«Μελέτη κυτταρογενετικών ευρημάτων κατά τη διερεύνηση της υπογονιμότητας και των καθ έξιν αποβολών σε ζευγάρια από τη Βόρεια Ελλάδα»

Π.Μ.Σ.Ι. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΚΑΙ ΣΤΙΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Α.Π.Θ Ακαδ. Έτος: 2016-2017 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη κυτταρογενετικών ευρημάτων κατά τη διερεύνηση της υπογονιμότητας και των καθ έξιν αποβολών σε ζευγάρια από τη Βόρεια Ελλάδα» Της Μεταπτυχιακής Φοιτήτριας Ελένης Ξανθοπούλου Α.Ε.Μ.575 Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Στυλιανή Φιδάνη-Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Φιδάνη Στυλιανή, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Λαμπρόπουλος Αλέξανδρος, Διευθυντής Καθηγητής Γιαννόπουλος Ανδρέας, Διευθυντής Αναπληρωτής Καθηγητής ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2017 ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2017

RESEARCH METHODOLOGY IN MEDICINE AND HEALTH SCIENCES MEDICAL SCHOOL AUTH Acad. Year: 2016-2017 MASTER S THESIS «Studying the cytogenetic findings arising during the investigation of infertility or subsequent miscarriages in couples from North Greece» Of postgraduate student Eleni Xanthopoulou Supervisor Professor: Stiliani Fidani Associate Professor of Medical Biology Medical Genetics, Medical School AUTH THESSALONIKI, 2017 2

Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία αποτελεί διπλωματική εργασία στο πλαίσιο του μεταπτυχιακού προγράμματος Ερευνητική μεθοδολογία στην Ιατρική και στις Επιστήμες Υγείας της Ιατρικής Σχολής. Πριν την παρουσίαση των αποτελεσμάτων της παρούσας διπλωματικής εργασίας αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνέβαλαν στην πραγματοποίηση της. Πρώτα θέλω να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια της Ιατρικής Σχολής κ. Φιδάνη Στυλιανή που μου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον αντικείμενο που ανταποκρίνεται απολύτως στα επιστημονικά μου ενδιαφέροντα καθώς και για την πολύτιμη καθοδήγηση και εμπιστοσύνη που μου έδειξε σε όλη την διάρκεια της εκπόνησης. Επίσης τις ευχαριστίες μου εκφράζω στους καθηγητές της Ιατρικής Σχολής κ Λαμπρόπουλο Αλέξανδρο και κ. Γιαννόπουλο Ανδρέα που δέχτηκαν να είναι μέλη της τριμελούς επιτροπής αξιολόγησης και την αποτελεσματική συνεργασία και συμβολή τους στην ολοκλήρωση την παρούσας εργασίας. 3

Περιεχόμενα ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6 ABSTRACT... 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 8 1.1 DNA και Χρωμοσώματα... 8 1.2 Μορφολογία των Χρωμοσωμάτων... 9 1.3 Καρυότυπος... 10 1.4 Τεχνικές Χρώσης των Χρωμοσωμάτων... 13 1.4.1 Τεχνικές Χρώσης που Δε Δημιουργούν Ζωνώσεις... 13 1.4.2 Τεχνικές Χρώσης που Δημιουργούν Ζωνώσεις... 13 1.5 Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες... 16 1.5.1 Αριθμητικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες... 16 1.5.1.1 Ευπλοειδίες... 16 1.5.1.2 Ανευπλοειδίες... 16 1.5.2 Δομικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες... 17 1.5.2.1 Ισοζυγισμένες Ανακατατάξεις... 19 1.5.3 Μωσαϊκισμός... 20 1.6 Κλινικές Ενδείξεις για Χρωμοσωμικό Έλεγχο... 21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 22 2.1 Υπογονιμότητα... 22 2.2 Αζωοσπερμία... 22 2.3 Καθ έξιν αποβολές... 25 ΣΚΟΠΟΣ... 28 ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 29 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 29 Λήψη Περιφερικού Αίματος... 29 Καλλιέργεια Λεμφοκυττάρων από περιφερικό αίμα... 30 Επίστρωση των Λεμφοκυττάρων... 31 Χρώση... 32 Παρατήρηση στο μικροσκόπιο... 32 Στατιστική Επεξεργασία... 33 4

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 34 ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 52 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 55 5

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ως καρυότυπος ορίζεται το σύνολο όλων των μεταφασικών χρωμοσωμάτων ενός κυττάρου. Ο καρυότυπος είναι χαρακτηριστικός για κάθε είδος και αποτελεί μια εξαιρετικά σημαντική εξέταση διότι μπορεί να δείξει ορισμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες (δομικές και αριθμητικές) που δεν μπορούν να ανιχνευθούν με την ίδια ευκολία με άλλες τεχνικές. Εκτός από τις ασθένειες με τις οποίες σχετίζεται άμεσα ένας παθολογικός καρυότυπος, όπως είναι το σύνδρομο Down με την τρισωμία του χρωμοσώματος 21, υπάρχουν και πολυάριθμες άλλες καταστάσεις, οι οποίες φαίνεται να σχετίζονται με τον καρυότυπο. Σε αυτές περιλαμβάνονται, μεταξύ άλλων, τα προβλήματα υπογονιμότητας, οι καθ έξιν αποβολές και οι παλίνδρομες κυήσεις. Στο πλαίσιο αυτό, λοιπόν, στόχος της παρούσας εργασίας είναι η καταγραφή των κυτταρογενετικών ευρημάτων σε ζευγάρια από τη Βόρεια Ελλάδα που έχουν ιστορικό υπογονιμότητας ή καθ έξιν αποβολών. Για το σκοπό αυτό, συγκεντρώθηκαν συνολικά 715 άτομα, τα οποία ελέγχθηκαν με κλασικό καρυότυπο ύστερα από καλλιέργεια λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος, και στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε επεξεργασία των δεδομένων που προέκυψαν από το δείγμα αυτό. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως ο καρυότυπος δε σχετίζεται με το επάγγελμα και την περιοχή διαμονής των ατόμων, αλλά με το πρόβλημα που αντιμετωπίζουν τα άτομα αυτά. 6

ABSTRACT Karyotype is defined as the set of all the metaphase chromosomes of one cell. Karyotype is characteristic for each species, and is a very important examination for human because it can show some chromosomal abnormalities (structural or arithmetic) that cannot be observed by any other procedure. Except for the diseases that are immediately associated with pathological karyotype, such as the Down syndrome and the 21 trisomy, there are numerous cases that seem to be connected with karyotype. These cases include, among other, the fertility problems and the recurrent miscarriages. In this context, the main objective of this project is to record the cytogenetic findings in couples from northern Greece who have a history of infertility or recurrent miscarriages. For this reason, 715 people were collected and tested with the classic karyotype after a culture of the lymphocytes of peripheral blood, and afterwards, this data were processed. The results showed that karyotype is not associated with the profession and the place of residence, but it is connected with the problem that couples face. 7

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1.1 DNA και Χρωμοσώματα Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) είναι το πιο σημαντικό μόριο τόσο των προκαρυωτικών όσο και των ευκαρυωτικών οργανισμών. Κάθε κύτταρο περιέχει μια πολύ μεγάλη ποσότητα DNA, η οποία προκειμένου να χωρέσει μέσα στο κύτταρο αλλά και να διατηρήσει τη λειτουργικότητα του DNA, αναδιπλώνεται στα χρωμοσώματα, δομές που εξασφαλίζουν τη μέγιστη συμπύκνωση του γενετικού υλικού (Σκούρας, 1997). Κάθε χρωμόσωμα παρουσιάζεται ως ένα επίμηκες, γραμμικό δίκλωνο μόριο DNA, ενώ, παράλληλα, το DNA και χρωμοσωμικές πρωτεΐνες δημιουργούν σύμπλοκα και πακετάρονται ως χρωματίνη (Nussbaum et al, 2011). Σε όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, πέρα από την κυτταρική διαίρεση, η χρωματίνη κατανέμεται ομοιογενώς στον πυρήνα του κυττάρου, ενώ, στην κυτταρική διαίρεση, παρουσιάζεται συμπυκνωμένη στα χρωμοσώματα, δομές ορατές στο μικροσκόπιο. Προκειμένου να χαρακτηρίζεται ένα χρωμόσωμα λειτουργικό, οφείλει, εκτός από τη σωστή κατεύθυνση της μεταγραφής, να είναι ικανό να αντιγράφεται χωρίς λάθη, αυτούσιο, να διανέμεται σε ίσες ποσότητες στα δύο νέα κύτταρα, και να κληρονομείται έτσι από κύτταρο σε κύτταρο και από γενιά σε γενιά. Οι ιδιότητες αυτές απαιτούν την ύπαρξη τριών βασικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε κάθε χρωμόσωμα (Russell, 2009): Μια αλληλουχία που αποτελεί σημείο έναρξης της μεταγραφής. Το κεντρομέρος, το οποίο αναλαμβάνει το σωστό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια της μίτωσης και της μείωση, και Το τελομέρος, μια αλληλουχία που ευθύνεται για τη σωστή και πλήρη αντιγραφή του DNA. 8

