ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο ERF (Ets-2 Repressor Factor) εiνaι μετaγpaφικός κaταστολέας της οικογέναας των ETS γονιδίων, ο οποίος ρυθμίζεται από το μονοπάπ RaslErk. Το 2 8kb mrna του Erf εκφράζεται ομοιόμορφα σε όλους τους ιστούς και τις κυτταρικές σειρές ποu έχουν μέχρι τώρα ελεγχθεί, εκτός από το πλακούντα. Αλληλεττιδρά in νίtrο και ίn νίvο ειδικά με την Erk κινάση, τόσο με την ενεργό φωσφωρυλιωμένη μορφή της όσο και με την ανενεργή. Αυτή η αλληλεπίδραση διαμεσολαβείται από δύο ξεχωρ~στάfxf μοτίβα στο κεντρικό τμήμα της Erf πρωτεϊνης, χαρασηρισηκά των υποστρωμάτων της Erk. Τα δύο αυτά μοτίβα δείχνουν διαφορετική προτίμηση για την πρόσδεση με την ενεργό ή την ανενεργό Erk κ~νάση,όπως έχει φανεί από ανάλυση σημειακών μεταλλαγών. Η ενεργός Erk, ωστόσο, αλληλεπιδρά με τον Erf με 5 ττερίπου φορές ισχυρότερη συγγένεια πρόσδεσης σε σχέση με την ανενεργό μορφή της Η Εrk-δ1αμεσολαβούμενηφωσφωpυλίωση του Erf tχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του υποκυπαρικού εντοπισμού ιου.. Έτσι, η φωσφωρυλιωμένη μορφή του Erf (κάτω από συνθήκες που η Erk είναι ενεργή) βρiσκεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ όταν το Ras!Erk μονοπάτι αναστέλλεται, τότε ο Ειf συσσωρεύεται γρήγορα στον πυρήνα, αποφωσφωρυλιώνεται και ασκεί τη δράση του ως μεταγραφικός παράγοντας. Μεταλλαγμένη μορφή του Erf, στην οποία και οι εφτά θέσεις φωσφωρυλίωοης έχουν μεταλλαχθει σε αλανίνη (Erf Μ1-7), καθιστά την πρωτε:ίνημονίμως πυρηνική. Αντiστοιχο φαινότυπο δείχνει και η μεταλλαγμένη μορφή του Erf που εiνσι ελαττωματική για την πρόσδεση στην Erk κινάση, αποδεικνύοντας ότι ο Erf είναι ειδικό υπόστρωμα της Erk. Υπερέκφραοη της Erf Μ1-7 πρωτεϊνης σε ινοβλάστες οδηγεί τα κύτταρα σε αναστολή του κυτταρικού τους κύκλου στη φάση G1. ενώ η αγρίου τίmοu πρωτεϊνη δεν έχει επiδραση. Η δράση αυτή εξαρτάται άμεσα από την παρουσία της πρωτεϊνης του Ρεηνοβλασιόραιος, αφού κύτταρα με έλλειψή της δεν αναστέλλοντα.ι από την Erf Μ1-7, ενώ η uπερέκφραση ιων κuκλινών D1 και Ε αναιρεί τη ανασταλτική δραστηριότητα του Εή. Επιπλέον, η Erf Μ1-7 πρωτεϊνη, όπως και η ελαττωματική, ως προς τη δέσμευση με την Erk. πρωτεϊνη του Erf αντιστρέφει το Ras-επαγώμενο μετασχηματισμό των
ΠE."JJiλ11t111. ινοβλaστών. παρέχοντος ενδείξεις ότι ο Erf μπορεi να έχει ογκοκaτσσταλτική λειτουργία, πέρα από το φυσιολογ1κόκοτοσιαυκό τοu ρόλο. Η δημιουργία στο εργαστήριο ποντικών με έλλειψη του Erf παρείχε περαιτέρω στοιχεία για την ίn νίνο δραστηριότητά του. Τα Erf-1- ποντίκια δεν είναι βιώσιμα πtρα από το στάδιο 10-10.Sdpc της εμβρuικής ζωής, εξαιτίας σοβαρών προβλημάτων στην ανάπτυξη του πλακούντα. Συγκεκριμένα, στους πλακούνtες των Erf-1- εμβρύων παρατηρείτσι μίcι συμπαγής χορισκη στοιβάδα, αγενεσία του λαβυρίνθου, μία εκτεταμένη στοιβάδα γιγαντιαίων κυττάρων και μία μικρότερη σπογγώδης στοιβάδα. Επiσης, παρατηρείται απουσfα των μεταμιτωτικών κυττάρων του χορίου και των σuγκυτιοκuττάρων που αποτελούν τα τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα του λαβυρίνθου. Αντίθετα, υπάρχει αυξημένη έκφραση γονιδίων-δεικτών των αρχέγονων τροφοβλαστικών κυττάρων που παραμένουν αδιαφοροποίητα. Επομένως, ο Erf φαiνεται ότι συμμετέχει στη διαφοροποίηση των ιροφοβλσσιικών κυττάρων και την ανάπτυξη συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων που οδηγούν στην πλακουντογένεση. Ενώ η ρύθμιση και ο φυσιολοναός ρόλος του Erf έχουν αρχίσει να αποκαλύπτονται, ελλιπής είναι η γνώση σχετικά με τα γονίδια-στόχους τοv και το μοριακό μηχανισμό δράσης του. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήθηκε προσπά.θεια ταυτοποίησης των γονιδίων που ρυθμίζει άμεσα ο Erf και ανίχνευσης του μηχανισμού μεταγραφικής καταστολής. Δημιουργήθηκαν πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες από εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικών αγρίου τύπου ή με έλλειψη του Erf και αναπτύχθηκαν είτε σε πλήρες θρεπτικό υλικό (ανενεργός Erf), είτε σε απουσία ορού για τέσσερεις ώρες (ενεργός Erf). Στη συνέχεια έγινε σίιγφση των μεταγραφικών προτύπων τους με υβριδοποίηση μικροσuστοιχειών cdna Η ανάλυση των αποτελεσμάτων απόκάλυψε 14 συνολικά γονίδια των οποίων η έκφραση αυξάνεται ελλείψει του Εή, σε συνθήκες που αυτός βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων και είναι ενεργός (δηλαδή απουσία ορού}. Δύο από αυτά, το c-myc και το Olig1, διερευνήθηκαν περαιτέρω αν αποτελούν άμεσους στόχους του Εή. Το c-myc επιλέχθηκε διότι είναι συμβατό με τη μέχρι στιγμής γνωστή λειτουργία και τη ρύθμιση του Erf και το O/ig1 επειδή έδειξε την υψηλότερη ενεργοποίηση απουσfα του Erf (περίπου 5,5 φορές). 2
Πεοίλιιtιιr, Αφού επιβεβαιώθηκε, με ημιποσοηκή αντίδραση PCR πραγμαηκού χρόνου (RT -qpcr). ότι τα επίπεδα τοο mrna του c-myc αυξάνονται απουσία του Erf, δείχθηκε με ανοσοκατακρήμνιση χρωματiνη.ς και qpcr ότι ο ενδογενής Erf προσδένεται στον υποκινητή του c-myc σε συνθήκες έλλειψης ορού. Επιπρόσθετα σύγκριση αγρίου τύπου με Erf-1- εμβρύων και πλακούντων έδειξε υσερεκφραοη τοu c-myc ελλείψει του Erf. Επιπλέον, με δοκψασiα λουσιφερσοης φάνηκε ότι ο Erf αγρίου τύπου καταστέλλει την, καθοδηγούμενη από το c-myc υποκινητή, μεταγραφή σε συνθήκες έλλειψης ορού. Η δράση αuτή εξαρτάται σπό την κατασταληκή περιοχή του Erf ιςοι την πφοχή πρόσδεσης στο DNA, συνιστώντας μία άμεση και ενεργή δράση του Erf στη μεταγραφική καταστολή του c-myc. Επαγώμενη υηερέκφραοη του αγρίου τύποu Erf ή του Erf Μ1-7 σε ινοβλάστες προκαλεί τη μείωση του c-myc mrna σε συνθήκες έλλειψης ορού ή και σε κανονικές συνθήκες αύξησης, αντίστοιχα. Υηερέκφραση του Erf Μ1-7 αλλά όχι και του Ειf wt στα Rasμετασχηματισμένα κύτταρα οδηγεί σε μείωση του c-myc mrna, παρέχοντας μία ένδειξη ότι το c Myc βρίσκεται καθοδικά του Erf. Επιπλέον, χρηαιμοποιώντας σταθερά διομολυσμένα MCF7 κύτταρο, των οποίων ο μετασχηματισμός εξαρτάται από το c-myc, δείχθηκε ότι ο Erf Μ1-7 ελαττώνει Τοc-Myc mrna και αντιστρέφει το μετασχηματισμένο φαινότυπο σε συνθήκες μειωμένου ορού. Τέλος, για να διαλευκανθεί γιατί ο Erf δεν αναστέλλει τον κυηαραό κύκλο απουσία του Rb, ελέγχθηκαν τα επiπεδα του c-myc mrna και η πρόσδεση του Erf στον υποκινητή του. Έτσι φάνηκε ότι απουσία ορού τα επί1τεδaιοα c-myc mrna δεν μειώνονtαι στα Rb-1- κϋτιαρα (αν κrn είναι ήδη πολύ χαμηλά σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα), ενώ συγχρόνως ο Erf δεν μπορεί να αλληλεπιδράση με τον υποκινητή του c-myc ανεξάρτητα από ης συνθήκες ανάπτυξης. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι σε ινοβλάστες με έλλειψη του c-myc, η Erf Μ1-7 πρωτεϊνη δεν μπορεί να αναστείλει τον κυτταρικό κύκλο, παρέχουν ισχυρές ενδεiξεις ότι ο υποκινητής του c-myc γονιδίου αποτελεί άμεσο στόχο του Ειi μεταγραφικού κσιαατολέα και εξηγούν το μηχαν1σμότης φυσιολογικής δράσης του Erf. Παράλληλα, ετnβεβαιώθηκε όη και ΤΟOlig1 mrna αυξάνεται απουσία του Εή σε συνθήκες έλλειψης ορού. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης έδειξαν όη ο Erf αλληλεπιδρά in νίνο με τον υποκινητή του Olig1, απουσία ορού. Εν συνεχεία κλωνοπ01ήθηκε η 5' πεp1οχή του γονιδίου και 3
