α. (Ramamoorthy et al., 2001). Αν και, γενικά, οι PR πρωτεΐνες δε σχετίζονται µε την ISR (Hoffland et al., 1995; Van Loon et al., 1998), υπάρχουν περιπτώσεις όπου εµφανίζονται ύστερα από επαγωγή αντοχής προκαλούµενη από PGPR (Benhamou et al., 1996; M Piga et al., 1997) ενώ το 34

ίδιο φαίνεται να ισχύει και στην περίπτωση συσσώρευσης φυτοαλεξίνων (Van Peer et al., 1991). 1.3. Είδη του γένους Pseudomonas, Bacillus, Serratia και Enterobacter ως βιοπαράγοντες Στο γένος Pseudomonas περιλαµβάνονται είδη που δε σχηµατίζουν σπόρια, είναι Gram-, έχουν ραβδοειδές σχήµα (Santoyo et al., 2012) και ανήκουν στην οικογένεια Pseudomonadaceae. Λόγω των ποικίλων γενετικών και φαινοτυπικών χαρακτηριστικών τους, τα µέλη αυτού του γένους έχουν καλές προοπτικές στη χρησιµοποίησή τους ως βιοπαράγοντες (Santoyo et al., 2012). Αναπτύσσονται πολύ γρήγορα µε αποτέλεσµα να είναι εξαίρετοι αποικιστές της ριζόσφαιρας. Ένας, ακόµη, λόγος είναι και η ικανότητά τους να χρησιµοποιούν διάφορα υποστρώµατα ως θρεπτικά συστατικά, όπως και η επιβίωσή τους σε συνθήκες οι οποίες είναι αιτία καταπόνησης για άλλα βακτήρια (Santoyo et al., 2012). Επίσης, η ικανότητά τους για παραγωγή αντιβιοτικών (φεναζινών κ.α.), πολυσακχαριτών, σιδηροφόρων (Santoyo et al., 2012) και για πρόκληση ISR (Han et al., 2006) είναι σηµαντικά. Η συµβολή των βακτηρίων του γένους Pseudomonas στη βιολογική καταπολέµηση τα τελευταία χρόνια είναι τεράστια, καθώς είναι το πιο γνωστό και πιο διαδεδοµένο γένος βακτηρίων, µε µεγάλη ικανότητα αναστολής παθογόνων και των ασθενειών που αυτά προκαλούν (Bolwerk et al., 2003; Mercado-Blanco et al., 2004; Kishore et al., 2005; Tziros et al., 2007; Upadhyay & Srivastava, 2008; Bardas et al., 2009; Berry et al., 2010; Athukorala et al., 2010; Raio et al., 2011; Ajouz et al., 2011; Puopolo et al., 2011; Rakh et al., 2011; Pastor et al., 2012). 35

Στο γένος Bacillus περιλαµβάνονται είδη που σχηµατίζουν σπόρια (ενδοσπόρια), είναι Gram+, έχουν και αυτά ραβδοειδές σχήµα και ανήκουν στην οικογένια Bacillaceae (Santoyo et al., 2012). Ήδη στη βιολογική καταπολέµηση εντόµων χρησιµοποιείται ευρέως σε εµπορικό σκεύασµα η ενδοτοξίνη και ενεργά σπόρια του B. thuringiensis τα οποία έχουν εντοµοκτόνες ιδιότητες (Papadopoulou-Mourkidou, 2008) όπως και κάποια στελέχη των B. subtilis και B.cereus εναντίον µυκήτων. Κάποια είδη µπορούν να είναι και παθογόνα του ανθρώπου (Chitarlu et al., 2011) ενώ άλλα µπορούν να δράσουν ως προωθητές της ανάπτυξης των φυτών και ως καταστολείς παθογόνων µέσω διαφόρων µηχανισµών όπως της βιοσύνθεσης αντιβιοτικών και άλλων αντιµικροβιακών µεταβολιτών, της παραγωγής αυξινών, κυτοκινινών, αµπσισικού οξέος και άλλων φυτοδιεγερτικών ουσιών (Araujo et al., 2005; Idris et al., 2007; Ahmad et al., 2008). Γενικά, τα βακτήρια αυτού του γένους έχουν µεγαλύτερη ικανότητα προσαρµογής από άλλα διότι σχηµατίζουν σπόρια τα οποία τους προσδίδουν ανθεκτικότητα σε αντίξοες συνθήκες (Szczech & Shoda, 2006). ιάφορα στελέχη του γένους Bacillus έχουν την ικανότητα να παράγουν λιποπεπτίδια που ανήκουν σε διάφορες χηµικές οµάδες όπως φενγκισίνη (fengysin), σερφακτίνη (surfactin) και ιτουρίνη (iturin) τα οποίεα αναστέλλουν την ανάπτυξη των παθογόνων (Ongena et al., 2005). Τα λιποπεπτίδια της ιτουρίνης όπως η ιτουρίνη Α, η βακιλλοµυκίνη D και η µυκοσουµπντιλίνη είναι αποτελεσµατικά εναντίον µυκήτων, όχι όµως βακτηρίων (Maget-Dana & Peypoux, 1994; Ongena et al., 2005). Ενδιαφέρον έχει το γεγονός ότι αυτά τα λιποπεπτίδια έχουν, επίσης, αιµολυτική δράση (Santoyo et al., 2012). Το B. subtilis µπορεί να συνθέσει περισσότερους από 60 τύπους αντιβιοτικών, κυρίως λιποπεπτίδια της οµάδας της ιτουρίνης (Araujo et al., 2005). Πολλά είδη, όπως τα B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. pasteurii, B. cereus, B. pumilus, B. mycoides και B. sphaericus (Ryu et al., 2003; Kloepper et al., 2004; Ongena et al., 2007) καθώς και κάποια 36

λιποπεπτίδιά τους όπως η σερφακτίνη και η φενγκισίνη, επάγουν ISR στα φυτά (Ongena et al., 2007). Στο γένος Serratia περιλαµβάνονται είδη µη σποριωτικά, ραβδόµορφα, Gram-, ανήκουν στην οικογένεια Enterobacteriaceae και είναι πανταχού παρόντα στη φύση (Madigan et al., 2003; Mohan et al., 2011). Συνήθως βρίσκονται στο χώµα, στο νερό, στα φυτά και στα ζώα και είναι γνωστά για την παραγωγή ουσιών που προωθούν την ανάπτυξη των φυτών και αναστέλλουν αυτήν των µυκήτων καθώς, επίσης, και για τη δηµιουργία ευνοϊκού περιβάλλοντος για τον επιτυχή αποικισµό των αζωτοδεσµευτικών οργανισµών (Mohan et al., 2011). Είδη του γένους Serratia σχηµατίζουν σειρά ερυθρών χρωστικών που περιέχουν πυρρόλιο, οι οποίες ονοµάζονται προντιτζιοσίνες (prodigiosins) (Madigan et al., 2003). Η προντιτζιοσίνη παράγεται ως δευτερογενής µεταβολίτης και παρουσιάζει ενδιαφέρον διότι περιέχει το δακτύλιο του πυρρολίου, ο οποίος απαντά στις χρωστικές που εµπλέκονται στη µεταφορά ενέργειας: πορφυρίνες, χλωροφύλλες και φυκοχωλεΐνες (Madigan et al., 2003). Η χρωστική αυτή παράγεται µόνο από τα είδη S. marcescens, S. plymuthica και S. rubidaea (Grimont & Grimont, 2006b). Η προντιτζιοσίνη που παράγεται από το βακτήριο S. marcescens, εκτός των άλλων, θεωρείται ως ένας από τους πιο σηµαντικούς αντιµυκητιακούς παράγοντες (AFF) και η παραγωγή της εξαρτάται από ένα πλήθως βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων (Someya et al., 2004). Το βακτήριο S. marcescens, επίσης, παράγει τρεις τύπους χιτινασών (ChiA, ChiB και ChiC) καθώς και µια χιτοβιοσιδάση (chitobiosidase) οι οποίες έχουν την ικανότητα να αποδιοργανώνουν τη χιτίνη που βρίσκεται στα κυτταρικά τοιχώµατα των µυκήτων και στον εξωσκελετό των εντόµων (Gutierrez-Roman et al., 2011). Πράγµατι, το βακτήριο αυτό, εκτός του γεγονότος ότι έχει χρησιµοποιηθεί ως βιοπαράγοντας εναντίον φυτοπαθογόνων όπως Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani και Phytopthora spp. (Gutierrez- 37

Roman et al., 2011), έχει βρεθεί ότι έχει εντοµοκτόνες (Mohan et al., 2011; Chandrashekhar et al., 2011) και φυτοπαθογόνες ιδιότητες (Gillis et al., 2013). Στελέχη του S. marcescens προσβάλλουν και τον άνθρωπο µόνο σε περιπτώσεις κατασταλµένου ανοσοποιητικού συστήµατος (Grimont & Grimont, 2006b). Στο γένος Enterobacter περιλαµβάνονται είδη µη σποριωτικά, Gram- και ανήκουν και αυτά στην οικογένεια Enterobacteriaceae (Humann et al., 2011). Τα βακτήρια είναι και αυτά ευκαιριακά παθογόνα του ανθρώπου ενώ ανθεκτικά νοσοκοµειακά στελέχη µπορούν να προκαλέσουν επιδηµίες βρεφικής σηψαιµίας (Beena & Prasad, 2011). Τα εντεροβακτήρια, όπως φαίνεται και στο γένος Serratia, αναπτύσσουν σηµαντικές σχέσεις µε σπέρµατα και ρίζες των ανώτερων φυτών (Nelson & Maloney, 1992). Σηµαντικό είδος της οικογένειας αυτής αποτελεί το E. cloacae το οποίο βρίσκεται παντού στη φύση (Nelson & Maloney, 1992; Humann et al., 2011). Έχει µελετηθεί, κυρίως, ως βιοπαράγοντας εναντίον ειδών του παθογόνου ωοµύκητα Pythium (Hadar et al., 1983; Nelson et al., 1986; Howell et al., 1988; Lynch et al., 1991; Roberts et al., 1994) αλλά είναι αποτελεσµατικό και εναντίον άλλων παθογόνων όπως Sclerotinia, Fusarium και Rhizopus (Sneh et al., 1984; Wilson et al., 1987; Nelson & Craft, 1991; Slininger et al., 2004). Ο ακριβής µηχανισµός βιολογικής δράσης του E. cloacae δεν είναι ακόµα γνωστός, όµως, οι Nelson & Maloney (1992) υποθέτουν ότι κάποια γνωρίσµατα ίσως παίζουν ρόλο στην καταστολή του παθογόνου και συνεπώς των ασθενειών που αυτό προκαλεί. Για να εξηγήσουν το γεγονός της γρήγορης επιβράδυνσης της αντίδρασης του Pythium στην προσέλκυσή του από τα διάφορα φυτάρια και τη µόλυνσή τους, θεώρησαν πως το βακτήριο καταβολίζει τα χηµικά µόρια-σήµατα που εκκρίνουν τα σπέρµατα των φυτών πριν αυτά προλάβουν να ενεργοποιήσουν 38

τις διαχειµάζουσες µορφές του παθογόνου. Ακόµη, η παραγωγή πτητικής αµµωνίας σε επίπεδα τοξικά για το παθογόνο, θεωρείται ως ένα ακόµα γνώρισµα βιολογικής δράσης καθώς το βακτήριο έχει την ικανότητα απαµίνωσης αµινοξέων. Σηµαντικό, επίσης, γνώρισµα αποτελεί και η µεγάλη ικανότητα προσκόλλησης στις υφές των παθογόνων που έχουν τα βακτήρια αυτά, σε ειδικές θέσεις όπως κάποια γλυκοσίδια που σχετίζονται µε το κυτταρικό τοίχωµα του παθογόνου (Nelson et al., 1986). Παρόµοιους µηχανισµούς χρησιµοποιούν και άλλα εντεροβακτήρια, όπως το Escherichia coli, σε ζωικά κύτταρα (Duguid & Old, 1980). Νεότερες έρευνες έδειξαν ότι το E. cloacae δρα ως ενδόφυτο και προάγει την ανάπτυξη των κακαόδενδρων (Theobroma cacao), λειτουργεί δηλαδή ως PGPR (Camara-Leite et al., 2013), ενώ άλλες έδειξαν ότι έχει και φυτοπαθογόνες ιδιότητες σε κρεµµύδι, παπάγια, πιπερόριζα και µακαντάµια (Nishijima et al., 1987,2004,2007; Bishop & Davies, 1990; Humann et al., 2011). 2. Εδαφογενείς φυτοπαθογόνοι µύκητες και ωοµύκητες και ασθένειες που προκαλούν Τα εδαφογενή παθογόνα, στα περισσότερα γεωργικά οικοσυστήµατα, µπορεί να είναι σηµαντικοί περιοριστικοί παράγοντες στην παραγωγή εµπορεύσιµων φυτικών προϊόντων και τροφίµων (Raaijmakers et al., 2009). Επίσης, είναι πιο δύσκολα στη διαχείριση και στην αντιµετώπισή τους σε σχέση µε τα παθογόνα που προσβάλλουν το υπέργειο µέρος των φυτών (Bruehl, 1987). Η επιβίωση και η ανάπτυξη των εδαφογενών παθογόνων είναι προσαρµοσµένη στο 39

