Ραδιοεπισηµασµένα βιοµόρια στη διάγνωση και στη θεραπευτική αντιµετώπιση του καρκίνου Μ. Φάνη, Π. Μπουζιώτη Εργαστήριο Ραδιοφαρµακολογικών Μελετών Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων-Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων Ε.Κ.Ε.Φ.Ε «ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ»
βιοµόρια Βιολογικώς ενεργά µόρια, τα οποία αποτελούνται από συνδυασµό αµινοξέων Ασκούν τη φαρµακολογική τους δράση µέσω εξειδικευµένης αλληλεπίδρασης µεσυγκεκριµένους υποδοχείς, οι οποίοι βρίσκονται στην επιφάνεια ή στο εσωτερικό των κυττάρων-στόχων Οι κυριότερες κατηγορίες βιοµορίων που βρίσκουν σήµερα εφαρµογή στην Πυρηνική Ιατρική και στην Ογκολογία, υπό ραδιοεπισηµασµένη µορφή, είναι τα Μονοκλωνικά Αντισώµατα (ΜoAbs) και τα Πεπτίδια.
βιοµόρια - πρωτεΐνες H οµική µονάδα R C C H α H 2 H H Χαρακτηριστικός δεσµός H 2 C C C C H R H R Πρωτεΐνη H H H H H 2 C C C C C... C C C H R H R H R H R
αντισώµατα και πεπτίδια Αντισώµατα: Πεπτίδια: > 50 αµινοξέων < 50 αµινοξέων Μικρά πεπτίδια: < 30 αµινοξέων
αντίσωµα (Ab) - αντιγόνο (Ag) Αντίσωµα (Ab): πρωτεΐνες που φτιάχνονται από κάθε ζώο εξ αιτίας της παρουσίας µέσα του µίας ξένης ουσίας Αντιγόνο (Ag): κάθε ξένο µακροµόριο που είναι ικανό να προκαλέσει το σχηµατισµό αντισώµατος Αντιγονική περιοχή: (επίτοπος) η περιοχή του αντιγόνου µε την οποία συνδέεταιτοειδικόαντίσωµα
δοµή αντισωµάτων L H H L
µονοκλωνικά αντισώµατα (MoAbs) 2 1 Αντιγόνο 1 2 3 3
δέσµευση πεπτιδίου στον υποδοχέα
επισηµασµένα βιοµόρια Με τον όρο επισηµασµένα (ραδιοεπισηµασµένα) βιοµόρια αναφερόµαστε στα βιοµόρια που φέρουν στο µόριό τους ένα ραδιοϊσότοπο. Τα επισηµασµένα βιοµόρια βρίσκουν εφαρµογή τόσο στο τοµέα της διάγνωσης (ραδιοανοσοσπινθηρογράφηση), όσο και στον τοµέα της θεραπείας (ραδιοανοσοθεραπεία). ραδιο-.: ραδιοϊσότοπο ανοσο-.: ανοσολογική αντίδραση Ag-Ab ήπεπτιδίου-υποδοχέα σπινθηρογράφηση/θεραπεία : απεικόνιση ή θεραπεία της οργανικής βλάβης (καρκίνος)
βασική αρχή R + R Ab + Ραδιοϊσότοπο R-Ab R R R-Ab Ag R-Ab-Ag
RIS/RIT Ραδιοανοσοσπινθηρογράφηση (RIS): Εντοπισµός και απεικόνιση πρωτογενών και µεταστατικών όγκων Ραδιοανοσοθεραπεία (RIT): Αναστολή της ανάπτυξης του όγκου ιαφορές φύση της ακτινοβολίας χορηγούµενη δόση ραδιενέργειας χορηγούµενη δόση βιοµορίου
ραδιοϊσότοπα / ραδιονουκλίδια Ισότοπα:τα άτοµα ενόςστοιχείουµε τον ίδιο ατοµικό αριθµό (Ζ), αλλά µε διαφορετικό αριθµό νετρονίων και κατ επέκταση διαφορετικό µαζικό αριθµό (Α). Οι πυρήνες των διαφόρων ισοτόπων ονοµάζονται νουκλίδια. A X Z Τα ισότοπα έχουν τις ίδιες χηµικές ιδιότητες. Τα ασταθή ισότοπα ονοµάζονται ραδιοϊσότοπα και οι πυρήνες αυτών, οι οποίοι διασπώνται, ονοµάζονται ραδιονουκλίδια. Τα ασταθή διασπώνται αυθόρµητα µε ταυτόχρονη εκποµπή ακτινοβολίας.
