مجله دانشگاه ابوالفضل علومدادخواه و پزشكي قم همكاران دوره پنجم شماره سوم پاييز 90 صفحات 5 الي 13 اثر حفاظتي عصاره هيدروالكلي به دست آمده از زيره سياه در آسيب بافت قلب و كليه 1 استاديار بيوشيمي دانشكده علوم پايه دانشگاه آزاد اسلامي واحد قم قم ايران. در مدل التهابي 3 2 1 ابوالفضل دادخواه فاي زه فاطمي ناهيد داووديان 2 استاديار بيوشيمي پژوهشكده علوم هستهاي پژوهشگاه علوم و فنون هستهاي تهران ايران. 3 كارشناس ارشد بيوشيمي باليني دانشكده پزشكي دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران. چكيده زمينه و هدف: سپسيس نوعي پاسخ سيستميك بدن به عفونت است كه در نهايت منجر به از كار افتادن و مرگ اندامها ميشود. با توجه به عوارض جانبي ناشي از مصرف داروهاي سنتتيك امروزه استفاده از گياهان دارويي در درمان سپسيس مورد توجه قرار گرفته است. اين مطالعه با هدف تعيين اثر محافظتي عصاره هيدروالكلي زيره سياه بر روي آسيب بافت قلب و كليه در مدل تجربي التهابي ) and (Cecal Ligation Puncture در رت صورت گرفت. روش بررسي: در اين مطالعه رتها به 5 گروه تقسيم شدند: گروه كنترل (SOP) گروه گروههاي تيمار + عصاره هيدروالكلي زيره سياه b.w) 100) 50mg/kg و گروه + ايندومتاسين (كنترل مثبت). ابتدا ايندومتاسين و عصاره بهصورت داخل صفاقي (i.p) بلافاصله پس از القاي سپسيس به حيوانات تزريق شد و 24 ساعت پس از القاي سپسيس بافت قلب كليه و پلاسماي آنها جدا و آناليز گرديد. تفاوته يا بين نتايج با استفاده از آزمون واريانس و تعقيبي توكي تعيين شد. يافتهها: در اين مطالعه سطح پراكسيداسيون ليپيدها در بافت كليه و نسبت اوره به كراتينين پلاسما در گروه بهطور معنيداري افزايش نشان داد. درصورتيكه سطح گلوتاتيون در اين بافت تغييري نيافت كه اين امر نشاندهنده آسيب نسبي بافت كليه در رتهاي سپتيكي است. برخلاف ايندومتاسين تيمار رتها با هر دو دوز عصاره هيدروالكلي زيره سياه هيچگونه تغييري در بهبود پارامترهاي فوق ايجاد نكرد. نتيجهگيري: نتايج اين مطالعه نشان داد تيمار رتهاي سپتيكي با عصاره هيدروالكلي زيره سياه بلافاصله بعد از انجام بهصورت داخل صفاقي تا ثيري بر روي بهبود پارامترهاي دخيل در آسيب بافتي كليه ندارد و اين عصاره در حفاظت از بافت كليه در برابر آسيب اكسيداتيو ايجادشده توسط سپسيس ناتوان است. كليد مقاله پژوهشي (Original Article) واژهها: عصاره هيدروالكلي زيره سياه آسيبهاي قلب كليه سي ال پي استرس اكسيداتيو. نويسنده مسي ول مكاتبات: دانشكده علوم پايه دانشگاه آزاد اسلامي واحد قم قم ايران آدرس پست الكترونيكي: dadkhah_bio@yahoo.com تاريخ دريافت: 89/4/13 تاريخ پذيرش: 89/8/11 مقدمه سپسيس عارضهاي است كه در پي دارد و تحقيقات گرفته است اين مشكلات باليني و اقتصادي فراواني را وسيعي در زمينههاي مختلف آن صورت (1). باوجود پيشرفتهاي درماني در زمينه سپسيس بيماري و عواقب ناشي از آن مهمترين عامل مرگ و مير در بيماران مراقبتهاي ويژه ميباشد (2). يكي از عوارض و مشكلات ناشي از سپسيس بههم خوردن تعادل سيستم استرس اكسيداتيو بدن است (3). در شرايط فيزيولوژيك بين تشكيل گونههاي اكسيدكننده و حذف آنها توسط تركيبات آنتياكسيدان تعادل وجود دارد. استرس اكسيداتيو زماني ايجاد
مجله دانشگاه علوم پزشكي قم ميشود كه اين تعادل در اثر توليد زياد راديكالهاي آزاد اكسيژن Species) ROS (Reactive Oxygen و يا تضعيف سيستم دفاع آنتياكسيداني مختل شود (4) رخداد اين دو فرآيند در سپسيس (1) منجر به آسيب اكسيداتيو بسياري از بافتهاي بدن از جمله قلب كليه و در نهايت از كارافتادن بافتها م ي دوره پنجم شماره 3 پاييز 90 گردد (5). امروزه داروهاي مختلفي از جمله آنتيبيوتيكها NSAIDها Drugs) (Non Steroidal Anti-Inflammatory و غيره براي كاهش و يا درمان عوارض ناشي از سپسيس استفاده ميشود. با توجه به نقش مهم و اصلي استرس اكسيداتيو در عوارض ناشي از سپسيس استفاده از آنتياكسيد آنها و عوامل طبيعي در كاهش اين عوارض مورد توجه ميباشد (1). عصاره آ گبي ياهان دارويي خواص بيولوژيكي و درماني متفاوتي دارند. در مطالعهاي نشان داده شد Tempol (يك گيرنده راديكالهاي آزاد) فاكتورهاي استرس اكسيداتيو از جمله Oxide) O 2 NO (Nitric و IL-1ß را در پلاسماي رتهاي مدل كاهش ميدهد. همچنين شاخصهاي آسيب كبدي Transaminase) ALT (Alanine Transaminase) AST (Aspartate و شاخصهاي آسيب كليه (كراتينين و اوره) نيز در پلاسما كاهش مييابد. در اين مطالعه مشخص گرديد با كاهش طول عمر رتها نيز زياد ميشود استرس اكسيداتيو توسط Tempol (6). تركيب ديگري بهنام Bicucullin نيز داراي