δείχθηκε με δοκιμασίες λουσιφερσοης, αφενός όtι τταρουmόζει μεταγραφική ενεργότητα και σφετσίρου ότι ο Erf καταστέλλει αυτή την ενεργότητα με ένα ΤSΑ-.εξαρτώμενο τρόπο. Τα παραπάνω αποτελούν ενδείξεις ότι ο Erf ρυθμίζει άμεσα τον Olig1 υποκινητή, ωστόσο περισσότερη ανάλυση είναι απαραίτητη για να αποδε1χθείαυτή η υπόθεση. Προκειμένου να αντληθούν επιπρόσθετα στοιχεία για τη ρύθμιση της δράσης του Erf, διερευνήθηκε η αλληλεπίδρασή του με τους συγκαταστολείς Hipk1 κm Ring1B. Οι δυο παραπάνω πρωτεϊνες είχαν ανιχνευθεί ως αλληλε:mδρώσες, με τον Erf, πρωτεϊνες σε σάρωση με το σύστημα των δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα. Η αλληλεττlδραση του Erf με την Rίng1Β δεν επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα θηλαστικών. Αντίθετα, ο Erf wt, αλλά και ο Erf Μ1-7, αλληλεπιδρούν με την κινάση-συγκαταστολέα Hipk1, καθώς και με ένα κυρίαρχα αρνηυκό της μετάλλαγμα (Hiρk1KR, ελαττωμαηκό γιο την ενεργότητα κινάσης), Χαρτογράφηση της περιοχής αλληλεπίδρασης έδειξε ότι το αμινοτελικό τμήμα του Erf και συγκεκριμένα ΤΟ τμήμα 1ΟΟ-202αα είναι uπεύθuνο για την πρόσδεση στην Hipk1. Επιπλέον, η Hipk1 και η Ηίρk2 φωσφωρυλιώνοuν το αμινοτελικό σκρο του Erf in νitro, όχι όρως και την κεντρική και καρβοξυτελική του περιοχή, σε συνέπεια με τα δεδομένα από τα πειράματα αλληλεπίδρασης. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό ποια κατάλοtπα φωσφωρυλιώνονται Σε δοκιμασiες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας είτε ετερόλογους GΑL4-καθοδηγούμενους SV40 υποκινητές αναφοράς, είτε το ο Myc uποκ1νητή φάνηκε ότι η Hipk1 και η Hipk2 αναιρούν την κατασταλτική δράση τοu Erf. Πρέπει να τονιστεί ότι οι Ηίρk1KR και Hiρk2KR πρωτεϊνες δεν έχει καμία επiδραση στην Ειf-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική καταστολή. Πειράματα υπ01<1uτταρικούεντοπισμού της GFP-ERF σuντηγμένης πpωτεfνης παρουσία των Ηίρk1/2, έδειξαν ότι ο Erf μετατοπίζεται μερικώς στο κuττορόπλασμα, εξηγώντας έτσι την αρνηιική επiδραση της στη δράση του Erf, ενώ παρουσία των Hipk1/2KR ο υπ01<uτταρικόςεντοπισμός του Erf δεν επηρεάζεται Τέλος, μελετήθηκε η ειδικότητα της αλληλεπίδραση Erf-Erk in vίvo Τμήματα της κεντρική περιοχής του Erf υπερέκφρόστηκαν και η σηματοδότηση του Ras/Erk μονοπατιού εξετάστηκε με βάση την υποκυτταρική κατανομή της GFP-ERF υβριδικής πρωτεϊνης. Έτσι ΤΟ τμήμα 294-425 αναστέλλει αποτελεσμαηκά το Ras/Erk σηματοδοτικό μονοπάτι, 4
π~ χωρίς να επηρεάζει την ενεργότητα της Erk κινάσης. Η αλλαγή στην υποκυτταρική κατανομή του Er:fοφείλεται στη μειωμένη φωσφωρυλiωσή του, όπως φαίνεται από ανοσοφθορισμό με ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τη φωσφωρυλιωμένη του μορφή. Επιπλtον, ο Elk-1 μεταγραφικός παράγοντας καθώς και η κινάση Rsk2 (που αποτελούν υποστρώματα της Erk κινάσης) απενεργοποιούνται παροuσία του τμήματος 294-425 του Erf. Τα παραπάνω υποστηρiζουν την άποιιη όπ ο Erf αποτελεί ειδικό υπόστρωμα της Erk κινάσης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδικός αναστολέας του μονοπατιού Ras/Erk. 5