Ο βαθμός στον οποίο είναι συμπυκνωμένο το DNA αλλάζει κατά τις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, η μέγιστη συμπύκνωση εμφανίζεται από τη μεταφασική χρωματίνη, ενώ στη φάση G1 της μεσόφασης, σημειώνεται μια σταδιακή αποσυμπύκνωση της χρωματίνης, η οποία λαμβάνει μια πιο χαλαρή μορφή στη φάση S της μεσόφασης. Αντίθετα, στη φάση G2, η χρωματίνη ξεκινά και πάλι να συμπυκνώνεται, προκειμένου να είναι πολύ συμπυκνωμένη πριν αρχίσει ο κυτταρικός κύκλος (Russell, 2009). Τέλος, αξίζει να αναφερθεί πως υπάρχουν δύο μορφές χρωματίνης: η ευχρωματίνη και η ετεροχρωματίνη. 1.2 Μορφολογία των Χρωμοσωμάτων Εδώ και πολλά χρόνια, το μικροσκόπιο αξιοποιείται για την παρατήρηση των χρωμοσωμάτων, ενέργεια η οποία έχει δείξει την ύπαρξη διαφορετικής μορφολογίας και διαφορετικών μεγεθών ανάμεσα στα χρωμοσώματα τόσο του ίδιου όσο και των διαφορετικών ειδών οργανισμών (Russell, 2009). Όλα τα χρωμοσώματα διαθέτουν μια περίσφιξη, το κεντρομερές, που διαθέτει έναν πολύ βασικό ρόλο στη συμπεριφορά των χρωμοσωμάτων κατά τη διαίρεση των κυττάρων. Το κεντρομερές είναι μια δομή που συνδέει τις δύο αδελφές χρωματίδες των μεταφασικών χρωμοσωμάτων και διακρίνει το χρωμόσωμα σε 2 επιμέρους τμήματα: στο μεγάλο βραχίονα (q) και στο μικρό βραχίονα (p). Η θέση του κεντρομερούς στα χρωμοσώματα μπορεί να διακρίνει τα τελευταία στις ακόλουθες κατηγορίες (Russell, 2009): 1. Μετακεντρικά Χρωμοσώματα : Διαθέτουν το κεντρομερές στο κέντρο περίπου, κι έτσι, σχηματίζονται δύο βραχίονες σχεδόν ίσου μεγέθους. 2. Υπομετακεντρικά Χρωμοσώματα : Διαθέτουν το κεντρομερές πλησιέστερα στο ένα άκρο του χρωμοσώματος, κι έτσι, σχηματίζονται δύο βραχίονες όπου ο ένας είναι μεγαλύτερος σε μήκος από τον άλλον. 3. Ακροκεντρικά Χρωμοσώματα : Διαθέτουν το κεντρομερές κοντά στο τελομέρος, κι έτσι, ο ένας βραχίονας είναι πολύ μικρότερος σε μήκος από τον άλλον. Πολλές φορές, στα ακροκεντρικά χρωμοσώματα ενοπίζονται και οι δορυφόροι. 9

4. Τελοκεντρικά Χρωμοσώματα : Στα χρωμοσώματα αυτής της κατηγορίας εντοπίζεται μόνο ένας βραχίονας, καθώς το κεντρομερές βρίσκεται στο άκρο τους. Τελοκεντρικά χρωμοσώματα δε συναντώνται στον ανθρώπινο οργανισμό. 1.3 Καρυότυπος Ως καρυότυπος ορίζεται το σύνολο όλων των μεταφασικών χρωμοσωμάτων ενός κυττάρου. Για τον προσδιορισμό και τη διάκριση των επιμέρους χρωμοσωμάτων, είναι απαραίτητα τα μεταφασικά χρωμοσώματα, λόγω του υψηλού βαθμού συμπύκνωσής τους. Έτσι, είναι ευκολότερη η παρατήρηση στο μικροσκόπιο, ενώ σημαντική βοήθεια σε αυτήν παρέχει και η πραγματοποίηση ειδικής χρώσης στα χρωμοσώματα (Russell, 2009). Ο καρυότυπος είναι χαρακτηριστικός για κάθε είδος, ενώ στον άνθρωπο, ο διπλοειδής αριθμός των χρωμοσωμάτων ανέρχεται στα 46. Η κατασκευή του καρυότυπου βασίζεται στην τοποθέτηση των χρωμοσωμάτων από το μεγαλύτερο σε μέγεθος προς το μικρότερο και ανάλογα με τη θέση του κεντρομέρους τους. Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί, πως εξαίρεση στον παραπάνω κανόνα του μεγέθους αποτελεί το χρωμόσωμα 21, το οποίο ενώ είναι μικρότερο σε μέγεθος από το 22, έχει λάβει τη συγκεκριμένη θέση στον καρυότυπο για ιστορικούς λόγους. Η δημιουργία του ανθρώπινου καρυότυπου βασίζεται, επιπλέον, στους εξής δείκτες: 1. Το βραχιονικό δείκτη. 2. Το σχετικό μήκος. 3. Τον κεντρομερικό δείκτη. Σήμερα, έχει επικρατήσει η κατάταξη και η ονοματολογία που προτάθηκε στο Denver του Colorado το 1960, σύμφωνα με την οποία, τα χρωμοσώματα του ανθρώπου είναι δυνατόν να ταξινομηθούν στις 7 ακόλουθες κατηγορίες (Nussbaum et al, 2011): Ομάδα Α [1 ο έως 3 ο χρωμόσωμα]: Μεγάλο μέγεθος, μετακεντρικά ή υπομετακεντρικά. 10

Ομάδα Β [4 ο και 5 ο χρωμόσωμα]: Μεγάλο μέγεθος, υπομετακεντρικά. Ομάδα C [6 ο έως και 12 ο χρωμοσώματα] : Μεσαίο μέγεθος, υπομετακεντρικά. Σε αυτήν την κατηγορία εντάσσεται και το φυλετικό χρωμόσωμα Χ. Ομάδα D [13 ο έως και 15 ο χρωμόσωμα] : Μεσαίο μέγεθος, ακροκεντρικά. Στα χρωμοσώματα αυτά εντοπίζονται και δορυφόροι. Ομάδα Ε [16 ο έως και 18 ο χρωμόσωμα] : Σχετικά μικρό μέγεθος, μετακεντρικά ή υπομετακεντρικά. Ομάδα F [19 ο και 20 ο χρωμόσωμα] : Μικρό μέγεθος, μετακεντρικά. Ομάδα G [21 ο και 22 ο χρωμόσωμα]: Μικρό μέγεθος, ακροκεντρικά. Σε αυτήν την ομάδα περιλαμβάνεται το φυλετικό χρωμόσωμα Υ. Επίσης, στα χρωμοσώματα αυτής της κατηγορίας εντοπίζονται και δορυφόροι. Συνολικά, ο καρυότυπος περιγράφεται με την αναφορά τριών βασικών παραμέτρων, με δεδομένη σειρά, και με κόμμα ανάμεσά τους. Οι συγκεκριμένες πληροφορίες είναι οι ακόλουθες: Ο αριθμός των χρωμοσωμάτων που περιέχεται σε κάθε κύτταρο. Τα φυλετικά χρωμοσώματα. Το είδος της ανωμαλίας των χρωμοσωμάτων, εφόσον αυτή εντοπιστεί. Έτσι, ένας φυσιολογικός καρυότυπος για το αρσενικό φύλο αναφέρεται ως 46,ΧΥ, ενώ ο αντίστοιχος φυσιολογικός καρυότυπος για το θηλυκό φύλο είναι 46,ΧΧ. Επιπροσθέτως, εάν έχει αξιοποιηθεί κάποια χρώση για τη δημιουργία ζωνώσεων στα χρωμοσώματα, για να αναφερθεί μια συγκεκριμένη ζώνη, πρέπει να σημειωθούν οι εξής 4 πληροφορίες: Ο αριθμός του χρωμοσώματος Ο βραχίονας του χρωμοσώματος (p ή q) Ο αριθμός της χρωμοσωμικής περιοχής Ο αριθμός της ζώνης που βρίσκεται στη συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή Προκειμένου να είναι δυνατή η ευρεία κοινή περιγραφή των χρωμοσωμικών ανωμαλιών του ανθρώπου, έχει καθιερωθεί το «διεθνές σύστημα ονοματολογίας στην κυτταρογενετική του ανθρώπου». Σύμφωνα με αυτό, κάθε χαρακτηριστικό του 11

καρυοτύπου μπορεί να περιγραφεί σύντομα με ένα συγκεκριμένο συμβολισμό που αξιοποιείται παγκοσμίως. Συμβολισμός A-G Επεξήγηση Ομάδες χρωμοσωμάτων 1-22 Αρίθμηση χρωμοσωμάτων X, Y Φυλετικά χρωμοσώματα P Q Cen Del Der Dic Dup Fra I Ins Inv R T Μικρός βραχίονας χρωμοσώματος Μεγάλος βραχίονας χρωμοσώματος Κεντρομερές Έλλειμμα Παράγωγο χρωμόσωμα Δικεντρικό χρωμόσωμα Διπλασιασμός Εύθραυστη θέση Ισοχρωμόσωμα Ένθεση Αναστροφή Δακτυλιοειδές χρωμόσωμα Μετάθεση : Θραύση :: Θραύση και επανένωση 12