اثرات ضد التهابي است و تيمار رتهاي مدل با آن باعث كاهش IL-1β TNF پراكسيداسيون ليپيدها و نيتريت همچنين كاهش آسيب كبدي و مرگ و مير حيوانات ميشود (i.v) (100mg/kg b.w) (8 7). تزريق آسكوربيك اسيد به رتهاي مدل باعث كاهش ALT و AST پراكسيداسيون ليپيدها گلوتاتيون و كاهش بيان ژنهاي inos اكسيژناز TNF و COX-2 ميگردد (9). زيره سياه در قديم بهعنوان يك گياه دارويي مورد استفاده بوده است. اين گياه در اروپاي مركزي و شمالي سيبري تركيه هند افريقاي شمالي و ايران كشت داده ميشود. زيره سياه براي اولين بار توسط اعراب و فيلينيه يا قديمي به خاطر برطرف كردن علاي م هيستريكي و رنگ پريدگي چهره معرفي گرديد. در افسانههاي گذشتگان آمده كه جوليس سزار و سربازان والريوس مخلوط ريشههاي زيره سياه با شير "Chara" را بهصورت نان مصرف ميكردهاند. در زمان شكسپير نيز خوردن سيب همراه با زيره سياه بهصورت دسر معمول بوده است (10). امروزه از دانهه يا زيره سياه بهعنوان طعمدهنده نان پنير شيرينيها محصولات گوشتي سسها و نوشابهها استفاده ميكنند. همچنين كاروون موجود در اسانس اين گياه معطر در وسايل آرايشي بهداشتي خمير دندان آدامس و داروسازي كاربرد دارد. اين دانهها در طب سنتي بهعنوان ملين در درمان بيماريهاي رودهاي (كوليك) و تازهكننده نفس و كمككننده هضم غذا بهخصوص در بچهها استفاده ميشود. همچنين دانهه يا م ي اين گياه داراي اثرات ضد اسپاسمي ضد نفخي ضد باكتريايي ضد سرطاني ازدياد قاعدگي خلطآور (اسپكتورانت) شيرآور اشتهاآور و نيروبخش ميباشند (10). نتايج تخليص و بررسي تركيبات زيره سياه نشان م ي دهد فاز آبي اين محصول داراي تركيبات منوترپنوي يد و انواع تركيبات آروماتيك فلاونوي يدها گلوكوزيدها و نوكلي وزيدها است (11). اجزاي فلاونوي يدي زيره سياه با كروماتوگرافي ستون سلولزي مشخص شود كه شامل: Quercetin 3-glucuronide, Isoquercitrin Kaempferol 3-glucoside و Quercetin 3-O-Caffeylglucoside ميباشد (12). همچنين مشخص شده است كه فاز آبي زيره سياه فعاليت آنتياكسيداني دارد كه به دليل حلاليت تركيبات فنوليك و فلاونوي يدي در فاز آ يب م ي باشد (13). مطالعات نشان دادهاند عصاره آبي گياهان دارويي و فلاونوي يدها داراي خواص فارماكولوژيكي گوناگوني هستند. بهعنوان مثال Quercetin موجود در زيره سياه در كاهش سيروز كبدي القاشده توسط CCl 4 در رتها مو ثر است و عمل خود را با افزايش آنزيمهاي آنتياكسيدان و كاهش اثر پرواكسيدانها انجام م ي دهد (14). همچنين Quercetin سلولهاي هپاتوماي H4IIE را در مقابل استرس اكسيداتيو ناشي از قرار گرفتن در معرض پراكسيد هيدروژن محافظت م ي كند (15). با توجه به انواع تركيبات فلاونوي يدي موجود در عصاره آبي زيره سياه ميتوان پيشبيني نمود كه اين عصاره داراي خواص بيولوژيكي گوناگوني است. در يك مطالعه ديگر نيز مشاهده گرديد خاصيت آنتياكسيداني عصاره آبي زيره سياه از آسكوربيك اسيد بيشتر است (16). تيمار رتهاي ديابتي القاشده با Streptozotocin بهصورت خوراكي با عصاره آبي دانه زيره سياه b.w) (20mg/kg باعث كاهش كلسترول و تريگليسيريد پلاسما ميشود (17). مقالهاي در سال 2006 گزارش نمود كه عصاره آبي دانه زيره سياه باعث مهار اثر موتاژنيكي N متيل - N نيترو - N -نيتروزوگوانيدين در سالمونلا ميشود (18). تيمار رده سلولي كبدي Chang با
Quercetin و 200µmol/L) Kaempferol 5) بهصورت وابسته به دوز باعث كاهش سطح پروتي ين و بيان ژنهاي inos و COX-2 و CRP م ي گردد (19). Quercetin نيز بهعنوان يك فلاونوي يد آنتياكسيداني وضعيت ROS را در سلولها تحت تا ثير قرار ميدهد (20). تيمار Mcellهاي صفاقي تحريكشده رت با عصاره آبي گياهي حاوي Quercetin باعث كاهش ترشح هيستامين از اين سلولها م ي شود (21). همچنين تيمار رت با (200 mg/kg b.w) Quercetin بهصورت خوراكي 2 ساعت قبل از تزريقLPS سطح MDA و NO را در بافت اين حيوانات كاهش ميدهد (22). امروزه يافتن فرمولاسيونهاي جديد بهويژه با منشا گياهي از جمله استراتژيهاي درماني سپسيس است. با اين وجود در مورد اثرات درماني زيره سياه براي كاهش عوارض ناشي از سپسيس بهخصوص كاهش آسيبهاي اكسيداتيو بافتها در اثر سپسيس مطالعهاي صورت نگرفته است. بنابراين اين مطالعه با هدف بررسي عملكرد عصاره هيدروالكلي استخراجشده از زيره سياه در درمان سپسيس انجام شد. بدين منظور در اين تحقيق تا ثير عصاره هيدروالكلي زيره سياه بر سطح فاكتورهاي استرس اكسيداتيو نظير LP و GSH در 2 بافت قلب و كليه همچنين پارامترهاي آسيب بافت قلب و كليه نظير اوره كراتينين و CK-MB در پلاسما موشهاي صحرايي بررسي گرديد. روش بررسي در اين