QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A e CENP-B) 708770 Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση To QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) είναι μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ημι-ποσοτική ανίχνευση αντισωμάτων κεντρόμερου, ειδικά αντιδραστική στα αντιγόνα CENP- A και CENP-B στον ανθρώπινο ορό. Η ανίχνευση αυτών των αντισωμάτων αποτελεί ένα βοήθημα στη διάγνωση ορισμένων νόσων των συνδετικών ιστών όπως η παραλλαγή CREST της σκληροδερμίας. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Αυτοαντισώματα αντιδραστικά με την περιοχή κεντρόμερου των χρωμοσωμάτων περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1980 1. Παραδοσιακά αυτά τα αντισώματα ανιχνεύονται μέσω έμμεσου ανοσοφθορισμού με χρήση ταχέως διαιρούμενων γραμμών κυττάρων καλλιέργειας ιστού, όπως HEp-2 ως υπόστρωμα 2. Το αναφερόμενο ως κεντρόμερο είναι πλέον γνωστό ότι αποτελείται από διάφορες πρωτεϊνικές υπομονάδες, οι σπουδαιότερες από τις οποίες είναι CENP-A, CENP-B και CENP-C 2. Πολλές από τις κεντρομερικές υπομονάδες έχουν απομονωθεί ή κλωνοποιηθεί. Αναλύσεις που χρησιμοποιούν πρωτεΐνες συνένωσης CENP-B χρησιμοποιούνται εδώ και αρκετά χρόνια 3. Αυτοαντισώματα σε κεντρόμερο πολύ συχνά βρίσκονται να έχουν ειδικότητα για CENP-B και CENP-A. Έχουν αναγνωριστεί τουλάχιστον τρία άλλα αντιγόνα, αλλά αντισώματα σε αυτά (CENP-D, CENP-E και CENP-F) αναγνωρίζονται πολύ λιγότερο συχνά 3,4. Οι αναλύσεις ELISA που περιλαμβάνουν CENP-B αναφέρεται ότι έχουν ειδικότητα 94-95% σε σύγκριση με μια καλή μέθοδο ανοσοφθορισμού που χρησιμοποιεί κυτταρικό υπόστρωμα HEp-2 3,5,6. Η πρωτεΐνη CENP-A κλωνοποιήθηκε 7 και δεδομένα πρόσφατων δημοσιεύσεων αποκαλύπτουν ότι οι αναλύσεις ELISA που περιλαμβάνουν CENP-A και CENP-B παράγουν αποτελέσματα σε μεγάλο βαθμό συγκρίσιμα με τον ανοσοφθορισμό και ότι η ευαισθησία των αναλύσεων που χρησιμοποιούν και τις δύο πρωτεΐνες είναι υψηλότερη από εκείνη που παράγεται από κάθε αντιγόνο χωριστά 8. Τα αντισώματα κεντρόμερου αναγνωρίζονται ως οροδιαγνωστικός δείκτης μιας μορφής συστημικής σκλήρυνσης ή σκληροδερμίας, η οποία αποκαλείται συχνά ως σύνδρομο CREST (ασβέστωση, φαινόμενο Raynaud, οισοφάγεια ακινησία, σκληροδακτηλία και τελαγγειεκτασία) 9. Ασθενείς με αντισώματα κεντρόμερου τείνουν να έχουν περισσότερο καλοήθη μορφή σκληροδερμίας με μικρότερη συστημική εμπλοκή και οι συγκεκριμένοι ασθενείς τείνουν να μην παράγουν άλλα αντιπυρηνικά αντισώματα συμπεριλαμβανομένου του SCL-70 10. Αρχη Μεθοδου Τα αντιγόνα που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία QUANTA Lite Centromere ELISA είναι ανασυνδυασμένα παράγωγα CENP-A και CENP-B. Αυτά τα αντιγόνα δεσμεύονται στην επιφάνεια μιας πλάκας μικροκοιλοτήτων. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενών προστίθενται σε ξεχωριστές κοιλότητες, επιτρέποντας στα παρόντα αντισώματα κεντρόμερου να συνδεθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Στη συνέχεια η προσθήκη υποστρώματος υπεροξειδάσης προκαλεί χρωματική αλλαγή ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντισωμάτων. Μετά τη διακοπή της ενζυματικής παραγωγής χρώματος, η παρουσία ή η απουσία αντισωμάτων συγκρίνεται με την οπτική πυκνότητα των πρότυπων αναφοράς. Αντιδραστηρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήταν πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με καθαρό αντιγόνο κεντρόμερου (CENP-A και CENP-B) (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά μέσα 2. ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορος ελέγχου (1 φιαλίδιο 1.2ml αραιωμένου διαλύματος χωρίς ανθρώπινα αντισώματα Centromere) 3. Centromere ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Centromere, προαραιωμένο, 1.2ml 4. Centromere ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού σε ανασυνδυασμένο ανθρώπινο Centromere, προαραιωμένο, 1.2ml 5. HRP Sample Diluent, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50ml 6. HRP Wash Concentrate, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25ml. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10ml 8. TMB Chromogen, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10ml 9. HRP Stop Soulution, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10ml 1
Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0.02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας των μαρτύρων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HbsAg, HCV όπως ορίζεται από τους κανονισμούς του FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Γι αυτό και όλοι οι ανθρώπινης προέλευσης μάρτυρες θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 11 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Aποφύγετε πιθανά εγκαύματα αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) περιέχει θειικό οξύ το οποίο είναι δηλητηριώδες, διαβρωτικό και τοξικό. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικα Μετρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων στα ενδιάμεσα στάδια μπορεί να επηρεάσει την ακρίβεια της μεθόδου. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτη καί άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα απο αυτά που αποκτώνται στη χειρωνακτική διαδικασία. Είναι στήν ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να καθορίσει τις αποδεκτές τιμές και όρια της αυτόματης διαδικασίας. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της μεθόδου: Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τη μικροπλάκα, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Προσεκτική τήρηση της διαδικασίας είναι απαραίτητη για ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκής συντήρηση της μικροπλάκας (κλείσιμο της αχρησιμοποίητης πλάκας) μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν αποδύο η περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης απο το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις οδηγίες χρήσης της σφαιρίνης. 9. Χημική μόλυνση της σφαιρίνης μπορεί να προέλθει απο ανεπαρκή καθαρισμό των τμημάτων διανομής των αναλυτών. Κατάλοιπα απο εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, εθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετα τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύσατε τα αντιδραστήρια στους 2-8 ο C. Να μήν παγώνουν. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται συμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιούμενες σειρές επικαλυμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσονται στούς 2-8 ο C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2-8 ο C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου η άλλων συντηριτικών στο υποό έλεγχο δείγμα μπορεί να επιρεάσει τα αποτελέσματα. Μικροβιακή μόλυνση, θέρμανση η δείγματα περιέχοντα ορατά ξένα στοιχεία δέν πρέπει να χρησιμοποιούνται. Αιμολυθέντα η λιπαιμικά δείγματα η ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. NCCLS Document H18-A2 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί άμεσα, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία 2
συντήρησης (2 8 ο C ) μέχρι 48 ώρες. Για μεγαλύτερο διάστημα, τα δείγματα θα πρέπει να καταψυχθούν στους 20 ο C. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Centromere ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1.2ml αραιωμένος ELISA Negative Αρνητικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος Centromere Low Θετικός πρότυπος ορός ελέγχου (έτοιμος προς χρήση) 1 1.2ml αραιωμένος Centromere High Ρυθμιστής (έτοιμος προς χρήση) 1 50ml HRP Sample Diluent, HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25ml HRP Wash Concentrate, HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10ml HRP Conjugate, HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), 1 10ml TMB Chromogen, TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Stop Solution, HRP Διάλυμα διακοπής, 0.344M θεεινικό οξύ Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Διάλυμα πλυσίματος) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450 και 620 nm Μεθοδολογια Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975 ml απεσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δέν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2 ml συμπυκνωμένου Wash και 78 ml απεσταγμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο υπόστρωμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5 μl ορού σε 500μl αραιωτικό δείγματος. Η προετοιμασία των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται εντός 8 ωρών. Οι θετικος και ο αρνητικός πρότυποι οροί δεν χρειάζονται αραίωση. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων προτείνεται η εις διπλούν τοποθέτηση όλων των διαλυμάτων αναφοράς, πρότυπων ορών ελέγχου και δειγμάτων. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20 26 C) και να έχουν αναδευτεί καλά. Υπολογίστε τον απαραίτητο αριθμό πηγαδιών που απαιτούνται, και φυλάξτε τις υπόλοιπες στην ειδική θήκη την οποία θα πρέπει να την κλείσετε καλά ώστε να προστατέψετε την μικροπλάκα από την υγρασία. 2. Προσθέστε 100 μl πρότυπων ορών ελέγχου, υψηλού, χαμηλού, αρνητικού και των υπό έλεγχο αραιωμένων δείγματων στις προκαθορισμένες θέσεις. Καλύψτε την μικροπλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100 μl HRP IgG συζεύγματος σε όλες τις πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των δειγμάτων θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας, σε φωτόμετρο στα 450 nm με φίλτρο αναφοράς 620 nm προαιρετικά. 3
Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε ανοσοενζυμική διαδικασία έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Οι θετικοί και ο αρνητικός πρότυποι οροί ελέγχου είναι ήδη αραιωμένοι. Γι αυτό το λόγο δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέτρο ελέγχου της διαδικασίας αραίωσης των δειγμάτων. 3. Επιπλέον κατάλληλοι οροί, μάρτυρες, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν από δείγματα ρουτίνας τα οποία θα αποθηκεύονται στη βαθιά κατάψυξη. πολιτειακών και\ ή των ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Μπορείτε να ετοιμάσετε επιπλέον απαραίτητο ορό μάρτυρα διαιρώντας σε ίσα μέρη τα δείγματα ανθρώπινου ορού που βρίσκεται στα πηγαδάκια και φυλάσσοντας στους -20 C. 4. Για να θεωρηθούν τα αποτελέσματα έγκυρα θα πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω κριτήρια. Στη περίπτωση που κάποιο κριτήριο δεν ισχύσει τότε θα πρέπει να επαναληφθεί η διαδικασία. α. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του υψηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (high positive) θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1.0 ενώ η απορρόφηση του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0.2. γ. Η απορρόφηση του χαμηλού θετικού πρότυπου ορού ελέγχου (low positive) θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του αρνητικού πρότυπου ορού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0.25. δ. Ο αρνητικός και ο υψηλός έλεγχοι δείχνουν την εγκυρότητα της διαδικασίας. Ο υψηλός θετικός δέν αντιστοιχεί στό σημείο αποκοπής της μεθόδου. ε. Ο χρήστης μπορεί να απευθυνθεί στό έγγραφο C24-A toυnccls για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του Centromere ELISA Low, και πολλαπλασιάζοντας το αποτέλεσμα με την τιμή του Centromere ELISA Low. Η τιμή του Centromere ELISA Low σε (units) φαίνεται στην ετικέτα του φιαλιδίου. Τιμή δείγματος Ο.A. δείγματος (μονάδες) = X Centromere oρού ελέγχου (μονάδες) O.A. Centromere ορού ελέγχου Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος σε ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Υπολογισμός Αποτελεσμάτων. Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Η τεχνική ELISA είναι πολύ ευαίσθητη και ικανή να ανιχνεύει μικρές διαφορές στον ασθενή πλυθησμό. Οι κατωτέρω είναι ενδεικτικές τιμές. Κάαθε εργαστήριο πρέπει να καθορίσει τίς δικές του τιμές αναφοράς βάσει τών τεχνικών, ελέγχων και πλυθισμού κ.λ.π. Το δείγμα μπορεί να χαρακτηρισθεί σάν αρνητικό, ασθενές θετικό, ισχυρώς θετικό. Αρνητικό Ασθενώς Θετικό Ισχυρώς θετικό Mονάδες <20 μονάδες 20-30 μονάδες >30 μονάδες 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την παρουσία αντισωμάτων κεντρόμερου και υποδηλώνει την πιθανότητα συνδρόμου CREST. 2. Το αρνητικό αποτέλεσμα δείχνει τη απουσία αντισωμάτων Centromere ή στάθμής κάτω του ορίου ανίχνευσης. 3. Συστήνεται τα αποτελέσματα να συνοδεύονται με την πληροφορία «τα ακόλουθα αποτελέσματα προέκυψαν με INOVA QUANTA Lite TM Centromere ELISA. Οι τιμές Κεντρόμερο που προκύπτουν απο διαφορετικούς κατασκευαστές δέν είναι συγκρίσιμες. Οι τιμές δέν μπορούν να συσχετισθούν με τόν τελικό τίτλο. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου.» Περιορισμοί της Μεθόδου 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλέγματος στο δείγμα μπορεί να οφείλεται στήν αυξημένη στάθμη μη ειδικής σύνδεσης, και συνεπώς ψευδές αποτέλεσμα. 2. Δεν βρέθηκαν όλοι οι πάσχοντες από σύνδρομο CREST θετικοί για αντισώματα CENP-A ή CENP-B. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου δέν έχουν ελεγχθεί σάν ακριβεί γιά δείγματα εκτός ορού. 4
Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα της QUANTA Lite TM Centromere (CENP-A & CENP-B) ELISA να ανιχνεύει αντισώματα κεντρόμερου IgG αξιολογήθηκε σε σύγκριση με μια άλλη δοκιμασία με βάση IFA για την ανίχνευση αντισώματος κεντρόμερου, καθώς επίσης και συγκρίνοντας τα αποτελέσματα με την κλινική διάγνωση σε μια εξωτερική κλινική αξιολόγηση και μία εσωτερική μελέτη. Φυσιολογικές τιμές Αναλύθηκε ένα σύνολο 150 τυχαίων φυσιολογικών δειγμάτων. Ο πληθυσμός αποτελείτο από 89 άνδρες και 61 γυναίκες ηλικίας από 17 έως 74 ετών. Μόνο 1 δείγμα (0.6%) βρέθηκε θετικό. Το ένα θετικό δείγμα ήταν αντιδραστικό στις 51 και ήταν επίσης θετικό για αντίσωμα κεντρόμερου μέσω IFA σε κυτταρικό υπόστρωμα HEp-2. Ευαισθησία και Ειδικότητα 397 δείγματα αναλύθηκαν με QUANTA Lite Centromere ELISA και μία άλλη εμπορικά διαθέσιμη δοκιμασία ANA για αντίσωμα κεντρόμερου. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω: Κεντρόμερο μέσω ανοσοφθορισμού + - QUANTA Lite + 158 0 Σχετική Ευαισθησία = 98.7% Centromere - 2 237 Σχετική Ειδικότητα = 100% Κλινικές Ευαισθησία και Ειδίκευση Το κιτ αντισωμάτων κεντρόμερου QUANTA Lite αξιολογήθηκε σε μία εξωτερική κλινική μελέτη και σε μία εσωτερική κλινική μελέτη. Ο ακόλουθος πίνακας συνοψίζει τα ευρήματα και των δύο κλινικών μελετών. Group ασθενών Νο. Νο θετ. (%) Κεντρόμερο * 159 157 (98.7%) Άλλα ANA θετικά * 59 0 Scl-70 θετικά * 29 0 Φυσιολογικοί 150 1** (0.6%) *Όλα αυτά ήταν θετικά στο κυτταρικό υπόστρωμα HEp-2. Ο όγκος των παραπάνω θετικών για κεντρόμερο δειγμάτων αναλύθηκαν στο εργαστήριο του Professor Rene' Louis Humbel, Central Hospital, Luxemburg. **Αυτό το ένα δείγμα βρέθηκε θετικό για κεντρόμερο στο HEp-2. Μελέτη αλληλεπίδρασης Το κιτ κεντρόμερου QUANTA Lite δοκιμάστηκε με 59 δείγματα με υψηλά επίπεδα άλλων αυτοαντισωμάτων, όπως ANA, dsdna, ENA και άλλα. Κανένα δεν βρέθηκε θετικό. Ομοίως, και τα 29 Scl-70 θετικά δείγματα βρέθηκαν αρνητικά. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η ακρίβεια και επαναληψιμότητα της ανάλυσης μετρήθηκε με την εξέταση έξι αντιγράφων από το κάθε αρνητικό, ασθενές θετικό και ισχυρό θετικό δείγμα σε έξι διαφορετικές αναλύσεις. Η μέση τιμή σε μονάδες του ισχυρού θετικού ήταν 128.7, του ασθενούς θετικού ήταν 24.99 και του αρνητικού ήταν 2.46. Η τυπική απόκλιση και ο συντελεστής διακύμανσης για κάθε δείγμα συνοψίζονται παρακάτω. Αρνητικό ισχυρώς θετικό Ασθενώς Θετικό SD CV SD CV SD CV Ολικό 0.26 10.6% 5.24 3.9% 0.87 3.5% Εντός μετρήσεων 0.14 5.7% 4.76 3.6% 0.91 3.6% Μεταξύ μετρήσεων 0.27 11.3% 5.92 4.4% 0.84 3.4% Βιβλιογραφία 1. Moroi Y., et al. Autoantibody to Centromere (kinetochore) in sclerderma sera. Proc Natl Acad Sci USA 77: 1627-1631, 1980. 2. McHugh NJ. Centromere autoantibodies pp 161-167 In Autoantibodies, JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, 1996. 3. Earnshaw WC., et al. Analysis of anticentromere autoantibodies using cloned autoantigen CENP- B. Proc Natl Acad Sci USA 84: 4979-4983, 1987. 4. Rattner JB., et al. CENP-F is a ca. 400 kda kinetochore protein that exhibits a cell cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton 26: 214-226, 1993. 5. Vazquez-Abad D, et al. AntiCentromere autoantibodies: Evaluation of an ELISA using recombinant fusion protein CENP-B as antigen. Arthritis Rheum 37: 248-252, 1994. 6. Whyte J., et al. Frequency of autoantibodies to a major epitope as the carboxyl terminal fragment of CENP-B in patients with autoimmune disease. Brit J Rheumatol 34: 407-412, 1995. 7. Sun D., et al. Detection of anticentromere antibodies using recombinant CENP-A protein. Arthritis Rheumatism 39: 863-867, 1996. 8. Russo K., et al. Circulating anticentromere CENP-A and CENP-B antibodies in patients with diffuse and limited systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, and rheumatoid arthritis. J Rheumatology 27: 142-148, 2000. 5
9. Tan EM., et al. Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis: Anticentromere antibody and its relationship to CREST syndrome. Arthritis Rheumatism 23: 617-625, 1980. 10. McCarty GA., et al. Anticentromere antibody clinical correlations and association with favorable prognosis in patients with scleroderma variants. Arthritis Rheumatism 26: 1-7, 1983. 11. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628770 December 2007 Revision GRC5 6