% anti-c1q σε ενεργή νεφρική (# σημείων)

QUANTA Lite TM Anti-C1q ELISA 704565 Προς Εξαγωγή Μόνο. Δεν διατίθεται προς πώληση στις Ηνωμένες Πολιτείες Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση CLIA Πολυπλοκότητα: Υψηλή Ενδεικνυόμενη Χρήση To QUANTA Lite TM Anti-C1q αποτελεί μια ανοσοπορροφητική ανάλυση συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA) για τον ημι-ποσοτικό εντοπισμό anti-c1q αντισωμάτων σε ανθρώπινο ορό. Η παρουσία των anti-c1q αντισωμάτων σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες εργαστηριακές εξετάσεις για να συμβάλει στην ανίχνευση των ατόμων που κινδυνεύουν να αναπτύξουν σπειραματονεφρίτιδα. Περίληψη και επεξήγηση της δοκιμασίας Αντισώματα σε ένα θραύσμα του πρώτου συστατικού του συμπληρώματος, C1q, έχουν βρεθεί σε διάφορα αυτοάνοσα νοσήματα 1, 2. Κατά τα τελευταία 21 χρόνια πολλές διαφορετικές μελέτες έχουν δείξει ότι σε άτομα με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) τα anti-c1q αυτοαντισώματα συνδέονται με την παρουσία της ενεργής σπειραματονεφρίτιδας 2-10. Αυτά τα αυτοαντισώματα δύναται να αυξηθούν κατά τη διάρκεια μιας ενεργούς έξαρσης του ΣΕΛ 3-9. Το C1q έχει βρεθεί σε αλλοιώσεις των νεφρών των ασθενών με ΣΕΛ σπειραματονεφρίτιδα 11 και τα anti-c1q αντισώματα συμβάλλουν στην σπειραματονεφρίτιδα σε μοντέλα ποντικών για την νεφρίτιδα του λύκου 12. Στο σύνολό τους, αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η παρουσία των anti-c1q αυτοαντισωμάτων αυξάνει τον κίνδυνο σε έναν ασθενή με ΣΕΛ ανάπτυξης της ενεργής σπειραματονεφρίτιδας, πιθανώς επειδή τα anti-c1q αντισώματα είναι παθογόνα όταν ο ασθενής έχει ανοσοσυμπλέγματα που κυκλοφορούν. Πίνακας 1. Συσχετισμός του anti-c1q με την ενεργή νεφρίτιδα του λύκου Αναφ. # # ΣΕΛ Σημεία Συσχετισμός με ενεργή νεφρική νόσο Καλύτερα από anti-dna % anti-c1q σε ενεργή νεφρική (# σημείων) % anti-c1q σε ανενεργή ή μη νεφρική (# σημείων) Συσχετισμός με SLEDAI ή ECLAM Σειριακές μετρήσεις επιδεικνύουν αλλαγή 3 240 p<0,0003 Ναι 44% (139) 18% (101) Δ.Ε. Ναι 4 129 p=0,017 Δ.Ε. 50% (22) 23% (107) p=0,006 Ναι 5 151 p=0,0001 Ναι 74% (77) 32% (74) Μ.Σ.** Ναι 6 43 p<0,005 Ναι 82% (17) 31% (26) Δ.Ε. Ναι 7 61 p<0,0001 Ναι 87% (23) 8% (38) p<0,0001 Ναι 8 68 p<0,01 Ναι 71% (21) 30% (47) p<0,01 Ναι 9 100 p<0,0001 Δ.Ε. 95% (38) 35% (62) Δ.Ε. Ναι Σε Ετοιμ.^ 58 p=0,054 Ναι 44% (16) 26% (42) p=0,005 Ναι Σύνολο 850 68% (353) 25% (625) *Δ.Ε. = Δεν Έγινε, **Μ.Σ. = Μη Σημαντικό, ^Μελέτη με χρήση QUANTA Lite Anti-C1q ELISA, το κείμενο βρίσκεται σε ετοιμασία για τη δεύτερη μελέτη Αρχές της Διαδικασίας Το κεκαθαρμένο C1q αντιγόνο είναι δεσμευμένο στις πλάκες της πολυστυρένιας πλάκας μικροκοιλοτήτων υπό συνθήκες που θα διατηρήσει το αντιγόνο στην αντιδραστική του κατάσταση. Αυτοαντισώματα στην όμοια με κολλαγόνο περιοχή του C1q συσχετίζονται με ενεργή νόσο σε ασθενείς με ΣΕΛ. Για να μειωθεί η δέσμευση των ανοσοσυμπλεγμάτων σε άλλα μέρη του C1q, υψηλή συγκέντρωση άλατος χρησιμοποιείται στο αραιωτικό δείγματος. Προαραιωμένοι οροί ελέγχου και αραιωμένοι οροί ασθενούς προστίθενται σε ξεχωριστές κοιλότητες, επιτρέποντας στα παρόντα anti-c1q αντισώματα να δεσμευθούν στο ακινητοποιημένο αντιγόνο. Το δείγμα που δεν είναι δεσμευμένο ξεπλένεται και ένα ένζυμο προσδιορισμένο ως αντι-ανθρώπινο IgG σύζευγμα προστίθεται σε κάθε κοιλότητα. Μια δεύτερη επώαση επιτρέπει στο ένζυμο προσδιορισμένο ως αντι-ανθρώπινο IgG σύζευγμα να δεσμευθεί σε οποιοδήποτε αντίσωμα του ασθενούς το οποίο έχει προσκολληθεί στις μικροκοιλότητες. Αφου