تحقيق از رتهاي نر بالغ ويستار با وزن متوسط 160g استفاده گرديد. رتها از مراكز نگهداري حيوانات آزمايشگاهي از انستيتو پاستور فرآوردهه يا ايران تهيه شدند. غذاي حيوانات از كارخانجات غذايي تهران بهصورت Pellet با فرمول استاندارد خريداري شد. حيوانات بالغ نيز دسترسي آزاد به غذا و آب آشاميدني از طريق بطري داشتند. در اين روش پس از بيهوش كردن رتها توسط مخلوطكتامين و گزيلوزين در ديواره شكمي آنها به اندازه 2cm برش ايجاد گرديد. سپس با خارج كردن سكوم و با فشار انگشت مدفوع درون سكوم به انتها انتقال داده شد. در ادامه بخش سكوم تا زير دريچه ايلي وسكال توسط نخ بخيه 0-3 بخيه زده شد و در سكوم (بدون آسيب به رگهاي خوني) 2 سوراخ توسط سر سوزن G20 ايجاد شد. بعد از اين مرحله با برگرداندن روده به داخل محفظه شكمي پوست و صفاق ابوالفضل دادخواه و همكاران بخيه زده شد. در گروه كنترل (لاپاراتومي) نيز جراحي فوق بدون بستن دريچه ايلي وسكال و سوراخ كردن سكوم انجام گرفت (23). سپس حيوانات مورد بررسي به پنج گروه 6 تايي تقسيم شدند. در گروه كنترل (SOP) رتها تحت جراحي لاپاراتومي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شد. در گروه حيوانات تحت جراحي قرار گرفته و DMSO بههمان صورت به آنها تزريق گرديد. دو گروه مختلف تيمار نيز عصاره هيدروالكلي (H.E) استخراجشده از زيره سياه b.w) 100) 50mg/kg را بلافاصله بعد از بهصورت i.p دريافت كردند. همچنين در گروه كنترل مثبت ايندومتاسين b.w) (10mg/kg بلافاصله بعد از بهصورت i.p به آنها تزريق شد. سپس 24 ساعت پس از تيمار رتها را كشته و بافت قلب و كليه آنها بهمنظور اندازهگيري پارامترهاي مورد نظر جداشد. همچنين پس از خونگيري از قلب پلاسما جهت اندازهگيري ماركرهاي آسيب بافتي جدا گرديد. ميزان TBARS [كه بهطور عمده Dialdehyde) MDA (Malone ميباشد] با روش اسپكتروفتومتري با استفاده از معرف تيوباربيتوريك اسيد (TBA) براساس روش اراي هشده توسط Buege و Aust (سال 1987) اندازهگيري شد. در اين روش 100mM بافر فسفات 1/5ml از بافت قلب و كليه در 0/15g هموژن گرديد و به مدت 5 دقيقه در 3000g سانتريفوژ شد. 1ml از محلول رويي به لوله دربدار منتقل و به آن 2ml از معرف TBA اضافه و ورتكس شد. سپس درب لوله بسته و به مدت 15 دقيقه در حمام آب جوش قرار گرفت. پس از سرد شدن لولهها در دماي اتاق به مدت 10 دقيقه با قدرت 3000g سانتريفوژ شدند و جذب محلول رويي در مقابل بلانك در 535nm توسط اسپكتروفتومتر خوانده شد. ميزان TBARS با استفاده از ضريب خاموشي آن محاسبه گرديد (24). در مرحله بعد GSH با استفاده از معرف Ellman s و براساس روش Seldak و اندازهگيري شد (25). در اين روش به (1986) Lindsay 200mg بافت قلب و كليه 8ml محلول 0/02M EDTA اضافه و هموژن گرديد. به 5ml از اين هموژنات 4ml آب مقطر و 1ml محلول %50 TCA افزوده شد و به مدت 10-15 دقيقه ورتكس گرديد. سپس جهت رسوب كامل پروتي ينهاي بافتي مخلوط به مدت 15 دقيقه در دور 3000g در دماي اتاق سانتريفوژ شد. در ادامه 2ml از
مجله دانشگاه علوم پزشكي قم محلول رويي با 4ml بافر تريس 0/4M حاوي EDTA دوره پنجم شماره 3 پاييز 90 MDA (nmol/gr tissue) 12 9 6 3 0 M: 7.77 SEM: 0.19 M: 9.77 SEM: 0.84 M: 8.6 * SEM:1.3 Groups M: 8.48 SEM:1.4 M:7.2 SEM: 0.24 SOP +Ind (ph=8/9) و 0/1ml محلول 0/01M DTNB (در متانول) 0/2M مخلوط گرديد و بلافاصله جذب آن توسط اسپكتروفتومتر در طول موج 412nm خوانده شد. ميزان GSH با استفاده از منحني استاندارد گلوتاتيون احيا اندازهگيري شد. بهمنظور بررسي آسيب احتمالي سلولهاي بافت قلب و كليه ميزان فعاليت برخي از پارامترهاي آنزيمي و غيرآنزيمي آسيب بافت كليه و قلب (به ترتيب (CK-MB, Urea, Creatinin 24 ساعت بعد از القاي سپسيس در پلاسما اندازهگيري شدند. اندازهگيري پارامترهاي مذكور طبق پروتكل تا ييدشده موجود در كيتهاي خريداريشده ازشركت پارس آزمون انجام گرفت. دادهها بهصورت ميانگين± و تفاوته يا انحراف معيار (SEM) گزارش شدند. اختلافات بين دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 13 و آزمون واريانس تعيين گرديد. آزمون تعقيبي مورد استفاده در اين آناليز Differences) Tukey's HSD (Honestly Significant بود. معيار معنيدار بودن دادهها در كمتر از 0/05( 0/05>p) در نظر گرفته شد. يافتهها همانطوركه در نمودار شماره 1 نشان داده شده است سطح MDA بهعنوان محصول ليپيد پراكسيداسيون در بافت كليه رتهاي مبتلا به سپسيس 24 ساعت بعد از القاي سپسيس (گروه ( %26 افزايش يافته است (0/05>p). تيمار رتهاي سپتيكي با عصاره هيدروالكلي