QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA 708715 Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: υψηλή

QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA 708715 Για In Vitro διαγνωστική χρήση Πολυπλοκότητα κατά CLIA: υψηλή Σκοπός χρήσης Το κιτ QUANTA Lite TM H. pylori IgG αποτελεί μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική ανάλυση (ELISA) για την ποιοτική ανίχνευση των αντισωμάτων σε H. pylori (Helicobacter pylori) στον ορό ανθρώπων. Αυτή η δοκιμασία προορίζεται για την υποβοήθηση της διάγνωσης των μολύνσεων H. pylori με κλινικά ευρήματα και συμπτώματα γαστρεντερικής νόσου. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Η αιτιολογική σχέση μεταξύ της λοίμωξης H. pylori και του πεπτικού έλκους έχει καταδειχθεί ικανοποιητικά αφότου προτάθηκε για πρώτη φορά το 1983. 1 Η λοίμωξη H. pylori εμφανίζεται σε ποσοστό μεγαλύτερο από το 95% των ασθενών με δωδεκαδακτυλικό έλκος, 80% των ασθενών με γαστρικό έλκος και σχετίζεται με με το γαστρικό καρκίνωμα και το λέμφωμα. 2-5 Η εξάλειψη της λοίμωξης H. pylori μειώνει την επανεμφάνιση έλκους. 2-5 Η θεραπεία της λοίμωξης H. pylori συνιστάται σε ασθενείς με δωδεκαδακτυλικό ή γαστρικό έλκος και πρόσφατα για τη λειτουργική δυσπεψία. 5,6 Η διάγνωση της λοίμωξης H. pylori περιλαμβάνει τόσο επεμβατικές όσο και μη επεμβατικές μεθόδους. Οι επεμβατικές δοκιμασίες περιλαμβάνουν ενδοσκόπηση για απευθείας παρατήρηση του γαστρικού βλεννογόνου και για λήψη βιοψίας για δοκιμασία ουρεάσης, ιστολογική χρώση (Warthin-Starry) και καλλιέργεια. 5,7 Η καλλιέργεια θεωρείται ο "χρυσός κανόνας", ωστόσο, είναι τουλάχιστον ευαίσθητη εξέταση (70-80% ευαισθησία). Η ιστολογική δοκιμασία και η δοκιμασία ουρεάσης έχουν ευαισθησίες και εξειδικεύσεις σε ποσοστό ανώτερο του 90%. 5 Τα κύρια μειονεκτήματα των επεμβατικών μεθόδων είναι ο κίνδυνος και η ταλαιπωρία των ασθενών, το υψηλό κόστος, και τα ψευδή αρνητικά αποτελέσματα λόγω της αποσπασματικής κατανομής του H. pylori στο στομάχι. Οι μη επεμβατικές δοκιμασίες περιλαμβάνουν δοκιμασία αναπνοής με χρήση ουρίας 14 C ή 13 C-labeled και οροδιαγνωστικών δοκιμασιών. Η εξέταση αναπνοής είναι ευαίσθητη και εξειδικευμένη, αλλά είναι ακριβή. Οι οροδιαγνωστικοί έλεγχοι παρέχουν μια χαμηλού κόστους και εξειδικευμένη εναλλακτική λύση έναντι των επεμβατικών και/ή ακριβών διαδικασιών όπως η ενδοσκόπηση και η δοκιμασία ουρίας 14 C αναπνοής. 2,3,5,8,9 Το κιτ QUANTA Lite TM H. pylori IgG είναι μέρος της οικογένειας QUANTA Lite TM των κιτ ELISA. Οι μέθοδοι ELISA για ανίχνευση του αντισώματος H. pylori έχουν καταδειχθεί ως ευαίσθητοι και εξειδικευμένοι. Αρχή μεθόδου Ένα κεκαθαρμένο αντιγόνο H. pylori δεσμεύεται στα πηγαδάκια μιας μικροπλάκας πολυστυρενίου, υπό συνθήκες οι οποίες διατηρούν το αντιγόνο στην αμιγή του κατάσταση. Προαραιωμένοι πρότυποι οροί ελέγχου (controls) και αραιωμένα δείγματα ασθενών προσθέτονται στα πηγαδάκια επιτρέποντας στα H. pylori IgG αντισώματα να συνδεθούν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο. Μη αντιδρώντα αντισώματα ξεπλένονται και προσθέτεται αντι ανθρώπινο IgG αντίσωμα συνδεδεμένο με ένζυμο σε κάθε πηγαδάκι. Η δεύτερη επώαση επιτρέπει την σύνδεση του αντι ανθρώπινου IgG αντισώματος με τα σχηματισμένα συμπλέγματα αντισώματος ακινητοποιημένου αντιγόνου. Μετά την απομάκρυνση τυχόν μη αντιδρώντων αντισωμάτων αντι-ανθρώπινου IgG, η υπόλοιπη δραστηριότητα ενζύμων μετριέται με προσθήκη υποστρώματος χρωμογόνου και μέτρηση της χρωματικής αλλαγής που πραγματοποιείται. Η ανάλυση μπορεί να αξιολογηθεί φασματοφωτομετρικά με τη σύγκριση του χρώματος που αναπτύσσεται στα πηγαδάκια του ασθενή με το χρώμα στα πηγαδάκια ελέγχου. Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με αντιγόνο H. pylori, (12-1 x 8 κοιλότητες), με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. Αρνητικός ορός ελέγχου ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς IgG ανθρώπινα αντισώματα σε H. pylori, προαραιωμένο 1,2mL 3. H. pylori IgG ELISA χαμηλό θετικό, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG ανθρώπινου ορού σε H. pylori, προαραιωμένο, 1,2mL 4. H. pylori IgG ELISA υψηλό θετικό, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα IgG ανθρώπινου ορού σε H. pylori, προαραιωμένο, 1,2mL 5. HRP Αραιωτικό δείγματος, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 6. HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στην ενότητα των Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Conjugate IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 8. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 9. Διάλυμα διακοπής HRP, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προσοχή 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 1

2. Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην προετοιμασία των πρότυπων ορών για αυτό το προϊόν έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικά για αντισώματα HIV, HBsAg και HCV από εγκεκριμένες μεθόδους FDA. Καμία μέθοδος πάντως δεν είναι σε θέση να αποκλείσει την παντελή απουσία μολυσματικών παραγόντων όπως και για HIV, HBV, HCV. Για αυτό το λόγο, οι οροί ελέγχου H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού, H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού και ο ορός αρνητικού ελέγχου ELISA θα πρέπει να μεταχειρίζονται με τον ίδιο τρόπο όπως ένα πιθανώς μολυσματικό προϊόν. 10 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και μπορεί να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Αν για την απόρριψη του αντιδραστηρίου χρησιμοποιούνται λεκάνες απόπλυσης, η συγκέντρωση των αζιδίων μπορεί να αποφευχθεί ξεπλένοντας με άφθονο νερό. 4. Το HRP σύζευγμα περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για να αποφύγετε πιθανά εγκαύματα, αποφεύγετε επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν την εισπνεύσετε εάν καταποθεί ή εάν απορροφηθεί από το δέρμα. Για να αποφύγετε κάποιο τραυματισμό, αποφεύγετε την εισπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Διάλυμα διακοπής HRP περιέχει θειικό οξύ. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή άλλα συστατικά που μπορεί να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για να αποφύγετε χημικά εγκαύματα αποφύγετε την επαφή του με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Ειδικά μέτρα 1. Αυτό το προϊόν είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Ανεπαρκές πλύσιμο της μικροπλάκας ή αναποτελεσματική αφαίρεση των διαλυμάτων από τα πηγαδάκια ELISA μπορεί να προκαλέσει μειωμένη ακρίβεια και έντονο παρασκήνιο. 4. Η λειτουργία αυτής της μεθόδου σε αυτόματο αναλυτή και άλλες συσκευές διανομής, μπορεί να δώσει διαφορετικά αποτελέσματα από αυτά που λαμβάνονται στη χειρωνακτική διαδικασία. Αποτελεί ευθύνη του κάθε εργαστηρίου να αξιολογεί ότι η αυτόματη διαδικασία δίνει αποτελέσματα δοκιμασίας εντός των αποδεκτών ορίων. 5. Η απόδοση της ανάλυσης επηρεάζεται από μια ποικιλία παραγόντων. Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, η θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, η ακρίβεια και επαναληψιμότητα του πιπεταρίσματος, η πλύση και η αφαίρεση των διαλυμάτων από τα πηγαδάκια ELISA, η ποιότητα του φωτόμετρου, οι χρόνοι επώασης. Η προσοχή στη συνάφεια είναι σημαντική για την ακρίβεια και επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. 