ξεπλυθεί κάθε μη δεσμευμένο ένζυμο προσδιορισμένο ως αντι-ανθρώπινο IgG, η υπόλοιπη ενζυμική δραστηριότητα μετράται με την προσθήκη ενός υποστρώματος χρωμογόνου και μετρώντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται. Η ανάλυση μπορεί να αξιολογηθεί φασματοφωτομετρικά μετρώντας και συγκρίνοντας την ένταση του χρώματος που αναπτύσσεται στις κοιλότητες του ασθενή με το χρώμα στις κοιλότητες ελέγχου. Αντιδραστήρια 1. Πλάκα μικροκοιλοτήτων πολυστυρενίου ELISA επικαλυμμένη με εξευγενισμένο αντιγόνο Anti-C1q (12-1 x 8 κοιλότητες) με θήκη σε αλουμινένια συσκευασία που περιέχει αφυγραντικά 2. Αρνητικός Έλεγχος ELISA, 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και ανθρώπινο ορό χωρίς ανθρώπινα αντισώματα έναντι του anti-c1q, προαραιωμένο 1,2ml 3. Anti-C1q ELISA Low Positive (χαμηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού του anti-c1q, προαραιωμένο, 1,2ml 4. Anti-C1q ELISA High Positive (υψηλό θετικό), 1 φιαλίδιο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει συντηρητικό και αντισώματα ανθρώπινου ορού έναντι του anti-c1q, προαραιωμένο, 1,2ml 5. Anti-C1q Αραιωτικό δείγματος, 1 φιαλίδιο χρώματος ροζ, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, Tween 20, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 50mL 1

6. HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 1 φιαλίδιο των 40x συμπυκνωμάτων χρώματος κόκκινου, που περιέχει Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20, 25mL. Ανατρέξτε στο Τμήμα Μεθόδων για οδηγίες αραίωσης. 7. HRP Σύζευγμα IgG (αίγας), αντι-ανθρώπινη IgG, 1 φιαλίδιο χρώματος μπλε, που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, σταθεροποιητές πρωτεΐνης και συντηρητικό, 10mL 8. TMB Χρωμογόνο, 1 φιαλίδιο που περιέχει σταθεροποιητές, 10mL 9. HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ, 1 φιαλίδιο άχρωμο, 10mL Προειδοποιήσεις 1. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Αυτό το προϊόν περιέχει ένα χημικό (0,02% chloramphenicol) στο αραιωτικό δείγματος, στους ορούς ελέγχου και στο σύζευγμα, το οποίο είναι γνωστό στην Πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο. 2. Όλα τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιούνται κατά την προετοιμασία των ελέγχων αυτού του προϊόντος έχουν ελεγχθεί και είναι αρνητικά για αντισώματα έναντι HIV, HBsAg, HCV με εγκεκριμένες από τον FDA μεθόδους. Ωστόσο, καμία μέθοδος ελέγχου δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση για την απουσία των HIV, HBV, HCV ή άλλων μολυσματικών παραγόντων. Επομένως, τα Anti-C1q ELISA Χαμηλού Θετικού, Anti-C1q ELISA Υψηλού Θετικού και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA θα πρέπει να χειρίζονται με τον ίδιο τρόπο ως δυνητικά μολυσματικά υλικά. 13 3. Το αζίδιο του νατρίου χρησιμοποιείται ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου είναι δηλητήριο και δύναται να είναι τοξικό σε περίπτωση κατάποσης ή απορρόφησης μέσω του δέρματος ή των ματιών. Το αζίδιο νατρίου μπορεί να αντιδράσει με μολύβδινες ή χάλκινες σωληνώσεις με αποτέλεσμα την πρόκληση δυνητικά εκρηκτικών μεταλλικών ενώσεων αζιδίων. Ξεπλύντε τις λεκάνες απόπλυσης εάν χρησιμοποιούνται για την απόρριψη του αντιδραστηρίου, με άφθονο νερό ώστε να αποφευχθεί η συγκέντρωση των αζιδίων. 4. Το σύζευγμα HRP περιέχει μια δηλητηριώδη/διαβρωτική χημική ουσία η οποία μπορεί να είναι τοξική εάν γίνει κατάποσή της σε μεγάλες ποσότητες. Για την πρόληψη πιθανών εγκαυμάτων αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα. 5. Το TMB χρωμογόνο περιέχει μία ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επικίνδυνη εάν εισπνευθεί, καταποθεί ή απορροφηθεί από το δέρμα. Για τη πρόληψη τραυματισμού, αποφύγετε την εισπνοή, την κατάποση ή την επαφή με το δέρμα ή τα μάτια. 