زيره سياه در 2 دوز 50 و 100mg/kg b.w هيچگونه تغيير معنيداري بر روي سطح پراكسيداسيون ليپيدها ايجاد نكرده است برخلاف عصاره سطح MDA در گروههاي تيمارشده با داروي ضد التهابي ايندومتاسين كاهش معنيداري داشته است (0/05>p). همانطوركه در نمودار شماره 2 مشاهده م ي سطح MDA شود در بافت قلب همه گروهها در سطح يكساني قرار دارد بهطوريكه پراكسيداسيون ليپيدها در بافت قلب رتهاي گروه تغيير معنيداري نيافته است. تيمار رتهاي مبتلا به سپسيس با عصاره حاصل از زيره سياه نيز تغيير معنيداري در ميزان MDA بافت قلب ايجاد نكرده است. نمودار شماره 1: تا ثير عصاره زيره سياه بر روي سطح MDA در بافت كليه رتهاي مبتلا به سپسيس در گروه كنترل (SOP) رتها تحت جراحي لاپاراتومي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در گروه حيوانات تحت جراحي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در دو گروه مختلف تيمار عصاره هيدروالكلي (H.E) استخراجشده از زيره سياه b.w) 100) 50mg/kg بلافاصله بعد از بهصورت i.p به آنها تزريق شده است. گروه كنترل مثبت نيز ايندومتاسين b.w) (10mg/kg را بلافاصله بعد از بهصورت i.p دريافت كردهاند. مقادير براساس ميانگين 6 نمونه± انحراف معيار گزارش شده است. علامت * نشاندهنده نتيجه حاصل از آناليز آماري گروه بوده كه با گروه كنترل معنيدار ميباشد (0/05>p). علامت نشاندهنده نتيجه حاصل از آناليز آماري گروههاي مختلف تيمار بوده كه با گروه معنيدار هستند (0/05>p). MDA (nmol/gr tissue) 5 4 3 2 1 0 M: 3.5 SEM: 0.23 M: 4.01 M: 3.9 SEM: 0.15 SEM: 0.06 M: 3.8 M: 3.7 SEM: 0.2 SEM: 0.06 Groups SOP +Ind نمودار شماره 2: تا ثير عصاره زيره سياه بر روي سطح MDA در بافت قلب رتهاي مبتلا به سپسيس در گروه كنترل (SOP) رتها تحت جراحي لاپاراتومي قرار گرفته و بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در گروه DMSO حيوانات تحت جراحي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. دو گروه مختلف تيمار نيز عصاره هيدروالكلي (H.E) استخراجشده از زيره سياه b.w) 100) 50mg/kg را بلافاصله بعد از بهصورت i.p دريافت كردهاند. در گروه كنترل مثبت ايندومتاسين b.w) (10mg/kg بلافاصله بعد از بهصورت i.p به آنها تزريق مقادير براساس ميانگين 6 نمونه ± انحراف معيار گزارش شده است. شده است. ميزان گلوتاتيون احيا (GSH) در هموژن بافت كليه و قلب رتهاي سپتيكي در تمام گروهها 24 ساعت بعد از القاي سپسيس در نمودار شماره 3 و 4 نشان داده شده است. طبق نمودار سطح گلوتاتيون در بافت كليه و قلب رتهاي مبتلا به
سپسيس (گروه ( نسبت به گروه كنترل تغيير معنيداري نيافته است. تيمار رتهاي سپتيكي با عصاره استخراجشده از زيره سياه در 2 دوز 50 وb.w 100mg/kg نيز تا ثيري بر روي ميزان گلوتاتيون نداشته كه اين عدم تغيير در گروه تيمارشده با ايندومتاسين نيز قابل مشاهده ميباشد. glutathione ( mol/g tissue) 50 40 30 20 10 0 M: 30 SEM: 0.7 M: 30.5 M: 29.7 SEM: 0.9 M: 26.5 SEM: 0.5 SEM: 0.8 Groups M: 31 SEM:2.5 SOP +Ind نمودار شماره 3: تا ثير عصاره زيره سياه بر روي سطح GSH در بافت كليه رتهاي مبتلا به سپسيس در گروه كنترل (SOP) رتها تحت جراحي لاپاراتومي قرار گرفته و بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در گروه DMSO حيوانات تحت جراحي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. دو گروه مختلف تيمار عصاره هيدروالكلي (H.E) استخراجشده از زيره سياه b.w) 100) 50mg/kg را بلافاصله بعد از بهصورت i.p دريافت كردهاند. در گروه كنترل مثبت ايندومتاسين (10mg/kgb.w) بلافاصله بعد از بهصورت i.p به آنها تزريق شده است. مقادير براساس ميانگين 6 نمونه ± انحراف معيار گزارش شده است. glutathione ( mol/g tissue) 25 20 15 10 5 0 M: 21.5 M: 20.7 SEM: 0.9 M: 18.8 SEM: 0.2 SEM: 0.36 Groups M: 24.9 SEM: 1.6 M: 19.6 SEM: 0.3 SOP +Ind نمودار شماره 4: تا ثير عصاره زيره سياه بر روي سطح GSH در بافت قلب رتهاي مبتلا به سپسيس در گروه كنترل (SOP) رتها تحت جراحي لاپاراتومي قرار گرفته و بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در گروه DMSO حيوانات تحت جراحي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. دو گروه مختلف تيمار عصاره هيدروالكلي (H.E) استخراجشده از زيره سياه 50mg/kgb.w) 100) را بلافاصله بعد از بهصورت i.p دريافت كردهاند. در گروه كنترل مثبت ايندومتاسين b.w) (10mg/kg بلافاصله بعد از بهصورت i.p به آنها تزريق شده است. مقادير براساس ميانگين 6 نمونه ± انحراف معيار گزارش شده