µεγαλύτερο µέρος του εδάφους αλλά η ριζόσφαιρα είναι η καίρια περιοχή, αφού εκεί τα παθογόνα έρχονται σε επαφή µε τα φυτά και εγκαθιστούν µια παρασιτική σχέση. Είναι το ίδιο, ακριβώς, σηµείο όπου η πολυποίκιλη κοινότητα της ριζόσφαιρας (µικροβιακή και ζωική) αλληλεπιδρά µε τα παθογόνα και µε αυτόν τον τρόπο καθορίζεται το αποτέλεσµα της απόπειρας της µόλυνσης (Raaijmakers et al., 2009). Οι µύκητες και οι ωοµύκητες είναι τα πιο σηµαντικά εδαφογενή παθογόνα (Raaijmakers et al., 2009) αν και οι µύκητες είναι αυτοί που θα απασχολήσουν την παρούσα διατριβή. Οι µύκητες είναι ευκαρυωτικοί, νηµατοειδείς, πολυκύτταροι, ετερότροφοι οργανισµοί οι οποίοι παράγουν ένα δίκτυο υφών που καλείται µυκήλιο και µε τη βοήθειά του απορροφούν θρεπτικά συστατικά από τα περιβάλλοντα υποστρώµατα (Alexopoulos et al., 1996). Οι ωοµύκητες έχουν µορφολογικές οµοιότητες µε τους πραγµατικούς µύκητες, όµως, φυλογενετικά σχετίζονται περισσότερο µε τα φύκη που περιέχουν χλωροφύλλη a και c (Alexopoulos et al., 1996). Παράγουν σπόρια µε ικανότητα αυτόνοµης κίνησης (ζωοσπόρια), περιέχουν στο κυτταρικό τους τοίχωµα κυτταρίνη αντί χιτίνης και από τις κυτταρικές τους µεµβράνες απουσιάζει η εργοστερόλη και οποιαδήποτε άλλη στερόλη (Brent & Hollomon, 2007). Παρόλα αυτά, οι µηχανισµοί µόλυνσης και παρασιτισµού όπως επίσης και οι ασθένειες που προκαλούν, είναι παρόµοια µε αυτά των πραγµατικών µυκήτων και γι αυτό αναφέρονται στην παρούσα διατριβή. Οι εδαφογενείς ασθένειες, ως επί το πλείστον, εµφανίζονται στον αγρό κατά κηλίδες και το γεγονός αυτό αποτελεί µια πρώτη κλινική διαγνωστική προσέγγιση για ένα φυτοπαθολόγο (Εικόνα 1). Σχεδόν όλοι οι εδαφογενείς µύκητες είναι νεκροτροφικοί (necrotrophs), κάτι που σηµαίνει ότι πρώτα νεκρώνουν το φυτικό ιστό µε τη χρήση ενζύµων και τοξινών και ύστερα απορροφούν τις θρεπτικές ουσίες που χρειάζονται µε τη βοήθεια των υφών τους. 40

Αντίθετα, τα περισσότερα βιοτροφικά παθογόνα (biotrophs), όπως αυτά που προκαλούν τις σκωριάσεις και τα ωίδια, προσβάλλουν τα υπέργεια µέρη του φυτού και χρειάζονται ζωντανό ιστό για να λάβουν τα θρεπτικά στοιχεία που χρειάζονται. Οι συνθήκες που επικρατούν στα εδάφη είναι, γενικά, µη ευνοϊκές για τη µυκηλιακή ανάπτυξη εξαιτίας υψηλών ή χαµηλών θερµοκρασιών ή και ξηρασίας. Τα παθογόνα επιβιώνουν στο έδαφος είτε σχηµατίζοντας ανθεκτικές µορφές όπως χλαµυδοσπόρια, σκληρώτια, κονίδια και υφές µε ενισχυµένα τοιχώµατα είτε διαβιώντας στις ρίζες και στα φυτικά υπολείµµατα (Bruehl, 1987). Όταν οι συνθήκες γίνουν ευνοϊκές και όταν ένα σπέρµα ή ρίζα πλησιάσει την αδρανή ανθεκτική µορφή, ο µύκητας βλαστάνει διεγειρόµενος από τα εκκρίµατα της ρίζας ή του σπέρµατος και αναπτύσσεται χηµειτροπικά προς το φυτό (Raaijmakers et al., 2009). Τότε η βλαστική υφή είτε προσκολλάται στην επιφάνεια της ρίζας, όπου διεισδύει και µολύνει τα επιδερµικά κύτταρα των ριζικών κορυφών, των δευτερογενών ριζών ή των ριζικών τριχιδίων ή επιτίθεται στους αναδυόµενους βλαστούς (Raaijmakers et al., 2009). Ο µύκητας διακλαδίζεται µέσω του φλοιού και συνεχίζει να εξαπλώνεται προς τα πάνω, εσωτερικά ή εξωτερικά του φυτού και µπορεί, επίσης, να προσβάλλει και γειτονικές ρίζες ή βλαστούς (Raaijmakers et al., 2009). Η ειδική οµάδα παθογόνων που προκαλούν τις αδροµυκώσεις (Fusarium oxysporum, Verticillium dahliae) µπορούν να διεισδύσουν µέσω της ενδοδερµίδας στον αγγειακό ιστό και να κινηθούν ανοδικά στο ξύλωµα εµποδίζοντας τη ροή του νερού (Beckman, 1987). Ένας µεγάλος αριθµός ασθενειών και συµπτωµάτων µπορούν να συσχετιστούν µε προσβολές εδαφογενών παθογόνων µυκήτων σε φυτά. Παρόλα αυτά, η κλινική διάγνωση τέτοιων ασθενειών στον αγρό δεν είναι εύκολη υπόθεση διότι η πλειοψηφία των συµπτωµάτων εµφανίζονται κάτω από το έδαφος ενώ αυτά 41

που υπάρχουν στο υπέργειο µέρος δεν είναι ξεκάθαρα γιατί µοιάζουν µε αυτά που προκαλούνται από αβιοτικούς παράγοντες όπως ξηρασία, καταπόνηση, τροφοπενίες. Η ζηµιά που συντελείται στις ρίζες ή/και στο λαιµό των φυτών έχει ως αποτέλεσµα τη µειωµένη πρόσληψη νερού και θρεπτικών ουσιών που οδηγεί σε γενικευµένα συµπτώµατα και σύνδροµα όπως νανισµό, τροφοπενίες, σύνδροµο του βραδέως µαρασµού, µειωµένη παραγωγικότητα κ.α. Εικ. 1. Εµφάνιση εδαφογενούς ασθένειας στον αγρό µε τη µορφή κηλίδας (www.ces.ncsu.edu) 42

2.1. Βιολογία του εδαφογενούς φυτοπαθογόνου µύκητα Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary και τρόποι αντιµετώπισης Ο ασκοµύκητας Sclerotinia sclerotiorum προκαλεί καταστροφικές ασθένειες στα καλλιεργούµενα φυτά σε όλα σχεδόν τα µέρη του κόσµου (Παναγόπουλος, 1995). Ανήκει στην οικογένεια Sclerotiniaceae της τάξης Helotiales του φύλου Ascomycota και δεν εµφανίζει ατελή (κονιδιακή) µορφή. Έχει ευρύτατο φάσµα ξενιστών αφού προσβάλλει πάνω από 400 είδη ποωδών φυτών (Duncan et al., 2006). Ο µύκητας επιβιώνει µε το µυκήλιό του σε προσβεβληµένα ή νεκρά φυτά, αλλά κυρίως στο έδαφος µε τα χαρακτηριστικά µαύρα και µεγάλα σκληρώτια που σχηµατίζει. Τα σκληρώτια διατηρούν τη βιωσιµότητα τους σε ξηρές συνθήκες για 6-8 έτη ενώ σε υγρό έδαφος µόνο για ένα χρόνο (Παναγόπουλος, 1995). Ο µύκητας, µέσω των σκληρωτίων, µπορεί να προκαλέσει ασθένεια µε δύο διακριτούς µηχανισµούς, είτε βλαστάνοντας προς αποθήκια παράγοντας ασκοσπόρια (carpogenically) είτε βλαστάνοντας προς µυκηλιακή υφή (myceliogenically) (Duncan et al., 2006; Zhang & Xue, 2010) προσβάλλοντας οποιαδήποτε φυτική επιφάνεια έρθει σε επαφή (Εικόνα 2). Τα φυτά προσβάλλονται σε οποιοδήποτε στάδιο ανάπτυξης, από το σπέρµα µέχρι και το ώριµο φυτό (Willets & Wong, 1980). Ο τρόπος µε τον οποίο θα βλαστήσει ένα σκληρώτιο εξαρτάται από τις περιβαλλοντικές συνθήκες (Zhang & Xue, 2010). Τα αποθήκια δε σχηµατίζονται σε θερµοκρασίες µεγαλύτερες των 23 C εποµένως, στην Ελλάδα ο κίνδυνος µολύνσεως από ασκοσπόρια υπάρχει αργά το φθινόπωρο, το χειµώνα και νωρίς την άνοιξη (Παναγόπουλος, 1995). Η µόλυνση συχνά εµφανίζεται στην περιοχή του λαιµού των φυτών, ως υδατώδης µεταχρωµατισµός των ιστών που σύντοµα εξαπλώνεται προς το στέλεχος και τη ρίζα. Κάτω από υγρές και ψυχρές σχετικά συνθήκες, ο µύκητας 43

εισέρχεται στους ιστούς µε απευθείας διάτρηση, αποδοµώντας την εφυµενίδα µε τη χρησιµοποίηση ενζύµων (εφυµενιδάσες, πηκτινάσες, κυτταρινάσες) που παράγονται από µια κατασκευή του (infection cushion) (Willets & Wong, 1980) και ως νεκροτροφικό παθογόνο, νεκρώνει τα επιδερµικά και παρεγχυµατικά κύτταρα, µε τα οποία έρχεται σε επαφή, για να τραφεί. Με αυτές τις συνθήκες, γρήγορα, εµφανίζεται το λευκό, βαµβακώδες µυκήλιο που καλύπτει την περιοχή της µόλυνσης και της εξάπλωσης του µύκητα. Ύστερα από µερικές ηµέρες Εικ. 2. Παραγωγή αποθηκίων από σκληρώτια του µύκητα Sclerotinia sclerotiorum και εκτόξευση ασκοσπορίων (ag.arizona.edu) 44

µυκηλιακής ανάπτυξης, εµφανίζονται τα σκληρώτια (Willets & Wong, 1980) τα οποία, µαζί µε µυκήλιο, µπορεί να βρίσκονται και µέσα στην εντεριώνη, κάτω από τις προσβεβληµένες περιοχές (Παναγόπουλος, 1995) (Εικόνα 3). Εικ. 3. Προσβεβληµένο φυτό ηλίανθου από το µύκητα Sclerotinia sclerotiorum (greenindustry.uwex.edu) Η αντιµετώπιση των ασθενειών που προκαλεί ο µύκητας δεν είναι καθόλου εύκολη λόγω του ευρέως φάσµατος ξενιστών αλλά και των πολύ ανθεκτικών σκληρωτίων που σχηµατίζει το παθογόνο (Zhang & Xue, 2010). Καλλιεργητικά µέτρα όπως περιορισµός της εδαφικής υγρασίας, άµεση καταστροφή των προσβεβληµένων οργάνων, βαθύ όργωµα για καταστροφή των σκληρωτίων, αµειψισπορά και ισορροπηµένη λίπανση οδηγούν σε µείωση της έντασης της ασθένειας, όµως, δεν αποτελούν τη λύση των προβληµάτων (Mueller et al., 2002; Zhang & Xue, 2010). Συνήθως, εφαρµόζεται χηµική καταπολέµηση µε την 45

προληπτική χρήση µυκητοκτόνων ουσιών όπως thiophanate methyl, iprodione, boscalid και pyraclostrobin. Παρόλα αυτά, η αποτελεσµατικότητα των χηµικών στον έλεγχο του παθογόνου είναι µικρή (Mueller et al., 2002; Bradley et al., 2006) διότι προκύπτουν δυσκολίες στην εφαρµογή τους στις καλλιέργειες και διότι οι επεµβάσεις δεν είναι δυνατό να συγχρονιστούν µε την παραγωγή µολύσµατος από το µύκητα (Steadman, 1979). Επιπλέον, η συνεχής χρήση χηµικών σε υψηλές συγκεντρώσεις δύναται να προκαλέσει φαινόµενα ανθεκτικότητας (Mueller et al., 2002: Zhang et al., 2003). Μια, ακόµα, συνήθης τακτική είναι αυτή της απολύµανσης του εδάφους µε µεθόδους όπως η ηλιοαπολύµανση, χρήση ατµού και χρήση χηµικών απολυµαντικών εδάφους όπως το dazomet. Η πιο συµφέρουσα και πιο αποτελεσµατική µέθοδος, είναι η χρήση ανθεκτικών ποικιλιών (Zhang & Xue, 2010) όµως, η έκφραση των γονιδίων της ανθεκτικότητας στον αγρό εξαρτάται από το διαθέσιµο µόλυσµα και από άλλες περιβαλλοντικές συνθήκες (Mueller et al., 2002). Τέλος, είναι προφανές ότι η αντιµετώπιση του µύκητα µε τα σύγχρονα µέσα είναι δυσχερής γι αυτό και οι έρευνες γύρω από τη βιολογική καταπολέµηση και τη χρήση βιοπαραγόντων των γενών Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Coniothyrium και Trichoderma έχουν ενταθεί τα τελευταία χρόνια (Savchuk & Fernando, 2004; Fernando et al., 2007; Yang et al., 2009; Athukorala et al., 2010; Berry et al., 2010; Zhang & Xue, 2010; Alvarez et al., 2011; Zhang et al., 2011; Zeng et al., 2012). 46