τύποι ραδιενεργού διάσπασης σωµατίδια α σωµατίδια β (β -, β + ) ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία γ
διαγνωστικά ραδιοϊσότοπα Ραδιοϊσότοπο 131 I 123 I 111 In 99m Tc 67 Ga 64 Cu Χρόνος υποδ/σµού (t 1/2 ) 8.04 d 13.27 h 2.8 d 6.0 h 3.26 d 12.7 h γ (0.364), β - (0.6) γ (0.159) γ (0.245, 0.171) γ (0.141) Ακτινοβολία (MeV) γ (0.093, 0.185, 0.3) γ (1.346), β - (0.578), β + (0.653)
γ-camera PET- camera
θεραπευτικά ραδιοϊσότοπα Ραδιοϊσότοπο 131 I 153 Sm 177 Lu 188 Re 32 P 90 Y 166 Ho 186 Re Χρόνος υποδ/σµού (t 1/2, d) > 10% ακτινοβολία-γ 8.0 1.95 6.7 σωµατίδια β - (Ē β kev) 181 225 133 0.71 764 < 10% ακτινοβολία-γ 14.3 695 2.7 1.1 3.71 935 666 329 γ-φωτόνια kev (%) 364 (81) 103 (28) 208 (11) 155 (15) - - 80 (6.2) 137 (9.2)
επιλογή ραδιοϊσοτόπου είδος ακτινοβολίας ενέργεια ακτινοβολίας χρόνος υποδιπλασιασµού ραδιοϊσοτοπική καθαρότητα χηµική φύση του ραδιοϊσοτόπου και ραδιοχηµική καθαρότητα σχέση µεταξύ µητρικού και θυγατρικού πυρήνα το κόστος της παραγωγής όσο και η δυνατότητα διάθεσης στο εµπόριο
επιλογή µεθοδολογίας επισήµανσης κατάλληλη µέθοδος επισήµανσης, ανεξαρτήτως του ραδιοϊσοτόπου, είναι εκείνη που οδηγεί σε : ένα τελικό προϊόν σταθερό in vivo υψηλή απόδοση επισήµανσης ελάχιστη απώλεια της βιολογικής δραστικότητας του βιοµορίου καθορίζεται από το χρησιµοποιούµενο ραδιοϊσότοπο και ειδικότερα από τις χηµικές του ιδιότητες
άµεση επισήµανση ενσωµάτωση του ραδιοϊσοτόπου στο µόριο του αντισώµατος αναγωγή δισουλφιδικών δεσµών (S - S) σε σουλφιδρυλοµάδες (- SH) R : 99m Tc, 186/188 Re S S SH HS S S S S SH HS S R S
έµµεση επισήµανση µε τη χρήση χηλικών µέσων διπλής δράσης πριν τη σύµπλεξη R B R µετά τη σύµπλεξη B B B R R : R +3 ( 99m Tc, 186/188 Re, 90 Y, 177 Lu, 153 Sm, 111 In, 166 Ho κ.ά)
αντιπροσωπευτικές µεθοδολογίες επισήµανσης Άµεση επισήµανση επισήµανση µονοκλωνικού αντισώµατος µε 99m Tc Έµµεση επισήµανση επισήµανση µονοκλωνικού αντισώµατος µε 153 Sm επισήµανση πεπτιδίων µε 99m Tc
Tc-99m 99 Mo (67 h) β 1-0.45 (14%) β 2-0.87 (1%) β 3-1.23 (85%) 0.920 γ 8 1.37 MeV γ 6 γ 7 0.514 0.181 99m Tc (6 h) γ 4 γ 5 0.142 0.140 γ 1 γ 2 γ 3 99 Tc (2.12 x 10 5 y) 0
99m Tc σύµπλοκα 99m Tc Στις ενώσεις του το Tc βρίσκεται στις οξειδωτικές βαθµίδες από (- I) έως (VII) και έχει διάφορους βαθµούς συναρµογής, από 4 έως 9 Οξειδωτική βαθµίδα (VII) (VI) (V) (IV) (III) (II) (I) (0) (-I) Πυρήνας των συµπλόκων Tc 4 Tc 3+ Tc 3+,tr-Tc 2+,Tc 2 3 4+,Tc 2+ Tc 4+,Tc(H) +,Tc(H) 2 2+ Tc 3+ Tc 2+ Tc + Tc,Tc 2 Tc Στις περισσότερες οξειδωτικές βαθµίδες απαιτείται ισχυρή σύµπλεξη µε κατάλληλους περιφερειακούς υποκαταστάτες για τη σταθεροποίηση του µετάλλου διαθέτουν οµάδες που περιέχουν άτοµα δότες(s,,, P, ) σε κατάλληλη στερεοχηµική διάταξη για τη σύµπλεξη