است. ابوالفضل دادخواه و همكاران بهمنظور بررسي آسيب بافت كليه و قلب 24 ساعت بعد از ماركرهاي آنزيمي و غيرآنزيمي اندازهگيري شدند كه نتايج آن در جدول شماره 1 نشان داده شده است. نسبت اوره به كراتينين در گروه به ميزان زيادي (حدود 5/5 برابر) نسبت به گروه كنترل افزايش دارد (0/05>p). افزايش معنيدار اين پارامتر كه نشاندهنده آسيب بافت كليه م ي باشد در گروه تيمارشده با ايندومتاسين بهطور معنيداري كاهش يافته است (0/05>p). برخلاف ايندومتاسين تيمار رتهاي سپتيكي با عصاره هيدروالكلي زيره سياه در هر دو دوز هيچگونه تغيير معنيداري در نسبت اوره به كراتينين در پلاسما ايجاد نكرده است. آنزيم CK-MB كه نشاندهنده آسيب بافت قلب ميباشد در هيچكدام از گروهها تغييري نيافته است بدان معني كه اين شاخص آسيب بافتي در گروه سپسيس (گروه ( افزايش نيافته و همچنين تيمار رتها با عصاره زيره سياه و داروي ايندومتاسين نيز تغييري در سطح اين آنزيم در پلاسما ايجاد نكرده است. جدول: تا ثير عصاره هيدروالكلي زيره سياه بر روي ماركرهاي آسيب گروهها بافتي در پلاسماي رتهاي مبتلا به سپسيس CK-MB (U/L) Urea/creatinine (mg/dl) 475/2±33 84/8± 12 لاپاراتومي (SOP) 480/7±34 * 462/5±81 397±90 474/3± 23 649±9 477/3± 14 423/3±66 36/8±11 +Ind10 در گروه كنترل (SOP) رتها تحت جراحي لاپاراتومي قرار گرفته و بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در گروه DMSO حيوانات تحت جراحي قرار گرفته و DMSO بهعنوان حلال عصاره به آنها تزريق شده است. در دو گروه مختلف تيمار رتها عصاره هيدروالكلي i.p بهصورت 100) را بلافاصله بعد از 50mg/kg b.w) زيره سياه (H.E) دريافت كردهاند. در گروه كنترل مثبت ايندومتاسين b.w) (10mg/kg بلافاصله بعد از بهصورت i.p به آنها تزريق شده است. مقادير براساس ميانگين 6 نمونه ± انحراف معيار گزارش شده است. علامت * نشاندهنده نتيجه حاصل از آناليز آماري گروه بوده كه با گروه كنترل معنيدار ميباشد (0/05>p). علامت نشاندهنده نتيجه حاصل از آناليز آماري گروههاي مختلف تيمار بوده كه با گروه معنيدار هستند (0/05>p). بحث نتايج اين مطالعه نشان داد تركيبات آنتياكسيداني از جمله انواع فلاونوي يدها تركيبات موجود در عصاره هيدروالكلي زيره سياه را
مجله دانشگاه علوم پزشكي قم تشكيل ميدهند (26). بنابراين در اين تحقيق اثرات محافظتي اين عصاره در آسيب بافت قلب و كليه در سپسيس القاشده توسط مدل تجربي التهابي در رت بررسي شد كه در اين راستا پارامترهاي دخيل در آسيب اكسيداتيو بافتي از جمله LP, GSH همچنين پارامترهاي پلاسمايي شاخص آسيب بافت كليه (اوره به كراتينين) و بافت قلب (CK-MB) اندازهگيري شدند. نتايج اين مطالعه نشان داد سپسيس القاشده توسط مدل التهابي باعث آسيب نسبي بافت كليه ميشود كه افزايش پراكسيداسيون ليپيدها همچنين افزايش نسبت اوره به كراتينين اين مطلب را تا ييد ميكند (نمودار شماره 2). مطالعات ديگري نيز نشان دادهاند استرس اكسيداتيو در سپسيس رابطه مستقيمي با آسيب بافتي در مدل دارد. افزايش قابل توجه ROS در سپسيس م ي تواند از مسيرهاي مختلف از جمله پراكسيداسيون ليپيدهاي غشايي و نيز آسيب اكسيداتيو به پروتي ين و DNA منجر به آسيب سلولي گردد (27 23). همچنين در اين مطالعه گلوتاتيون بهعنوان يك جزء مهم در مكانيسم دفاع داخل سلولي (28) در بافت كليه رتهاي مبتلا به سپسيس تغييري ايجاد نكرد. اين امر نشاندهنده اين نكته است كه آسيب بافت كليه آنقدر جدي نبوده كه باعث كاهش معنيدار GSH گردد (نمودار شماره 3). از طرف ديگر يافتهها مطالعه حاضر نشان داد بافت قلب پس از القاي سپسيس توسط مدل تجربي التهابي دچار آسيب جدي نشده است. عدم تغيير معنيدار پارامترهاي دخيل در آسيب اكسيداتيو بافتي از جمله GSH LP همچنين CK-MB پلاسما در تمام گروهها اين نتيجه را تا ييد م ي كند (0/05>p) (نمودار شماره 4 2 و جدول دوره پنجم شماره 3 پاييز 90 شماره 2). نتايج مطالعه حاضر نشان داد تيمار رتها با عصاره هيدروالكلي زيره در 2 دوز 50 و 100 mg به ازاي هر كيلوگرم وزن بدن تا ثيري در پارامترهاي استرس اكسيداتيو TBARS) و (GSH در 2 بافت قلب و كليه ندارد (0/05>p) و اين در حالي است كه داروي ايندومتاسين باعث كاهش معنيداري در سطح LP و نيز كاهش نسبت اوره به كراتينين (شاخص عملكرد كليه) در پلاسماي رتهاي تيمارشده ميشود (0/05>p) (نمودار شماره 1-4 و جدول شماره 2). مطالعات قبلي بر روي بافت ريه نيز نشان داد عصاره هيدروالكلي زيره سياه در 2 دوز 50 و 100mg به ازاي هر كيلوگرم وزن بدن تا ثيري بر روي پارامترهاي دخيل در آسيب اكسيداتيو بافتي LP) (GSH, MPO, ندارد ( 26 ) درصورتيكه اثرات مثبت اسانس حاصل از زيره سياه در مطالعات قبلي گزارش شده است. اسانس حاصل از دانههاي زيره سياه با خاصيت آنتياكسيداني و آنتيباكتريايي در (26) In Vitro با تعديل فاكتورهاي دخيل در سيستم استرس اكسيداتيو/آنتياكسيداني از آسيب بافت كبد و ريه ناشي از سپسيس جلوگيري م ي كند (30 29). نتايج حاصل از بررسي خاصيت آنتياكسيداني اسانس در رتهاي سپتيكي نشان ميدهد اسانس زيره سياه در ساعات مختلف پس از القاي سپسيس باعث تعديل سطح فاكتورهاي دخيل در تعادل سيستم آنتياكسيداني/ استرس اكسيداتيو در دو بافت كبد و ريه ميشود و اين در حالي است كه عصاره هيدروالكلي تا ثيري بر روي پارامترهاي فوق ندارد (31). خواص فارماكوديناميكي و توزيع تركيبات موجود در عصاره زيره سياه در بدن ميتواند يكي از دلايل عدم تا ثير عصاره هيدروالكلي بر روي پارامترهاي دخيل در آسيب اكسيداتيو بافتي باشد. وجود تركيبات آروماتيك گلوكوزيدي آلكيل گلوكوزيدها گلوسيدها نوكلي وزيدها و فلاونوي يدها در عصاره هيدروالكلي زيره سياه (11) باعث زيست دسترسي (Bioavailability) پايين اين عصاره ميشود. محدود بودن زيست دسترسي پليفنلها نه تنها به دليل خواص فيزيكوشيميايي مولكول بلكه به دليل متابوليسم آن نيز ميباشد كه موجب ورود يكباره اينگونه مولكولها به فاز 2 متابوليسم ميشود (32-34). بهعلاوه باوجود اثبات فعاليت آنتياكسيداني پليفنلها و فلاونوي يدها در مطالعات متعددي نيز فعاليت پرواكسيداني اين تركيبات گزارش شده است (35-37). نتايج تحقيقات Robaszkiewicz و همكارانش نشان داد اثرات پرواكسيداني فلاونوي يدها ميتواند بهصورت وابسته به دوز باشد. اين محققين گزارش كردن د ريه انساني تيمار رده سلولي سرطان (10µM و (5 Quercetin با غلظتهاي پايين A549 منجر به افزايش فعاليت آنزيمهاي آنتياكسيداني SOD كاتالاز GST و كاهش توليد ROS در اين سلولها ميشود ولي اين تركيب فلاونوي يدي در غلظت زياد (100µM) بهعنوان يك تركيب پرواكسيدان عمل كرده و منجر به افزايش توليد ROS و كاهش فعاليت آنزيمهاي آنتياكسيداني ميگردد (38). همچنين تيمار رده سلولي لوكمياي انسان HL-60 با يك تركيب فلاونوي يد بهنام اپيژنين منجر به توليد ROS در اين سلولها ميشود. اين در
حالي است كه تيمار همزمان اين سلولها با مهاركنندههاي آنزيم ROS توليد MPO توسط اپيژنين را كاهش ميدهد. نتايج اين تحقيق نشان داد اكسيداسيون اپيژنين توسط آنزيم MPO و تبديل شدن آن به راديكال فنوكسيل مسي ول اثرات پرواكسيداني اپيژنين است (39). آنزيم MPO در حضور H 2 O 2 با گرفتن يك الكترون از حلقه كاتكول B موجود در فلاونوي يدها آنها را به راديكال فنوكسيل تبديل ميكند كه منجر به آسيب اكسيداتيو به ماكرومولكولهاي سلول ميشود (20). همچنين مطالعات نشان داده است فعاليت پرواكسيداني پليفنلها در اثر واكنش با فلزاتي مانند آهن و مس ايجاد ميشود بدين صورت كه پليفنلها به +3 Fe متصل شده و آن را به خود پليفنلها به سمي كوي ينون +2 Fe احيا م ي كنند. در اين فرآيند (Semiquinone) اكسيد ميشوند كه در ادامه قادرند يك اتم +3 Fe ديگر را به +2 Fe احيا و خود به كوي ينون تبديل شوند. +2 Fe حاصل از فرآيند فوق با شركت در واكنش شبهفنتوني منجر به توليد راديكالهاي هيدروكسيل ميشود (40). همچنين پليفنلها با فعاليتي همانند آنزيم سوپر اكسيد دسموتاز با آنيونهاي سوپر اكسيد واكنش داده و H 2 O 2 و راديكالهاي سمي كوي ينون را ايجاد م ي كنند. از طرفي H 2 O 2 حاصل از فرآيند فوق نيز قادر است با شركت در واكنش فنتون و در حضور +2 Fe راديكالهاي هيدروكسيل بيشتري توليد كند (40). بهطوركلي با توجه به مطالب فوق م ي توان بيان نمود كه پليفنلها و فلاونوي يدها در حالت احيا مانند آنتياكسيدان عمل ميكنند درصورتيكه همين تركيبات در حالت اكسيدشده (مثل راديكال فنوكسيل يا كوي ينون) م ي توانند بهعنوان يك عامل پرواكسيدان عمل نمايند ابوالفضل دادخواه و همكاران (20). نتايج تحقيق حاضر نيز نشان داد در شرايط سپسيس ميزان توليد ROS و فعاليت آنزيم MPO افزايش و سطح آنتياكسيدانهايي نظير گلوتاتيون كاهش مييابد. بنابراين احتمالا در اين شرايط پليفنلها و فلاونوي يدهاي موجود در عصاره هيدروالكلي زيره سياه به حالت اكسيد درآمده و بهعنوان يك عامل پرواكسيدان عمل ميكنند بهطوريكه قادر به جبران آسيبهاي ناشي از سپسيس نميباشند. همچنين نبايد تا ثير نوع تزريق زمان تزريق و نوع مدل التهابي را در عدم تا ثير عصاره هيدروالكلي زيره سياه ناديده گرفت. از طرفي نيز بررسي راههاي ديگر تزريق از جمله تزريق زيرپوستي وريدي و يا تيمار بهصورت خوراكي و زمانهاي مختلف تزريق قبل و بعد از القاي سپسيس بايد مدنظر قرار گيرد. نتيجهگيري نتايج اين مطالعه نشان داد تزريق i.p عصاره هيدروالكلي زيره سياه بلافاصله بعد از القاي سپسيس هيچگونه تا ثيري بر روي تعديل پارامترهاي اكسيداتيو دخيل در آسيب بافتي در كليه و قلب نداشته است. البته در اين راستا بررسي مدلهاي ديگر القاي سپسيس همچنين استفاده از راههاي ديگر تيمار حيوانات نيز نبايد ناديده گرفته شود. References: 1. Victor VM, Rocha M, Fuente MD. Immune Cells: Free Radicals and Antioxidants in Sepsis. Int Immunopharmacol 2004;4:327-347. 