2.2. Βιολογία του εδαφογενούς φυτοπαθογόνου µύκητα Sclerotium rolfsii Sacc. και τρόποι αντιµετώπισης Ο αδηλοµύκητας Sclerotium rolfsii είναι ένα από τα σηµαντικότερα εδαφογενή παθογόνα, το οποίο δρα κυρίως στις τροπικές και υποτροπικές περιοχές της Γης (Punja, 1985; Abeysinghe, 2009). Η τέλειά του µορφή (Athelia rolfsii) ανήκει στην οικογένεια Atheliaceae της τάξης Atheliales του φύλου Basidiomycota αλλά σχηµατίζεται σπάνια στη φύση και γι αυτό στερείται σηµασίας για τη βιολογία του παθογόνου (Παναγόπουλος, 1995). Ανεπίσηµα πια, η ατελής µορφή του µύκητα ανήκει στο φύλο Deuteromycota της κλάσης Agonomycetes των Αδηλοµυκήτων (Fungi Imperfecti). Έχει ευρύ φάσµα ξενιστών µε περισσότερα από 500 είδη φυτών σε 100 οικογένειες να παρουσιάζουν ευαισθησία (Punja, 1985; Karthikeyan et al., 2006). Επιτίθεται, κυρίως, στο λαιµό των φυτών ξενιστών του, κοντά στην επιφάνεια του εδάφους αλλά έχει την ικανότητα να µολύνει οποιοδήποτε µέρος του φυτού, µε το οποίο έρχεται σε επαφή, κάτω από ευνοϊκές περιβαλλοντικές συνθήκες (Agrios, 2005), συµπεριφορά παρόµοια µε αυτή του Sclerotinia sclerotiorum (νεκροτροφικό παθογόνο). Σχηµατίζει πολυάριθµα, µικρά, κυκλικά, λευκά στην αρχή και αργότερα καστανά µέχρι ερυθροκαστανά σκληρώτια στα σηµεία προσβολής και πάνω από το λευκό µεταξώδες µυκήλιο (Παναγόπουλος, 1995) ενώ δεν παράγει καθόλου σπόρια (Αγονοµύκητας-Mycelia Sterilia) (Εικόνα 4). Αναπτύσσεται, κυρίως, στα όξινα εδάφη και ευνοείται από τις υψηλές θερµοκρασίες (29-35 C) (Παναγόπουλος, 1995). Όσον αφορά την εδαφική υγρασία, οι απόψεις διίστανται και η επίδρασή της στη µυκηλιακή ανάπτυξη και στη µόλυνση των φυτικών ιστών είναι δύσκολο να ερµηνευτεί (Punja, 1985). Ο Παναγόπουλος (1995) αναφέρει πως το παθογόνο έχει ανάγκη µεγάλης υγρασίας 47

και αναπτύσσεται, κυρίως, στα κακώς αποστραγγιζόµενα εδάφη. Επίσης, οι Shew et al (1984) αναφέρουν ότι η εµφάνιση της ασθένειας που προκαλείται από το παθογόνο, ευνοείται σε εδάφη µε υψηλή περιεκτικότητα σε ιλύ (silt) η οποία έχει την ικανότητα κατακράτησης νερού. Αντίθετα, οι Mustafee και Chattopadhyay (1971) παρατήρησαν ότι όσο µεγαλύτερα τα ποσοστά εδαφικής υγρασίας τόσο µικρότερη η ανάπτυξη του µύκητα ενώ οι Weerapat και Schroeder (1966) το γεγονός ότι η ασθένεια εµφανιζόταν σε µεγαλύτερο βαθµό σε αµµώδη, καλώς αποστραγγιζόµενα εδάφη (Weerapat & Schroeder, 1966) και σε εδάφη µε ποσοστά υγρασίας µικρότερα του κορεσµού (Ramarao & Raja, 1980). Το τελευταίο παρατηρείται και σε περιοχές του νοµού Ηλείας (προσωπική παρατήρηση). Η µόλυνση πραγµατοποιείται µε τη συνδυασµένη δράση οξαλικού οξέος και πολυγαλακτουρονασών που εκκρίνονται από την υφή µόλυνσης και µηχανικής πίεσης που ασκείται στη φυτική επιφάνεια (Punja, 1985). Το οξαλικό οξύ δεσµεύει ιόντα ασβεστίου από τα κυτταρικά τοιχώµατα για να σχηµατιστεί οξαλικό ασβέστιο, το οποίο χαµηλώνει το ph στο ιδανικό σηµείο για τη δράση των πολυγαλακτουρονασών και των κυτταρινασών (Bateman & Beer, 1965; Bateman, 1969,1972; Punja et al., 1985b). Το οξαλικό οξύ, επίσης, είναι άµεσα τοξικό στα φυτά (Bateman & Beer, 1965; Franceschi & Horner, 1980). Οι µυκηλιακές υφές αναπτύσσονται τόσο ενδοκυτταρικά όσο και στους µεσοκυττάριους χώρους ενώ, παράλληλα, απελευθερώνονται περοξειδάσες µέσω της ενζυµατικής τους δράσης (Punja, 1985). Το τελικό αποτέλεσµα της δράσης του µύκητα είναι η τυπική, υγρή, νεκρωτική εµφάνιση των ιστών που προσβάλλονται (Punja, 1985). Η παραγωγή λυτικών ενζύµων του κυτταρικού τοιχώµατος, σε συνδυασµό µε το οξαλικό οξύ είναι, εν µέρει, υπεύθυνα για το ευρύ φάσµα φυτών που υποκύπτουν στη µόλυνση από το παθογόνο (Punja, 1985). 48

Εικ. 4. Προσβολή λαιµού φυτού τοµάτας από το µύκητα Sclerotium rolfsii µε την παρουσία πολυάριθµων σκληρωτίων (zipcodezoo.com) Η αντιµετώπιση του S. rolfsii είναι δύσκολη, ως ένα βαθµό, λόγω του µεγάλου φάσµατος ξενιστών και της γρήγορης παραγωγής µεγάλου αριθµού σκληρωτίων τα οποία επιβιώνουν στο έδαφος πολλά χρόνια (Punja, 1985). Η αντοχή των σκληρωτίων για τόσο µεγάλο χρονικό διάστηµα οφείλεται σε µεγάλο βαθµό στην παρουσία µελανίνης στo φλοιό τους (Chet, 1975). Εξαιτίας αυτών των δυσκολιών, χρησιµοποιείται συνδυασµός καλλιεργητικών, βιολογικών και/ή χηµικών µεθόδων (Abeysinghe, 2009). Πολλά µυκητοκτόνα έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν τη βλάστηση των σκληρωτίων και τη µυκηλιακή ανάπτυξη του παθογόνου (Punja, 1985). Οι κυριότεροι περιορισµοί στη χρήση χηµικών είναι ότι χρειάζονται µεγάλες ποσότητες, κάθε σκεύασµα δεν είναι εγκεκριµένο για κάθε καλλιέργεια και τα 49

αποτελέσµατα της κάθε µυκητοκτόνου ουσίας δεν είναι σταθερά κάθε καλλιεργητική περίοδο (Punja, 1985). Επιπλέον, προκύπτουν χηµικά υπολείµµατα στα τρόφιµα, ρύπανση του περιβάλλοντος και ανάπτυξη ανθεκτικότητας (Karthikeyan et al., 2006). Στην αντιµετώπιση της ασθένειας συµβάλλουν και οι εφαρµογές συνθετικών, αµµωνιακών λιπασµάτων όπως η ουρία και το διττανθρακικό αµµώνιο (Thakur & Mukhopadhyay, 1972; Bakr & Khan, 1981; Punja et al., 1985a). Αυτές οι χηµικές ενώσεις µπορούν να συνεισφέρουν στην καταπολέµηση του µύκητα µε την προυπόθεση ότι τα επίπεδα του αζώτου που θα απελευθερωθεί δε θα είναι επικίνδυνα για την καλλιέργεια (Punja, 1985). Τα αµµωνιακά λιπάσµατα αναστέλλουν άµεσα τη µυκηλιακή ανάπτυξη µε τη βοήθεια της αµµωνίας που απελευθερώνεται (Henis & Chet, 1967; Avizohar-Hershenzon & Shacked, 1969; Punja & Grogan, 1982; Punja et al., 1985b), η οποία είναι τοξική για το µύκητα και έµµεσα τροποποιώντας την ευπάθεια του ξενιστή ή τους πληθυσµούς των ανταγωνιστικών µικροοργανισµών (Henis & Chet, 1968). Επίσης, εφαρµογή ασβεστούχων λιπασµάτων όπως νιτρικό ασβέστιο και θειικό ασβέστιο παρέχουν προστασία σε κάποιο βαθµό και ιδιαίτερα σε συνθήκες χαµηλής πίεσης της ασθένειας (Punja et al., 1985b). Υψηλότερα επίπεδα ασβεστίου στους φυτικούς ιστούς αντισταθµίζουν µερικώς τη δράση του οξαλικού οξέος και των ενζύµων που λύουν τα κυτταρικά τοιχώµατα (Punja et al., 1985a). Η χρησιµοποίηση των καλλιεργητικών µέτρων έχει ως σκοπό τη µείωση του αριθµού των σκληρωτίων και τον περιορισµό των ασθενειών που οφείλονται στο µύκητα. Συνήθως χρησιµοποιούνται παράλληλα µε µεθόδους βιολογικής καταπολέµησης όπως µε τη συνδυασµένη χρήση του µυκοπαράσιτου Trichoderma harzianum και µε ηλιοαπολύµανση (Elad et al., 1980). Μια άλλη αποτελεσµατική µέθοδος είναι το βαθύ όργωµα πριν την εγκατάσταση της καλλιέργειας για καταστροφή και αποµάκρυνση των σκληρωτίων από την περιοχή της ριζόσφαιρας 50

(Gurkin & Jenkins, 1985). Επιπλέον, η αµειψισπορά προτείνεται µόνο µε τη χρήση φυτών τα οποία έχουν φυσική ανθεκτικότητα στο παθογόνο. Τέτοια είναι κάποια αγρωστώδη όπως το σιτάρι και το καλαµπόκι (Punja, 1985). Τα οργανικά υπολείµµατα όπως το compost ή το άχυρο µειώνουν την ένταση της ασθένειας µε τρόπο αντίστοιχο µε αυτόν των συνθετικών αµµωνιακών λιπασµάτων (Zmora- Nahum et al., 2008) και µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε µικρής έκτασης καλλιέργειες. Τέλος, χρήση ανθεκτικών ποικιλιών έχει αναφερθεί (Branch & Brenneman, 1999; Fery & Dukes, 2002). Αρκετές µελέτες έχουν αποδείξει την αντιµετώπιση του παθογόνου µύκητα µε τη χρήση βιοπαραγόντων σε διάφορες θερµοκηπιακές και υπαίθριες καλλιέργειες (Abeysinghe, 2009), κυρίως µε τη χρήση µυκοπαρασίτων του γένους Trichoderma και Gliocladium (Henis et al., 1983; Elad et al., 1984; Papavizas & Lewis, 1989; Papavizas & Collins, 1990; Latunde-Dada, 1993; Benhamou & Chet, 1996; Biswas & Sen, 2000) αλλά και βακτηριακών βιοπαραγόντων κυρίως στελεχών των γενών Serratia, Bacillus, Pseudomonas και Streptomyces (Ordentlich et al., 1987; Kishore et al., 2005; Abeysinghe, 2009; de Curtis et al., 2010; Boukaew et al., 2011; Le et al., 2011; Rakh et al., 2011; Majumdar et al., 2011; Pastor et al., 2012). 51