3+ σύµπλοκα (Tc=) 3+ X X H H Tc H H SH HS Y Y H H H H MeH S S HMe
σύµπλοκα (=Tc Tc=) + H H X Tc X H 2 H 2 H H Y Y H H S S P P H H H H
αναγωγή MoAb χλωριούχος κασσίτερος 2-µερκαπτοαιθανόλη διθειοθρεϊτόλη ασκορβικό οξύ RT gel filtration MoAb ανηγµένο MoAb
επισήµανση MoAb µε µε 99m Tc διαδικασία 2 σταδίων 99m Tc 4 - + Sn 2+ + L L: µεθυλενοδιφωσφονικό οξύ (MDP) πυροφωσφορικό νάτριο (PYP) γλυκοεπτονικό ασβέστιο κ.ά. 1 ο στάδιο 5 min, RT, ph ~ 8 99m Tc-L (ασθενές ενδιάµεσο σύµπλοκο) 99m Tc-L + MoAb 2 ο στάδιο 15 min, RT, ph ~ 7 99m Tc-MoAb διαδικασία 1 σταδίου 99m Tc 4 - + [Sn 2+ + L + MoAb] 99m Tc-MoAb 15 min, RT, ph ~ 7
Sm-153 62 Sm153 β 1 Χρόνος υποδιπλασιασµού: : 46.75 h Προϊόν διάσπασης: Ευρώπιο-153 (σταθερό( σταθερό) Κύριες β - µεταπτώσεις: : 640 kev (35%) - β 1 710 kev (43%) - β 2 810 kev (21%) - β 3 Μέση β - ενέργεια: : 227 kev Κύριες γ µεταπτώσεις: : 70 kev (5.4%) - γ 1 103 kev (28%) - γ 2 β 2 β 3 γ 1 173 103 γ 2 0 63 Eu153
σύµπλοκα λανθανίδων EDTA HC HC CH CH DTPA HC HC CH CH CH DTA HC CH HC CH TA HC CH CH log K (SmDTA) =23.0 log K (SmDTPA) = 22.3
DTPA HC HC CH CH CH Ln H H
σχηµατισµός ανοσοσυµπλέγµατος Ab-DTPA H + Ab H 2 Ab C H H H H
σχηµατισµός ανοσοσυµπλέγµατος C L + H 2 Ab Ab C L L + H S Ab Ab S L + H 2 Ab Ab C L C S L S R L + H 2 Ab Ab R L
επισήµανση MoAb-L µε µε 153 153 Sm (Ln( Ln) «ενεργοποιηµένος» υποκαταστάτης L διάλυµα 153 Sm 3+ RT, 30 min ph 8 gel filtration 60 min, RT ph 5.0-5.5 MoAb ανοσοσύµπλεγµα MoAb-L gel filtration Απορρόφηση (280 nm ) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 300 250 200 150 100 50 0 Ραδιενέργεια (µc i) Απορρόφηση Ραδιενέργεια 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Αριθµός Κλασµάτων
µειονεκτήµατα των ραδιοεπισηµασµένων αντισωµάτων λόγω του µεγάλου µοριακού τους βάρους, παρουσιάζουν βραδεία αιµατική κάθαρση και υψηλές τιµές ακτινοβολίας υποβάθρου (background) στην ραδιοανοσοσπινθηρογράφηση: καθυστερηµένη απεικόνιση και περιορισµός στη χρήση βραχύβιων ραδιονουκλιδίων στην ραδιοανοσοθεραπεία: ακτινοβόληση υγιών ιστών ησύνδεσήτωνmoabs τους µε τα αντιγόνα των όγκων δεν είναι πάντα ειδική και συχνά γίνεται κατά τρόπο χαλαρό τα Μονοκλωνικά Αντισώµατα δεν διεισδύουν στον καρκινικό ιστό, αλλά παραµένουν στην επιφάνεια του όγκου δεδοµένου ότι τα αρχικά χρησιµοποιηθέντα αντισώµατα ήταν ζωικής προέλευσης η ενδοφλέβια χορήγησή τους είχε ως συνέπεια ανοσολογική αντίδραση (HAMA)