1.4 Τεχνικές Χρώσης των Χρωμοσωμάτων Προκειμένου να αναγνωρίζονται και να μελετώνται εύκολα τα χρωμοσώματα στο μικροσκόπιο, έχουν χρησιμοποιηθεί πολυάριθμες, διαφορετικές τεχνικές χρώσης. Οι τεχνικές αυτές έχουν την ικανότητα βαφής των χρωμοσωμάτων, δημιουργούν συγκεκριμένα πρότυπα σε αυτά, και μπορούν να διακριθούν στις χρώσεις που δημιουργούν ζωνώσεις και σε εκείνες που δε δημιουργούν ζωνώσεις. 1.4.1 Τεχνικές Χρώσης που Δε Δημιουργούν Ζωνώσεις Οι τεχνικές χρώσεις που δε δημιουργούν ζωνώσεις στα χρωμοσώματα οδηγούν σε ομοιόμορφο χρωματισμό των τελευταίων, και έτσι, δεν είναι δυνατή η διάκριση συγκεκριμένων γνωρισμάτων, όπως είναι τα τελομέρη και οι δορυφόροι. Ο προσδιορισμός των χρωμοσωμάτων με αυτές τις χρώσεις είναι δύσκολη, κι έτσι, αυτές μπορούν να διακρίνουν μόνο τις διαφορετικές ομάδες των χρωμοσωμάτων. Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές μπορούν να αξιοποιηθούν για την εύρεση αριθμητικών ανωμαλιών (Nussbaum et al, 2011). 1.4.2 Τεχνικές Χρώσης που Δημιουργούν Ζωνώσεις Οι τεχνικές χρώσης των χρωμοσωμάτων είναι δυνατόν να διακριθούν σε αυτές μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο βασικές ομάδες: στις τεχνικές που δημιουργούν ζώνες σε ολόκληρα τα χρωμοσώματα, και στις τεχνικές που δημιουργούν ένα συγκεκριμένο αριθμό ζωνώσεων. Οι βασικότερες από αυτές τις τεχνικές που δίνουν ζωνώσεις σε ολόκληρα τα χρωμοσώματα είναι οι εξής (Nussbaum et al, 2011): 13

Ζώνες G Η τεχνική που αξιοποιεί τη χρωστική Giemsa (ζώνωση G) είναι μία από τις συχνότερες τεχνικές που αξιοποιείται στα σύγχρονα εργαστήρια κυτταρογενετικής. Η συγκεκριμένη μέθοδος στηρίζεται στην απομάκρυνση των μη ιστονικών πρωτεϊνών που συνδέονται με τα χρωμοσώματα. Η χρωστική Giemsa έχει την ικανότητα δέσμευσης στις πλούσιες χρωμοσωμικές περιοχές σε ΑΤ, κι έτσι, δημιουργείται ένα χαρακτηριστικό πρότυπο ανοιχτόχρωμων και σκουρόχρωμων ζωνών (ζώνες G), το οποίο οφείλεται στην αλληλουχία του DNA και στη θέση των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να αξιοποιεί τόσο για τον προσδιορισμό όλων των χρωμοσωμάτων, όσο και για την εύρεση τυχόν αριθμητικών και δομικών ανωμαλιών (Nussbaum et al, 2011). Ζώνες Q Στην τεχνική ζωνώσεων Q, χρησιμοποιείται ως επί το πλείστον η φθορίζουσα χρωστική κουϊνακρίνη, και ύστερα από επεξεργασία των χρωμοσωμάτων με την ίδια, ακολουθεί παρατήρηση των χρωμοσωμάτων σε μικροσκόπιο φθορισμού. Με την τεχνική αυτή, δημιουργείται στα χρωμοσώματα ένα χαρακτηριστικό πρότυπο σκοτεινών και φωτεινών ζωνών (ζώνες Q), οι οποίες διευκολύνουν τον προσδιορισμό όλων των χρωμοσωμάτων (Nussbaum et al, 2011). Τέλος, σημειώνεται πως οι σκοτεινές ζώνες της χρώσης Q ισοδυναμούν με τις φωτεινές ζώνες της χρώσεις G. Η ζώνωση Q αποτελεί μια πολύ σημαντική τεχνική προκειμένου να προσδιορίζονται οι διάφοροι ετερομορφισμοί και οι σποραδικές παραλλαγές στη μορφολογία των χρωμοσωμάτων (Nussbaum et al, 2011). Ζώνες R Η ζώνωση R απαιτεί την ειδική κατεργασία των χρωμοσωμάτων πριν τη χρώση τους, όπως είναι η θέρμανση των χρωμοσωμάτων. Η ειδική αυτή κατεργασία οδηγεί στη δημιουργία αντίστροφων ζωνώσεων από εκείνες που σχηματίζονται στις τεχνικές Q ή G, κι έτσι, οι φωτεινές ζώνες αντιστοιχούν στις ετεροχρωματινικές περιοχές του χρωμοσώματος, ενώ οι σκούρες ζώνες ταυτίζονται με τις ευχρωματινικές περιοχές. 14

Η τεχνική αυτή αξιοποιείται κυρίως σε δείγμα κακής ποιότητας, λόγω της μεγαλύτερης ευκολίας ανάλυσης των ζωνών αυτών (Nussbaum et al, 2011). Ορισμένες άλλες, εξειδικευμένες και πολύ χρήσιμες τεχνικές είναι οι εξής: Ζώνες C Η τεχνική ζώνωσης C απαιτεί τη σύντομη επώαση των χρωμοσωμάτων σε διάλυμα 0,07Ν NaOH ή σε άλλες ουσίες με αλκαλικό ph, στάδιο το οποίο προκαλεί διαφορική απομάκρυνση του DNA και οδηγεί στη δημιουργία πιο χαρακτηριστικών ζωνών G. Ζώνες NOR Στη μέθοδο αυτή, τα χρωμοσώματα υφίστανται κατεργασία με νιτρικό άργυρο, προκειμένου να χρωματιστούν ειδικά οι περιοχές του οργανωτή του πυρηνίσκου, οι οποίες βρίσκονται στους μίσχους των ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων και διαθέτουν πολυάριθμα αντίγραφα των γονιδίων εκείνων που κωδικοποιούν το ριβοσωμικό RNA (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 1987; Nussbaum et al, 2011). FISH Η φθορίζουσα Υβριδοποίηση In Situ (FISH) είναι μια σύγχρονη τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως σήμερα στα κυτταρογενετικά εργαστήρια, λόγω της ικανότητάς της να προσδιορίζει με ακρίβεια μια δεδομένη αλληλουχία του γονιδιώματος. Η συγκεκριμένη μέθοδος αξιοποιεί ειδικούς ανιχνευτές που στοχεύουν συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA και έτσι, είναι δυνατή η εύρεση τυχόν δομικών ή χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Μία εξελιγμένη μορφή της FISH είναι ο φασματικός καρυότυπος (SKY), όπου υβριδοποιούνται ταυτόχρονα πολλοί ανιχνευτές και εξετάζονται παράλληλα και τα 24 διαφορετικά χρωμοσώματα του ανθρώπινου κυττάρου (Nussbaum et al, 2011). 15

1.5 Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες ορίζονται ως «παρεκκλίσεις από τη φυσιολογική κατάσταση της δομής ή του αριθμού των χρωμοσωμάτων» (Russell, 2009). Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες χωρίζονται σε αριθμητικές και δομικές. 1.5.1 Αριθμητικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες Οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες είναι δυνατόν να κατηγοριοποιηθούν στις ευπλοειδίες, όπου ένα κύτταρο ή ένας οργανισμός έχει μια πλήρη σειρά χρωμοσωμάτων ή ένα πολλαπλάσιο αντιγράφων της, και στις ανευπλοειδίες, όπου ένα κύτταρο ή ένας οργανισμός διαθέτει χρωμοσώματα σε αριθμό μη πολλαπλάσιο της απλοειδούς σειράς (Russell, 2009). 1.5.1.1 Ευπλοειδίες Οι ευπλοειδίες περιλαμβάνουν αλλαγές του αριθμού των χρωμοσωμικών σειρών, με αποτέλεσμα την ύπαρξη ενός ακέραιου πολλαπλάσιου της σειράς των χρωμοσωμάτων ενός φυσιολογικού απλοειδή γαμέτη εκτός του 2. O αριθμός του απλοειοδούς γαμέτη συμβολίζεται με n, και στο ανθρώπινο είδος, ισούται με 23 χρωμοσώματα. Κύτταρα με ευπλοειδίες σημειώνονται συχνά σε αποβληθέντα έμβρυα (Τριανταφυλλίδης & Κουβάτση, 1987). 1.5.1.2 Ανευπλοειδίες Οι ανευπλοειδίες αφορούν στην αλλαγή του αριθμού των μεμονωμένων χρωμοσωμάτων, και όχι ολόκληρων των χρωμοσωμικών σειρών. Αυτές οι αλλαγές είναι δυνατόν να εντοπιστούν σε απλοειδείς, διπλοειδείς και πολυπλοειδείς οργανισμούς. 16

Το βασικότερο αίτιο πρόκλησης γαμετών με μη φυσιολογικό αριθμό χρωμοσωμάτων είναι ο μη διαχωρισμός των ομόλογων χρωμοσωμάτων κατά τη μείωση Ι και ο μη διαχωρισμός των αδελφών χρωματίδων κατά τη μείωση ΙΙ. Τα φαινόμενα αυτά είναι δυνατόν να εντοπιστούν σε όλα τα χρωμοσώματα ανεξαιρέτως (Nussbaum et al, 2011). Στο σημείο αυτό, αξίζει να αναφερθεί πως σωματικά κύτταρα με διαφορετικό από το φυσιολογικό αριθμό χρωμοσωμάτων είναι δυνατόν να δημιουργηθούν και από μη διαχωρισμό κατά τη μίτωση. Στον άνθρωπο, όπως και σε όλους τους ζωικούς οργανισμούς, η ανευπλοειδία είναι συνήθως θνησιγόνα, και ως εκ τούτου, εντοπίζεται κυρίως σε νεκρά έμβρυα που έχουν αποβληθεί. Στους διπλοειδείς οργανισμούς (n=46 χρωμοσώματα), εντοπίζονται 4 βασικά είδη ανευπλοειδίας (Nussbaum et al, 2011): 1. Ασωμία : Η ασωμία αποτελεί την έλλειψη ενός ζεύγους ομόλογων χρωμοσωμάτων (2n-2). 2. Μονοσωμία : Στη μονοσωμία, απουσιάζει μόνο ένα χρωμόσωμα (2n-1). 3. Τρισωμία: Στην τρισωμία, εντοπίζεται ένα επιπλέον χρωμόσωμα (2n+1). 4. Τετρασωμία : Η τετρασωμία χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη ενός επιπρόσθετου ζεύγους χρωμοσωμάτων (2n+2). 1.5.2 Δομικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες Οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες αφορούν σε θραύση των χρωμοσωμάτων και στη συνέχεια, ανασύσταση των θραυσμάτων αυτών σε ένα μη φυσιολογικό συνδυασμό. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες συναντώνται σπανιότερα από τις ανευπλοειδίες. Οι βασικότερες δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες που εντοπίζονται είναι οι ακόλουθες (Russell, 2009; Nussbaum et al, 2011): Μη ισοζυγισμένες Αναδιατάξεις. Στο συγκεκριμένο είδος δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών, οι φαινοτυπικές συνέπειες οφείλονται ως επί το πλείστον στην παρουσία 17