Σκοπός της εργασίας Η παρούσα εργασία είχε τους παρακάτω στόχους: 1. Τον έλεγχο της δράσης των πρόσφατα αναφερθέντων βιοπαραγόντων Bacillus cereus Σ76 και Σ79, Serratia marcescens ΠιΧα5-ΙΙ, Σ47 και Σ52, Serratia rubidaea Σ55 και Σ49, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 εναντίον των εδαφογενών µυκήτων Rhizoctonia solani, Sclerotinia slerotiorum, Verticillium dahliae και Sclerotium rolfsii, in vitro. 2. Τη δοκιµή των νέων βιοπαραγόντων Enterobacter cloacαe ΤοΖα9-12 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 και ΤοΖα4-8 εναντίον των παραπάνω εδαφογενών µυκήτων αλλά και του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, in vitro. 3. Τη δοκιµή των Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Bacillus cereus Σ76 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 εναντίον των εδαφογενών µυκήτων Sclerotinia sclerotiorum και Sclerotium rolfsii σε νεαρά φυτά ηλίανθου και τοµάτας, αντίστοιχα (in planta). 4. Τη διερεύνηση της ικανότητας παραγωγής ανασταλτικών ουσιών για την ανάπτυξη του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, από τους νέους βιοπαράγοντες Enterobacter cloacαe ΤοΖα9-12 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 και ΤοΖα4-8. 52

Πειραµατικό µέρος 53

ΚΕΦ. 1: Ταυτοποίηση των βακτηριακών στελεχών ΤοΖα4-8, ΤοΖα9-12 και ΤοΖα1-5-10 µε τη βοήθεια µοριακών και βιοχηµικών µεθόδων 1.1. Εισαγωγή Η ταυτοποίηση βακτηρίων έχει σαν στόχο την κατάταξη ενός µικροοργανισµού σε συγκεκριµένο γένος, είδος και βιότυπο. Χρησιµοποιούνται δοκιµές που στηρίζονται σε: µορφολογικά χαρακτηριστικά (χρώση Gram), καλλιεργητικά χαρακτηριστικά (κατάλληλα θρεπτικά υλικά, συνθήκες επώασης, µορφολογία αποικιών), µεταβολικές ιδιότητες (βιοχηµική ταυτοποίηση µε διάσπαση υποστρωµάτων-παραγωγή ενζύµων), έλεγχο διαφόρων αντιγονικών παραγόντων, ειδικών για κάθε είδος (ορολογική ταυτοποίηση) και ανίχνευση χαρακτηριστικών αλληλουχιών βάσεων στο γενετικό υλικό των µικροοργανισµών µε µοριακές τεχνικές (µοριακή ταυτοποίηση). Σε προηγούµενη εργασία (Κάµου, 2012) τρία βακτηριακά στελέχη είχαν επιλεγεί µεταξύ άλλων στελεχών, µε βάση την ανασταλτική επίδρασή τους στην ανάπτυξη του φυτοπαθογόνου µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici, σε πολλαπλές και διπλές καλλιέργειες. Τα στελέχη αυτά ήταν τα ΤοΖα4-8, ΤοΖα9-12 και ΤοΖα1-5-10, είχαν αποµονωθεί από ρίζες τοµάτας και µετά την αρχική τους επιλογή δεν είχαν ταυτοποιηθεί ούτε είχαν αξιολογηθεί περαιτέρω ως βιοπαράγοντες. Η µοριακή ήταν η κυριότερη µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των τριών αυτών στελεχών. Επειδή όµως δεν έδωσε σαφή αποτελέσµατα σε όλες τις περιπτώσεις κρίθηκε απαραίτητη η χρησιµοποίηση και άλλης µεθόδου ταυτοποίησης κυρίως της βιοχηµικής. Στη 54

µοριακή µέθοδο η αλληλούχηση της περιοχής που βρίσκεται µεταξύ του 16S και 23S rrna του βακτηριακού γονιδιώµατος που πολλαπλασιάστηκε µε την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης (PCR) χρησιµοποιήθηκε και για τα τρία βακτήρια, ενώ η βιοχηµική χρησιµοποιήθηκε συµπληρωµατικά µόνο σε µία περίπτωση. Η διαδικασία της µοριακής ταυτοποίησης διεξήχθη στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής ενώ της βιοχηµικής στο εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιµωδών Νοσηµάτων της Κτηνιατρικής Σχολής. 1.2. Υλικά και µέθοδοι 1.2.1. Ταυτοποίηση µέσω της αλληλούχησης της περιοχής ανάµεσα στο 16S rrna και 23S rrna Για την ταυτοποίηση των τριών νέων βακτηριακών στελεχών χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος της αλληλούχησης της περιοχής ανάµεσα στο 16S rrna και 23S rrnα. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν ήταν οι L1 (5 - CAAGGCATCCACCGT -3 ) και G1 (5 - GAAGTCGTAACAAGG -3 ) οι οποίοι υβριδοποιούνται στην περιοχή αυτή (Weisburg et al., 1991). Εξαγωγή του βακτηριακού γενετικού υλικού Για την εξαγωγή του βακτηριακού DNA χρησιµοποιήθηκε η διαδικασία που περιγράφηκε από τους Psifidi et al (2010) στη µέθοδο 6, µε ορισµένες τροποποιήσεις. Αναλυτικά, η διαδικασία είχε ως εξής: Αρχικά, κάθε βακτήριο καλλιεργήθηκε σε 50 ml υγρό θρεπτικό µέσο (LC medium) και επωάστηκε σε 55

αναδευόµενο επωαστήρα για 24 ώρες. Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες µεταφέρθηκαν σε σωλήνες falcon των 50 ml και φυγοκεντρήθηκαν στις 6.000 rpm για 10 λεπτά, για την αποµάκρυνση του LC. Μετά την απόρριψη του υπερκειµένου, οι σωλήνες falcon συµπληρώθηκαν µε PBS και ακολούθησε ισχυρή ανακίνηση για τη διάλυση του βακτηριακού ιζήµατος. Στη συνέχεια, µεταφέρθηκαν 2 ml από κάθε καλλιέργεια σε µικροσωλήνα eppendorf και τοποθετήθηκαν στον καταψύκτη σε θερµοκρασία -80 o C για 2 ώρες. Μετά το πέρας των 2 ωρών και αφού οι µικροσωλήνες ξεπάγωσαν, πραγµατοποιήθηκε φυγοκέντριση στις 10.000 rpm για 2 λεπτά. Στη συνέχεια, απορρίφθηκε το υπερκείµενο και προστέθηκαν 700 µl Lysis buffer το οποίο είχε θερµανθεί προηγουµένως για να διαλυθεί. Ακολούθησε θέρµανση του κάθε µικροσωλήνα σε θερµοκρασία 70 o C για 10 λεπτά και αµέσως µετά µεταφορά του διαλύµατος σε νέο µικροσωλήνα που ήδη περιείχε 300 ml CCl 3. Μετά από ανακίνηση 5 λεπτών, πραγµατοποιήθηκε ξανά φυγοκέντρηση στις 16.000 rcf για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, 400 µl από το υπερκείµενο µεταφέρθηκαν σε νέο µικροσωλήνα που περιείχε 200 µl αιθανόλης 100% και ύστερα από ολιγόλεπτη ανακίνηση το νέο διάλυµα µεταφέρθηκε εκ νέου, αυτή τη φορά σε αυτοσχέδια στήλη η οποία έχει την ικανότητα να δεσµεύει το DNA. Η στήλη τοποθετήθηκε µέσα σε µικροσωλήνα και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 1.500 rcf για 10 λεπτά. Ακολούθησε αποµάκρυνση του µικροσωλήνα και αντικατάστασή του µε καινούριο, προσθήκη στη στήλη 700 µl διαλύµατος Wash 1 και νέα φυγοκέντριση στις 8.000 rcf για 2 λεπτά. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε ύστερα από την προσθήκη διαλύµατος 700 µl Wash 2. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 400 µl διαλύµατος Wash 3 και η στήλη φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 rcf για 3 λεπτά. Οι µικροσωλήνες στη συνέχεια αφέθηκαν ανοιχτοί, έως ότου εξατµιστεί όλη η αιθανόλη. Κατά τη διάρκεια της αναµονής θερµάνθηκαν 10 ml TE (1x), για 10 λεπτά, στους 95 o C και στη συνέχεια προστέθηκαν από αυτό 80 µl σε κάθε µικροσωλήνα. Οι 56

µικροσωλήνες µε το ληφθέν DNA αφού αφέθηκαν σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά, φυγοκεντρήθηκαν στις 5.000 rcf για 3 λεπτά και το συνολικό DNA µεταφέρθηκε σε µικροσωλήνα των 1,5 ml και αποθηκεύτηκε στην κατάψυξη. Ενίσχυση του αποµονωµένου DNA µε αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης πραγµατοποιήθηκε σε µικροσωλήνα eppendorf των 0,2 ml ο οποίος περιείχε 0,2 mm από κάθε dntp, 4 µl 5Χ Buffer, 1µM από τον εκκινητή L1 και 1µM από τον εκκινητή G1, 1 µl του κάθε δείγµατος καθώς και 0,4 µl Phire πολυµεράση. Τέλος, ο µικροσωλήνας συµπληρώθηκε µέχρι τα 20 µl µε νερό που είχε υποστεί µεταχείριση µε DEPC. Αφού ετοιµάστηκαν οι µικροσωλήνες, τοποθετήθηκαν σε θερµοκυκλοποιητή για επώαση στις εξής συνθήκες: 1. Αποδιάταξη του αρχικού εκµαγείου του DNA: 98 o C, για 30 δευτερόλεπτα 2. Αποδιάταξη του εκµαγείου του DNA: 98 o C, για 10 δευτερόλεπτα 3. Υβριδοποίηση των εκκινητών µε τα άκρα του DNA στόχου: 55 o C, για 20 δευτερόλεπτα 4. Επέκταση των συµπληρωµατικών αλυσίδων: 72 o C, για 30 δευτερόλεπτα Τα στάδια 2, 3, 4 επαναλήφθηκαν 40 φορές 57

5. Συµπλήρωση των αλυσίδων που δεν ολοκληρώθηκαν: 72 o C για 5 λεπτά Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Η πηκτή αγαρόζης παρασκευάστηκε σε συγκέντρωση 1,5%, στο διάλυµα της ηλεκτροφόρησης ΤΑΕ 1Χ (Tris Acetate EDTA: 0,04M Tris Acetate, 0,001M EDTA). Αφού διαλύθηκε η αγαρόζη µε θέρµανση µέχρι το σηµείο βρασµού, στρώθηκε σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης, η οποία αφού έπηξε η αγαρόζη, πληρώθηκε µε διάλυµα ΤΑΕ 1Χ. Εκτός από τα δείγµατα µε το βακτηριακό DNA, στην πηκτή προστέθηκαν και 5µl ενός δείκτη DNA γνωστών µοριακών βαρών (LADDER). Στα δείγµατα προστέθηκε περίπου 1µl από διάλυµα της χρωστικής ουσίας κυανούν της βρωµοφαινόλης. Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιήθηκε σε τάση 100V, για 90 λεπτά και στη συνέχεια η πηκτή εµβαπτίστηκε σε υδατικό διάλυµα βρωµιούχου αιθιδίου (0,5mg/ml), για 20 λεπτά. Το βρωµιούχο αιθίδιο έχει την ιδιότητα να παρεµβάλλεται µεταξύ των βάσεων των νουκλεϊκών οξέων και να φθορίζει παρουσία υπεριώδους φωτός. Η θέση του DNA έγινε ορατή µε τοποθέτηση της πηκτής σε τράπεζα φθορισµού (UV transilluminator). Εξαγωγή των προïόντων της αντίδρασης από την πηκτή αγαρόζης Αρχικά πραγµατοποιήθηκε µια PCR συνολικού όγκου 100µl για κάθε δείγµα, το προϊόν της οποίας αποµακρύνθηκε από την πηκτή αγαρόζης µε νυστέρι 58

και αποστειρωµένη λεπίδα. Η ζώνη DNA που παραλήφθηκε, µεταφέρθηκε σε µικροσωλήνα eppendorf του 1,5ml. Η εξαγωγή του DNA έγινε µε το kit καθαρισµού NucleoTrap purification kit (Macherey Nagel, Duren, Germany) σύµφωνα µε τις οδηγίες του παρασκευαστή και το καθαρό πλέον DNA στάλθηκε για αλληλούχηση και µε τους δύο εκκινητές. Συστοιχία και σύγκριση των αλληλουχιών Μεταξύ των δύο αλληλουχιών κάθε αποµόνωσης (µε τον ανοδικό και καθοδικό εκκινητή) παραλήφθηκαν τα αποτελέσµατα της αλληλούχησης, έγινε η συστοιχία των βάσεων µέσω του προγράµµατος MEGA version 5.0. Με αυτό το πρόγραµµα και µέσω της σύγκρισης των ξεκάθαρων κορυφών του χρωµατογραφήµατος συµπληρώθηκαν οι βάσεις, που ήταν ασαφείς. Επίσης αποµακρύνθηκαν από τα άκρα των αλυσίδων οι εκκινητές, ώστε να µην αναγνωρίζονται εσφαλµένα από τον αλγόριθµο κατά τη σύγκριση των αλληλουχιών µε αυτές της βάσης δεδοµένων. Η συστοιχία των βάσεων έγινε µε το πρόγραµµα ClustalX Pro. Το σύνολο της αλληλουχίας του προϊόντος της PCR για το κάθε βακτήριο συγκρίθηκε µε υπάρχουσες αλληλουχίες, στη βάση δεδοµένων NCBI, µέσω της χρήσης του αλγόριθµου BLASTN. 59