6. Συνιστάται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Ανεπαρκές κλείσιμο της συσκευασία που περιέχει ταινίες μικροκοιλοτήτων και αφυγραντικά μπορεί να προκαλέσει αποδομή του συνδεδεμένου αντιγόνου και αποτελέσματα χαμηλής ακρίβειας. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν από δύο ή περισσότερες χρήσεις της σφαιρίνης από το ίδιο φιαλίδιο. Είναι σημαντικό να τηρούνται όλες οι συνιστώμενες διαδικασίες χειρισμού συζεύγματος HRP. 9. Χημική λοίμωξη του συζεύγματος HRP μπορεί να προέλθει από ανεπαρκή καθαρισμό ή ανεπαρκές ξέπλυμα του εξοπλισμού ή των οργάνων. Κατάλοιπα από εργαστηριακά χημικά όπως φορμαλίνη, χλωρίνη, αιθανόλη, η απορρυπαντικά θα προκαλέσουν υποβιβασμό της σφαιρίνης με το χρόνο. Συνιστάται ο καθαρισμός των οργάνων και συσκευών μετά τη χρήση χημικών καθαριστικών. Αποθήκευση 1. Αποθηκεύστε τα αντιδραστήρια στους 2-8 C. Μην τα καταψύχετε. Είναι σταθερά για χρήση μέχρι τη λήξη τους εάν αποθηκεύονται σύμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι μη χρησιμοποιημένες σειρές επικαλυμμένων με αντιγόνο πηγαδιών πρέπει να ασφαλίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους,η οποία περιέχει απορροφητικό υγρασίας, και να φυλάσσονται στους 2-8 C. 3. Το αραιωμένο διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 C. Δείγματα Η διαδικασία μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με δείγματα ορού. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα της δοκιμασίας μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσματα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα που έχουν επιμολυνθεί με μικρόβια, έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία ή περιέχουν ορατά σωματίδια. Αιμολυθέντα ή λιπαιμικά δείγματα ή ορός πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται άμεσα από το ολικό αίμα. Το NCCLS Document Η18-Α2 συνιστά τις ακόλουθες συνθήκες φύλαξης για τα δείγματα: 1) Φυλάξτε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. 2) Εάν η διαδικασία δεν ολοκληρωθεί μέσα σε 8 ώρες, καταψύξτε το δείγμα στους 2-8 C. 3) Εάν η διαδικασία δεν ολοκληρωθεί μέσα σε 48 ώρες ή απαιτείται η αποστολή του δείγματος, καταψύξτε στους 20 C ή χαμηλότερα. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. 2

Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 H. pylori IgG ELISA μικροπλάκα (12-1x8 πηγαδάκια), με βάση 1 1,2mL προαραιωμένος αρνητικός ορός ελέγχου ELISA 1 1,2mL προαραιωμένος H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού 1 1,2mL προαραιωμένος H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού 1 50mL HRP Αραιωτικό δείγματος 1 25mL HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπυκνωμάτων 1 10mL HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG 1 10mL TMB Χρωμογόνο 1 10mL HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ Πρόσθετος εξοπλισμός που απαιτείται και δεν συμπεριλαμβάνεται Μικροπιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 5, 100, 200 300 και 500 μl Ρύγχη μικροπιπετών Σωληνάρια για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό 1L δοχείο για το διάλυμα HRP Wash Concentrate (Συμπύκνωμα πλύσης) Φωτόμετρο μέτρησης της μικροπλάκας με δυνατότητα φίλτρου στα 450nm (και 620nm για μετρήσεις διπλής κυματομορφής) Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (20-26 o C) και να έχουν αναδευτεί καλά. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου σε 975mL αποσταγμένου νερού. Σε περίπτωση που δεν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη τη μικροπλάκα μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μικρότερη ποσότητα ετοιμάζοντας 2,0mL συμπυκνώματος και 78mL αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα είναι σταθερό για μία εβδομάδα στους 2-8 o C. 3. Ετοιμάστε τις αραιώσεις 1:101 των δειγμάτων υπό εξέταση προσθέτοντας 5µL ορού σε 500µL HRP αραιωτικό δείγματος. Τα αραιωμένα δείγματα πρέπει να χρησιμοποιούνται εντός 8 ωρών από τη στιγμή της προετοιμασίας τους. ΜΗΝ ΑΡΑΙΩΝΕΤΕ τους ορούς H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού, H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού και ELISA αρνητικού ελέγχου. 4. Για την αποτελεσματικότερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων του H. pylori IgG με χρήση αυθαίρετων μονάδων απαιτούνται δύο πηγαδάκια των τριών διαλυμάτων ελέγχου και ένα ή δύο πηγαδάκια για κάθε δείγμα ασθενή. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία 1. ΟΛΑ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΣΕ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΩΜΑΤΙΟΥ (20 26 C) ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ. Τοποθετήστε τον απαιτούμενο αριθμό μικροκοιλοτήτων/ταινιών στη θήκη. Επιστρέψτε αμέσως τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στο σάκο που περιέχει τα αφυγραντικά μέσα και σφραγίστε καλά για να ελαχιστοποιήσετε την έκθεση σε υδρατμούς. 2. Προσθέστε 100µL αραιωμένους ορούς H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού, H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού και ELISA αρνητικού ελέγχου και των αραιωμένων δειγμάτων ασθενών στα πηγαδάκια. Καλύψτε τα πηγαδάκια και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε οριζόντια επιφάνεια. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με την προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την μικροπλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100μL HRP IgG συζεύγματος σε όλα τα πηγαδάκια. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100µL TMB χρωμογόνου σε κάθε πηγαδάκι. Επωάστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος σε θερμοκρασία δωματίου. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε πηγαδάκι. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την μικροπλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς τα πηγαδάκια. 8. Η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας σε κάθε πηγαδάκι στα 450nm θα πρέπει να γίνει εντός μίας ώρας από το τέλος της διαδικασίας. Αν επιθυμείτε βιοχρωματικές μετρήσεις, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε κυματομορφή αναφοράς 620nm. 3

Ποιοτικός έλεγχος 1. Οι οροί H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού, H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού και ο ορός ELISA αρνητικού ελέγχου θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε παρτίδα δειγμάτων έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ότι τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες λειτουργούν σωστά. 2. Σημειώστε ότι εφόσον οι οροί H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού, H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού και ορός ELISA αρνητικού ελέγχου είναι προ-αραιωμένοι, δεν ελέγχουν τις διαδικαστικές μεθόδους που σχετίζονται με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Μπορεί να απαιτείται η ανάλυση πρόσθετων ορών ελέγχου, σύμφωνα με τις οδηγίες ή τις απαιτήσεις των τοπικών ή/και εθνικών διατάξεων ή των οργανισμών διαπίστευσης. Πρόσθετοι κατάλληλοι οροί ελέγχου μπορούν να ανασυσταθούν διαιρώντας σε υποπολλαπλάσια δείγμα ανθρώπινου ορού πολλαπλών δοτών και αποθηκεύοντας σε θερμοκρασία < -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της δοκιμασίας, πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα κριτήρια που παρατίθενται παρακάτω. Εάν κάποιο από αυτά τα κριτήρια δεν ικανοποιείται, η δοκιμασία πρέπει να θεωρηθεί άκυρη και η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. α. Η απορρόφηση του προαραιωμένου H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προαραιωμένου H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού η οποία θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προαραιωμένου ELISA αρνητικού ελέγχου. β. Η απορρόφηση του H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 1,0 ενώ η απορρόφηση του ELISA αρνητικού ελέγχου δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 0,2. γ. Η απορρόφηση του H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού θα πρέπει είναι μεγαλύτερη από το διπλάσιο της απορρόφησης του ELISA αρνητικού ελέγχου ή μεγαλύτερη από 0,25. δ. Ο ELISA αρνητικού ελέγχου και ο και ο H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού έχουν σκοπό να ελέγχουν για ουσιαστική αποτυχία αντιδραστηρίου. Ο H. pylori IgG ELISA υψηλού θετικού δεν θα επιβεβαιώσει την ακρίβεια στην αποκοπή της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης μπορεί να ανατρέξει στο έγγραφο C24-A του NCCLS για περισσότερα στοιχεία του ποιοτικού ελέγχου. Υπολογισμός αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος απορροφητικότητας (O.A.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντίδραση για κάθε δείγμα μπορεί μετά να υπολογισθεί διαιρώντας το μέσο όρο απορροφητικότητας του δείγματος με το μέσο όρο απορροφητικότητας του H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού. Το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται με το πλήθος των μονάδων που αντιστοιχεί στο H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού που φαίνεται στην ετικέτα. Ο.A. δείγματος Τιμή δείγματος = -------------------- Χ H. pylori IgG ELISA χαμηλού θετικού (μονάδες) H. pylori IgG ELISA O.A. Χαμηλού θετικού (μονάδες) Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του παρόντος αντισώματος με ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίσουν μια ανταποκρινόμενη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα αναφερθεί ως ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθιερώσει το δικό του εύρος φυσιολογικών τιμών με βάση τις δικές του τεχνικές, ορούς ελέγχου, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις εσωτερικές καθιερωμένες διαδικασίες του εργαστηρίου. Τα δείγματα ερμηνεύονται ως αρνητικά (αρνητικά για το αντίσωμα IgG έναντι H. pylori), αμφίβολα ή θετικά (εντοπίζεται αντίσωμα IgG έναντι H. pylori) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Μονάδες Αρνητικό <20 Αμφίβολο 20,1 24,9 Θετικό >25 Τα αμφίβολα δείγματα πρέπει να αναλύονται ξανά πριν την αναφορά των αποτελεσμάτων. 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει μόνο προηγούμενη ανοσολογική έκθεση σε H. pylori. Δεν μπορεί να διακρίνει ανάμεσα σε ενεργή και ανενεργή λοίμωξη H. pylori. Η ενεργή λοίμωξη αξιολογείται με καλλιέργεια υλικού βιοψίας, με δοκιμασία ουρίας αναπνοής 13 C ή με άλλες μεθόδους ανίχνευσης ουρεάσης. 2. Ένα δείγμα με αμφίβολες συγκεντρώσεις IgG έναντι H. pylori δεν μπορεί να αξιολογηθεί για την κατάσταση των αντισωμάτων. Αν τα αποτελέσματα παραμένουν αμφίβολα μετά την επαναληπτική δοκιμασία, το αποτέλεσμα πρέπει να αναφερθεί ως αμφίβολο και/ή πρέπει να ληφθεί πρόσθετο δείγμα. 4