κάποιου διπλασιασμού, ή κάποιου ελλείμματος, ή μερικές φορές, και στα δύο αυτά μαζί. Ελλείμματα. Το έλλειμμα αποτελεί την απουσία ενός τμήματος του χρωμοσώματος που προκαλεί χρωμοσωμική ανισορροπία. Οι φαινοτυπικές επιπτώσεις των ελλειμμάτων οφείλονται κυρίως στο φαινόμενο της απλοανεπάρκειας, δηλαδή στην αδυναμία του μονού αντιγράφου να ανταποκριθεί επιτυχώς στις λειτουργίες που φυσιολογικά εκτελούνται από τα δύο αντίγραφα. Βέβαια, ο φαινότυπος εξαρτάται και από την έκταση του ελλείμματος, τον αριθμό, αλλά και τη σημαντικότητα των λειτουργιών των γονιδίων που απουσιάζουν. Διπλασιασμοί. Ως διπλασιασμός ορίζεται η δομική ανωμαλία όπου ένα χρωμοσωμικό τμήμα έχει διπλασιαστεί. Το μέγεθος του διπλασιασμού ποικίλλει, ενώ τα επαναλαμβανόμενα κομμάτια μπορεί να βρίσκονται είτε διαδοχικά είτε σε διαφορετικά σημεία του γονιδιώματος. Δακτυλιοειδή Χρωμοσώματα. Τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα προκύπτουν από θραύση ενός χρωμοσώματος σε 2 σημεία και στη συνέχεια, σχηματισμό δακτυλίου μέσω της σύνδεση των δύο ελεύθερων τμημάτων. Τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα διαθέτουν κεντρομερές, και έτσι, συμμετέχουν σταθερά στη διαδικασία της μίτωσης. Χρωμοσώματα Δείκτες. Τα χρωμοσώματα δείκτες αποτελούν χρωμοσώματα μη ταυτοποιήσιμα, πολύ μικρού μεγέθους, τα οποία εντοπίζονται συχνά ως μωσαϊκό. Τα χρωμοσώματα δείκτες μικρού μεγέθους αποτελούνται κυρίως από την 18

ετεροχρωματίνη του κεντρομερούς και το τμήμα που βρίσκεται κοντά στο τελευταίο, ενώ εκείνα μεγαλύτερου μεγέθους διαθέτουν κομμάτια από τους βραχίονες. Δικεντρικά Χρωμοσώματα. Τα δικεντρικά χρωμοσώματα διαθέτουν είτε δύο τμήματα διαφορετικής χρωμοσωμικής προέλευσης, είτε δύο χρωματίδες του ίδιου χρωμοσώματος. Η ύπαρξη των δικεντρικών χρωμοσωμάτων εντοπίζεται πολύ σπάνια. Ισοχρωμοσώματα. Τα ισοχρωμοσώματα είναι χρωμοσώματα όπου υπάρχει μόνο ο ένας από τους δύο βραχίονες, ο οποίος έχει διπλασιαστεί ως «αντικείμενο-είδωλο» και έχει σχηματίσει ένα χρωμόσωμα. Η παρουσία ενός ισοχρωμοσώματος σε ένα κύτταρο οδηγεί παράλληλα σε μερική τρισωμία του υπάρχοντος τμήματος και σε μερική μονοσωμία του τμήματος που απουσιάζει. 1.5.2.1 Ισοζυγισμένες Ανακατατάξεις Οι ισοζυγισμένες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις συνήθως δεν οδηγούν σε σοβαρά φαινοτυπικά προβλήματα, διότι ουσιαστικά περιλαμβάνεται όλη η γενετική πληροφορία στο κύτταρο, παρόλο που έχει κατανεμηθεί με τρόπο διαφορετικό. Ωστόσο, σημαντικό ζήτημα αποτελούν οι γαμέτες των ατόμων που φέρουν ισοζυγισμένες ανακατατάξεις (Nussbaum et al, 2011). Οι βασικότερες ισοζυγισμένες ανακατατάξεις είναι οι ακόλουθες: Αναστροφές. Οι αναστροφές περιλαμβάνουν αποκοπή και ακόλουθη ενσωμάτωση ενός τμήματος μετά από περιστροφή 180 μοιρών. Οι αναστροφές μπορεί να είναι είτε περικεντρικές, δηλαδή να περιέχουν το κεντρομερές, είτε παρακεντρικές, δηλαδή να μην περιέχουν το 19

κεντρομερές. Στις αναστροφές, δεν απουσιάζει γενετικό υλικό, επομένως, φαινοτυπικές επιπτώσεις εμφανίζονται μόνο εάν τα σημεία θραύσης δικαόπτουν γονίδια ή περιοχές καθοριστικές για τη γονιδιακή έκφραση. Μεταθέσεις. Ως μεταθέσεις ορίζονται οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες όπου μεταφέρεται κάποιο τμήμα σε διαφορετική θέση στο γονιδίωμα. Διακρίνονται δύο βασικοί τύποι μεταθέσεων: οι αμοιβαίες, όπου πραγματοποιείται ρήξη μη ομόλογων χρωμοσωμάτων και αμοιβαία ανταλλαγή των τμημάτων αυτών, και οι μεταθέσεις κατά Robertson, όπου πραγματοποιείται σύντηξη 2 ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων και παράλληλα, χάνονται οι μικροί βραχίονές τους. Οι συχνότερες κατά Robertson είναι οι 13q14q και 14q21q (Pylyp et al, 2013). Ενθέσεις. Οι ενθέσεις αποτελούν μη αμοιβαίες μεταθέσεις, όπου πραγματοποιείται θραύση ενός τμήματος και εισαγωγής του σε ένα άλλο χρωμόσωμα, με προσανατολισμό ίδιο ή αντίθετο με τον αρχικό. 1.5.3 Μωσαϊκισμός Τις περισσότερες φορές, μια χρωμοσωμική ανωμαλία εντοπίζεται στο σύνολο των κυττάρων του οργανισμού. Ωστόσο, ορισμένες φορές, είναι δυνατόν να εντοπιστούν 2 ή περισσότερες χρωμοσωμικές σειρές στο ίδιο άτομο, κατάσταση η οποία ονομάζεται μωσαϊκισμός. Ο μωσαϊκισμός είναι δυνατόν να είναι είτε δομικός είτε αριθμητικός, και η ανίχνευσή του πραγματοποιείται με τη βοήθεια της καρυοτυπικής ανάλυσης Βασικό αίτιο του μωσαϊκισμού αποτελεί ο μη διαχωρισμός σε μια πρώιμη, μεταζυγωτική μίτωση. Οι φαινοτυπικές συνέπειες του μωσαϊκισμού είναι δύσκολο να εκτιμηθούν, ιδίως όταν πρόκειται για προγεννητική διάγνωση του προβλήματος. 20

Ωστόσο, συνήθως οι φαινοτυπικές επιπτώσεις του μωσαϊκισμού είναι συνήθως ηπιότερες από εκείνες των μη μωσαϊκών χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Γενικά, οι συνέπειες αυτές του μωσαϊκισμού στην ανάπτυξη του ατόμου φαίνεται να εξαρτώνται από το χρόνο εμφάνισης του μη διαχωρισμού, τον τύπο της ανωμαλίας, τον τύπο των ιστών που έχουν προσβληθεί και το ποσοστό μωσαϊκισμού. 1.6 Κλινικές Ενδείξεις για Χρωμοσωμικό Έλεγχο Η κλασική κυτταρογενετική ανάλυση αποτελεί μέχρι σήμερα μία από τις πιο σημαντικές μεθόδους διάγνωσης της γενετικής. Σε χρωμοσωμικό έλεγχο παραπέμπονται τα άτομα σε ποικίλες περιπτώσεις, όπως είναι οι ακόλουθες: 1. Γνωστή ή Πιθανολογούμενη Χρωμοσωμική Ατυπία 2. Καθ έξιν αποβολές 3. Υπογονιμότητα 4. Διαταραχές φυλετικής διαφοροποίησης 5. Συγγενείς διαμαρτίες 6. Αιματολογικές νεοπλασίες και ασθένειες που σχετίζονται με χρωμοσωμικές ανωμαλίες. 7. Έκθεση σε ακτινοβολία ή μεταλλαξιγόνα 21