1.2.2. Ταυτοποίηση µέσω της βιοχηµικής µεθόδου api 20E Η µοριακή µέθοδος δεν επαρκούσε για την ταυτοποίηση του στελέχους ΤοΖα 9-12 και ως εκ τούτου κρίθηκε απαραίτητο να χρησιµοποιηθεί συµπληρωµατικά και βιοχηµική µέθοδος. Το σύστηµα που χρησιµοποιήθηκε ήταν το api 20E (BIOMERIEUX, France). Το api 20E αποτελεί ένα προτυποποιηµένο σύστηµα ταυτοποίησης για Enterobacteriaceae και άλλα µη απαιτητικά Gram- βακτήρια, και χρησιµοποιεί 21 βιοχηµικές εξετάσεις σε µικρογραφία και µια βάση δεδοµένων (apiweb ). Τα αποτελέσµατα της συγκεκριµένης µεθόδου αφορούν σε επίπεδο είδους και όχι στελέχους. Αρχή της µεθόδου Η ταινία api 20E αποτελείται από 20 µικροσωλήνες που περιέχουν αφυδατωµένα υποστρώµατα, στους οποίους εµβολιάζεται βακτηριακό αιώρηµα που προκαλεί χρωµατικές µεταβολές, ύστερα από µια περίοδο επώασης. Οι αντιδράσεις διαβάζονται σύµφωνα µε τον πίνακα ανάγνωσης και η ταυτοποίηση γίνεται χρησιµοποιώντας τον πίνακα ανάγνωσης και το λογισµικό ταυτοποίησης. Εµβολιασµός υποστρωµάτων Το στέλεχος ΤοΖα 9-12 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υπόστρωµα LC- agar για 7 ηµέρες. Στη συνέχεια επανακαλλιεργήθηκε στο ίδιο υπόστρωµα για 48 ώρες για τη λήψη µεµονωµένων αποικιών, µία από τις οποίες χρησιµοποιήθηκε για την ταυτοποίηση. 60

Σε µια φύσιγγα API Suspension Medium (5 ml) εµβολιάστηκε µια καλά αποµονωµένη αποικία του βακτηρίου από το τρυβλίο. Το µίγµα, στη συνέχεια, αναµίχθηκε προσεκτικά σε συσκευή Vortex έτσι ώστε να σχηµατιστεί ένα οµοιογενές βακτηριακό αιώρηµα. Αµέσως µετά, µε τη χρήση πιπέττας πληρώθηκαν µε το βακτηριακό αιώρηµα οι µικροσωλήνες µε τα υποστρώµατα. Για τις αντιδράσεις CIT, VP και GEL πληρώθηκε και το σωληνάριο και το κυπέλιο ενώ για όλες τις υπόλοιπες µόνο το σωληνάριο (Εικόνα 5). Για τις ADH, LDC, ODC, H 2 S και URE δηµιουργήθηκαν αναερόβιες συνθήκες επικαλύπτοντας τα σωληνάρια µε παραφινέλαιο. Στο τέλος, το κυτίο επώασης κλείστηκε και αφέθηκε για επώαση σε θερµοκρασία 36 o C ± 2, για 24 ώρες. Εικ. 5. Σχηµατική απεικόνιση της ταινίας api 20E µε τους 20 βασικούς µικροσωλήνες που περιέχουν τα αφυδατωµένα υποστρώµατα Ανάγνωση και ερµηνεία αποτελεσµάτων Μετά την περίοδο της επώασης και µε τη βοήθεια του πίνακα ανάγνωσης καταγράφηκαν οι αντιδράσεις στο φύλλο αποτελεσµάτων µε + ή ανάλογα µε τη 61

χρωµατική µεταβολή. Σε τρεις εξετάσεις χρειάστηκε η προσθήκη αντιδραστηρίων µετά την επώαση για να συµβεί η χρωµατική µεταβολή. Συγκεκριµένα, στην εξέταση TDA προστέθηκε µια σταγόνα αντιδραστηρίου TDA, στην εξέταση IND µια σταγόνα αντιδραστηρίου JAMES, ενώ στη VP µια σταγόνα του αντιδραστηρίου VP1 και µια σταγόνα του αντιδραστηρίου VP2. Η ταυτοποίηση προέκυψε µε το αριθµητικό προφίλ που έδωσαν οι αντιδράσεις σε κάθε εξέταση. Στα φύλλα αποτελεσµάτων, οι εξετάσεις χωρίζονται σε οµάδες των 3 και για κάθε µία δίνεται τιµή 1, 2 ή 4. Προσθέτοντας τις τιµές που αντιστοιχούν σε θετικές αντιδράσεις µέσα σε κάθε οµάδα, προκύπτει ένας επταψήφιος αριθµός προφίλ για τις 20 εξετάσεις της ταινίας. Η ταυτοποίηση ολοκληρώθηκε όταν εισήχθη το επταψήφιο νούµερο στο λογισµικό ταυτοποίησης apiweb. 1.3. Αποτελέσµατα Συζήτηση 1.3.1. Ταυτοποίηση µέσω της αλληλούχησης της περιοχής ανάµεσα στο 16S rrna και 23S rrna Τα προκαρυωτικά ριβοσωµικά γονίδια 16S και 23S χωρίζονται από ενδιάµεσες περιοχές (ITS) οι οποίες παρουσιάζουν ένα µεγάλο βαθµό παραλλακτικότητας στην αλληλουχία τους σε επίπεδα γένους και είδους (Clementino et al., 2001). Με βάση αυτήν την παραλλακτικότητα επιχειρήθηκε η ταυτοποίηση των τριών στελεχών µε όσο το δυνατόν µεγαλύτερη ασφάλεια. 62

Τα αποτελέσµατα των αλληλουχήσεων, ύστερα από την επεξεργασία που υπέστησαν, είχαν ως εξής, σύµφωνα µε τη βάση δεδοµένων του NCBI: 1. Το στέλεχος ΤοΖα4-8 παρουσιάζει 99% οµολογία µε το στέλεχος Serratia marcescens WW4 (Acc. Number: CP003959) 2. Το στέλεχος ΤοΖα1-5-10 παρουσιάζει 100% οµολογία µε το στέλεχος Serratia marcescens PCH5 (Acc. Number: FN600648) 3. Το στέλεχος ΤοΖα9-12 παρουσιάζει 97% οµολογία µε το στέλεχος Enterobacter cloacae EcWSU1 (Acc. Number: CP002886) και 98% οµολογία µε το στέλεχος Klebsiella oxytoca E718 (Acc. Number: CP003683) Συνεπώς τα στελέχη ΤοΖα 4-8 και ΤοΖα 1-5-10 ανήκουν στο είδος Serratia marcescens, ενώ το στέλεχος ΤοΖα 9-12 δεν είναι δυνατό να ταυτοποιηθεί µε βάση τα αποτελέσµατα της µοριακής µεθόδου. Με τη µέθοδο της υβριδοποίησης του DNA έχει όντως αποδειχτεί ότι τα γένη Enterobacter και Klebsiella έχουν υψηλή γενετική συγγένεια που κυµαίνεται από 45% έως 55%, ανάλογα µε το είδος (Brenner et al., 1972). Είναι πολύ πιθανόν το κοµµάτι του ριβοσωµικού DNA που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα µοριακή µέθοδο, δηλαδή η περιοχή ανάµεσα στο 16S και 23S rrna να συµπεριλαµβάνεται στο όµοιο γενετικό κοµµάτι και των δύο γενών µε αποτέλεσµα να προκύπτει οµολογία και µε τα δύο γένη. 63

Εικ. 6. Ηλεκτροφόρηµα σε πηκτή αγαρόζης στο οποίο φαίνονται τα τµήµατα του γονιδιώµατος µεταξύ των περιοχών ανάµεσα στο 16S και 23S rrna για τα 3 στελέχη των ριζοβακτηρίων που ταυτοποιήθηκαν (από αριστερά προς τα δεξιά): ΤοΖα1-5-10, Ladder, ΤοΖα4-8 και ΤοΖα9-12 1.3.2. Ταυτοποίηση µέσω βιοχηµικής µεθόδου api 20E Το στέλεχος ΤοΖα9-12, όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, δεν κατέστη δυνατό να ταυτοποιηθεί µε µοριακές µεθόδους αφού τα αποτελέσµατα έδωσαν οµολογία µε δύο γένη της οικογένειας Enterobacteriaceae των Πρωτεοβακτηρίων, 64

το γένος Enterobacter και το γένος Klebsiella. Ως εκ τούτου, τη λύση κλήθηκε να δώσει η βιοχηµική µέθοδος και συγκεκριµένα η µέθοδος api 20E. Τα αποτελέσµατα της µεθόδου, µε τη βοήθεια του λογισµικού apiweb είχαν ως εξής: Το στέλεχος ΤοΖα9-12 παρουσιάζει 94,6% οµολογία µε το είδος Enterobacter cloacae και 2,8% οµολογία µε το είδος Enterobacter gergoviae Το ποσοστό του 94,6% από µόνο του δεν είναι αρκετό για την επιτυχή ταυτοποίηση ενός βακτηρίου, όµως στη συγκεκριµένη περίπτωση ο συνδυασµός των αποτελεσµάτων µοριακών και βιοχηµικών µεθόδων έδωσαν µια ολοκληρωµένη εικόνα για την κατάταξη του στελέχους. Οπότε, το στέλεχος ΤοΖα9-12 ανήκει στο είδος Enterobacter cloacae. Οι Grimont & Grimont (2006a) αναφέρουν ότι πριν την ανακάλυψη των βιοχηµικών µεθόδων ταυτοποίησης τα γένη Enterobacter (Aerobacter) και Klebsiella ήταν αδιαφοροποίητα και θεωρούνταν ένα γένος. Άρχισαν να διαφοροποιούνται από τη στιγµή που ο Møller (1955) επινόησε µερικές απλές µεθόδους για να ερευνήσει τις αποκαρβοξυλάσες των αµινοξέων. Ανακάλυψε ότι τα είδη του γένους Enterobacter ήταν θετικά στην αποκαρβοξυλάση της αργινίνης ενώ αυτά του γένους Klebsiella αρνητικά και έτσι µπόρεσε να τα ξεχωρίσει (Grimont & Grimont, 2006a). Συνεπώς αποκλείεται το ενδεχόµενο το στέλεχος ΤοΖα9-12 να είναι είδος Klebsiella. 65

ΚΕΦ. 2: ράση ριζοβακτηρίων και µεταβολιτών τους επί εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων in vitro 2.1. Εισαγωγή Οχτώ (8) στελέχη ριζοβακτηρίων που αποµονώθηκαν από καλλιεργούµενα φυτά και στη συνέχεια διαπιστώθηκε η δράση τους, in vitro και in planta, επί του φυτοπαθογόνου µύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Forl) (Κάµου, 2012) και τρία (3) νέα στελέχη που δεν είχαν αξιολογηθεί περεταίρρω ως βιοπαράγοντες, εξετάστηκαν in vitro, σε διπλές καλλιέργειες, για την αναστολή της ανάπτυξης ή αποικισµό των υφών τεσσάρων (4) εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων. Συγκεκριµένα, τα στελέχη Bacillus cereus Σ76 και Σ79, Serratia marcescens ΠιΧα5ΙΙ, Σ47 και Σ52, Serratia rubidea Σ55 και Σ49, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 και τα νέα στελέχη Enterobacter cloacαe ΤοΖα9-12 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 και ΤοΖα4-8 δοκιµάστηκαν εναντίον των Sclerotinia slerotiorum, Verticillium dahliae, Sclerotium rolfsii και Rhizoctonia solani. Τα τρία τελευταία δοκιµάστηκαν και εναντίον του Forl. Επιπλέον, τα Bacillus cereus Σ76, Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7, Enterobacter cloacαe ΤοΖα9-12 και Serratia marcescens ΤοΖα4-8 και ΠιΧα5-ΙΙ, δοκιµάστηκαν in vitro εναντίον του Forl και του Sclerotium rolfsii για την παρουσία πτητικών ουσιών που αναστέλλουν τη µυκηλιακή ανάπτυξη. 66