6. Το HRP διάλυμα διακοπής της αντίδρασης (Stop Solution) αποτελείται από ένα αραιωμένο διάλυμα θειικού οξέως. Αποφύγετε την έκθεση σε βάσεις, μέταλλα, ή άλλα μείγματα που δύναται να αντιδράσουν με οξέα. Το θειικό οξύ είναι δηλητήριο και διαβρωτικό και επομένως μπορεί να είναι τοξικό εάν καταποθεί. Για την πρόληψη χημικού εγκαύματος, αποφύγετε την επαφή με το δέρμα και τα μάτια. 7. Να χρησιμοποιείτε τον κατάλληλο ατομικό προστατευτικό εξοπλισμό όταν δουλεύετε με τα αντιδραστήρια που παρέχονται. 8. Αντιδραστήρια που έχουν χυθεί πρέπει να καθαρίζονται αμέσως. Τηρείτε όλους τους ομοσπονδιακούς, εθνικούς και τοπικούς περιβαλλοντικούς κανονισμούς για την απόρριψη αποβλήτων. Προφυλάξεις 1. Αυτό το προίον είναι για In Vitro Διαγνωστική Χρήση. 2. Η αντικατάσταση συστατικών με διαφορετικά από τα παρεχόμενα σε αυτό το σύστημα μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 3. Το ημιτελές ή το αναποτελεσματικό πλύσιμο και η ανεπαρκής αφαίρεση των υγρών από τις κοιλότητες των ταινιών ELISA θα προκαλέσει ενδεή ακρίβεια και/η υψηλά ποσοστά παρασιτικών αποτελεσμάτων. 4. Η προσαρμογή αυτής της ανάλυσης για χρήση σε αυτόματο επεξεργαστή δειγμάτων καί άλλων συσκευές διαχείρισης, ολική ή μερική, μπορεί να αποφέρει διαφορετικά αποτελέσματα δοκιμασίας από αυτά που αποκτώνται στη χειροκίνητη διαδικασία. Είναι ευθύνη του εκάστοτε εργαστηρίου να επιβεβαιώσει ότι οι αυτόματες διαδικασίες του αποφέρουν αποτελέσματα δοκιμασιών εντός των αποδεκτών ορίων. 5. Μια ποικιλία παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την απόδοση της ανάλυσης. Αυτοί περιλαμβάνουν την αρχική θερμοκρασία των αντιδραστηρίων, τη θερμοκρασία του εργαστηριακού χώρου, την ακρίβεια και επαναληψιμότητα της τεχνικής του πιπεταρίσματος, την επιμελή πλύση και την αφαίρεση των διαλυμάτων από τις κοιλότητες των ταινιών, το φωτόμετρο που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση των αποτελεσμάτων και τη διάρκεια των χρόνων επώασης κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Προσεκτική τήρηση της συνοχής είναι απαραίτητη για τη λήψη ορθών και επαναλήψιμων αποτελεσμάτων. 6. Συνίσταται η ακριβής τήρηση του πρωτοκόλλου. 7. Το ημιτελές επανασφράγισμα της συσκευασίας με φερμουάρ η οποία περιέχει ταινίες μικροκοιλοτήτων και αφυγραντικά θα οδηγήσει στον εκφυλισμό του αντιγόνου και σε ενδεή ακρίβεια. 8. Μη αποδεκτές χαμηλές τιμές απορρόφησης μπορεί να παρατηρηθούν έπειτα από δύο ή περισσότερες χρήσεις από το ίδιο φιαλίδιο HRP συζεύγματος έπειτα από μια χρονική περίοδο. Είναι σημαντικό να ακολουθείτε τις προτεινόμενες οδηγίες χρήσης του HRP συζεύγματος. 9. Χημική μόλυνση του HRP συζεύγματος μπορεί να προέλθει από ανεπαρκή καθαρισμό ή ανεπαρκές ξέβγαλμα του εξοπλισμού ή των οργάνων. Κατάλοιπα από κοινά εργαστηριακά χημικά όπως η φορμαλίνη, η χλωρίνη, η αιθανόλη ή τα απορρυπαντικά θα προκαλέσουν εκφυλισμό του HRP συζεύγματος με το χρόνο. Ξεπλύνετε διεξοδικά όλο τον εξοπλισμό ή τα όργανα μετά τη χρήση χημικών καθαριστικών/απολυμαντικών. 2