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2.1 Υπογονιμότητα Ως υπογονιμότητα ορίζεται η αδυναμία επίτευξης εγκυμοσύνης ύστερα από ένα έτος συστηματικών σεξουαλικών επαφών, χωρίς τη χρήση προφυλακτικών μέσων (Pylyp et al, 2013). Διακρίνεται στην πρωτοπαθή υπογονιμότητα, όπου απουσιάζει η σύλληψη, και στη δευτεροπαθή, όπου παλαιότερα έχει σημειωθεί σύλληψη, ανεξαρτήτως του τελικού αποτελέσματος, αλλά το ζευγάρι δεν μπορεί να επιτύχει ξανά σύλληψη. Η υπογονιμότητα επηρεάζει το 15% των ζευγαριών αναπαραγωγικής ηλικίας, ενώ το ¼ περίπου των προβλημάτων αυτών οφείλεται στον άνδρα (Ferlin et al, 2007). 2.2 Αζωοσπερμία Η αζωοσπερμία είναι περιγραφικός όρος που αναφέρεται στην απουσία σπερματοζωαρίων κατά την εκσπερμάτιση των ανδρών, χωρίς να υποδηλώνει συγχρόνως κάποιο αίτιο για την ύπαρξη της συγκεκριμένης κατάστασης (Aziz, 2013, Wosnitzer et al, 2014). Η πάθηση αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς συναντάται στο 15% περίπου των στείρων ανδρών (Wosnitzer et al, 2014) Ο όρος του συγκεκριμένου προβλήματος είναι αρκετά ασαφής, καθώς προκύπτουν πολλές διαφοροποιήσεις και υποπεριπτώσεις ανάλογα με τα διαφορετικά κριτήρια διάγνωσης (Aziz, 2013). Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως είναι η ύπαρξη του συνδρόμου Klinefelter, η φορέων κυστική ίνωση και περιπτώσεις προηγούμενης βασεκτομής, η αζωοσπερμία είναι δυνατόν να ανιχνευθεί πριν την ανάλυση του σπέρματος, διαφορετικά, η διαδικασία αυτή είναι απαραίτητη ώστε να διαγνωσθεί η αζωοσπερμία, καθώς και να διακριθεί από την ασπερμία, όπου υπάρχει πλήρης απώλεια του σχηματισμού του σπέρματος ή πλήρης απουσία εκσπερμάτωσης (Aziz, 2013). 22

Εικόνα 1 Κλινικά Χαρακτηριστικά των σπερματοζωαρίων σε άτομα με αζωοσπερμία (http://www.iator.gr/2016/10/27/ti-ine-i-azoospermia/). Η αζωοσπερμία μπορεί να διακριθεί σε 2 βασικές κατηγορίες: στην αποφρακτική αζωοσπερμία (Obstructive Azoospermia, OA) και στη μη αποφρακτική αζωοσπερμία (Non-obstructive Azoospermia, NOA) (Wosnitzer et al, 2014). Τα αίτια στα οποία οφείλεται η παρουσία της αζωοσπερμίας ποικίλλουν, ενώ ένα σημαντικό ποσοστό των περιπτώσεων αζωοσπερμίας οφείλεται σε γενετικά αίτια (Sadeghi Nejad & Farrokhi, 2007). Όσον αφορά στις γενετικές αναλύσεις ρουτίνας που πραγματοποιούνται στις περιπτώσεις αζωοσπερμίας, αυτές περιλαμβάνουν τις αναλύσεις των χρωμοσωμάτων μέσω του καρυοτύπου, ο οποίος προσδιορίζει ανωμαλίες στα χρωμοσώματα τόσο αριθμητικές όσο και δομικές, και τη διερεύνηση τυχόν μικροελλειμμάτων στο χρωμόσωμα Υ (Wosnitzer et al, 2014, Dong et al, 2015). Η πιο συχνή χρωμοσωμική ανωμαλία που σχετίζεται με την αζωοσπερμία είναι το σύνδρομο Klinefelter, όπου εντοπίζεται ένα επιπλέον χρωμόσωμα Χ στους άνδρες αυτούς (47,XXY), ενώ δεύτερες σε συχνότητα, όσον αφορά στο πρόβλημα της αζωοσπερμίας, έρχονται οι μετατοπίσεις κατά Robertson, όπου συντήκονται οι δύο μεγάλοι βραχίονες δύο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (13, 14, 15, 21 ή 22). Στη βιβλιογραφία των τελευταίων ετών, εντοπίζονται αρκετές μελέτες που μελετούν τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε άνδρες με αζωοσπερμία, καθώς και ορισμένα σπάνια περιστατικά. 23

Αρχικά, μια ιδιαίτερη περίπτωση αναφέρθηκε από τους Onrat et al (2012), όπου ένας στείρος άνδρας με αζωοσπερμία, βρέθηκε να έχει μια μετατόπιση Yq/15p. Δεδομένου ότι οι μετατοπίσεις που περιλαμβάνουν το χρωμόσωμα Υ είναι γενικά πολύ σπάνιες, η περίπτωση αυτή χρήζει ιδιαίτερης προσοχής. Ο καρυότυπος του συγκεκριμένου ατόμου ήταν 46,XX, t(y;15)(q12;p11), ενώ βρέθηκε ότι η δομική αυτή χρωμοσωμική ανωμαλία κληρονομήθηκε από τον πατέρα, ο οποίος έφερε την de novo αλλαγή του χρωμοσώματος 15, και είχε καρυότυπο 45,X, t(y;15)(q12;p11), αλλά δεν ήταν στείρος. Έτσι, υποτέθηκε πως η μετατόπιση αυτή του πατέρα οδήγησε σε σχηματισμό μη ισορροπημένων γαμετών, και ως εκ τούτου, ο άνδρας του συγκεκριμένο περιστατικού εμφάνισε στειρότητα (Onrat et al, 2012). Οι Pylyp et al (2013) πραγματοποίησαν μια μελέτη όπου αξιολογήθηκαν η συχνότητα και τα είδη των χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε 204 ασθενείς στην Ουκρανία που είχαν είτε ολιγοσπερμία είτε μη αποφρακτική αζωοσπερμία, καθώς και σε 87 άνδρες με φυσιολογικά επίπεδα σπέρματος. Η αξιολόγηση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών πραγματοποιήθηκε με κυτταρογενετικές τεχνικές σε δείγματα λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, χρωμοσωμικές ανωμαλίες βρέθηκαν στο 17% των ανδρών με διαταραχές σπέρματος, και συγκεκριμένα, στο 12,7% των ανδρών με ολιγοσπερμία και στο 35% των ανδρών με αζωοσπερμία. Επιπλέον, η συχνότητα με την οποία εμφανίζουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες τα άτομα με διαταραχές σπέρματος είναι πολύ υψηλότερη από εκείνη των ασθενών με φυσιολογικά επίπεδα σπέρματος, ενώ παρατηρείται και μια αύξηση της συχνότητας εμφάνισης χρωμοσωμικών ανωμαλιών όσο μειώνεται η ποσότητα του σπέρματος. Τέλος, βρέθηκε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των ανωμαλιών στα φυλετικά χρωμοσώματα και στην ύπαρξη αζωοσπερμίας, σχέση η οποία δεν εντοπίστηκε στα άτομα με ολιγοσπερμία (Pylyp et al, 2013). Οι Kuroda et al (2014) ανέφεραν ένα περιστατικό ενός στείρου ανδρός 43 ετών που διαγνώσθηκε, μέσω εξέτασης σπέρματος, με αζωοσπερμία και διέθετε στον καρυότυπο των κυττάρων του δύο ειδών δακτυλιωτά Υ χρωμοσώματα. Αναλυτικότερα, ο καρυότυπος του συγκεκριμένου ανδρός ήταν 45, XO/46, X, +mar1/46, X, +mar2, ενώ η ανάλυση των μικροελλείψεων του χρωμοσώματος Υ έδειξε ότι υπάρχει πλήρης απώλεια των αζωοσπερμικών παραγόντων (Azoospermic Factor, AZF) b και c, καθώς και μερική έλλειψη του αζωοσπερμικού παράγοντα a 24

(AZFa). Οι ελλείψεις αυτές συσχετίστηκαν με αδυναμία απόκτησης παιδιού, αφού δεν υπήρχε η δυνατότητα συλλογής σπέρματος, ακόμη και με τη μέθοδο TESE (Testicular Sperm Extraction) (Kuroda et al, 2014). Οι Ambulkar et al (2015) πραγματοποίησαν μια μελέτη σε 160 άτομα με μη αποφρακτική αζωοσπερμία, προκειμένου να διερευνήσουν τη συχνότητα των χρωμοσωμικών ανωμαλιών και των μικροελλειμμάτων του τόπου AZF στο χρωμόσωμα Υ. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες ανιχνεύτηκαν με τις ζώνες G, ενώ τα μικροελλείμματα ανιχνεύτηκαν μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας, το 7,5% του δείγματος εμφάνισε χρωμοσωμικές ανωμαλίες, με κυρίαρχο το σύνδρομο Klinefelter, το οποίο αποτελεί συχνό αίτιο της αζωοσπερμίας. Επίσης, το 12,8% του δείγματος εμφάνισε μικροελλείμματα στις διάφορες AZF περιοχές του Υ χρωμοσώματος. 2.3 Καθ έξιν αποβολές Αποβολή είναι η αυτόματη διακοπή της κύησης μέχρι και την 24η εβδομάδα της εγκυμοσύνης. (Pokale & Khadke, 2016). Οι καθ έξιν αποβολές, οι οποίες χαρακτηρίζονται και ως επαναλαμβανόμενη απώλεια της εγκυμοσύνης, αποτελεί το φαινόμενο όπου συναντώνται 3 διαδοχικές απώλειες της εγκυμοσύνης, οι οποίες συμβαίνουν τουλάχιστον έως 20 εβδομάδες από την τελευταία εμμηνορρυσιακή περίοδο. Η συχνότητα με την οποία συναντάται το συγκεκριμένο φαινόμενο είναι 1 στις 300 γυναίκες (Hyde & Schust, 2015). Τα αίτια και οι παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με τις καθ έξιν αποβολές είναι πολυάριθμα, και περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, την αυξημένη ηλικία της γυναίκας, την αυξημένη ηλικία του πατέρα, την κατανάλωση αλκοόλ, το κάπνισμα, μεταβολές στο ανοσολογικό σύστημα του ατόμου, καθώς και γενετικές αλλαγές. Αναφορικά με τις γενετικές μεταβολές, έχουν συσχετιστεί σε μεγάλο βαθμό με τις καθ έξιν αποβολές. Ως εκ τούτου, μια εξέταση στην οποία πάντοτε υποβάλλονται τα ζευγάρια με καθ έξιν αποβολές είναι η ανάλυση κλασικού καρυοτύπου (Pokale & Khadke, 2016). 25