Τέλος, ελέγχθηκε η ικανότητα και των 11 βακτηρίων να λύουν τις µυκηλιακές υφές του Forl σε µια βιοδοκιµή λύσης υφών. Οι δοκιµές αυτές ήταν διερευνητικές µε σκοπό την επιλογή των κατάλληλων συνδυασµών βιοπαραγόντων-παθογόνων για χρήση σε πειράµατα in planta. Από τους µηχανισµούς βιοελέγχου που αναφέρθηκαν στην εισαγωγή της παρούσας διατριβής, δύο είναι αυτοί που µπορούν να αποτελέσουν αντικείµενο άµεσης παρατήρησης σε in vitro δοκιµές, ο παρασιτισµός και η παραγωγή αντιµικροβιακών µεταβολιτών. Μετά την ολοκλήρωση των δοκιµών in vitro και τη διαπίστωση της βιολογικής δράσης των τριών νέων στελεχών θεωρήθηκε αναγκαία η µελέτη των µεταβολιτών που αυτά παράγουν και οι οποίες ενδεχοµένως θα προκαλούσαν δυσµενή επίδραση στους µύκητες, ως προς την ανάπτυξη των υφών τους και των αναπαραγωγικών οργάνων τους. Για το σκοπό αυτό πραγµατοποιήθηκαν δύο βιοδοκιµές στις οποίες τα υπερκείµενα υγρών καλλιεργειών των στελεχών Enterobacter cloacαe ΤοΖα9-12 και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 και ΤοΖα4-8, καθώς και εκχυλίσµατά των υπερκειµένων, δοκιµάστηκαν εναντίον της βλάστησης κονιδίων και µυκηλιακής ανάπτυξης του µύκητα Forl. Στην πρώτη βιοδοκιµή, ουσίες που παραλήφθηκαν ύστερα από εκχύλιση µε οργανικό διαλύτη από υπερκείµενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των βακτηρίων, διαχωρίστηκαν µε τη µέθοδο της χρωµατογραφίας λεπτής στιβάδας (TLC) και µελετήθηκε η ανασταλτική τους δράση στην ανάπτυξη του µύκητα Forl (βιοδοκιµή TLC). Στη δεύτερη βιοδοκιµή δοκιµάστηκαν τόσο ακατέργαστα υπερκείµενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των τριών βακτηρίων καθώς και οργανικά 67

εκχυλίσµατα αυτών επί της βλάστησης των κονιδίων του µύκητα, σε υγρό µέσο πάνω σε πλάκα µικροτιτλοποίησης (βιοδοκιµή microtiter). 2.2. Υλικά και µέθοδοι Μικροοργανισµοί και διατήρησή τους Στον Πίνακα 4 δίνονται πληροφορίες για τη προέλευση των ριζοβακτηρίων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και που είχαν προηγουµένως αποµονωθεί στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας (Κάµου, 2012). Πιν. 4: Βακτηριακά στελέχη που αποµονώθηκαν από τη ριζόσφαιρα καλλιεργούµενων ξενιστών από διάφορες περιοχές της Ελλάδας (προσαρµογή από Κάµου, 2012) Ηµεροµηνία Τοποθεσία Φυτό Ονοµασία αποµονώσεων 23/9/2009 Άγιος Παύλος Πιπεριά ΠιΧα5ΙΙ Χαλκιδικής 28/4/2010 Πυλαία Θεσσαλονίκης Σιτάρι Σ47 5/5/2010 Θέρµη, Αγρόκτηµα Σιτάρι Σ49, Σ52, Σ55 Α.Π.Θ. 12/5/2010 Καλλικράτεια Σιτάρι Σ76, Σ79 Χαλκιδικής 30/8/2010 Ζάκυνθος Τοµάτα ΤοΖα7, ΤοΖα4-8, ΤοΖα9-12, ΤοΖα1-5-10 Τα ριζοβακτήρια διατηρούνταν σε τρυβλία Petri µε LC-agar µε ανανέωση περίπου κάθε 7-10 ηµέρες, υπό ασηπτικές συνθήκες. Η σύσταση του LC- agar 68

(Pledger & Polatnick, 1961, Smit et al., 1987), ανά λίτρο απεσταγµένου νερού, ήταν η ακόλουθη: Tryptone 10gr Yeast extract 5gr NaCl 8gr MgSO 4 7 H 2 O 12.5gr Tris - HCl 5ml Agar 20gr Οι φυτοπαθογόνοι µύκητες προέρχονταν από τη συλλογή του εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας εκτός από τον Forl που παραχωρήθηκε από τον καθηγητή Prof. Ben Lugtenberg, IBL, Leiden University Ολλανδίας. Οι µύκητες διατηρούνταν σε τρυβλία Petri µε θρεπτικό υπόστρωµα PDA (Potato Dextrose Agar, Merck, Germany) και ανανεώνονταν κάθε 30 ηµέρες υπό ασηπτικές συνθήκες. Για µακροχρόνια αποθήκευση οι µικροοργανισµοί διατηρούνταν στους -80C σε διάλυµα πεπτόνης:γλυκερόλης (15% v:v γλυκερόλη και 0,5% v:v πρωτεόζηπεπτόνη). Παραγωγή και µέτρηση συγκέντρωσης κονιδίων του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici Για τη σποριοποίηση του Forl χρησιµοποιήθηκε ως θρεπτικό υλικό το Czapek Dox Broth (Duchefa, Haarlem The Netherlands), το οποίο περιέχει ανά λίτρο απεσταγµένου νερού τα παρακάτω συστατικά: FeSO 4 x 7H 2 O MgSO 4 x 7H 2 O KCl 0.1gr 0.5gr 0.5gr 69

NaNO 3 K 2 HPO 4 Sucrose 3gr 1gr 30gr Σε κωνική φιάλη των 500ml τοποθετήθηκαν 300ml Czapek Dox Broth. Στη συνέχεια, αφού αποστειρώθηκε το υλικό σε κλίβανο για 35 min υπό πίεση 2 bar και θερµοκρασία 120 o C, εµβολιάστηκε µε Forl, τα εµβόλια του οποίου αφαιρέθηκαν από τα άκρα αναπτυσσόµενης καλλιέργειας σε τρυβλίο PDA. Μετά η υγρή καλλιέργεια τοποθετήθηκε σε αναδευόµενο επωαστήρα (shaker), σε 120 rpm και θερµοκρασία 25 o C και επωάστηκε για 3 ηµέρες. Η µέτρηση της συγκέντρωσης των κονιδίων πραγµατοποιήθηκε µε τη βοήθεια µικροσκοπίου και ενός αιµατοκυτταρόµετρου τύπου Thoma Zeiss, αφού προηγούµενα η καλλιέργεια είχε διηθηθεί µε ειδικό αποστειρωµένο τουλουπάνι (miracloth, Calbiochem, USA). 2.2.1. Αναστολή της ανάπτυξης εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων από τα στελέχη ριζοβακτηρίων σε διπλές καλλιέργειες in vitro 2.2.1.1. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων στο ίδιο τρυβλίο Σε αυτή τη σειρά δοκιµών in vitro έγινε συνδυασµός του κάθε ριζοβακτηρίου µε κάθε µύκητα σε τρυβλία Petri 9 cm µε θρεπτικό υπόστρωµα LCagar, αφού διαπιστώθηκε ότι οι µύκητες αναπτύσσονταν ικανοποιητικά στο µέσο 70

αυτό. Κάθε συνδυασµός εκτελέστηκε σε τρεις επαναλήψεις-τρυβλία. Πρώτα εµβολιάστηκε ο µύκητας σε ένα σηµείο, περίπου 1 εκ. από την περιφέρεια του τρυβλίου και στη συνέχεια ο κάθε βιοπαράγοντας ξεχωριστά, αντιδιαµετρικά του µύκητα. Το εµβόλιο του µύκητα ελήφθη υπό ασηπτικές συνθήκες µε τη βοήθεια µυκητολογικού κρίκου, έτσι ώστε όλα τα εµβόλια να έχουν την ίδια διάµετρο και αυτά των βακτηρίων µε τη βοήθεια αποστειρωµένων οδοντογλυφίδων. Ως µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε ένα τρυβλίο µε LC-agar όπου είχε εµβολιαστεί µόνο ο µύκητας σε ένα σηµείο, περίπου 1 εκ. από την περιφέρεια του. Να σηµειωθεί ότι η δοκιµή µε το µύκητα V. dahliae πραγµατοποιήθηκε σε τρυβλία µε θρεπτικό υπόστρωµα PDA και όχι LC-agar λόγω µη κανονικής ανάπτυξης του µύκητα στο LC. Τα τρυβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαµο επώασης, µε θερµοκρασία 25 ο C, για περίπου 7-15 ηµέρες, ανάλογα µε το ρυθµό ανάπτυξης του κάθε µύκητα. Οι δοκιµές µε κάθε µύκητα πραγµατοποιήθηκαν δύο φορές. 2.2.1.2. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων σε διαφορετικά τρυβλία (αντικριστά) για τον έλεγχο της παρουσίας πτητικών ουσιών Χρησιµοποιήθηκαν τα βακτήρια P. chlororaphis ΤοΖα7, B. cereus Σ76, E. cloacαe ΤοΖα9-12 και S. marcescens ΠιΧα5-ΙΙ και ΤοΖα4-8 εµβολιασµένα σε τρυβλία Petri 6 cm, µε θρεπτικό υπόστρωµα LC-agar και οι φυτοπαθογόνοι µύκητες S. rolfsii και Forl εµβολιασµένοι σε τρυβλία 6 cm, µε θρεπτικό υπόστρωµα PDA. Τα τρυβλία των βακτηρίων τοποθετήθηκαν ανοικτά απέναντι από αυτά των µυκήτων και σφραγίστηκαν µε Parafilm. Για κάθε µεταχείρηση έγιναν τρεις (3) επαναλήψεις-τρυβλία ενώ ο µάρτυρας αποτελούταν από ένα 71

τρυβλίο εµβολιασµένο µε τον κάθε µύκητα και τοποθετηµένο απέναντι σε ένα τρυβλίο που περιείχε µόνο το θρεπτικό µέσο (LC). Τα τρυβλία τοποθετήθηκαν σε θάλαµο επώασης για περίπου 10 ηµέρες. Κάθε δοκιµή πραγµατοποιήθηκε δύο φορές. 2.2.1.3. Έλεγχος ικανότητας λύσης µυκηλιακών υφών- Βιοδοκιµή λύσης υφών Σε αποστειρωµένο PDA θερµοκρασίας 45 o C προστέθηκαν 2ml από αιώρηµα κονιδίων Forl το οποίο λήφθηκε ύστερα από διήθηση υγρής καλλιέργειας του µύκητα, 3-5 ηµερών. Η τελική συγκέντρωση µολύσµατος στο PDA ήταν 4 x 10 4 σπόρια/ml. Στη συνέχεια το υλικό στρώθηκε σε τρυβλία 6 cm ύστερα από ανάδευση και αφέθηκε να στερεοποιηθεί υπό ασηπτική ροή αέρα. Στα προεµβολιασµένα µε κονίδια του µύκητα τρυβλία εµβολιάστηκαν οι βιοπαράγοντες P. chlororaphis ΤοΖα7, B. cereus Σ76 και Σ79, S. rubidaea Σ55 και Σ49, S. marcescens ΠιΧα5-ΙΙ, Σ47 και Σ52, P. fluorescens 113 και τα νέα βακτηριακά στελέχη E. cloacae ΤοΖα9-12, S. marcescens ΤοΖα4-8 και ΤοΖα1-5- 10 µε τη χρήση αποστειρωµένων οδοντογλυφίδων. Τα τρία τελευταία εµβολιάστηκαν σε ξεχωριστά τρυβλία για καλύτερη παρατήρηση της δράσης τους. Συνεπώς, τα στελέχη S. marcescens ΠιΧα5-ΙΙ και Σ47, B.cereus Σ76 και Σ79 και S. rubidaea Σ55 τοποθετήθηκαν σε ένα τρυβλίο και τα υπόλοιπα (P. chlororaphis ΤοΖα7, S. rubidaea Σ49 και S. marcescens Σ52) σε ένα ξεχωριστό τρυβλίο. 72

2.2.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici από τα βακτηριακά στελέχη Serratia marcescens ΤοΖα 4-8 και ΤοΖα 1-5-10 και Enterobacter cloacae ΤοΖα 9-12 Στις βιοδοκιµές που περιγράφονται σε αυτήν την παράγραφο δοκιµάστηκαν µόνο τα τρία νέα στελέχη Serratia marcescens ΤοΖα 4-8 και ΤοΖα 1-5-10 και Enterobacter cloacae ΤοΖα 9-12, δεδοµένου ότι τα υπόλοιπα που αναφέρονται στην παρούσα διατριβή είχαν µελετηθεί µε αντίστοιχες βιοδοκιµές σε προηγούµενη εργασία (Κάµου, 2012). 2.2.2.1. ιαχωρισµός αντιµικροβιακών ουσιών από οργανικά εκχυλίσµατα καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων µε χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας Βιοδοκιµή TLC Παραγωγή και εκχύλιση βακτηριακού διηθήµατος Τα 3 βακτήρια εµβολιάστηκαν σε 250 ml LC-broth και ακολούθησε επώαση σε ανακινούµενο επωαστήρα, στις 150 στροφές/λεπτό, σε θερµοκρασία 25 o C, για τρεις ηµέρες. Μετά το πέρας των τριών ηµερών, οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν στις 6.000 στροφές/λεπτό, για 10 λεπτά και το υπερκείµενο συλλέχθηκε σε σωλήνες falcon των 50 ml και ακολούθησε η εκχύλιση. Το υπερκείµενο αναµίχθηκε µε ίσο όγκο οξικού αιθυλεστέρα σε διαχωριστικό χωνί. Στη συνέχεια, ύστερα από ισχυρή ανάδευση, συλλέχθηκε η οργανική φάση η οποία συµπυκνώθηκε µέχρι ξηρού σε περιστρεφόµενο συµπυκνωτή, υπό κενό. Η τελική συµπύκνωση έγινε µέχρι ξηρού κάτω από ροή αερίου Ν 2 και το τελικό ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε 1 ml οξικού αιθυλεστέρα. Η ίδια 73