3. Το αρνητικό δείγμα δηλώνει ότι δεν υπάρχει αντίσωμα έναντι H. pylori ή ότι υπάρχουν συγκεντρώσεις κάτω από το όριο εντοπισμού της ανάλυσης. Δείγματα που λήφθηκαν πολύ νωρίς κατά την πρωτοπαθή λοίμωξη μπορεί να μην έχουν ανιχνεύσιμα επίπεδα αντισωμάτων IgG. Εάν υποπτεύεστε πρωτοπαθή λοίμωξη, θα πρέπει να ληφθεί ένα άλλο δείγμα σε 4-6 εβδομάδες και να εξεταστεί ταυτόχρονα στην ίδια ανάλυση με το αρχικό δείγμα. 4. Συνιστάται τα αποτελέσματα που δίνονται από το εργαστήριο να περιλαμβάνουν τη δήλωση: «Τα παρακάτω αποτελέσματα αποκτήθηκαν με τη μέθοδο INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Οι τιμές H. pylori IgG που προσδιορίζονται με μεθόδους ανάλυσης διαφορετικών κατασκευαστών δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά. Το μέγεθος των αναφερόμενων επιπέδων IgG δεν μπορεί να συσχετιστεί με ένα τίτλο τελικού σημείου. Όρια της διαδικασίας 1. Αυτή η δοκιμασία προορίζεται για την υποβοήθηση της διάγνωσης H. pylori. 2. Αυτή η δοκιμασία πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο για άτομα με συμπτώματα που υποδεικνύουν γαστρεντερική νόσο και δεν προορίζεται για χρήση από ασθενείς χωρίς συμπτώματα. 3. Η εύρεση αρνητικού αποτελέσματος για αντισώματα δεν αποκλείει την παρουσία H. pylori, καθώς η συγκέντρωση αντισωμάτων μπορεί να είναι χαμηλότερη από το ανιχνεύσιμο όριο της ανάλυσης. 4. Αρνητικά αποτελέσματα μπορεί να προκύψουν εάν τα δείγματα ληφθούν πολύ νωρίς κατά τη λοίμωξη, πριν από την εμφάνιση των ανιχνεύσιμων αντισωμάτων. Εάν υποπτεύεστε λοίμωξη H. pylori, θα πρέπει να ληφθούν νέα δείγματα σε 4-6 εβδομάδες και να εξεταστούν παράλληλα με το αρχικό δείγμα. 5. Ένα θετικό αποτέλεσμα δεν επιτρέπει διάκριση ανάμεσα σε ενεργή λοίμωξη και αποικισμό από H. pylori. 6. Το θετικό αποτέλεσμα της εξέτασης δηλώνει μόνο την παρουσία αντισωμάτων έναντι H. pylori και όχι απαραίτητα την παρουσία γαστρεντερικής νόσου. 7. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τα κλινικά ευρήματα και άλλες οροδιαγνωστικές δοκιμασίες. 8. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης αυτής της ανάλυσης δεν έχουν τεκμηριωθεί για μήτρες διαφορετικές από ορό. Αναμενόμενες τιμές Εκτιμάται ότι περίπου 50% του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί με H. pylori. Στις αναπτυσσόμενες χώρες 50% ή μεγαλύτερο ποσοστό μολύνεται έως την ηλικία των 10, ενώ στις αναπτυγμένες χώρες η λοίμωξη κατά την παιδική ηλικία είναι ασυνήθιστη. Η οροθετικότητα αυξάνει κατά περίπου 0,5 1,0% το χρόνο με την αύξηση της ηλικίας (δηλ. περίπου 60% οροθετικότητα για την ηλικιακή ομάδα των 60 ετών). 3,7,12,13 Εύρος φυσιολογικών τιμών Δύο ομάδες ασυμπτωματικών, υγιών ατόμων (ηλικίας 18-75), ένα από το San Diego, CA και ένα από το Buffalo, NY εξετάστηκαν με το QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Τα αποτελέσματα ήταν 1,8% (1/53) των ορών από το San Diego και 11,3%(11/97) των ορών από το Buffalo ήταν θετικά σε αντισώματα H. pylori IgG. Τα δεδομένα έδειξαν μια αύξηση της οροθετικότητας με την αύξηση της ηλικίας, όπως αναμενόταν από τη βιβλιογραφία. Ευαισθησία και εξειδίκευση Δείγματα μελέτης Η απόδοση του QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA ελέγχθηκε σε ένα σύνολο 295 κλινικά επιβεβαιωμένων αναδρομικών δειγμάτων από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε ενδοσκόπηση. Η παρουσία της λοίμωξης H. pylori αξιολογήθηκε με εξετάσεις καλλιέργειας, ιστολογικές και CLO. Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά έναντι H. pylori εάν η καλλιέργεια ήταν θετική ή εάν 2 ή 3 αναλύσεις βρέθηκαν να είναι θετικές. Πίνακας 1: Ευαισθησία και εξειδίκευση στην κλινική ομάδα αρ= 295 INOVA H.pylori IgG ΘΕΤ ΑΜΦΙΒ ΑΡΝΗΤ Κλινικά ΘΕΤ* αρ= 155 141 5 9 ΑΡΝΗΤ 11 3 126 αρ= 140 *Τα δείγματα θεωρήθηκαν θετικά εάν ήταν θετικά στην καλλιέργεια ή εάν ήταν CLO και ιστολογικά θετικά. Ευαισθησία: 94,0% (141/150) Εξειδίκευση: 92,0% (126/137) Συμφωνία: 93,0% (267/287) Σημείωση: αμφίβολα αποτελέσματα αποκλείστηκαν από τους υπολογισμούς Παρότι κατά το χρόνο της συλλογής δειγμάτων, οι ασθενείς προσδιορίστηκαν αρνητικοί από εξετάσεις καλλιέργειας, ιστολογικές και CLO, εκτιμάται ότι κάποιοι ασθενείς είχαν προηγούμενη έκθεση σε H. pylori με βάση την ισχυρή αντίδραση IgG που παρατηρήθηκε σε μερικά "αρνητικά" δείγματα. Κατά συνέπεια, 7 από τα 11 αρνητικά δείγματα που βρέθηκαν θετικά από το INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA ελέγχθηκαν ξανά από παρόμοιο κιτ H. pylori IgG εγκεκριμένο για in vitro διαγνωστική χρήση. Το κιτ του εμπορίου εντόπισε 6 δείγματα θετικά και 1 απροσδιόριστο. 5

Αποτελέσματα δοκιμής σε τυφλή κλινική ομάδα σε τρεις τοποθεσίες Τα αποτελέσματα που λήφθηκαν σε μια ομάδα 40 τυφλών κλινικών δειγμάτων που εξετάστηκαν σε 3 τοποθεσίες, συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Η εξειδίκευση ήταν 100% (10/10) και στις τρεις τοποθεσίες. Η ευαισθησία ήταν 96,3% στην τοποθεσία 1, 96,6% στην τοποθεσία 2 και 93,1% στην τοποθεσία 3 Πίνακας 2: Ευαισθησία και εξειδίκευση του QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA που λήφθηκε από 3 τοποθεσίες με τυφλή κλινική ομάδα. Τοποθεσία 1 Τοποθεσία 2 Τοποθεσία 3 Ευαισθησία N=30 96,3% (26/27) 96,6% (28/29) 93,1% (27/29) Εξειδίκευση N=10 100% (10/10) 100% (10/10) 100% (10/10) Συνολική συμφωνία: 97,3% (36/37) 97,4% (38/39) 94,9% (37/39) Σημείωση: Ισότιμα δεν περιλαμβάνονται. Εγκυρότητα οριακής τιμής Η οριακή τιμή για αυτήν την ανάλυση επιβεβαιώθηκε ελέγχοντας την κλινική ομάδα δειγμάτων και χρησιμοποιώντας ανάλυση ROC (Receiver Operating Characteristics) της οριακής τιμής 11. Ανάλυση ROC Η ανάλυση ROC παρέχει μια εκτίμηση της διαγνωστικής ακρίβειας της ανάλυσης INOVA H. pylori IgG σε σύγκριση με την αναφερόμενη κλινική κατάσταση του ασθενούς. Επίσης επιτρέπει επιβεβαίωση του οριακού σημείου της ανάλυσης 11. Η ανάλυση υποστηρίζει τη χρήση των περιοχών ερμηνείας αποτελεσμάτων που έχουμε καθορίσει για αυτό το κιτ. Μελέτη αλληλεπίδρασης Πραγματοποιήθηκε μελέτη προσρόφησης για την εκτίμηση της αλληλεπίδρασης των μικροβιακών αντιγόνων με το INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Συνοπτικά, οροί με διαφορετικά επίπεδα αντισωμάτων έναντι του H. pylori απορροφήθηκαν με ένα από τα αντιγόνα H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus ή E. coli και δείγματα μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων ορών εξετάστηκαν στην ανάλυση H. pylori IgG. Όλα τα οροθετικά σε H. pylori δείγματα παρέμειναν οροθετικά όταν απορροφήθηκαν με άλλα αντιγόνα εκτός του H. pylori. Το μέσο ποσοστό συγκόλλησης ήταν 82,1% χρησιμοποιώντας αντιγόνο H. pylori και 2,9% όταν χρησιμοποιήθηκαν αντιγόνα που παράγονται από άλλους οργανισμούς. Η παρουσία αντι-πυρηνικών αντισωμάτων (5 οροί), ρευματοειδούς παράγοντα (5 οροί) και αντισωμάτων αντι-dna (5 οροί) ελέγχθηκε επίσης και δεν επηρέασε την εξειδίκευση του INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Παρεμβολή Για να προσδιοριστεί εάν η παρουσία υψηλών επιπέδων χολερυθρίνης, χοληστερόλης ή τριγλυκεριδίων επηρεάζουν το QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA, πραγματοποιήθηκαν δύο μελέτες. Στην πρώτη, 20 δείγματα ορού (6 H. pylori θετικά και 14 αρνητικά) εξετάστηκαν με και χωρίς την προσθήκη χολερυθρίνης (40x φυσιολογικά επίπεδα) ή αιμοσφαιρίνης (66x φυσιολογικά). Η δεύτερη μελέτη αποτελούνταν από κορυφαία θετικό H. pylori ορό με ορό που περιείχε υψηλά επίπεδα χολερυθρίνης, χοληστερόλης ή τριγλυκεριδίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι καμία από αυτές τις ουσίες δεν