9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΛΟΓΙΑΣ ΤΟΥ ΦΥΛΟΥ ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΣΤΟ ΛΑΒΡΑΚΙ (DICENTRARCHUS LABRAX) Σταύρου Β. 1, Παυλίδης Μ. 1, Παπαδάκη Μ. 2, Συγγελάκη Ε. 2, Μυλωνάς Κ. 2 1 Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, pavlidis@biology.uoc.gr 2 Ινστιτούτο Υδατοκαλλιεργειών, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών, mylonas@her.hcmr.gr Περίληψη Το λαβράκι (Dicentrarchus labrax) είναι γονοχωριστικός Τελεόστεος, της οικογένειας Moronidae χωρίς εξωτερικό φυλετικό διμορφισμό. Η αύξησή του είναι συσχετισμένη με το φύλο, όπου τα θηλυκά άτομα μεγαλώνουν γρηγορότερα και αποκτούν εμπορεύσιμο μέγεθος πριν ωριμάσουν ενώ τα αρσενικά ωριμάζουν ένα χρόνο νωρίτερα γεγονός που μειώνει το ρυθμό αύξησάς τους, πριν να φτάσουν στο εμπορεύσιμο μέγεθος. Ο μηχανισμός του καθορισμού του φύλου για το λαβράκι δεν έχει εξακριβωθεί, αλλά η ιστολογική διαφοροποίηση των γονάδων ολοκληρώνεται μέχρι το τέλος του πρώτου έτους. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αναλογία φύλου έχουν μελετηθεί, αλλά το πώς αυτή επηρεάζει την αύξηση και την αναπαραγωγική ωρίμανση είναι άγνωστο και μελετάται στο συγκεκριμένο πείραμα. Χρησιμοποιώντας 4 μονοφυλετικές δεξαμενές, 2 για το κάθε φύλο, και 2 με αναλογία φύλου 1:1 διαπιστώθηκε ότι η ωρίμανση δεν επηρεάζεται από την αναλογία φύλου όπως επίσης και η αύξηση των αρσενικών ατόμων, αλλά η αύξηση των θηλυκών και το τελικό τους μέγεθος είναι μεγαλύτερο στην μονοφυλετική εκτροφή. Λέξεις κλειδιά: Ρυθμός αύξησης, φυλετικός διμορφισμός, καθορισμός του φύλου, μονοφυλετικές καλλιέργειες. EFFECT OF SEX RATIO ON GROWTH AND MATURATION IN EUROPEAN SEA BASS (DICENTRARCHUS LABRAX) Stavrou V. 1, Pavlidis M. 1, Papadaki M. 2, Sigelaki E. 2, Mylonas C.C. 2 1 Department of Biology, University of Crete, pavlidis@biology.uoc.gr 2 Institute of Aquaculture, Hellenic Center for Marine Research, mylonas@her.hcmr.gr Abstract The European sea bass (Dicentrarchus labrax) is a gonochoristic Teleost of the family Moronidae, and has no external sexual dimorphism. Its growth is associated with sex, with females growing faster and reaching marketable size before puberty, whereas males reach puberty a year earlier with a significant reduction in growth rate prior to the marketable size. The mechanism for sex determination in European sea bass is yet to be identified, but gonadal differentiation is completed by the end of the first year. The determining factors for sex ratio have already been studied, but the effects of sex ratio on the growth and maturation of the species are unknown yet and are the subject of the present study. By using 4 monosex fish tanks, 2 for each sex, and 2 in which the sex ratio was 1:1 it was concluded that maturation, as well as the growth of the males are not affected by the sex ratio. On the other hand, the growth and final size of the females was higher in monosex rearing. Keywords: Growth rate, sexual dimorphism, sex determination, monosexual farming. 