2. Bone RC, Grodzin CJ, Balk RA. Sepsis: A New Hypothesis for Pathogenesis of the Disease Process. Chest 1997;112:235-243. 3. Basu S, Eriksson M. Lipid Peroxidation Induced by an Early Inflammatory Response in Endotoxaemia. Acta Anaesthesiol Scand 2000;14:17-23. 4. Gutteridge JM, Mitchell J. Redox Imbalance in the Critically Ill. Br Med Bull 1999;55:9-75. 5. Basu S, Eriksson M. Vitamin E in Relation to Lipid Peroxidation in Experimental Septic Shock. Eur J Pharmacol 2006;534:202-209. 6. Liaw WJ, Chen TH, Lai ZZ, Chen SJ, Chen A, Tzao C, et al. Effects of a Membrane-Permeable Radical Scavenger, Tempol, on Intraperitoneal Sepsis-Induced Organ Injury in Rats. Shock 2005;23(1):88-96.
مجله دانشگاه علوم پزشكي قم دوره پنجم شماره 3 پاييز 90 7. Hsu DZ, Liu MY. Effects of Sesame Oil on Oxidative Stress after the Onset of Sepsis in Rats. Shock 2004;22(6):582-585. 8. Hsu DZ, Li YH, Chien SP, Liu MY. Effects of Sesame Oil on Oxidative Stress and Hepatic Injury after Cecal Ligation and Puncture in Rats. Shock 2004;21(5):466-469. 9. Kim JY, Lee SM. Effect of Ascorbic Acid on Hepatic Vasoregulatory Gene Expression during Polymicrobial Sepsis. Life Sci 2004;75(16):2015-26. 10. De Carvalho CCCR, Da Fonseca, MMR. Carvone: Why and Howshould one Bother to Produce This Terpene. Food Chem 2006;95:413-422. 11. Matsumura T, Ishikawa T, Kitajima J. Water-Soluble Constituents of Caraway: Aromatic Compound, Aromatic Compound Glucoside and Glucides. Phytochemistry 2002;61(4):455-459. 12. Kunzemann J, Herrmann K. Isolation and Identification of Flavon(ol)-O-Glycosides in Caraway (Carum Carvi L), Fennel (Foeniculum Vulgare Mill), Anise (Pimpinella Anisum L), and Coriander (Coriandrum Sativum L), and of Flavon- C-Glycosides in Anise. I Phenolics of Spices (Author's Transl). Z Lebensm Unters Forsch 1977;164(3):194-200. 13. Padmashree A, Roopa N, Semwal AD, Sharma GK. Star-Anise (Illicium Verum) and Black Caraway (Carum Nigrum) as Natural Antioxidants. Food Chem 2007;104:59-66. 14. Pavanato MA, Possa MN, Augusto MC, Francisca LS. Quercetin Prevents Oxidative Stress in Cirrhotic Rats. Dig Dis Sci 2007;52(10):2616-21. 15. Elke Röhrdanz, Achim Bittne, Quynh-Hoa Tran-Thi, Regine Kahl. The Effect of Quercetin on the mrna Expression of Different Antioxidant Enzymes in Hepatoma Cells. Mol Toxicol 2003;77(9):506-510. 16. Satyanarayana S, Sushruta K, Sarma GS, Srinivas N, Subba Raju GV. Antioxidant Activity of the Aqueous Extracts of Spicy Food Additives-Evaluation and Comparison with Ascorbic Acid in in-vitro Systems. J Herb Pharmacother 2004;4(2):1-10. 17. Lemhadri A, Hajji L, Michel JB, Eddouks M. Cholesterol and Triglycerides Lowering Activities of Caraway Fruits in Normal and Streptozotocin Diabetic Rats. J Ethnopharmacol 2006;106(3):321-326. 18. Mazaki M, Kataoka K, Kinouchi T, Vinitketkumnuen U, Yamada M, Nohmi T, et al. Inhibitory Effects of Caraway (Carum Carvi L) and Its Component on N-methyl-N'-nitro-N-Nitrosoguanidine-Induced Mutagenicity. J Med Invest 2006;53(2):123-133. 19. García-Mediavilla V, Crespo I, Collado PS, Esteller A, Sánchez-Campos S, Tuñón MJ, et al. The Anti-Inflammatory Flavones Quercetin and Kaempferol Cause Inhibition of Inducible Nitric Oxide Synthase, Cyclooxygenase-2 and Reactive C-Protein, and Down-Regulation of the Nuclear Factor Kappa B Pathway in Chang Liver Cells. Eur J Pharmacol 2007;557(3):221-229. 