διαδικασία χρησιµοποιήθηκε και για συµπύκνωση οξικού αιθυλεστέρα ίσου όγκου, που χρησιµοποιήθηκε ως µάρτυρας στη βιοδοκιµή TLC. Βιοδοκιµή TLC Στη µέθοδο αυτή οι ουσίες που περιέχονται σε ένα δείγµα µετακινούνται επί της πλάκας µε διαφορετική ταχύτητα ανάλογα µε την πολικότητά τους και µε αυτόν τον τρόπο διαχωρίζονται. Για το διαχωρισµό χρησιµοποιήθηκαν αλουµινένιες πλάκες χρωµατογραφίας, επιστρωµένες µε µια λεπτή στοιβάδα γέλης οξειδίου του πυριτίου κανονικής φάσης (Silica gel 60 F 254, C 18 normal phase, Merck, Darmstadt, Germany). Στη δοκιµή αυτή χρησιµοποιήθηκε 1 ενιαία πλάκα διαστάσεων 8 16 cm. Στην πλάκα τοποθετήθηκαν τα εκχυλίσµατα των τριών βακτηριακών στελεχών και ο µάρτυρας (εκχύλισµα οξικού αιθυλεστέρα) σε απόσταση 1 cm από τις περιφέρειες της πλάκας και 2 cm µεταξύ τους. Σε κάθε θέση έγινε ενστάλαξη 75 µl βακτηριακού εκχυλίσµατος µε τη βοήθεια µηχανικού σιφωνίου. Στη συνέχεια, η πλάκα τοποθετήθηκε όρθια σε γυάλινο δοχείο που περιείχε µίγµα µεθανόλης:νερού σε αναλογία 60:40 έτσι ώστε η στάθµη του υγρού να είναι χαµηλότερα από την ευθεία που τοποθετήθηκαν τα εκχυλίσµατα. Με τη βοήθεια των τριχοειδών φαινοµένων ο διαλύτης αφέθηκε αρκετή ώρα να ανέλθει µέχρι το επίπεδο του 1 cm από το άνω άκρο της πλάκας. Ύστερα, η πλάκα αφέθηκε να στεγνώσει εντελώς για αρκετή ώρα κάτω από ασηπτικό ρεύµα αέρα στο θάλαµο νηµατικής ροής. Τέλος, αφού στέγνωσε η πλάκα, χωρίστηκε στη µέση µε ψαλίδι και τα δύο τµήµατά της τοποθετήθηκαν σε πλαστικά τετράγωνα τρυβλία. Μέσα στα τρυβλία οι πλάκες καλύφθηκαν µε PDA µε ενσωµατωµένα κονίδια του Forl σε συγκέντρωση 4 10 4 σπόρια/ml. Αφού στερεοποιήθηκε το θρεπτικό υπόστρωµα, τα τρυβλία αφέθηκαν για επώαση για πέντε ηµέρες σε θερµοκρασία 25 o C. Η δοκιµή διενεργήθηκε 2 φορές. 74

2.2.2.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici από οργανικά εκχυλίσµατα και από ακατέργαστα υπερκείµενα φυγοκέντρησης υγρών καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων Βιοδοκιµή microtiter Παραγωγή και λήψη διηθήµατος και παραγωγή εκχυλισµάτων καλλιέργειας των τριών βακτηρίων Τα βακτήρια εµβολιάστηκαν σε 7 ml LC-broth και η επώαση έγινε σε ανακινούµενο επωαστήρα, στις 150 στροφές/λεπτό, σε θερµοκρασία 25 o C, για 24 ώρες. Μετά το πέρας της επώασης, οι καλλιέργειες φυγοκεντρήθηκαν στις 6.000 στροφές/λεπτό, για 10 λεπτά και 75 µl από το υπερκείµενο κάθε καλλιέργειας διηθήθηκαν µε αποστειρωµένα φίλτρα Whatman 0,45 µm ώστε να αποκλειστεί η παρουσία βακτηριακών κυττάρων. Η εκχύλιση των ουσιών έγινε όπως περιγράφεται στην παραπάνω βιοδοκιµή TLC. Ειδικότερα, 7 ml κάθε βακτηριακού εκχυλίσµατος συµπυκνώθηκαν µέχρι ξηρού, κάτω από ροή Ν 2 και το ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε 75 µl απεσταγµένο και αποστειρωµένο νερό. Μεταχειρίσεις Η ανάπτυξη του µύκητα µετρήθηκε, σε πλάκα πολυστυρενίου (microtiter) των 96 πηγαδιών, µέσω της οπτικής πυκνότητας, στα 620 nm. Προέκυψαν 14 µεταχειρίσεις που ήταν οι εξής: 1. Θετικός µάρτυρας εκχυλισµάτων: αιώρηµα κονιδίων Forl σε µίγµα 2ΧCzapek Dox(75µl):νερό(75µl), 50:50 (v:v) 75

2. Αρνητικός µάρτυρας εκχυλισµάτων: εκχύλισµα S. marcescens ΤοΖα 4-8 (75µl) + 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 3. Αρνητικός µάρτυρας εκχυλισµάτων: εκχύλισµα E. cloacae ΤοΖα 9-12 (75µl) + 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 4. Αρνητικός µάρτυρας εκχυλισµάτων: εκχύλισµα S. marcescens ΤοΖα 1-5-10 (75µl) + 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 5. Εκχύλισµα S. marcescens ΤοΖα 4-8 (75µl) + αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 6. Εκχύλισµα E. cloacae ΤοΖα 9-12 (75µl) + αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 7. Εκχύλισµα ΤοΖα S. marcescens 1-5-10 (75µl) + αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 8. Θετικός µάρτυρας υπερκείµενων: αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl): LC(75µl), 50:50 (v:v) 9. Αρνητικός µάρτυρας υπερκείµενων: υπερκείµενο S. marcescens ΤοΖα 4-8 (75µl) + 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 10. Αρνητικός µάρτυρας υπερκείµενων: υπερκείµενο E. cloacae ΤοΖα 9-12 (75µl) + 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 11. Αρνητικός µάρτυρας υπερκείµενων: υπερκείµενο S. marcescens ΤοΖα 1-5-10 (75µl) + 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 12. Υπερκείµενο S. marcescens ΤοΖα 4-8 (75µl) + αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 13. Υπερκείµενο E. cloacae ΤοΖα 9-12 (75µl) + αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 14. Υπερκείµενο S. marcescens ΤοΖα 1-5-10 (75µl) + αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox(75µl), 50:50 (v:v) 76

Κάθε µεταχείριση αποτελούταν από τρεις επαναλήψεις (τρία πηγαδάκια) και κάθε πηγαδάκι πληρώθηκε µε συνολικά 150 µl υλικού. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε θερµοκρασία 25 o C για επώαση και ανά 8 ώρες, για συνολικά 104 ώρες, µετρήθηκε η οπτική πυκνότητα (OD) σε µήκος κύµατος 620 nm, µε φασµατοφωτόµετρο (JENWAY 6405). Η δοκιµή εκτελέστηκε µια φορά. Μετρήσεις και στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων Με τα δεδοµένα της οπτικής πυκνότητας των εκχυλισµάτων έγιναν οι εξής υπολογισµοί: Έστω Α: ο θετικός µάρτυρας Forl σε 2ΧCzapek Dox:νερό, Β: τα εκχυλίσµατα των διηθηµάτων των βακτηρίων σε νερό µαζί µε αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox και Γ: τα εκχυλίσµατα των διηθηµάτων των βακτηρίων σε νερό και Czapek-Dox. Για τη σύγκριση του Α µε το Β, υπολογίστηκε ο µέσος όρος των τριών τιµών του Γ και αφαιρέθηκε από κάθε τιµή του Β. Από αυτές τις τιµές προέκυψε ένας µέσος όρος ο οποίος στη συνέχεια συγκρίθηκε µε το µέσο όρο των τιµών του Α. Το αντίστοιχο έγινε και µε τα δεδοµένα της οπτικής πυκνότητας των διηθηµάτων. Έστω Α : ο µάρτυρας Forl σε 2ΧCzapek Dox:LC, Β : τα διηθήµατα των βακτηρίων σε νερό µαζί µε αιώρηµα κονιδίων Forl σε 2ΧCzapek Dox και Γ : τα διηθήµατα των βακτηρίων και 2ΧCzapek Dox. Για τη σύγκριση του Α µε το Β υπολογίστηκε ο µέσος όρος των τριών τιµών του Γ και αφαιρέθηκε από κάθε τιµή του Β. Από αυτές τις τιµές προέκυψε ένας µέσος όρος ο οποίος στη συνέχεια συγκρίθηκε µε το µέσο όρο των τιµών του Α. Η στατιστική επεξεργασία των δεδοµένων έγινε στο πρόγραµµα EXCEL και οι µέσοι όροι συγκρίθηκαν µεταξύ τους µε το κριτήριο LSD. 77

2.3. Αποτελέσµατα Τα αποτελέσµατα όλων των βιοδοκιµών που περιγράφονται στο παρόν Κεφάλαιο παρατίθενται συγκριτικά στον Πίνακα 5. 2.3.1. Αναστολή της ανάπτυξης εδαφογενών φυτοπαθογόνων µυκήτων από τα στελέχη ριζοβακτηρίων σε διπλές καλλιέργειες in vitro 2.3.1.1. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων στο ίδιο τρυβλίο Τα αποτελέσµατα των in vitro αλληλεπιδράσεων των ριζοβακτηρίων µε τους πέντε εδαφογενείς παθογόνους µύκητες ήταν τα ακόλουθα: 1. Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl) Στις µεταχειρίσεις µε τα βακτήρια E. cloacae ΤοΖα9-12 και S. marcescens ΤοΖα4-8 δεν σχηµατίστηκε ζώνη αναστολής. Αντίθετα, τα βακτήρια αποίκισαν τις υφές. Η αποικία του µύκητα έχασε την βαµβακώδη εµφάνισή της και ήταν επίπεδη σε σχέση µε το µάρτυρα. Το S. marcescens ΤοΖα1-5-10 προκάλεσε αναστολή της αύξησης των υφών του µύκητα χωρίς να έρθει σε επαφή µε αυτές. Το S. marcescens ΤοΖα4-8 έδειξε να είναι αποτελεσµατικότερο των άλλων δύο σε όλες τις επαναλήψεις (Εικόνα 7) προκαλώντας τη µεγαλύτερη αναστολή της αύξησης του µύκητα. 78

Εικ. 7. Αποικισµός των υφών του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici από το ριζοβακτήριο Serratia marcescens ΤοΖα4-8 2. Rhizoctonia solani Στο πείραµα αυτό τα βακτήρια χωρίστηκαν σε τρεις κατηγορίες: αυτά που προκάλεσαν σχηµατισµό ζώνης αναστολής και ήταν τα S. rubidaea Σ55, S. marcescens Σ47, Σ52 και ΤοΖα1-5-10, και P. chlororaphis ΤοΖα7 (Εικόνα 8), αυτά που αποίκισαν τις υφές του µύκητα και ήταν τα E. cloacae ΤοΖα9-12, B. cereus Σ76 και Σ79 και S. marcescens ΤοΖα4-8 (Εικόνα 9) και σε αυτά που δεν είχαν ξεκάθαρη δράση- σε κάποιες επαναλήψεις δρούσαν µε σχηµατισµό ζώνης αναστολής και σε κάποιες ως αποικιστές των υφών και ήταν τα S. rubidaea Σ49 και S. marcescens ΠιΧα5-ΙΙ (Εικόνα 10). Να σηµειωθεί ότι σε όλους τους συνδυασµούς και σε όλες τις επαναλήψεις τους ο µύκητας µέσα στη διάρκεια της εβδοµάδας, αποκτούσε σταδιακά ένα πολύ έντονα σκοτεινό χρώµα στην κάτω πλευρά του τρυβλίου Petri, σε σχέση µε το µάρτυρα (Εικόνα 8). 79

1. Sclerotium rolfsii Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν στο πείραµα µε τον µύκητα S. rolfsii και τα ριζοβακτήρια ήταν τα πιο εντυπωσιακά αφού σε τέσσερις µεταχειρίσεις ο µύκητας δεν αναπτύχθηκε καθόλου και συγκεκριµένα υπό την επίδραση των S. marcescens ΤοΖα4-8 και ΤοΖα1-5-10, S. rubidaea Σ49 και P. chlororaphis ΤοΖα7 (Εικόνα 11) σε όλες τις επαναλήψεις που πραγµατοποιήθηκαν. Στις υπόλοιπες µεταχειρίσεις µε τα B. cereus Σ79 και Σ76, E. cloacae ΤοΖα9-12, S. rubidaea Σ55 και S. marcescens Σ52, Σ47 και ΠιΧα5-ΙΙ και σε µία µόνο επανάληψη παρατηρήθηκε µικρή µυκηλιακή ανάπτυξη η οποία µε το πέρασµα τριών ηµερών είχε ανασταλεί και οι υφές είχαν νεκρωθεί παίρνοντας, επίσης, χαρακτηριστικό σκοτεινό χρώµα (Εικόνα 12). Εικ. 8. Σχηµατισµός ζώνης αναστολής υπό την επίδραση του ριζοβακτηρίου Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 στον φυτοπαθογόνο µύκητα Rhizoctonia solani. Είναι εµφανής ο σκοτεινότερος χρωµατισµός των υφών υπό την επίδραση του βακτηρίου 80