1. Εισαγωγή Το λαβράκι (Dicentrarchus labrax) είναι ευρύαλος θαλάσσιος Τελεόστεος που ανήκει στην οικογένεια Moronidae και είναι ένα από τα κύρια είδη της μεσογειακής θαλασσοκαλιέργειας. Είναι γονοχωριστικό είδος χωρίς δευτερογενή μορφολογικά χαρακτηριστικά, αλλά με εμφανή διαφοροποίηση στον αυξητικό ρυθμό, με τα θηλυκά άτομα να αυξάνονται γρηγορότερα από τα αρσενικά και τελικά να αποκτούν μεγαλύτερο μέγεθος (Carrillo et al., 1995) κατά τη διάρκεια των δυο πρώτων χρόνων του κύκλου ζωής. Ο καθορισμός του φύλου είναι πολυπαραγοντικός. Το λαβράκι έχει 48 χρωμοσώματα και είναι διπλοειδής οργανισμός χωρίς όμως μορφολογικά ευδιάκριτα φυλετικά -1030-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ χρωμοσώματα (Aref yev, 1989). Επιπλέον δεν έχει βρεθεί κάποια ειδική αλληλουχία DNA που να καθορίζει το φύλο (Martinez et al., 1999), παρά την πρόταση ότι τα αρσενικά και θηλυκά άτομα θα μπορούσαν να διαφέρουν στην ποσότητα ή τον τρόπο κατανομής της ετεροχρωματίνης (Cano et al., 1996). Σημαντικό επίσης είναι το γεγονός ότι η ιστολογική διαφοροποίηση των γονάδων δεν είναι ολοκληρωμένη μέχρι περίπου το τέλος του πρώτου έτους ζωής (Blazquez et al., 1995). Το γεγονός αυτό επιτρέπει την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών παραμέτρων και κυρίως της θερμοκρασίας στη ρύθμιση της φυλετικής διαφοροποίησης (Pavlidis et al., 2000). Είναι γνωστό ότι στις περισσότερες παραγωγικές μονάδες τα αρσενικά υπερέχουν αριθμητικά των θηλυκών ατόμων σε ποσοστά που μπορεί να φτάσουν και το 99%. Ένα σημαντικό ποσοστό των αρσενικών ατόμων φθάνει σε γοναδική ωρίμανση πριν το εμπορεύσιμο μέγεθος (14-20 μήνες) σε σχέση με τα θηλυκά τα οποία ωριμάζουν στην ηλικία των δύο ετών. Στα αρσενικά η αναπαραγωγική ωρίμανση σχετίζεται με την μείωση του ρυθμού αύξησης και του βρώσιμου βάρους, γεγονός που επηρεάζει αρνητικά τη παραγωγή των μονάδων εκτροφής. Σκοπός της εργασίας ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της αναλογίας του φύλου στην αύξηση και στη γοναδική ωρίμανση του λαβρακιού. 2. Υλικά και Mέθοδοι Χρησιμοποιήθηκαν λαβράκια (n = 240) στα όποια έγινε βιοψία γονάδων για την ταυτοποίηση του φύλου και στη συνέχεια μαρκάρισμα και κατανομή σε 6 x 2 m 3 δεξαμενές (n = 40) με βάση την αναλογία του φύλου: δύο από τις ομάδες απαρτίζονταν αποκλειστικά από αρσενικά άτομα (Male), δύο αποκλειστικά από θηλυκά (Female) και δύο από αρσενικά και θηλυκά άτομα σε αναλογία φύλου 1:1 (Mixed). Οι ομάδες δημιουργήθηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε το μέσο βάρος της κάθε μιας να είναι περίπου 140 γραμμάρια (x ± SD, Male A: 140,2 ± 25,8 g; Male B: 140,5 ± 27,1 g; Female A: 144,6 ± 31,0 g; Female B: 144,3 ± 29,8 g; Mixed A:142,6 ± 29,0 g; Mixed B: 142,0 ± 28,5 g). Τα ψάρια ταΐζονταν κάθε πρωί από Δευτέρα έως Παρασκευή. Με την τοποθέτηση διχτυών στην έξοδο του νερού της κάθε δεξαμενής ήταν δυνατή η καταμέτρηση της ποσότητας της τροφής που δεν καταναλωνόταν από τα ψάρια και κάθε μήνα γινόταν υπολογισμός του βάρους της καταναλωθείσας τροφής από κάθε ομάδα. Από το Μάιο του 2007 μέχρι το Μάρτιο του 2008 πραγματοποιείτο μια δειγματοληψία το μήνα κατά την οποία καταγράφονταν το βάρος και το ολικό μήκος σώματος. Στο τέλος της κάθε δειγματοληψίας γινόταν αλλαγή της δεξαμενής της