Συνθήκες Αποθήκευσης 1. Αποθηκεύσατε όλα τα αντιδραστήρια του κιτ στους 2-8 C. Να μην καταψύχονται. Τα αντιδραστήρια είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης όταν η αποθήκευση και ο χειρισμός τους γίνονται σύμφωνα με τις οδηγίες. 2. Οι αχρησιμοποίητες επικαλυμμένες με αντιγόνο ταινίες μικροκοιλοτήτων πρέπει να επανασφραγίζονται στην αλουμινένια συσκευασία τους, η οποία περιέχει αφυγραντικά, και να φυλάσονται στούς 2-8 C. 3. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης είναι σταθερό για μία εβδομάδα στούς 2 8 C. Συλλογή Δείγματος Αυτή η διαδικασία πρέπει να διεκπεραιωθεί με ένα δείγμα ορού. Η προσθήκη αζιδίου ή άλλων συντηρητικών στα δείγματα της δοκιμασίας μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσματα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα που έχουν επιμολυνθεί με μικρόβια, έχουν υποστεί θερμική επεξεργασία ή περιέχουν ορατά σωματίδια. Έντονα αιμολυμένος, ικτερικός ή λιπαιμικός ορός ή δείγματα πρέπει να αποφεύγονται. Μετά τη συλλογή του δείγματος, ο ορός θα πρέπει να διαχωρίζεται από το ολικό αίμα. Το CLSI Έγγραφο H18-A3 προτείνει τις παρακάτω συνθήκες συντήρησης και αποθήκευσης των δειγμάτων: 1) Τα δείγματα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου όχι περισσότερο από 8 ώρες. 2) Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν ολοκληρωθεί εντός οκτώ ωρών, τότε τα δείγματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία συντήρησης 2 8 C. 3) Σε περίπτωση που η δοκιμασία δεν ολοκληρωθεί εντός 48 ωρών, ή για αποστολή του δείγματος, τα δείγματα καταψύχονται στους -20 C ή χαμηλότερα. Τα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιχθούν καλά μετά την απόψυξη και πριν από την εξέταση. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 1 Anti-C1q ELISA πλάκα μικροκοιλοτήτων (12-1x8 πηγαδάκια) με βάση 1 1,2mL προ-αραιωμένος Αρνητικός Έλεγχος ELISA 1 1,2mL προ-αραιωμένος Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό 1 1,2mL προ-αραιωμένος Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό 1 50ml Anti-C1q Αραιωτικό Δείγματος 1 25ml HRP Συμπύκνωμα πλύσης, 40x συμπύκνωμα 1 10ml HRP IgG Σύζευγμα (αίγας), αντι-ανθρώπινο IgG 1 10ml TMB Χρωμογόνο 1 10ml HRP Διάλυμα διακοπής, 0,344M θειικό οξύ Υλικά Που Απαιτούνται Αλλά Δεν Παρέχονται Μικροπιπέτες για παράδοση όγκου 5, 100, 200-300, and 500µL Απορριπτόμενα ρύγχη για μικροπιπέττες Σωληνάρια δοκιμασίας για την διάλυση δειγμάτων των ασθενών όγκου 4 ml Απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό 1L δοχείο για το αραιωμένο HRP Συμπύκνωμα πλύσης Συσκευή ανάγνωσης πλάκας μικροκοιλοτήτων με δυνατότητα μέτρησης ΟΠ 450nm (και 620nm για ενδείξεις διπλού μήκους κύματος) Μέθοδος Πριν ξεκινήσετε 1. Επάγετε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (2026 o C) και αναδεύστε καλά 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο HRP διάλυμα πλύσεων 1:40 προσθέτοντας το περιεχόμενο του φιαλιδίου συμπυκνωμένου HRP διαλύματος πλύσεων σε 975 ml αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Σε περίπτωση που δεν θα χρησιμοποιήσετε ολόκληρη την πλάκα εντός αυτής της περιόδου μπορείτε να ετοιμάσετε μικρότερη ποσότητα προσθέτοντας 2 ml του συμπυκνώματος σε 78 ml αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού για κάθε 16 πηγαδάκια που θα χρησιμοποιηθούν. Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα είναι σταθερό για μια εβδομάδα στους 2-8 o C. 3. Ετοιμάστε μια αραίωση1:101 του κάθε δείγματος ασθενούς προσθέτοντας 5 μl του δείγματος σε 500μl αραιωτικό δείγματος Anti-C1q. Τα αραιωμένα δείγματα θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 8 ωρών από την προετοιμασία. ΝΑ ΜΗΝ ΑΡΑΙΩΝΟΝΤΑΙ τα Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό, Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό και Αρνητικός Έλεγχος ELISA. 