Εικ. 9. Αποικισµός των υφών του µύκητα Rhizoctonia solani από το βακτηριακό στέλεχος Bacillus cereus Σ79 Εικ. 10. Αποικισµός των υφών (αριστερά) και σχηµατισµός ζώνης αναστολής (δεξιά) από τη δράση του βιοπαράγοντα Serratia rubidaea Σ49 81

Εικ. 11. Παρουσία του ριζοβακτηρίου Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 ο µύκητας Sclerotium rolfsii δεν αναπτύχθηκε καθόλου Εικ. 12. Ελάχιστη ανάπτυξη του µύκητα και σκοτεινός µεταχρωµατισµός υπό την επίδραση του στελέχους Bacillus cereus Σ76 82

2. Verticillium dahliae Σηµαντική παρατήρηση στο συγκεκριµένο πείραµα είναι ότι κανένα ριζοβακτήριο δεν αποίκισε τις υφές του µύκητα, ενώ σε όλες τις µεταχειρίσεις και επαναλήψεις τους σχηµατίστηκε ζώνη αναστολής. Το στέλεχος S. marcescens Σ52 παρουσίασε τα καλύτερα αποτελέσµατα καθώς εµπόδισε τον µύκητα να αναπτυχθεί σε πάρα πολύ µεγάλο βαθµό ενώ αυτό που εντυπωσίασε ήταν το γεγονός ότι απέτρεψε τον σχηµατισµό µικροσκληρωτίων σε όλες τις επαναλήψεις της συγκεκριµένης µεταχείρισης (Εικόνα 13). Εικ. 13. Πολύ µικρή ανάπτυξη του µύκητα Verticillium dahliae και παντελής απουσία µικροσκληρωτίων υπό την επίδραση του βιοπαράγοντα Serratia marcescens Σ52 3. Sclerotinia sclerotiorum Άξιο αναφοράς στο συγκεκριµένο πείραµα είναι το γεγονός ότι υπήρξαν µεταχειρίσεις που τα ριζοβακτήρια δεν είχαν καµία επιδραση στον µύκητα, όπως 83

στην περίπτωση των E. cloacae ΤοΖα9-12 και S. rubidaea Σ49 (Εικόνα 14) Αντίθετα, τα καλύτερα αποτελέσµατα προέκυψαν µε τα στελέχη B. cereus Σ76 και Σ79 όπου παρατηρήθηκε µια δυσδιάκριτη ζώνη αναστολής, έντονος αποικισµός των υφών και παντελής απουσία σκληρωτίων µέχρι τη µέρα της τελικής παρατήρησης (Εικόνα 15). Τα υπόλοιπα βακτηριακά στελέχη προκάλεσαν ποικίλα ανασταλτικά αποτελέσµατα που όµως δεν ήταν όµοια µε αυτά των βακίλων. Εικ. 14. Καµία επίδραση του στελέχους Enterobacter cloacae ΤοΖα9-12 στον µύκητα Sclerotinia sclerotiorum. Οι υφές περνούν πάνω από τη βακτηριακή αποικία Εικ. 15. ράση του βιοπαράγοντα Bacillus cereus Σ76 στον Sclerotinia sclerotiorum 84

2.3.1.2. ιπλές καλλιέργειες βακτηρίων και φυτοπαθογόνων µυκήτων σε διαφορετικά τρυβλία (αντικριστά) για τον έλεγχο της παρουσίας πτητικών ουσιών 1. Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici (Forl) Αξιοσηµείωτη επίδραση παρατηρήθηκε στις µεταχειρίσεις µε το στέλεχος S. marcescens ΤοΖα4-8 και ακόµα περισσότερο µε το B. cereus Σ76. Συγκεκριµένα, στη µεταχείριση µε το S. marcescens ΤοΖα4-8 παρατηρήθηκε αραιότερο µυκήλιο στο κέντρο της καλλιέργειας σε µια ζώνη µετά το πέρας της οποίας το µυκήλιο ήταν πυκνότερο και πιο ανεπτυγµένο σε σχέση µε το µάρτυρα ενώ η διάµετρος της καλλιέργειας ήταν λίγο µικρότερη από αυτή του µάρτυρα (Εικόνα 16). Στο B. cereus Σ76 παρατηρήθηκε αραιότερο µυκήλιο σε γενικό βαθµό και δε δηµιουργήθηκε ζώνη ενώ η διάµετρος ήταν κατά πολύ µικρότερη από αυτής του µάρτυρα και σε σχέση µε το S. marcescens ΤοΖα 4-8 (Εικόνα 17). Τα βακτήρια P. chlororaphis ΤοΖα7, E. cloacae ΤοΖα9-12 και S. marcescens ΠιΧα5-ΙΙ δεν προκάλεσαν αξιοσηµείωτες αλλαγές στην καλλιέργεια (Εικόνα 18). 1. Sclerotium rolfsii Και σε αυτή τη σειρά πειραµάτων η αλληλεπίδραση σχεδόν όλων των ριζοβακτηρίων εκτός του B. cereus Σ76 µε τον συγκεκριµένο φυτοπαθογόνο µύκητα έδωσε εντυπωσιακά αποτελέσµατα. Συγκεκριµένα, οι µεταχειρίσεις µε τα στελέχη S. marcescens ΤοΖα4-8 και ΠιΧα5-ΙΙ, P. chlororaphis ΤοΖα7 και E. cloacae ΤοΖα9-12 προκάλεσαν αδυναµία αύξησης και ανάπτυξης των µυκηλιακών 85

υφών του µύκητα (Εικόνα 19). Αντίθετα αποτελέσµατα προέκυψαν µε το B. cereus Σ76 όπου όχι µόνο δεν ανεστάλη η αύξηση και ανάπτυξη των υφών αλλά αυτές παρουσιάστηκαν πιο πυκνές σε σχέση µε το µάρτυρα. Παρ όλα αυτά, µε το πέρας της περιόδου παρατηρήσεων ο σχηµατισµός σκληρωτίων δεν είχε ξεκινήσει σε αντίθεση µε το µάρτυρα που φαίνονταν τα νεαρά σκληρώτια (Εικόνα 20). Εικ. 16. Αραιότερο µυκήλιο και µικρότερη διάµετρος ανάπτυξης καλλιέργειας Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici υπό τη δράση πτητικών ουσιών του Serratia marcescens ΤοΖα4-8 86

Εικ. 17. Αραιότερο µυκήλιο και µικρότερη διάµετρος ανάπτυξης Καλλιέργειας Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici υπό τη δράση πτητικών ουσιών του Bacillus cereus Σ76 Εικ. 18. Καµιά επίδραση ή απουσία πτητικών ουσιών του Pseudomonas chlororaphis ΤοΖα7 στον Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici 87

Εικ. 19. Αδυναµία ανάπτυξης του µύκητα Sclerotium rolfsii υπό την επίδραση πτητικών ουσιών του στελέχους Serratia marcescens ΤοΖα4-8 Εικ. 20. Πυκνότερες υφές του µύκητα Sclerotium rolfsii υπό την επίδραση πτητικών ουσιών του Bacillus cereus Σ76 88

2.3.1.3. Έλεγχος ικανότητας λύσης µυκηλιακών υφών- Βιοδοκιµή λύσης υφών Παρότι τα στελέχη P. chlororaphis ΤοΖα7, B. cereus Σ76 και Σ79, S. rubidaea Σ55 και Σ49, S. marcescens ΠιΧα5-ΙΙ, Σ47 και Σ52 είχαν προηγουµένως δοκιµαστεί σε βιοδοκιµή λύσης υφών (Κάµου, 2012) εντούτοις χρησιµοποιήθηκαν και στην παρούσα εργασία µαζί µε τα τρία νέα στελέχη E. cloacae ΤοΖα9-12 και S. marcescens ΤοΖα4-8 και ΤοΖα1-5-10, ώστε να είναι δυνατή η µεταξύ τους σύγκριση. Όλα τα βακτηριακά στελέχη που χρησιµοποιήθηκαν εµφάνισαν ικανότητα λύσης µυκηλιακών υφών του Forl, όµως, το στέλεχος S. marcescens ΤοΖα4-8 έδειξε τα καλύτερα αποτελέσµατα (Εικόνες 21,22). Εικ. 21. Ικανότητα λύσης υφών του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici από διάφορους βιοπαράγοντες 89

Εικ. 22. Ικανότητα λύσης υφών του Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici από τα στελέχη Enterobacter cloacae ΤοΖ 9-12 (αριστερά), Serratia marcescens ΤοΖα4-8 (κέντρο) και Serratia marcescens ΤοΖα1-5-10 (δεξιά) 90

Πίν. 5. Επίδραση ριζοβακτηρίων στην ανάπτυξη εφαφογενών φυτοπαθογόνων μυκήτων µε ποικίλους τρόπους δράσης Δημιουργία ζώνης αναστολής Αποικισμός των υφών Δράση πτητικών Δράση μεταβολιτών S. rolfsii S. sclerotiorum R. solani V. dahliae Forl S. rolfsii S. sclerotiorum R. solani V. dahliae Forl S. rolfsii Forl TLC Υπερκείμενα Εκχυλίσματα B. cereus Σ76 +++ + Ø -; + ++ + - Ø + B. cereus Σ79 +++ + Ø -; + ++ + - P. chlororaphis ++++ + + + - - ++++ - ToZα7 E. clocae +++ - - + - - + - + ++++ - ++ + ToΖα 9-12 S. marsescens ++++ + - + - - + - + ++++ + ++++ + + ΤοΖα4-8 S. marsescens ++++ + + + + - - - - - + ++ ToZa 1-5-10 S. marsescens +++ + + + - - - Σ47 S. marsescens +++ + + ++ Ø - - - Σ52 S. marsescens ++++ + +/- + - +/- - ++++ - ΠιΧα5II S. rubidaea Σ49 ++++ - +/- + - +/- - S. rubidaea Σ55 +++ + + + - - ++++ πλήρης αναστολή μυκηλιακής ανάπτυξης, +++ αρχικά μικρή μυκηλιακή ανάπτυξη και στη συνέχεια διακοπή της, ++επιβράδυνση της μυκηλιακής ανάπτυξης, + μικρή επιβράδυνση της μυκηλιακής ανάπτυξης, -καμία επίδραση στη μυκηλιακή ανάπτυξη, +/- μη επαναλήψιμες επιδράσεις πότε με αναστολή και πότε με αποικισμό, Δεν σχηματίστηκαν υφές και δεν ήταν δυνατή η παρατήρηση, Προαγωγή της μυκηλιακής ανάπτυξης, Ø αναστολή του σχηματισμού σκληρωτίων Άδεια κελιά σημαίνουν ότι δεν μελετήθηκε η αλληλεπίδραση 91

2.3.2. Αναστολή της ανάπτυξης του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici από τα βακτηριακά στελέχη Serratia marcescens ΤοΖα 4-8 και ΤοΖα 1-5-10 και Enterobacter cloacae ΤοΖα 9-12 2.3.2.1. ιαχωρισµός αντιµικροβιακών ουσιών οργανικών εκχυλισµάτων καλλιεργειών των ριζοβακτηρίων µε χρωµατογραφίας λεπτής στοιβάδας Βιοδοκιµή TLC Μετά το πέρας των 5 ηµερών παρατηρήθηκαν οι κηλίδες αναστολής της ανάπτυξης του µύκητα που είχαν σχηµατιστεί λόγω της δράσης των εκχυλισµάτων κάθε βακτηρίου (Εικόνα 23). Οι κηλίδες αυτές αποτελούσαν τα σηµεία όπου οι εν λόγω ουσίες προκαλούσαν αναστολή βλάστησης κονιδίων και µυκηλιακής ανάπτυξης του Forl. Συγκεκριµένα, κηλίδες προκάλεσαν τα εκχυλίσµατα των στελεχών E. cloacae ΤοΖα9-12 µε Rf=0,70 και S. marcescens ΤοΖα4-8 µε Rf=0,76, ενώ κηλίδα δε σχηµατίστηκε στην περίπτωση του µάρτυρα οξικού αιθυλεστέρα, αλλά και στην περίπτωση του S. marcescens ΤοΖα1-5-10. 92

Εικ. 23. Κηλίδες αναστολής που δηµιουργήθηκαν λόγω δράσης µεταβολιτών των στελεχών Enterobacter cloacae ΤοΖα9-12 και Serratia marcescens ΤοΖα4-8 εναντίον του µύκητα Fusarium oxysporum f.sp. radicislycopersici 93