20. Galati G, O'Brien PJ. Potential Toxicity of Flavonoids and other Dietary Phenolics: Significance for their Chemopreventive and Anticancer Properties. Free Radic Biol Med 2004;37(3):287-303. 21. Haggag EG, Abou-Moustafa MA, Boucher W, Theoharides TC. The Effect of a Herbal Water-Extract on Histamine Release from Mast Cells and on Allergic Asthma. J Herb Pharmacother 2003;3(4):41-54. 22. Abd EI-Gawad HM, Khalifa AE. Quercetin, Coenzyme Q10, and l-canavanine as Protective Agents Against Lipid Peroxidation and Nitric Oxide Generation in Endotoxin-Induced Shock in Rat Brain. Pharmacol Res 2001;43(3):257-263. 23. Hubbard WJ, Choudhry M, Schwacha MG, Kerby JD. Cecal Ligation and Puncture. Shock 2005;24:52-57. 24. Buege JA, Aust SD. Microsomal Lipid Peroxidation. Methods Enzymol 1978;52:302-311. 25. Seldak J, Lindsay RH. Estimation of Total Protein Bound and Non-Protein Sulfidryl Groups in Tissue with Elman, s Reagent. Anal Biochem 1986;25:192-205. 26. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Rezaei MB, Seyhoon M. The Effect of Essential Oils and Hydroalcoholic Extract of Caraway Seed on Oxidative Stress Parameters in Rats Suffering from Acute Lung Inflammation before and after γ- Irradiation. IJMAP 2010;25:441-455.
ابوالفضل دادخواه و همكاران 27. Gutteridge, JMC. Lipid Peroxidation and Antioxidants as Biomarkers of Tissue Damage. Clin Chem 1995;41:1819-28. 28. Villa P, Saccani A, Sica A. Glutathione Protects Mice from Lethal Sepsis by Limiting Inflammation and Potentiating Host Defense. J Infect Dis 2002;185:1115-20. 29. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Ashrafihelan J. Hepatoprotective Effects of G-Irradiated Caraway Essential Oils in Experimental Sepsis. Appl Radiat Isot 2010;68:280-285. 30. Fatemi F, Allameh A, Khalafi H, Rajaee R, Rezaei MB. Biochemical Properties of γ-irradiated Caraway Essential Oils. J Food Biochem 2010;In Press. 31. Davoodian N. Considering the Statues of Oxidative Stress and Antioxidant Defense System in Septic Rats Treated with Hydroalcoholic and Essential Oils Derived from Caraway seeds. Tehran: Medical Department, Tarbiat Modares Univresity; 2009. p. 45-73. 32. Lu H, Meng X, Yang CS. Enzymology of Methylation of Tea Catechins and Inhibition of Catechol-O- Methyltransferase by ( )-Epigallocatechin Gallate. Drug Metab Dispos 2003;31:572-579. 33. Lu H, Meng X, Li C, Sang S, Patten Ch, Sheng Sh, et al. Glucuronides of Tea Catechins: Enzymology of Biosynthesis and Biological Activities. Drug Metab Dispos 2003;31:452-461. 34. Yang CS, Sang S, Lambert JD, Lee MJ. Bioavailability Issues in Studying the Health Effects of Plant Polyphenolic Compounds. Mol Nutr Food Res 2008;52:139-151. 35. Panemangalore M, Bebe FN. Short-and Long-Term Exposure to Low Levels of Pesticide and Flavonoid Mixtures Modify Endogenous Antioxidants in Tissues of Rats. J Environ Sci Health 2009;44:357-364. 36. Murzakhmetova M, Moldakarimov S, Tancheva L, Abarova S, Serkedjieva J. Antioxidant and Prooxidant Properties of a Polyphenol-Rich Extract from Geranium Sanguineum L. In Vitro and In Vivo Phytother Res 2008;22:746-751. 37. Babich H, Gottesman RT, Liebling EJ, Schuck AG. Theaflavin-3-Gallate and Theaflavin-3-Gallate, Polyphenols in Black Tea with Prooxidant Properties. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2008;103:66-74. 38. Robaszkiewicz A, Balcerczyk A, Bartosz G. Antioxidative and Prooxidative Effects of Quercetin on A549 Cells. Cell Biol Int 2007;31:1245-50. 39. Miyoshi N, Naniwa K, Yamada T, Osawa T, Nakamura Y. Dietary Flavonoid Apigenin is a Potential Inducer of Intracellular Oxidative Stress: The Role in the Interruptive Apoptotic Signal. Arch Biochem Biophys 2007;466:274-282. 40. Perron NR, Brumaghim JL. A Review of the Antioxidant Mechanisms of Polyphenol Compounds Related to Iron Binding. Cell Biochem Biophys 2009;53:75-100.