µικρά πεπτίδια - πλεονεκτήµατα παρασκευάζονται σχετικά εύκολα µε αµινοξική σύνθεση λόγω του µικρού µεγέθους τους, µετά την χορήγηση η περίσσειά τους αποβάλλεται ταχέως από το σώµα µπορούν να υποβληθούν σχετικά εύκολα σε τροποποίηση της δοµής τους, ώστε να διευρυνθεί η ικανότητά τους να συνδέονται µε υποδοχείς λόγω του µικρού µεγέθους τους δεν προκαλούν αντιγονικές αντιδράσεις τα επισηµασµένα πεπτιδικά παράγωγα αποβάλλονται σχεδόν αποκλειστικά από το ουροποιητικό σύστηµα
RGD πεπτίδια στην αγγειογένεση Eπισήµανση RGD (Arg-Gly-Asp) πεπτιδικών παραγώγων για δυνητική απεικόνιση των ιντεγκρινών των επιθηλιακών, αλλά και των καρκινικών κυττάρων κατά την αυξηµένη αγγειογένεση που παρατηρείται σε πρωτογενείς και µεταστατικούς όγκους. RGDfK
προσύµπλοκο [ 99m Tc(H ) (C) ] + 2 3 3 H 2 C 99m Tc - C 4 + abh 4 Tc 75 o C C C H 2 H 2 + H 2 + C C Tc C H 2 H 2
RGDfK πεπτιδικά παράγωγα RGDfK PADA His
επισηµασµένα RGD παράγωγα Tc H 2 Tc (C) 3 (C) 3 RGDfK-PADA- 99m Tc(C) 3 RGDfK-His- 99m Tc(H 2 )(C) 3
παράγωγα µποµπεσίνης και καρκινογένεση Οι µποµπεσίνες και οι υποδοχείς της εµπλέκονται στην παθογένεση των ακόλουθων καρκινωµάτων (σε θηλαστικά): Μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύµονα Μυελώδες καρκίνωµα θυρεοειδούς Παγκρεατικό καρκίνωµα Γαστρικό καρκίνωµα Καρκίνωµαπαχέοςεντέρου Καρκίνωµα µαστού Καρκίνωµα προστάτη Γαστρινώµατα
επισηµασµένα παράγωγα µποµπεσίνης H H S Tc H S H H H Bombesin Bombesin H H QRLGQWAVGHLM Tc H S
ραδιοχηµικός έλεγχος - Ταχεία Χρωµατογραφία Λεπτής Στιβάδας (ITLC) - Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Απόδοσης (HPLC) - Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου (SDS-PAGE) - Χρωµατογραφία µοριακής διήθησης (gel filtration) Ραδιοχηµική καθαρότητα Σταθερότητα
ραδιοβιολογικός έλεγχος in vitro σύνδεση σε καρκινικά κύτταρα ικανότητα σύνδεσης σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν το Ag ή τον υποδοχέα διατήρηση της βιολογικής τους δράσης ραδιοβιολογική αξιολόγηση µελέτες βιοκατανοµής σε φυσιολογικά πειραµατόζωα µελέτες βιοκατανοµής και απεικόνισης σε παθολογικά πρότυπα
σπινθηρογραφική απεικόνιση σε γ-camera (πειραµατική εφαρµογή) 4 h 1 d 2 d 3 d 4 d ήπαρ όγκος
σπινθηρογραφική απεικόνιση σε γ-camera (πειραµατική εφαρµογή) Νεφρά Όγκος Ουροδόχος Κύστη Καρκίνος του εντέρου Μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύµονα
σπινθηρογραφική απεικόνιση σε γ-camera (κλινική εφαρµογή)
συµπερασµατικά Τα ραδιοεπισηµασµένα βιοµόρια είναι τα «εργαλεία» για την εφαρµογή της ραδιοανοσοσπινθηρογράφησης και της ραδιοανοσοθεραπείας, δύο ιδιαίτερα σηµαντικών µεθόδων για τη διάγνωση και τη θεραπευτική αντιµετώπιση του καρκίνου, αντίστοιχα. Η κατάλληλη επιλογή τόσο του βιοµορίου, όσο και του ραδιοϊσοτόπου, συνεισφέρει σήµερα στον ακριβή εντοπισµό του όγκου, στο σαφή προσδιορισµότων διαστάσεών του, ενώ παράλληλα επιτρέπει την έγκαιρη ανίχνευση αποµακρυσµένων µεταστάσεων.