4. Ο προσδιορισμός της παρουσίας ή της απουσίας του anti-c1q χρησιμοποιώντας αυθαίρετες μονάδες απαιτεί δύο κοιλότητες για καθέναν από τους τρεις ελέγχους και μία ή δύο κοιλότητες για κάθε δείγμα ασθενούς. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των δειγμάτων. Διαδικασία ανάλυσης 1. ΟΛΑ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΕΠΑΧΘΟΥΝ ΣΕ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΔΩΜΑΤΙΟΥ (20 26 C) ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ. Τοποθετήστε τον απαραίτητο αριθμό μικροκοιλοτήτων/ταινιών στη βάση. Επιστρέψτε άμεσα τις αχρησιμοποίητες ταινίες στη θήκη που περιέχει αφυγραντικά και σφραγίστε ώστε να μειώσετε την έκθεση σε υδρατμούς. 3

2. Προσθέστε 100µL από τον προαραιωμένο Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό, τον Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό, τον Αρνητικό Έλεγχο ELISA και τα αραιωμένα δείγματα των ασθενών στις κοιλότητες. Καλύψτε τις κοιλότητες και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε επίπεδη επιφάνεια. Ο χρόνος επώασης ξεκινάει με τη προσθήκη του τελευταίου δείγματος. 3. Πλύση: Ξεπλύνετε καλά κάθε πηγαδάκι από τα περιεχόμενα. Προσθέστε 200-300µL αραιωμένου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης HRP σε όλα τα πηγαδάκια και ξεπλύνετε. Επαναλάβετε τη διαδικασία δύο ακόμα φορές, για τρεις πλύσεις συνολικά. Αναποδογυρίστε την πλάκα και τινάξτε την σε απορροφητικό υλικό για να αφαιρέσετε το εναπομείναν υγρό κατόπιν της τελικής πλύσης. Είναι σημαντικό κάθε πηγαδάκι να είναι εντελώς άδειο μετά από κάθε πλύση. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία για την πλύση όπως και για την προσθήκη των δειγμάτων. 4. Προσθέστε 100μL του HRP IgG συζεύγματος σε κάθε κοιλότητα. Το σύζευγμα πρέπει να αφαιρεθεί από τα φιαλίδια χρησιμοποιώντας τυπικές ασηπτικές συνθήκες και καλές εργαστηριακές πρακτικές. Αφαιρέστε από το φιαλίδιο μόνο την ποσότητα συζεύγματος που είναι απαραίτητη για την ανάλυση. ΠΡΟΣ ΑΠΟΦΥΓΗ ΕΝΔΕΧΟΜΕΝΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ Ή/ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ, ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΞΑΝΑ ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΕ. Πραγματοποιήστε επώαση στα πηγαδάκια για 30 λεπτά, όπως στο βήμα 2. 5. Πλύση: Επαναλάβετε το βήμα 3. 6. Προσθέστε 100 μl TMB χρωμογόνου σε κάθε κοιλότητα και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά σε σκοτεινό μέρος. 7. Προσθέστε 100µL διαλύματος διακοπής αντίδρασης (HRP Stop Solution) σε κάθε κοιλότητα. Ακολουθήστε την ίδια διαδικασία και πρόγραμμα του πρόσθετου διαλύματος διακοπής της αντίδρασης (HRP Stop Solution) όπως χρησιμοποιήθηκε για το χρωμογόνο TMB. Τινάξτε ελαφρά την πλάκα με το δάκτυλο, για να αναμιχθούν εκτενώς οι κοιλότητες. 8. Μετρήστε την απορρόφηση (ΟΠ) κάθε κοιλότητας εντός μίας ώρας στα 450nm από τη διακοπή της αντίδρασης. Εάν απαιτούνται διχρωματικές μετρήσεις τα 620nm δύναται να χρησιμοποιηθούν ως το μήκος κύματος αναφοράς. Έλεγχος Ποιότητας 1. Το Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό, το Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA θα πρέπει να τεθούν σε λειτουργία για κάθε παρτίδα δείγματος ώστε να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια και οι διαδικασίες αποδίδουν κατάλληλα. 2. Να σημειωθεί ότι εφόσον το Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό, το Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό και ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA είναι προαραιωμένα, δεν προβλέπουν διαδικαστικές μεθόδους σχετιζόμενες με την αραίωση των δειγμάτων. 