επηρεάζει το QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Ακρίβεια και επαναληψιμότητα Η απόδοση μεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε εξετάζοντας, εις διπλούν, μια τυφλή ομάδα από 14 δείγματα που συμπεριλάμβανε 2 θετικά, 3 χαμηλά, 2 μέτρια και 1 υψηλά θετικό δείγμα και τους αρνητικούς, χαμηλά θετικούς και υψηλά θετικούς ορούς ελέγχου του κιτ δύο φορές καθημερινά (μία φορά το πρωί και μία φορά το απόγευμα) για 3 ημέρες σε καθεμιά από τις τοποθεσίες της δοκιμής. Πίνακας 4: Συνδυασμένη απόδοση μεταξύ των αναλύσεων για τρεις τοποθεσίες Ορός R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 NC LPC HPC SRU 46,7 23,8 30,2 46,5 45,6 25 4,2 24,3 25 86,6 3,5 4,0 25,8 3,4 4,4 25 84,6 SD 2,4 2,3 4,9 2,3 2,5 3,4 2,6 2,9 3,0 8,8 2,7 3,0 2,5 2,8 3,2 0 5 CV% 5 10 16 5 5 13 61 12 12 10 77 76 10 82 73 0 6 Η απόδοση εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε ελέγχοντας 6 δείγματα, συμπεριλαμβανομένων αρνητικού, αμφίβολου, οριακά θετικού, χαμηλού θετικού, μέτρια θετικού και υψηλού θετικού δείγματος 15 φορές. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 5. Πίνακας 5: Απόδοση εντός της ανάλυσης για το QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Ορός 1 Ορός 2 Ορός 3 Ορός 4 Ορός 5 Ορός 6 Μέσος 84,03 99,28 31,98 25,96 21,12 2,98 S.D. 3,09 4,21 1,44 1,52 0,91 0,30 C.V.% 3,6 4,2 4,5 5,9 4,3 10,1 6

Γραμμικότητα Για την αξιολόγηση της γραμμικότητας του QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA, 4 δείγματα αραιώθηκαν σειριακά από 1:50 σε 1:51.200 και αναλύθηκαν στο QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Η ανάλυση έδειξε ότι η μέθοδος είναι γραμμική από περίπου 15-20 μονάδες στην κατώτερη στάθμη 121 μονάδες στην ανώτατη. Οι τιμές R 2 για τους 4 ορούς ήταν 0,99 ή καλύτερες. SRU 140 120 100 80 60 40 20 0 QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Γραμμικότητα 1:50 1:200 1:800 1:3200 Διάλυση Γραμμικός ( 95) Γραμμικός ( 96) Γραμμικός ( 63) Γραμμικός ( 77) y = -18,159x + 138,35 R 2 = 0,9934 y = -10,639x + 86,575 R 2 = 0.9937 y = -13,894x + 119,42 R 2 = 0,9903 y = -15,844x + 120,41 R 2 = 0,9885 Βιβλιογραφία 1. Marshall BJ. 1983. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii: 1273-1275. 2. Walsh JH and Peterson WL. 1995. The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15):984-991. 3. Blaser MJ. 1992. Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: 386-394. 4. The Eurogast Study Group. 1993. An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857):1359-1362. 5. NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. 1994. JAMA 272:65-69. 6. Malfertheiner P, et al. 1997. Current European concept in the mangement of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9:1-2. 7. Hirschl AM, et al. 1993. Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168:763-766. 8. Bourke B, Jones N, and Sherman P. 1996. Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15:1-13. 9. Patel P, et al. 1995. Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet 346:1315-1318. 10. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1995. Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests using receiver operating characteristic (ROC) Plots; approved guideline (NCCLS document GP10-A), Wayne, PA. 12. Megraud F, et al. 1989. Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27:1870-1873. 13. Veldhuyzen SJO, et al.1994. Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169:434-437. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service 888-545-9495 628715GRC November 2009 Revision 4 Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 7