κάθε ομάδας για να μειωθεί η επίδραση της δεξαμενής εκτροφής. Σε πέντε από τις δειγματοληψίες, και συγκεκριμένα από τον Οκτώβριο μέχρι το Φεβρουάριο, πέντε άτομα από κάθε δεξαμενή θανατώνονταν (15 αρσενικά και 15 θηλυκά ανά δειγματοληψία) με τη χρήση αναισθητικού. Πριν από τη θανάτωσή τους γινόταν αιμοληψία για τον προσδιορισμό διαφόρων βιοχημικών και ορμονικών δεικτών. Μετά τη θανάτωση των ατόμων γινόταν αφαίρεση των γονάδων, ζύγισμα και ιστολογική επεξεργασία έτσι ώστε να γίνει εκτίμηση του σταδίου αναπαραγωγικής ωρίμανσης. Επιπλέον, όλα τα άτομα κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου ελέγχονταν για την παραγωγή σπέρματος και αυγών χρησιμοποιώντας πίεση στην κοιλιακή χώρα. Tέλος, υπολογίστηκαν και οι κάτωθι δείκτες και συντελεστές: συντελεστής ευρωστίας ή Fulton index (K=100*Βάρος σώματος/ολικό Μήκος σώματος 3 ), γοναδοσωματικός δείκτης (GSI=100*Βάρος γονάδων/βάρος σώματος), ειδικός αυξητικός ρυθμός (SGR=100*(LnBW f - LnBW i )/t, όπου BW f το τελικό βάρος σώματος, BW i το αρχικό βάρος και t ο χρόνος σε ημέρες), και ο δείκτης μετατρεψιμότητας (FCR=μηνιαία κατανάλωση τροφής/κέρδος σε βιομάζα). Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με Ανάλυση Διασποράς (ANOVA) με δύο παράγοντες. 3. Αποτελέσματα Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε κανένα από τους προς εξέταση πα- -1031-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ ράγοντες μεταξύ των διπλών αντιγράφων της κάθε πειραματικής ομάδας. Στατιστικά σημαντική διαφορά (P < 0.001) στο μήκος και βάρος του σώματος παρατηρήθηκε μεταξύ των πειραματικών ομάδων από το Σεπτέμβριο 2007 έως και το τέλος του πειράματος (Εικ. 1). Πιο συγκεκριμένα η ομάδα που περιλάμβανε μόνο θηλυκά άτομα (Female) εμφάνισε μεγαλύτερο μέσο βάρος από την ομάδα που περιείχε άτομα σε αναλογία φύλου 1:1 (Mixed), ενώ το μικρότερο μέσο βάρος παρατηρήθηκε στην ομάδα των όλο αρσενικών ατόμων (Μale). Επίσης, η ομάδα που περιλάμβανε μόνο θηλυκά άτομα, εμφάνισε μεγαλύτερο μήκος σώματος σε σύγκριση με τις άλλες δυο ομάδες (Εικ. 2). Καμιά στατιστικά σημαντική διαφορά δεν βρέθηκε μεταξύ των τριών ομάδων στην κατανάλωση της τροφής, στο δείκτη μετατρεψιμότητας (FCR), στον ειδικό αυξητικό ρυθμό (SGR), στο συντελεστή ευρωστίας (K) και στο γοναδοσωματικό δείκτη (GSI). Προχωρώντας στη σύγκριση του μεγέθους του συνόλου των αρσενικών ατόμων που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα με αυτά του συνόλου των θηλυκών ατόμων, επιβεβαιώνεται το γεγονός ότι τα αρσενικά άτομα είναι μικρότερα σε μέγεθος από τα θηλυκά. Σημαντικό αποτέλεσμα, όμως, ήταν ότι τα θηλυκά άτομα που βρίσκονταν σε δεξαμενή χωρίς την παρουσία αρσενικών ατόμων είχαν μεγαλύτερο βάρος και μήκος σώματος από τα θηλυκά της Ομάδας Mixed κατά τους τρεις τελευταίους μήνες του πειράματος (Εικ. 3). Δεν παρατηρήθηκε κάτι αντίστοιχο στα αρσενικά άτομα (Εικ. 4). Δεν παρατηρήθηκε καμιά σημαντική επίδραση της αναλογίας φύλου στη γοναδική ωρίμανση του λαβρακιού η οποία προχώρησε ομαλά τόσο στα αρσενικά όσο και στα θηλυκά άτομα ανεξάρτητα από την ομάδα στην οποία βρίσκονταν (Εικ 5, 6). Εικ. 1: Σύγκριση του μέσου βάρους λαβρακιών που εκτράφηκαν σε