Εικόνα 2 Αίτια που σχετίζονται με τις καθ έξιν αποβολές (Pokale & Khadke, 2016). Σύμφωνα με τα ερευνητικά δεδομένα έως σήμερα, ένα ποσοστό των καθ έξιν αποβολών οφείλονται σε δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες που φέρουν τα ζευγάρια. Στις καθ έξιν αποβολές, οι δομικές εκείνες ανωμαλίες που φαίνεται να κατέχουν σημαντικό ρόλο είναι οι μετατοπίσεις και οι αναστροφές (Pokale & Khadke, 2016). Σύμφωνα με τους Karaman & Ulug (2013), το 8,8% των ζευγαριών που αντιμετωπίζουν το πρόβλημα των επαναλαμβανόμενων αποβολών, φέρει κάποια μετατόπιση. Οι Farcas et al (2007) μελέτησαν συνολικά 260 ζευγάρια με ιστορικό καθ έξιν αποβολών. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας έδειξαν την ύπαρξη μετατοπίσεων στο 2,88% του συνόλου, όπου το 1,15% αντιστοιχούσε σε μετατοπίσεις κατά Robertson και το 1,73% αντιστοιχούσε σε ισοζυγισμένες μετατοπίσεις. Οι Zhang et al (2014) εξέτασαν τη σχέση μεταξύ του καρυοτύπου του εμβρύου και των χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε ζευγάρια με καθ έξιν αποβολές (Recurrent Miscarriages, RM). Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκαν συνολικά 34 ζευγάρια, από τα οποία τα 20 άτομα παρουσίασαν χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Αναφορικά με τους καρυότυπους των ζευγαριών αυτών, το 69,2% είχε αναστροφές, ενώ το 73,3% είχε πολυμορφισμούς στους καρυότυπους, όπως είναι οι αναστροφές στο χρωμόσωμα 9. Όλες αυτές οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες οδήγησαν σε ζωντανά, φαινοτυπικά φυσιολογικά παιδιά. Ακολούθως, όταν αναλύθηκε και ο καρυότυπος των παιδιών 26

αυτών, βρέθηκε ότι το 48,3% του συνόλου ο καρυότυπος ήταν φυσιολογικός, στο 41,4% υπήρχαν ανωμαλίες, ενώ στο 10,3% ο καρυότυπος ήταν πολυμορφικός. Συνολικά, λοιπόν, η συγκεκριμένη μελέτη έδειξε μια θετική σχέση ανάμεσα στις χρωμοσωμικές ανωμαλίες και στις καθ έξιν αποβολές, ενώ επισημαίνεται ότι στα ζευγάρια που φέρουν περισσότερες από 2 αποβολές, είναι υποχρεωτική η προγεννητική διάγνωση (Zhang et al, 2014). 27

ΣΚΟΠΟΣ Δεδομένων όλων των παραπάνω σχέσεων μεταξύ των χρωμοσωμικών ανωμαλιών ατόμων και των προβλημάτων υπογονιμότητας και καθ έξιν αποβολών, γίνεται σαφές πως κρίσιμη σημασία διαθέτει η ανάλυση του κλασικού καρυοτύπου στα άτομα με ένδειξη υπογονιμότητας και καθ έξιν αποβολών καθώς και η παροχή των κατάλληλων γενετικών συμβουλών έτσι ώστε να διαχειριστούν την κατάσταση, και ενδεχομένως να αποκτήσουν, με τις κατάλληλες εναλλακτικές λύσεις, και το παιδί που επιθυμούν. Στο πλαίσιο αυτό, στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί η καταγραφή και ανάλυση των αποτελεσμάτων του κλασικού καρυότυπου σε άτομα με προβλήματα υπογονιμότητας και καθ έξιν αποβολών και η διερεύνηση της σχέσης των ευρημάτων με το φύλο, την ηλικία, το επάγγελμα, την περιοχή πόλη διαμονής και το πρόβλημα που τους οδήγησε στον καρυοτυπικό έλεγχο. 28

ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Τα στάδια που πραγματοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης ερευνητικής εργασίας είναι τα ακόλουθα: Λήψη περιφερικού αίματος Καλλιέργεια των Λεμφοκυττάρων του αίματος Διαχωρισμός των λεμφοκυττάρων από τα άλλα συστατικά του αίματος Επίστρωση των λεμφοκυττάρων Χρώση των δειγμάτων Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Δημιουργία του καρυοτύπου Στατιστική Ανάλυση του συνόλου των δεδομένων Λήψη Περιφερικού Αίματος Το πρώτο βήμα που απαιτείται για τη διεξαγωγή του καρυότυπου ενός ατόμου είναι η αιμοληψία, κατά την οποία λαμβάνονται 2ml περιφερικού αίματος, με τη βοήθεια μιας σύριγγας των 5ml που περιέχει 1,5ml ηπαρίνη. Η παρουσία της ηπαρίνης είναι απαραίτητη διότι ενεργεί ως αντιπηκτικό και αποτρέπει τη συγκόλληση των λεμφοκυττάρων, την πήξη του αίματος και τελικά, το σχηματισμό θρομβίνης. 29

Καλλιέργεια Λεμφοκυττάρων από περιφερικό αίμα Από το αίμα που συλλέγεται από το κάθε άτομο, τοποθετείται από 1 ml σε 2 αποστειρωμένες φλάσκες καλλιέργειας που περιέχουν 10ml θρεπτικό υλικό. Η διαδικασία αυτή διεξάγεται υπό ασηπτικές συνθήκες, έτσι ώστε να αποτραπούν ενδεχόμενες επιμολύνσεις, ενώ, επισημαίνεται πως η ετοιμασία δύο ξεχωριστών καλλιεργειών για το εκάστοτε δείγματος συμβάλλει στην αύξηση του αριθμού των μιτώσεων και συνεπώς, στην αύξηση της πιθανότητας της εύρεσης καλύτερων μιτώσεων για ανάλυση. Το θρεπτικό υλικό που αξιοποιείται κατά την καλλιέργεια των λεμφοκυττάρων του αίματος περιλαμβάνει τα ακόλουθα συστατικά στοιχεία: 100ml θρεπτικό υλικό RPMI Medium 1640 20ml ορός εμβρύου μοσχαριού, ο οποίος βοηθά στην ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων 2ml στρεπτομυκίνη, η οποία είναι ένα αντιβιοτικό με στόχο την αποτροπή των ενδεχόμενων μολύνσεων του δείγματος 2,5ml φυτοαιμοσυγκολλητίνη (Phyto, PTH), η οποία είναι μια λεκτίνη που συμβάλλει στη συγκόλληση των ερυθρών κυττάρων, καθώς και στη διέγερση της διαίρεσης των λεμφοκυττάρων 2ml L-γλουταμίνη, η οποία ενεργεί ως υπόστρωμα για τη σωστή ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων Ύστερα από την ανάμιξη του αίματος με το θρεπτικό, οι φλάσκες ανακινούνται ελαφρά και τοποθετούνται σε ειδικό κλίβανο επώασης, στους 37 ο C για 96 ώρες. Ύστερα από το χρόνο αυτό, προστίθεται 0,1ml κολχικίνης σε κάθε φλάσκα, ενώ ακολουθεί ελαφριά ανάδευση και επώαση στους 37 ο C για 45 λεπτά. Η κολχικίνη είναι ένα αλκαλοειδές που συμβάλλει στον γρήγορο αποπολυμερισμό των μικροσωληνίσκων και στην παύση της διαίρεσης κατά τη μετάφαση (Ελευθερίου, 2007). Η ουσία αυτή κρίνεται αναγκαία για το χρωμοσωμικό έλεγχο, καθώς κατά το 30