3. Επιπλέον έλεγχοι δύναται να δοκιμαστούν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ή απαιτήσεις των τοπικών, πολιτειακών και/ή ομοσπονδιακών κανονισμών ή επικυρωμένων οργανισμών. Επιπλέον κατάλληλος ορός ελέγχου μπορεί να ετοιμαστεί διαιρώντας τα συγκεντρωμένα δείγματα ανθρώπινου ορού και αποθηκεύοντας στους < -20 C. 4. Για να είναι έγκυρα τα αποτελέσματα της δοκιμασίας, πρέπει να ικανοποιούνται όλα τα κριτήρια που παρατίθενται παρακάτω. Εάν κάποιο από αυτά τα κριτήρια δεν ικανοποιείται, η δοκιμασία πρέπει να θεωρηθεί άκυρη και η ανάλυση πρέπει να επαναληφθεί. α. Η απορρόφηση του προαραιωμένου Anti-C1q ELISA Υψηλού Θετικού πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προαραιωμένου Anti-C1q ELISA Χαμηλού Θετικού, η οποία πρέπει να είναι μεγαλύτερη από την απορρόφηση του προαραιωμένου Αρνητικού Ελέγχου ELISA. β. Το προαραιωμένο Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό πρέπει να έχει απορρόφηση μεγαλύτερη από 1,0 ενώ η απορρόφηση του προαραιωμένου Αρνητικού Ελέγχου ELISA δεν μπορεί να είναι πάνω από 0,2. γ. Η απορρόφηση του Anti-C1q ELISA Χαμηλό θετικό (Low Positive) πρέπει να είναι περισσότερο από δύο φορές μεγαλύτερη εκείνης του Αρνητικού Ελέγχου ELISA (Negative Control) ή πάνω από 0,25, αλλά όχι μεγαλύτερη από 0,6. δ. Ο Αρνητικός Έλεγχος ELISA και το Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό σκοπεύουν στο να ελέγχουν για τυχόν ουσιώδη ανεπάρκεια των αντιδραστηρίων. Το Anti-C1q ELISA Υψηλό Θετικό δε διασφαλίζει ακρίβεια στις οριακές τιμές της ανάλυσης. ε. Ο χρήστης θα πρέπει να ανατρέξει στο CLSI Έγγραφο C24-A3 για επιπρόσθετη καθοδήγηση επί των καταλλήλων πρακτικών ΠΕ. Υπολογισμός των Αποτελεσμάτων Ο μέσος όρος οπτικής πυκνότητας (O.Π.) για κάθε διπλό δείγμα πρέπει πρώτα να υπολογισθεί. Η αντιδραστικότητα κάθε δείγματος μπορεί τότε να υπολογιστεί διαιρώντας το μέσο όρο ΟΠ του δείγματος με το μέσο όρο ΟΠ του Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό. Το αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται με τον αριθμό των μονάδων που έχει καθοριστεί για το Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό που φαίνεται στην ετικέτα. ΟΠ Δείγματος Τιμή Δείγματος = x Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό (μονάδες) Anti-C1q ELISA Χαμηλό Θετικό ΟΠ (μονάδες) 4

Η αντιδραστικότητα σχετίζεται με την ποσότητα του αντισώματος που είναι παρόν με ένα μη-γραμμικό τρόπο. Ενώ οι αυξήσεις και οι μειώσεις στις συγκεντρώσεις των αντισωμάτων του ασθενή θα αντικατοπτρίζονται σε μια αντίστοιχη άνοδο ή πτώση στην αντιδραστικότητα, η αλλαγή δεν είναι ανάλογη (π.χ. ένας διπλασιασμός της συγκέντρωσης του αντισώματος δεν θα διπλασιάσει την αντιδραστικότητα). Αν απαιτείται ακριβέστερη ποσοτικοποίηση των αντισωμάτων του εξεταζόμενου, πρέπει να γίνουν διαδοχικές αραιώσεις του δείγματος και η τελευταία αραίωση που θα μετρηθεί ως θετική στην ανάλυση θα πρέπει να αναφερθεί ως η ισχύς διαλύματος αντισωμάτων του ασθενούς. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Η ανάλυση ELISA είναι πολύ ευαίσθητη στην τεχνική και είναι ικανή να ανιχνεύσει ακόμα και μικρές διαφορές στους πληθυσμούς των ασθενών. Οι τιμές που φαίνονται παρακάτω είναι ενδεικτικές τιμές μόνο. Κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει το δικό του εύρος τιμών βασισμένο πάνω στις δικές του τεχνικές, ελέγχους, εξοπλισμό και πληθυσμό ασθενών σύμφωνα με τις δικές του καθορισμένες διαδικασίες. Το δείγμα μπορεί τότε να ταξινομηθεί ως αρνητικό, ασθενώς, ενδιάμεσο ή ισχυρώς θετικό σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Μονάδες Αρνητικό <20 Ασθενώς θετικό 20 39 Ενδιάμεσο θετικό 40 80 Ισχυρώς θετικό >80 1. Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύει την παρουσία anti-c1q αντισωμάτων και υποδηλώνει την αυξημένη πιθανότητα νεφρίτιδας του λύκου σε ασθενείς με ΣΕΛ. 2. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι δεν υπάρχει anti -C1q αντίσωμα ή συγκεντρώσεις κάτω από την οριακή τιμή για αρνητικό δείγμα της ανάλυσης. Περιορισμοί της Διαδικασίας 1. Η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων ή άλλων συσσωρεύσεων ανοσοσφαιρίνης στο δείγμα του ασθενούς, δεν θα παράγει ψευδή θετικά σε αυτή την ανάλυση, λόγω του ειδικά πλούσιου σε άλας αραιωτικού δείγματος 2. 2. Δεν είναι όλοι οι ασθενείς με νεφρίτιδα του λύκου σχετιζόμενη με το ΣΕΛ θετικοί για anti-c1q. 3. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα και άλλες ορολογικές εξετάσεις. 4. Τα χαρακτηριστικά επιδόσεων της ανάλυσης δεν έχουν διαπιστωθεί για μεσοκυττάριες ουσίες εκτός του ορού. Αναμενόμενες Τιμές Η ικανότητα του QUANTA Lite Anti-C1q ELISA να ανιχνεύει anti-c1q αντισώματα σε ασθενείς με ΣΕΛ αξιολογήθηκε εκτελώντας δύο μελέτες σε ασθενείς με κλινική διάγνωση ΣΕΛ. Βλ. τον παρακάτω πίνακα για μια σύγκριση των αποτελεσμάτων από τη βιβλιογραφία και το QUANTA Lite Anti-C1q ELISA. Κλινική Ευαισθησία και Ειδικότητα ΣΕΛ Αρ=139 Σύνολο Ευαισθησία και Ειδικότητα Anti-C1q ΣΝ+ ΣΝ- ELISA Θετικό 19 31 50 Ευαισθησία = 50% Αρνητικό 19 70 89 Ειδικότητα = 70% Σύνολο 38 101 Η Σπειραματονεφρίτιδα (ΣΝ+) θεωρείται ως η νοσηρή κατάσταση στην παρούσα ανάλυση και καθόλου σπειραματονεφρίτιδα (ΣΝ-) θεωρείται ως απουσία νόσου. Φυσιολογικές Τιμές Ώστε να καθοριστεί το διάστημα αναφοράς συνολικά 184 δείγματα από τυχαίους αιμοδότες εξετάστηκαν στο Anti-C1q ELISA. Υπήρξαν 15 δείγματα θετικά για Anti-C1q παρέχοντας ειδικότητα της τάξεως του 91,8%. Άτομα ελέγχου ρευματικών και μολυσματικών νόσων Εβδομήντα-ένα δείγματα από ασθενείς με διάγνωση καθορισμένων ρευματικών παθήσεων και 76 δείγματα με αντισώματα σε οργανισμούς μολυσματικών νόσων εξετάστηκαν στο Anti-C1q ELISA. Αυτά περιλάμβαναν 28 δείγματα Σκληροδέρματος, 16 δείγματα Συνδρόμου του Sjögren, 27 δείγματα RA, 52 HCV, 8 HSV, 8 CMV, 3 δείγματα Τοξοπλάσμωσης και 5 δείγματα Ερυθράς. Ένα δείγμα Συνδρόμου του Sjögren, 1 RA, 1 Σκληρόδερμα, 2 HCV, 2 CMV, 1 HSV και 1 δείγμα Τοξοπλάσμωσης ήταν θετικά για το Anti-C1q παρέχοντας ειδικότητα της τάξεως του 93,9% σε αυτή την ομάδα. 5

Σύγκριση μεθόδων Δείγματα από τους φυσιολογικούς αιμοδότες, τους ελέγχους με ρευματικές παθήσεις και μολυσματικές νόσους που παραθέτονται παραπάνω και 58 ασθενείς με ΣΕΛ εξετάστηκαν τόσο με το QUANTA Lite Anti- C1q όσο και με το anti-dsdna ELISAs. Τα αποτελέσματα βρίσκονται στον παρακάτω πίνακα. Θετική και Αρνητική Ποσοστιαία Συμφωνία με το anti-dsdna Όλοι οι ασθενείς Αρ=389 Anti-C1q ELISA dsdna IgG ELISA Σύνολο % Συμφωνίας Θετική Αρνητική Θετική 16 27 43 Θετ. % Συμφωνεί=37% Αρνητική 12 334 346 Αρν. % Συμφωνεί=96% Σύνολο 28 361 Συν. % Συμφωνεί=90% Διασταυρωτική Αντιδραστικότητα Για την αξιολόγηση της πιθανής διασταυρούμενης αντιδραστικότητας του C1q αντιγόνου με άλλα αυτοαντισώματα, το QUANTA Lite Anti-C1q ELISA αξιολογήθηκε με 16 δείγματα, τα οποία είχαν υψηλά επίπεδα διαφόρων άλλων αυτοαντισωμάτων. Σε αυτήν την ομάδα συμπεριλήφθηκαν 2 δείγματα καθένα από τα οποία αντέδρασε με SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P και DNA. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά για anti-c1q. Ακρίβεια και Επαναληψιμότητα Η απόδοση εντός της ανάλυσης για το QUANTA Lite Anti-C1q ELISA αξιολογήθηκε εξετάζοντας 9 δείγματα 9 ή 10 φορές το καθένα σε 3 παρτίδες των κιτ. Παρακάτω παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα. C1q 1 C1q 2 C1q 3 N 209 C1q 4 C1q 5 Lis 22 Μέση τιμή 93 U 39 U 25 U 9 U 18 U 29 U 77 U TA 2.01 1.37 21.05 1.09 1.59 0.94 1.67 CV 2 % 3 % 4 % 12 % 9 % 3 % 2 % Η απόδοση εκτός της ανάλυσης του QUANTA Lite Anti-C1q ELISA αξιολογήθηκε εξετάζοντας 12 δείγματα σε 6 ξεχωριστές περιστάσεις καλύπτοντας ένα χρονικό διάστημα έως και οκτώ ημερών. Αυτές οι αναλύσεις εκτελέστηκαν σε τρεις παρτίδες Anti-C1q ELISA πλακών και τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα παρουσιάζονται παρακάτω. C1q 1 C1q 2 C1q 5 C1q 6 N207 Lis14 Lis 22 Μέση τιμή 94 U 43 U 33 U 27 U 7 U 71 U 61 U TA 4.09 3.40 2.32 3.35 0.52 2.47 6.51 CV 4 % 8 % 7 % 13 % 8 % 3 % 11 % 6

Βιβλιογραφία 1. Gunnarsson, I., Ronnelid, J., Lundberg, I. & Jacobson, S.H. Occurrence of anti-c1q antibodies in IgA nephropathy. Nephrol Dial Transplant 12, 2263-2268 (1997). 2. Siegert, C.E., Daha, M.R., Halma, C., van der Voort, E.A. & Breedveld, F.C. IgG and IgA autoantibodies to C1q in systemic and renal diseases. Clin Exp Rheumatol 10, 19-23 (1992). 3. Haseley, L.A. et al. Antibodies to C1q in systemic lupus erythematosus: characteristics and relation to Fc gamma RIIA alleles. Kidney Int 52, 1375-1380 (1997). 4. Horvath, L. et al. High levels of antibodies against Clq are associated with disease activity and nephritis but not with other organ manifestations in SLE patients. Clin Exp Rheumatol 19, 667-672 (2001). 5. Marto, N., Bertolaccini, M.L., Calabuig, E., Hughes, G.R. & Khamashta, M.A. Anti-C1q antibodies in nephritis: correlation between titres and renal disease activity and positive predictive value in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 64, 444-448 (2005). 6. Coremans, I.E. et al. Changes in antibodies to C1q predict renal relapses in systemic lupus erythematosus. Am J Kidney Dis 26, 595-601 (1995). 7. Moroni, G. et al. Anti-C1q antibodies may help in diagnosing a renal flare in lupus nephritis. Am J Kidney Dis 37, 490-498 (2001). 8. Siegert, C.E. et al. Predictive value of IgG autoantibodies against C1q for nephritis in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 52, 851-856 (1993). 9. Trendelenburg, M., et al. High prevalence of anti-c1q antibodies in biopsy-proven active lupus nephritis. Nephrol Dial Transplant 21, 3115-3121 (2006). 10. Moura G.C. et al. Anti-C1q antibodies: assaociation with Nephritis and disease activity in Systemic Lupus Erythematosus. J Clin Lab Anal 23, 19-23 (2009). 11. Jennette, J.C. & Hipp, C.G. Immunohistopathologic evaluation of C1q in 800 renal biopsy specimens. Am J Clin Pathol 83, 415-420 (1985). 12. Trouw, L.A. et al. Anti-C1q autoantibodies deposit in glomeruli but are only pathogenic in combination with glomerular C1q-containing immune complexes. J Clin Invest 114, 679-688 (2004). 13. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 5 th Edition, 2007. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (Domestic) : 877-829-4745 Technical Service (International) : 00+ 1 858-805-7950 info@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624565GRC February 2010 Revision 1 7