διαφορετικές αναλογίες φύλου (Male= μόνο αρσενικά, Female = μόνο θηλυκά, Mixed = αρσενικά/θηλυκά 1:1). Τα διαφορετικά γράμματα δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (P < 0.001). Εικ. 2: Σύγκριση του μέσου ολικού μήκους λαβρακιών που εκτράφηκαν σε διαφορετικές αναλογίες φύλου (Male = μόνο αρσενικά, Female = μόνο θηλυκά, Mixed = αρσενικά/θηλυκά 1:1.). Τα διαφορετικά γράμματα δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (P < 0.05). -1032-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Εικ. 3: Σύγκριση του βάρους των λαβρακιών από την ομάδα που είχε μόνο θηλυκά άτομα (F) και των θηλυκών από την ομάδα Mixed (M). Τα διαφορετικά γράμματα δηλώνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (P < 0.05). 4. Συζήτηση - Συμπεράσματα Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν παλαιότερες εργασίες στο λαβράκι που δείχνουν ότι τα αρσενικά άτομα εμφανίζουν στατιστικά σημαντικά μικρότερο αυξητικό ρυθμό από αυτό των θηλυκών ατόμων. Το γεγονός ότι αυτό δε συνδέεται με διαφορές στην κατανάλωση τροφής ή στο δείκτη μετατρεψιμότητας της τροφής αλλά και το ότι δεν επηρεάζεται από την παρουσία ή μη του άλλου φύλου αποτελεί ισχυρή ένδειξη ότι είναι γενετικά καθορισμένο. Όμως, σε αντίθεση με αυτό που συμβαίνει στα αρσενικά άτομα, η αναλογία φύλου επηρέασε τον αυξητικό ρυθμό των θηλυκών ατόμων κατά τη διάρκεια της περιόδου ωοτοκίας, γεγονός που δεν μπορεί να αποδοθεί σε διαφορές στη γοναδική ωρίμανση μεταξύ των θηλυκών ατόμων των ομάδων Female και Mixed, αλλά μάλλον σε κοινωνικές αλληλεπιδράσεις (σχέσεις ιεραρχίας) μεταξύ αρσενικών και θηλυκών ατόμων. Τέλος, η αναπαραγωγική ωρίμανση τόσο των αρσενικών όσο και των θηλυκών ατόμων φαίνεται πως δεν επηρεάζεται από την αναλογία του φύλου και πως συμβαίνει ακριβώς με τον ίδιο τρόπο για το κάθε φύλο είτε με την παρουσία είτε με την απουσία του άλλου φύλου. Εικ. 4: Σύγκριση του βάρους των λαβρακιών από την ομάδα που είχε μόνο αρσενικά άτομα (Male) και των αρσενικών από την ομάδα Mixed. Δεν παρατηρείται στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων. -1033-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 5: Αναπαραγωγική ωρίμανση των αρσενικών ατόμων από τις ομάδες Μale και Mixed. Immature: στους όρχεις περιέχονται Α και Β σπερματογόνια και ίσως σπερματοκύτταρα καθώς επίσης και άφθονος συνδετικός ιστός. Spermatogenesis: εκτός από σπερματογόνια και σπερματοκύτταρα περιέχονται τόσο σπερματίδες όσο και σπερματοζωάρια. Running: άφθονα σπερματοζωάρια, λίγα σπερματογόνια Α και ίσως κάποια σπερματοκύτταρα και σπερματίδες. Σε αυτό το στάδιο με πίεση στην κοιλιακή χώρα απελευθερώνεται σπέρμα από την ουρογενετική οπή. Post spawining: παρατηρούνται ελάχιστα Α σπερματογόνια και ίσως λίγα σπερματοζωάρια, υπάρχει παχύς συνδετικός ιστός και σπερματοζωάρια σε φαγοκυττάρωση. Εικ. 6: Γοναδική ωρίμανση των θηλυκών ατόμων από τις ομάδες Female και Μixed. Perinucleolar: στις ωοθήκες περιέχονται πολυεδρικά ωοκύτταρα με πολλούς πυρήνες. Lipid: εμφάνιση λιπιδικών σταγονιδίων και της ακτινωτής ζώνης. Cortical alveoli: αύξηση σε μέγεθος των ωοκυττάρων, εμφάνιση λεκιθικών κυστιδίων και αύξηση του πάχους της ακτινωτής ζώνης. Vitellogenesis: αύξηση σε αριθμό και μέγεθος των λεκιθικών κυστιδίων και του πάχους της ακτινωτής ζώνης. MGV (migratory germinal vesicle): ξεκινά η μετανάστευση του πυρήνα και η ένωση των λιπιδικών σταγονιδίων μεταξύ τους καθώς και των λεκιθικών κυστιδίων. FOM (final oocyte maturation): συνεχίζεται η συνένωση των λιπιδικών σταγονιδίων και λεκιθικών κυστιδίων και η κατάρρευση του κυτταρικού φάκελου. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Aref yev, V.A., 1989. Cytogenetic analysis of the common sea bass, Dicentrarchus labrax, and the structure of the nucleolar organizer regions. Journal of Ichthyology, 29: 812-822. Baroiller, J.F. & D Cotta, H., 2001. Environment and sex determination in farmed fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 130: 99-409. Bazquez, M., Piferrer, F., Zanuy, S., Carrillo, M. & Donaldson, E.M., 1995. Development of sex control techniques for European sea bass (Dicentrarchus labrax L) aquaculture: effects of dietary 17-methyltestosterone prior to sex differentiation. Aquaculture, 135: 329-342. Cano, J., Pretel, A., Malendez, S., Garcva, F., Caputo, V., Fenocchio, A.S. & Bertolio, L.A.C., 1996. Determination of early stages of sex chromosome differentiation in the sea bass Dicentrarchus labrax L. Cytobios, 87: 45-59. Carrillo, M., Zanuy, S., Blazquez, M., Ramos, J., Piferrer, F. & Donaldson, E.M., 1995. Sex control and ploidy manipulation in sea Bass. Environmental Impacts of Aquatic Biotechnology, OCDE: 125-144. Martinez, G., Rodriguez, L., Carillo, M. & Zanuy, S., 1999. Attempts for the development of sex seciffic DNA probes in the European sea bass (Dicentrarchus labrax ) using subtractive hybridization. Aquaculture, 173: 12(abstr). Pavlidis, M., Koumoundouros, G., Sterioti, A., Somarakis, S., Divanach, P. & Kentouri, M., 2000. Evidence of temperature- -1034-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ dependent sex determination in the European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Journal Experimental Zoology, 287: 225-232. Piferrer, F., Blazquez, M., Navarro, L. & Gonzalez, A., 2005. Genetic, endocrine, and environmental components of sex determination and differentiation in the European sea bass (Dicentrarchus labrax L). General and Comparative Endocrinology, 142: 102 110. Saillant, E., Fostier, A., Haffraya, P., Menu, B. & Chataina B., 2002. Saline preferendum for the European sea bass, Dicentrarchus labrax, larvae and juveniles: effect of salinity on early development and sex determination. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 287: 103 117. Saillant, E., Dupont-Nivet, M., Haffray, P. & Chatain, B., 2006. Estimates of heritability and genotype-environment interactions for body weight in sea bass (Dicentrarchus labrax L) raised under communal rearing conditions. Aquaculture, 254:139 147. Zanuy, S., Carrillo, M., Felip, A., Rodriguez, l., Blazquez, M., Ramos, J. & Piferrer, F., 2001. Genetic hormonal and environmental approaches for the control of reproduction in the European sea bass (Dicantrarchus labrax L.). Aquaculture, 202: 187 203. -1035-