στάδιο της μετάφασης, τα χρωμοσώματα αποκτούν την πιο συμπυκνωμένη και ευδιάκριτη μορφή τους. Στη συνέχεια, μεταφέρεται η καλλιέργεια σε σωλήνα φυγοκέντρησης και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές ανά λεπτό (rpm) για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο από τη φυγοκέντρηση αφαιρείται, και προστίθεται 1ml διαλύματος KCl (5,6g/L Η2Ο ) σε όλους τους σωλήνες. Το περιεχόμενο αναδεύεται με Vortex, και προστίθεται επιπλέον διάλυμα KCl, έτσι ώστε ο τελικός όγκος να ανέρχεται στα 7ml. Ακολούθως, τα δείγματα επωάζονται στον κλίβανο, στους 37 ο C για 45 λεπτά. Η επώαση αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική διότι κατά τη διάρκειά της, διαρρηγνύονται οι πυρήνες των κυττάρων λόγω των ωσμωτικών φαινομένων που προκαλεί το διάλυμα KCl και απλώνονται τα χρωμοσώματα. Στη συνέχεια, προστίθενται 2ml μονιμοποιητικού διαλύματος FIX, το οποίο αποτελείται από μεθανόλη και από οξικό οξύ, σε αναλογία 3:1, και διατηρούνται οι σωλήνες στην κατάψυξη (-20 ο C) για 24 ώρες. Ύστερα από τις ώρες αυτές, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές ανά λεπτό για 10 λεπτά, αφαίρεση του υπερκειμένου, και προσθήκη 7ml FIX ανά δείγμα. Η συγκεκριμένη διαδικασία επαναλαμβάνεται για 4 συνολικά φορές, και στοχεύει στον καθαρισμό του ιζήματος. Στο τέλος του συγκεκριμένου σταδίου, ολοκληρώνεται η καλλιέργεια των λεμφοκυττάρων. Σε κάθε περίπτωση, αξίζει να επισημανθεί πως όλη η διαδικασία πρέπει να πραγματοποιείται σε αποστειρωμένες συνθήκες, σε θερμοκρασία ίση με 22-23 ο C και σε υγρασία μεταξύ 50 και 70 βαθμών. Επίστρωση των Λεμφοκυττάρων Ύστερα από τον καθαρισμό του ιζήματος, το τελευταίο πρέπει να επιστρωθεί σε αντικειμενοφόρους πλάκες. Για το σκοπό αυτό, δημιουργείται μια λεπτή στρώση υγρασίας στην αντικειμενοφόρο πλάκα, τοποθετείται μία σταγόνα του δείγματος στο κέντρο της πλάκας, ακολουθεί αναμονή λίγων δευτερολέπτων προκειμένου να κατακαθίσει το ίζημα στην αντικειμενοφόρο πλάκα, και προστίθεται στο ίδιο σημείο μία σταγόνα μονιμοποιητικού FIX. Μόλις στεγνώσει το δείγμα, παρατηρείται στο οπτικό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεως, με σκοπό τον εντοπισμό μεταφάσεων. 31

Έτσι, ελέγχεται εάν υπάρχουν αρκετές και ευδιάκριτες μεταφάσεις για τη συνέχεια της διαδικασία. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες με ικανοποιητικά δείγματα «ψήνονται» στον κλίβανο, στους 60 ο C, για 24 ώρες ή, στους 90 ο C για 1 ώρα, προκειμένου να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της χρώσης. Χρώση Για τη χρώση των παρασκευασμάτων, πραγματοποιείται βύθιση των αντικειμενοφόρων πλακών σε θρυψίνη για 45 έως 55 δευτερόλεπτα, ξέπλυμα σε φυσιολογικό ορό, και προσθήκη της χρωστικής Leishman, η οποία περιλαμβάνει χρωστική Leishman και buffer (PBS) σε αναλογία 1:4. Ύστερα από αναμονή 3 λεπτών, ξεπλένονται οι πλάκες και αφήνονται σε διηθητικό χαρτί να στεγνώσουν. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Τελευταίο βήμα αποτελεί η τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών στο μικροσκόπιο, όπου με τη βοήθεια του 10x φακού, εντοίζονται οι καλύτερες μεταφάσεις, δηλαδή εκείνες με τα πιο διακριτά και ευδιάκριτα χρωμοσώματα. Η καλύτερη παρατήρηση πραγματοποιείται με τον ελαιοδυτικό 100x φακό, καθώς και από τον ηλεκτρονικό υπολογιστή, όπου μεταφέρεται η εικόνα από το οπτικό μικροσκόπιο και επεξεργάζεται με το πρόγραμμα MetaSystems Ikaros. Το συγκεκριμένο πρόγραμμα συμβάλλει στο διαχωρισμό και στην καταμέτρηση των χρωμοσωμάτων, στη διάταξή τους ανά ζεύγη και τη δημιουργία του τελικού καρυότυπου. Σημειώνεται πως για κάθε άτομο, αναλύονται τουλάχιστον 20 μεταφάσεις, προκειμένου να είναι σίγουρα τα αποτελέσματα, ενώ για κάθε παθολογικό καρυότυπο, αναλύονται 100 διαφορετικές μεταφάσεις. 32

Στατιστική Επεξεργασία Ύστερα από την ανάλυση όλων των καρυοτύπων και τη συγκέντρωση των δεδομένων, πραγματοποιήθηκε καταγραφή και ανάλυση με τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου SPSS v20. Με αυτόν τον τρόπο, αναλύθηκαν οι συχνότητες των διάφορων χαρακτηριστικών του δείγματος, αλλά πραγματοποιήθηκαν και οι συσχετίσεις μεταξύ του καρυοτύπου και των διάφορων στοιχείων των υπό μελέτη ατόμων. 33

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η παρούσα αναδρομική μελέτη διενεργήθηκε στο Εργαστήριο της Κυτταρογενετικής της Β Παιδιατρικής Κλινικής του Νοσοκομείο ΑΧΕΠΑ κατά την χρονική περίοδο Ιανουάριος του 2012 έως Δεκέμβριος 2016. Συνολικά, συγκεντρώθηκαν 715 άτομα που χρειάστηκαν ανάλυση καρυοτύπου, πριν τη διεξαγωγή της οποίας λήφθηκαν ορισμένες πληροφορίες, όπως το φύλο, η ηλικία, το επάγγελμα, η περιοχή πόλη διαμονής και το πρόβλημα που τους οδήγησε στον καρυοτυπικό έλεγχο. Ύστερα από την καταγραφή και ανάλυση των δεδομένων, προέκυψε πως το δείγμα ήταν διαχωρισμένο σχεδόν εξ ημισείας στα δύο φύλα, αφού αποτελούνταν από 375 άνδρες και 340 γυναίκες. Φύλο Συχνότητα Ποσοστό Έγκυρο Ποσοστό Αθροιστική Συχνότητα Άνδρας 375 52,4 52,4 52,4 Γυναίκα 340 47,6 47,6 100,0 Σύνολο 715 100,0 100,0 34

Όσον αφορά στις ηλικίες του δείγματος, το τελευταίο καλύπτει ένα ευρύ φάσμα ηλικιών, ξεκινώντας από τα 13 έτη έως και τα 65 έτη, ενώ, κατηγοριοποιώντας τες σε 4 επιμέρους ομάδες, γίνεται αντιληπτό πως η συντριπτική πλειοψηφία του δείγματος ανήκει στις ηλικίες μεταξύ 31 και 45 ετών. Ηλικία Συχνότητα Ποσοστό Έγκυρο Ποσοστό Αθροιστική Συχνότητα <16 ετών 2,3,3,3 16-30 ετών 79 11,0 11,2 11,5 31-45 ετών 577 80,7 81,6 93,1 45 ετών και άνω 49 6,9 6,9 100,0 Σύνολο 707 98,9 100,0 Μη διαθέσιμα 999 8 1,1 στοιχεία Σύνολο 715 100,0 35

Επόμενο στοιχείο που καταγράφηκε ήταν το επάγγελμα, και συγκεκριμένα, εάν εκείνο σχετίζεται ή όχι με κάποιου είδους ακτινοβολία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το επάγγελμα της συντριπτικής πλειοψηφίας του δείγματος (99%) δεν είχε κάποια σχέση με ακτινοβολίες, ενώ μόλις το 1% από το σύνολο των 715 ατόμων απάντησε θετικά. Ακολούθως, συγκεντρώθηκαν οι απαντήσεις για την περιοχή που διαμένουν τα άτομα που εξετάστηκαν για καρυότυπο. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η πλειοψηφία των ατόμων αυτών ζουν στην Κεντρική Μακεδονία (86,7%), ενώ τα αμέσως επόμενα ποσοστά σημειώθηκαν για την Ανατολική Μακεδονία & Θράκη, και για τη Δυτική Μακεδονία, με τιμές 6,9 και 3,1, αντίστοιχα. Τέλος, σημειώθηκε για ποιο λόγο κλήθηκαν τα συγκεκριμένα άτομα να κάνουν καρυοτυπική ανάλυση. 36

Για ποιο λόγο πραγματοποιήθηκε ανάλυση καρυοτύπου; Συχνότητα Ποσοστό Έγκυρο Ποσοστό Αθροιστική Συχνότητα Καθ'έξιν Αποβολές 304 42,5 42,5 42,5 Παλίνδορμες Κυήσεις 8 1,1 1,1 43,6 Υπογοναδισμός / Αζωοσπερμία / Υπογονιμότητα / Αδυναμία Σύλληψης / Ολιγοσπερμία / Αδύναμο Σπέρμα Αποβολές με γνωστή χρωμοσωμική ανωμαλία Αποτυχημένες Εξωσωματικές Προγεννητικός Έλεγχος για εξωσωματική - Χρωμοσωμικός έλεγχος 148 20,7 20,7 64,3 8 1,1 1,1 65,5 229 32,0 32,0 97,5 9 1,3 1,3 98,7 Λοιπές ενδείξεις 9 1,3 1,3 100,0 Σύνολο 715 100,0 100,0 Τα αποτελέσματα έδειξαν πως υπάρχουν πάρα πολλοί διαφορετικοί λόγοι, εκ των οποίων οι κυριότεροι είναι οι καθ έξιν αποβολές και οι αποτυχημένες εξωσωματικές, με ποσοστά 42,5% και 32%, αντίστοιχα. 37

Τέλος, αφού ολοκληρώθηκε η καρυοτυπική εξέταση και συμπληρώθηκαν τα αποτελέσματα στο SPSS, υπολογίστηκαν οι συχνότητες (απόλυτες, σχετικές και αθροιστικές) για τον καρυότυπο του δείγματος. 38

Καρυότυπος Συχνότητα Ποσοστό Έγκυρο Ποσοστό Αθροιστική Συχνότητα Φυσιολογικός (46,ΧΧ ή 46,ΧΥ) 675 94,4 94,4 94,4 47,ΧΧΥ 14 2,0 2,0 96,4 45,ΧΥ rob(14,21)(q10;q10) 1,1,1 96,5 46,XX(inv9) 6,8,8 97,3 45,XX(inv9)rob(14321)(q105 q10) 4,6,6 97,9 46,XX t(1;18) (q10;q10) 1,1,1 98,0 47,ΧΧΥ inv(9) 1,1,1 98,2 45XY, t(13;14) 1,1,1 98,3 46,ΧΥ inv(9) inv(9) 1,1,1 98,5 46,XY t(4;18)(q32;pter) 1,1,1 98,6 46,XX t(2;7) (p10;q10) 1,1,1 98,7 45,XY t (21;22) 1,1,1 98,9 46,XX t(3;12) 1,1,1 99,0 47,XXX 3,4,4 99,4 46XX, t(15;17) (15q23 --> 15qt::17p13-->17pter) 1,1,1 99,6 46XY inv(9) 1,1,1 99,7 45XY, t(13;14)(q10;q10) 1,1,1 99,9 46,XX t(x;19)(q11-->21;q13- ->1.1) 1,1,1 100,0 Σύνολο 715 100,0 100,0 Έτσι, φαίνεται πως η συντριπτική πλειοψηφία (94,1%) του δείγματος είχε φυσιολογικό καρυότυπο, ενώ μόλις το 5,9% εμφάνισε παθολογικό καρυότυπο. Οι παθολογικοί καρυότυποι διέφεραν σημαντικά, με κυρίαρχες τις μεταθέσεις και τις αναστροφές. 39

40

Εικόνα 2. 45,XX,inv(9),rob(14;21)(q10;q10) Παθολογικός Καρυότυπος θήλεος με μετατόπιση τύπου Robertson του ενός χρωμοσώματος 21 στο χρωμόσωμα 14. Επίσης παρουσιάζει περικεντρική αναστροφή στο ένα αυτοσωμικό χρωμόσωμα 9. 41

Εικόνα 3. 45,XY,rob(14;21)(q10;q10) Παθολογικός Καρυότυπος άρρενος με μετατόπιση τύπου Robertson του ενός χρωμοσώματος 21 στο χρωμόσωμα 14. 42

Εικόνα 4. 46,XX,t(1;18)(p31;q11)Παθολογικός Καρυότυπος θήλεος με αμοιβαία μετάθεση του μικρού βραχίονα του ενός αυτοσωμικού χρωμοσώματος 1 και του μεγάλου βραχίονα του χρωμοσώματος 18. 43

Εικόνα 5. 46,XX,t(2;7)(p10;q10) Παθολογικός Καρυότυπος θήλεος με αμοιβαία μετάθεση του βραχέος σκέλος του χρωμοσώματος 2 και του μακρού σκέλους του χρωμοσώματος 7. 44

Εικόνα 6. 46,XY,t(15;17(q23 qter::p13 17pter). Παθολογικός Καρυότυπος άρρενος με αμοιβαία μετάθεση μεταξύ του ενός χρωμοσώματος 15 και του ενός χρωμοσώματος 17. 45

Εικόνα 7. 46,XY,t(4;18)(q32;pter).Παθολογικός Καρυότυπος άρρενος με μετάθεση ενός τμήματος του μεγάλου βραχίονα του ενός αυτοσωμικού χρωμοσώματος 4 στο μικρό βραχίονα του ενός αυτοσωμικού χρωμοσώματος 18. 46

Εικόνα 8. 46,XX,t(10;11)(q24;p15) Παθολογικός Καρυότυπος θήλεος με μετάθεση των μακρών σκελών του ενός χρωμοσώματος 10 στο ter των βραχέων σκελών του ενός χρωμοσώματος 11. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκαν συσχετίσεις με έλεγχο Pearson Chi - Square ανάμεσα σε όλα τα στοιχεία που είχαν καταγραφεί για τα άτομα και στο αποτέλεσμα της καρυοτυπικής ανάλυσης. Η συσχέτιση του καρυοτύπου με το φύλο δείχνει πως το φύλο επηρεάζει σημαντικά τον καρυότυπο σε διάστημα εμπιστοσύνης 99% (αφού το p-value είναι μικρότερο από 0,05), γεγονός το οποίο είναι αναμενόμενο λόγω των φυλετικών χρωμοσωμάτων που εμπεριέχονται στον καρυότυπου και καθορίζουν το φύλο των ατόμων. Στη συνέχεια, ο καρυότυπος συσχετίστηκε με την ηλικία των ατόμων του δείγματος, με την οποία φαίνεται να υπάρχει μια στατιστικά σημαντική σχέση. 47

Καρυότυπος * Ηλικία Crosstabulation Ηλικία 45 16-31 - ετών <16 30 45 και ετών ετών ετών άνω Σύνολο Καρυότυπος Φυσιολογικός (46,ΧΧ ή 46,ΧΥ) 1 71 553 43 668 Asymp. Sig. (2- sided) 47,ΧΧΥ 1 3 8 2 14 0,004 45,ΧΥ rob(14,21)(q10;q10) 0 0 1 0 1 46,XX(inv9) 0 1 4 1 6 45,XX(inv9)rob(14;21)(q10;q10) 0 1 2 1 4 46,XX t(1;18) (p31;q11) 0 1 0 0 1 47,ΧΧΥ inv(9) 0 1 0 0 1 46,ΧΥ inv(9) 0 0 0 1 1 46,XY t(4;18)(q32;pter) 0 0 1 0 1 46,XX t(2;7) (p10;q10) 0 0 1 0 1 45,XY t (21;22) 0 0 1 0 1 46,XX t(3;12) 0 0 1 0 1 47,XXX 0 1 2 0 3 46XX, t(15;17) (15q23 --> 15qt::17p13-->17pter) 0 0 1 0 1 46XY inv(9) 0 0 0 1 1 48

45XY, t(13;14)(q10;q10) 0 0 1 0 1 46,XX t(x;19)(q11-->21;q13-- >1.1) 0 0 1 0 1 Σύνολο 2 79 577 49 707 Ο καρυότυπος του κάθε συμμετέχοντος στην παρούσα έρευνα συσχετίστηκε και με το επάγγελμά του, δηλαδή με το εάν το τελευταίο έχει κάποια σχέση με ακτινοβολίες ή όχι. Η ύπαρξη ακτινοβολιών στο επάγγελμα των ατόμων δε φαίνεται να σχετίζεται με τον καρυότυπό του, αφού η τιμή του p-value είναι πολύ υψηλή (1,000). Ακολούθως, ελέγχθηκε η σχέση του καρυοτύπου με την περιοχή διαμονής των ατόμων. Η τιμή του p-value είναι αρκετά υψηλή, γεγονός που συνεπάγεται πως επίσης δεν παρατηρείται καμία συσχέτιση ανάμεσα στις επιμέρους περιοχές της Βόρειας Ελλάδας και στον καρυότυπο των ατόμων που ελέγχθηκαν. Τέλος, ο καρυότυπος συσχετίστηκε με τα προβλήματα για τα οποία έσπευσαν οι συμμετέχοντες για καρυοτυπική ανάλυση. Καρυότυπος * Για ποιο λόγο πραγματοποιήθηκε ανάλυση καρυοτύπου; Crosstabulation Για ποιο λόγο πραγματοποιήθηκε ανάλυση καρυοτύπου; Καρυότυπος Φυσιολογι κός (46,ΧΧ ή 46,ΧΥ) Καθ'έξιν Αποβολέ Υπογοναδισμός / Αζωοσπερμία / Υπογονιμότητα / Αδυναμία Σύλληψης / Ολιγοσπερμία / Αδύναμο Αποβολές με γνωστή χρωμοσω μική Αποτυχη μένες Εξωσωμ Προγεννητικ ός Έλεγχος για εξωσωματικ ή - Χρωμοσωμικ Παλίνδρο ς μες Κυήσεις Σπέρμα ανωμαλία ατικές ός έλεγχος Λοιπές ενδείξεις Σύνο λο 295 7 129 8 223 9 4 675 47,ΧΧΥ 0 0 13 0 1 0 0 14 Asymp. Sig. (2- sided) 0,000 49

45,ΧΥ rob(14,21) (q10;q10) 46,XX(inv 9) 45,XX(inv 9)rob(143 21)(q105q 10) 46,XX t(1;18) (q10;q10) 47,ΧΧΥ inv(9) 45XY, t(13;14) 46,ΧΥ inv(9) inv(9) 46,XY t(4;18)(q3 2;pter) 46,XX t(2;7) (p10;q10) 45,XY t (21;22) 46,XX t(3;12) 0 0 1 0 0 0 0 1 3 0 1 0 2 0 0 6 3 0 0 0 0 0 1 4 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 47,XXX 2 1 0 0 0 0 0 3 46XX, t(15;17) (15q23 -- > 15qt::17p 13-- >17pter) 46XY inv(9) 45XY, t(13;14)(q 10;q10) 46,XX t(x;19)(q1 1-- >21;q13-- >1.1) 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 Σύνολο 304 8 148 8 229 9 9 715 50